CN115927148A - 一种无乳糖添加的高效生产乳酰-n-新四糖的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无乳糖添加的高效生产乳酰‑N‑新四糖的基因工程菌及其应用,属于代谢工程和食品发酵领域。本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对底盘微生物进行改造,通过在乳糖合成菌株中重构乳酰‑N‑新四糖合成途径、调控中心碳代谢并弱化副产物途径、上调从头合成途径的关键酶,解除阻遏蛋白抑制、增强产物的胞外输出等策略实现无抗基因工程菌的构建和乳酰‑N‑新四糖的高效合成。本发明得到的重组大肠杆菌可以利用甘油和乳糖高效合成乳酰‑N‑新四糖,发酵过程中不添加抗生素,产物安全无害,生产成本低廉且产物生产水平较高,具有较强的社会经济效益,市场开发前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一种无乳糖添加的高效生产乳酰-N-新四糖的基因工程菌及其应用,属于代谢工程和食品发酵领域。
背景技术
人乳寡糖(HMOs)是人乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体组分,母乳中的寡糖含量为5-15g/L,是牛乳的100-300倍。近年来,随着食品工业的快速发展,对于功能寡糖的开发成为了国际生物技术领域的重要课题,寡糖产业现已成为一个应用于食品、饲料、医药、化工等行业的重要新兴产业。
乳酰-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose,LNnT)是人乳寡糖中重要的成分之一,属于非岩藻糖基化的中性母乳寡糖,在母乳中的含量约为0.5g/L,具有增强人体免疫力、调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局(EFSA)、欧盟(EU)和美国食品药品管理局(FDA)批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。
目前,LNnT的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法,其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料,且以较低的环境代价获得高经济产出,因此具有更为广阔的应用前景。LNnT(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)是由D-半乳糖、N-乙酰氨基乳糖和D-乳糖依次连接组成的线性四糖,其合成途径较为复杂。目前生物合成法仍存在一些不足限制了产物的高效合成,如胞内的合成前体供给不足、合成途径与竞争途径之间代谢流不平衡、代谢压力过大可能影响菌株的遗传稳定性等。
通过绿色生物过程利用廉价生物质生产高附加值产品是实现碳中和和环境友好经济的重要途径。绿色、高效、安全型底盘微生物的开发是解决HMOs规模化生产和应用的关键。随着代谢工程和合成生物学的发展。当前,乳酰-N-新四糖生产菌株常见于大肠杆菌,报道较少且产量偏低。乳酰-N-新四糖的生产需要外源乳糖的供给,乳糖原料成本高,在微生物中开发乳糖合成新技术可以解决乳酰-N-新四糖高效生物合成过程中的乳糖高成本问题。
本发明旨在利用合成生物学手段,通过消除副产物途径和竞争抑制途径抑制,构建无乳糖添加的无抗生素添加或有抗生素添加的乳酰-N-新四糖生产菌株,通过模块化LNnT通路关键基因的构建与组合,上调从头合成途径的关键酶,增强产物的胞外输出等策略实现无乳糖添加的工程菌的构建和乳酰-N-新四糖的高效合成。
发明内容
[技术问题]
现有技术合成乳酰-N-新四糖效率不高,受体乳糖价格昂贵,无法提供安全、高效生产乳酰-N-新四糖的菌株,也不能提供成本低廉且绿色环保的乳酰-N-新四糖的制备方法。
[技术方案]
本发明为了解决乳酰-N-新四糖合成过程中受体乳糖昂贵、产物产量较低等问题,提供了一种高效生产乳酰-N-新四糖的基因工程菌及其构建方法。
本发明的第一个目的是提供一株重组大肠杆菌,所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主进行基因编辑,所述重组大肠杆菌为(a)或(b):
(a)敲除基因组上β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶基因wecB;敲除基因组上葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABCGlc组件编码基因crr和ptsG,并在crr和ptsG位点分别整合了setA和glf;敲除基因组上泛醌依赖性丙酮酸脱氢酶基因poxB,并在该位点整合了β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA;敲除基因组上磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶基因簇pta-ackA,并在该位点整合了谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS;敲除基因组上甲酸裂解酶基因pflB,并在该位点整合了N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿酸基转移酶基因glmU;敲除基因组上UDP-乳糖-6-脱氢酶基因ugd,并在该位点整合了尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因galE;敲除基因组上乳糖激酶基因glk,并在该位点整合了来源于脑膜炎奈瑟球菌的β-1,4-半乳糖基转移酶基因NmlgtB;
(b)在(a)的基础上,游离表达基因glmS、galE、lgtA和NmlgtB。
在一种实施方式中,所述重组大肠杆菌以pETDuet-1质粒表达基因glmS和galE,以pRSFDuet-1质粒表达基因lgtA和NmlgtB。
在一种实施方式中,所述β-半乳糖苷酶基因lacZ的NCBI登录号为NP_414878.1,UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶基因wecB的NCBI登录号为YP_026253.1。
在一种实施方式中,所述葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABCGlc组件编码基因包括crr和ptsG,crr的Gene ID为946880,ptsG的Gene ID为945651。
在一种实施方式中,所述葡萄糖转运蛋白基因glf来源于运动发酵单胞菌,糖外排转运蛋白基因setA来源于伯氏耶尔森氏菌ATCC 43970,其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
在一种实施方式中,所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA和β-1,4-半乳糖基转移酶NmlgtB基因来源于脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriaceae meningitidis),其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中,所述泛醌依赖性丙酮酸脱氢酶基因poxB的Gene ID为946132,磷酸乙酰转移酶基因pta的Gene ID为946778,乙酸激酶基因ackA的Gene ID为946775,甲酸裂解酶基因pflB的Gene ID为945514,UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugd的Gene ID为946571,葡萄糖激酶基因glk的Gene ID为946858,尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因galE的Gene ID为945354,谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS的Gene ID为948241,N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿酸基转移酶基因glmU的Gene ID为948246。
在一种实施方式中,所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿酸基转移酶基因glmU、尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、β-1,4-半乳糖基转移酶基因NmlgtB、setA和glf均利用启动子T7启动表达。
本发明的第二个目的是提供一种生产乳酰-N-新四糖中的方法,所述方法为以所述重组大肠杆菌为发酵菌株,在以甘油、葡萄糖为碳源的发酵体系中生产乳酰-N-新四糖。
在一种实施方式中,在摇瓶或发酵罐中发酵生产乳酰-N-新四糖。
在一种实施方式中,将所述重组大肠杆菌接种于发酵培养基,发酵初始时加入终浓度为20~30g/L的甘油和终浓度为5~10g/L的葡萄糖,在30~40℃,150~250rpm条件下摇瓶培养40~60h。
在一种实施方式中,将所述重组大肠杆菌接种至含有发酵培养基的发酵罐中,进行初始发酵,待初始碳源消耗完后,流加碳源。
在一种实施方式中,所述重组大肠杆菌在20~40℃培养,维持发酵体系中的溶氧为30±5%,pH为6.5~7.0。
在一种实施方式中,待初始甘油消耗完后流加甘油,使得甘油的浓度为2~3g/L。
在一种实施方式中,待初始葡萄糖消耗完后补加葡萄糖,使其浓度维持在10±0.5g/L。
在一种实施方式中,所述发酵培养基中含有甘油20~30g/L,葡萄糖5~10g/L,磷酸二氢钾10~15g/L,柠檬酸1~2g/L,磷酸氢二氨3~5g/L,七水硫酸镁1~2g/L,酵母提取物8~10g/L,微量金属溶液8~10mL/L。
在一种实施方式中,所述微量金属溶液中含有柠檬酸三铁8~10g/L,七水硫酸镁2~3g/L,五水硫酸铜0.5~1.0g/L,一水硫酸锰0.2~0.5g/L,硼砂0.2~0.5g/L,钼酸铵0.1~0.2g/L,二水氯化钙1~2g/L。
本发明还提供了上述重组大肠杆菌在生产含有乳酰-N-新四糖的产品中的应用。
本发明的有益效果:
本发明在大肠杆菌中引入了乳酰-N-新四糖的生物合成途径,通过弱化副产物途径,调控中心碳代谢、上调从头合成途径的关键酶,解除阻遏蛋白的阻遏抑制、增强产物的胞外输出等策略实现了无抗菌株的构建和无外源乳糖添加的乳酰-N-新四糖的高效合成。本申请构建的无抗基因工程菌EL6在无乳糖添加的摇瓶条件下生产乳酰-N-新四糖的能力达到1.168g/L,在3L发酵罐中乳酰-N-新四糖的产量达到15.42g/L。同时,本申请构建的有抗基因工程菌EL7在无乳糖添加的摇瓶条件下生产乳酰-N-新四糖的能力达到3.41g/L,在3L发酵罐中乳酰-N-新四糖的产量达到30.05g/L,为乳酰-N-新四糖的工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1为以葡萄糖和甘油为底物生产乳酰-N-新四糖的代谢过程示意图。
图2为弱化副产物途径并引入乳酰-N-新四糖途径工程菌的产量对比图。
图3为组合优化LNnT通路乳酰-N-新四糖途径工程菌的产量对比图。
图4为菌株EL7的摇瓶发酵。
图5为无抗菌株EL6的3L发酵罐补料分批发酵。
图6为有抗菌株EL7的3L发酵罐补料分批发酵。
具体实施方式
以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明,以下实例中所使用的质粒、PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品,具体操作按照试剂盒说明书进行。
本发明的实施方式不限于此,其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。
DNA产物、质粒的测序工作交予天霖生物科技(无锡)有限公司完成。
大肠杆菌感受态的制备:上海生工生物工程公司试剂盒。
下述实施例中涉及的质粒:
pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1均来自实验室保藏,购自上海百风生物科技有限公司;载体pCas9和pTargetF购自Addgene。
下述实施例中涉及的培养基:
LB液体培养基:10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/L氯化钠。
LB固体培养基:10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/L氯化钠,18g/L琼脂粉。
发酵培养基:甘油20g/L,葡萄糖10g/L,磷酸二氢钾13.5g/L,柠檬酸1.7g/L,磷酸氢二氨4.0g/L,七水硫酸镁1.4g/L,酵母提取物10g/L,微量金属溶液10mL/L(柠檬酸三铁10g/L,七水硫酸镁2.25g/L,五水硫酸铜1.0g/L,一水硫酸锰0.35g/L,硼砂0.23g/L,钼酸铵0.11g/L,二水氯化钙2.0g/L),pH 6.8。
下述实施例中的方法:
(1)使用HPLC测定乳酰-N-新四糖:1mL发酵液于100℃煮沸10min,12000r/min离心5min,上清液经0.22μm膜过滤处理,利用HPLC检测乳酰-N-新四糖的生成量以及乳糖和甘油的消耗量。
HPLC检测条件:示差折光检测器;色谱柱为Rezex ROA-organic acid(Phenomenex,USA),柱温为50℃;流动相为0.005mol/L的H2SO4水溶液,流速为0.6mL/min;进样量为10μL。
(2)摇瓶发酵无抗菌株:工程菌单菌落接种于LB液体培养基,37℃,200rpm,摇瓶培养12h,得到种子液;将种子液以2%(v/v)的接种量接入50mL发酵培养基,37℃,200rpm的条件下培养48h。
(3)摇瓶发酵有抗菌株:工程菌单菌落接种于LB液体培养基,37℃,200rpm,摇瓶培养12h,得到种子液;将种子液以2%(v/v)的接种量接入50mL发酵培养基,加入相应抗生素,37℃,200rpm,摇瓶培养至OD600为0.6,加入IPTG至终浓度为0.4mM,将温度改为25℃,200rpm的条件下诱导培养48h。
实施例1:消除副产物途径和竞争途径的抑制,构建无抗乳酰-N-新四糖生产菌株
乳酰-N-新四糖的合成需要乳糖的供给,为了防止糖酵解途径的代谢溢流,本发明弱化了副产物途径并引入乳酰-N-新四糖合成途径。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,利用CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除所述工程菌敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶基因wecB,获得EL0大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB;在EL0大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB的基础上敲除了葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABCGlc组件编码基因crr和ptsG,并在crr和ptsG位点分别整合了setA和glf,获得EL1大肠杆菌E.coli BL21(DE3)ΔlacZΔwecB,ΔptsG::PT7-glf,Δcrr::PT7-setA。
以EL1大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB,ΔptsG::PT7-glf,Δcrr::PT7-setA为出发菌株,利用CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除泛醌依赖性丙酮酸脱氢酶基因poxB,并在该位点整合了β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA;敲除磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶基因簇pta-ackA,并在该位点整合了谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS;敲除了甲酸裂解酶基因pflB,并在该位点整合了N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿酸基转移酶基因glmU;敲除了UDP-乳糖-6-脱氢酶基因ugd,并在该位点整合了尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因galE;最后,敲除了乳糖激酶基因glk,并在该位点整合了β-1,4-半乳糖基转移酶NmlgtB。
乳糖生产菌株中以甘油和葡萄糖为底物的乳酰-N-新四糖的代谢通路如图1所示,基因敲除和整合的具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表1):
(1)以敲除poxB并染色体整合β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA基因为例,通过http://www.regenome.net/cas-offinder查找poxB基因的特异性靶点gRNA(20bp),使用poxB-gRNA-F/poxB-gRNA-R上下游引物,以pTargetF质粒(Addgene:#62226)为模板进行PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶Dpn I酶切,以去除多余的环状质粒pTargetF。后将扩增产物转化E.coli DH5α感受态细胞,小提质粒,通过测序鉴定,将构建成功的敲除质粒命名为pTargetF-poxB。
(2)以大肠杆菌EL1菌株基因组为模板,利用上游同源臂引物poxB-US-F/poxB-US-R,中游同源臂引物lgtA-MS-F/lgtA-MS-R和下游同源臂引物poxB-DS-F/poxB-DS-R分别扩增三条序列片段,产物纯化回收后采用SOE-PCR方法使用引物poxB-US-F/poxB-DS-R将三片段连接获得基因同源修复模板。
(3)取pCas9质粒(Addgene:#62225)及大肠杆菌EL1电转感受态细胞,冰上放置5min后融化感受态,取10μL质粒加入100μL感受态细胞中,轻轻混匀。将质粒和电转感受态细胞转入预冷的电转杯中,2.5kV电击5ms,电击后迅速加入预冷的液体LB,轻轻吹打混匀后将混有质粒和感受态细胞的培养基转移到新的离心管中扩大培养1.5h。6000r/min离心2min,弃去上清液,菌体涂布于含有卡那抗性的LB平板上,放置于30℃培养箱过夜培养。
(4)挑取大肠杆菌EL1/pCas9单菌落于LB培养基中,30℃培养1.0h,加入终浓度为30mM的L-阿拉伯糖以诱导λ-red系统表达。当OD600达到0.6-0.8时,制备大肠杆菌EL1/pCas9感受态。
(5)将500ng步骤(1)构建的带有poxB特异性靶点gRNA(20bp)的靶向质粒pTargetF和1000ng步骤(2)构建的同源修复模板电转至步骤(4)制备的大肠杆菌EL1/pCas9感受态细胞,涂布于LB平板(卡那霉素和壮观霉素),30℃培养16-24h,对平板上长出的单菌落进行菌落PCR验证,筛选阳性转化子和进行基因测序。
(6)对验证正确的单菌落进行pTargetF-poxB和pCas9质粒的消除,单菌落接种于LB液体培养基(卡那抗性)中,30℃、200r/min培养至对数生长期,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG过夜培养,诱导pTargetF-poxB质粒失活。菌液划线含有Kan的LB平板上,于30℃、200r/min培养12h。单菌落点板于卡那和壮观霉素的双抗性平板上,若无菌落生长,表明pTargetF-poxB质粒消除成功。
(7)pCas9质粒为温敏型质粒,将消除成功pTargetF-poxB质粒的单菌落转接至LB无抗性液体培养基中,42℃传代培养消除pCas9质粒。菌液划线无抗性的LB平板后37℃恒温培养,单菌落点板于含卡那抗性的LB培养基中,若单菌落不生长,则表明pCas9质粒消除成功,将构建好的无pTargetF-poxB质粒和pCas9质粒的基因缺失菌株在-80℃条件下保存备用。
(8)基因lacZ和wecB的敲除操作参照上述步骤,基因poxB、pta-ackA、pflB、ugd和glk的敲除和对应的lgtA、glmS、glmU、galE、NmlgtB的整合操作参照上述步骤,其他实施例中涉及的基因编辑菌株的构建步骤均参照实施例1。
表1基因敲除和整合引物
在重组工程菌中,糖酵解途径副产物的积累不仅对细胞生长有毒害作用,并且还与乳酰-N-三糖的合成竞争碳源物质。为了加强前体乳酰-N-三糖的合成,本发明通过基因敲除来阻断副产物甲酸和乙酸的生成。通过调控五个可能参与竞争途径的酶进一步实现乳酰-N-新四糖在工程大肠杆菌中的高效生产。本实施例中构建的工程菌株如表2所示,检测工程菌株的乳酰-N-新四糖的合成能力、菌体生物量以及副产物积累情况。结果显示,在缺失poxB并引入lgtA基因后,初步构建了乳酰-N-新四糖生产菌株,通过摇瓶培养测定EL2菌株的乳酰-N-新四糖滴度为0.23g/L,在发酵上清中有3.15g/L乳糖的剩余。在解除所有糖酵解途径副产物后,重组菌株在发酵期间未检测到乙酸、甲酸的积累。菌株EL6表现出更高的生物量,且合成乳糖的产量达到2.40g/L。此外,乳酰-N-新四糖的胞外输出含量达到0.73g/L(图2)。上述表明弱化糖酵解途径使更多的碳流向乳酰-N-新四糖和乳糖合成通路,有利于乳酰-N-新四糖的高效生物合成。
表2.基因组整合乳酰-N-新四糖代谢通路的工程菌(无抗菌株)的详细信息
实施例2:乳酰-N-新四糖从头合成路径的重组质粒的构建
重组质粒的构建具体步骤如下(所涉及到的引物序列见表3):
(1)galE、glmS基因片段的获得:以大肠杆菌K12的基因组为模板,以galE-F/galER和glmS-F/glmS-R为引物,分别扩增出galE和glmS基因片段,胶回收DNA片段,将回收的galE和glmS基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)分别连接到载体pACYDuet-1的BamHI/Sai I和Bgi II/Xho I酶切位点之间,最终获得质粒pACY-glmS-galE。以质粒pACY-glmS-galE为模板,利用引物glmS-galE-F/glmS-galE-R(引物序列见表3)扩增出glmS-galE基因片段,胶回收DNA片段,将回收的glmS-galE基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)分别连接到载体pETYCDuet-1、pCDFDuet-1和pRSFDuet-1的Bgi II/Xho I酶切位点之间,获得质粒pET-glmS-galE、pCDF-glmS-galE和pRSF-glmS-galE。
(2)lgtA和NmlgtB基因片段的获得:委托天霖生物科技(上海)有限公司合成来源于脑膜炎奈瑟球菌的lgtA基因序列,将合成后的lgtA基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)连接到载体pETFDuet-1的BamH I/Sai I酶切位点之间,获得质粒pET-lgtA,再将NmlgtB基因片段连接到载体质粒pET-lgtA的Bgi II/Xho I酶切位点之间,最终获得的质粒为pET-lgtA-NmlgtB。以质粒pET-lgtA-NmlgtB为模板,利用引物lgtA-NmlgtB-F/lgtA-NmlgtB-R(引物序列见表3)扩增出lgtA-NmlgtB基因片段,胶回收DNA片段,将回收的lgtA-NmlgtB基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)分别连接到载体pACYCDuet-1、pCDFDuet-1和pRSFDuet-1的Bgi II/Xho I酶切位点之间,获得质粒pAC-lgtA-NmlgtB、pCDF-lgtA-NmlgtB和pRSF-lgtA-NmlgtB。
表3.质粒构建引物
实施例3:模块化LNnT通路关键基因的构建、组合与微调
将实施例2获得的质粒表达glmS-galE基因片段的质粒(pCDF-glmS-galE、pACY-glmS-galE、pRSF-glmS-galE、pET-glmS-galE)和表达lgtA-NmlgtB基因片段的质粒(pAC-lgtA-NmlgtB、pCDF-lgtA-NmlgtB、pRSF-lgtA-NmlgtB、pET-glmS-galE)进行组合,并转入实施例1构建的EL0大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB,得到了12个不同的有抗菌株,分别表示为SA1~SA12(表4)。12个不同的有抗菌株摇瓶发酵后的乳酰-N-新四糖的产量分别为1.168g/L、0.423g/L、0.693g/L、0g/L、0.645g/L和0.452g/L、0.365g/L、0.420g/L、0.463g/L、0.105g/L、0.243g/L和0g/L。其中含有重组质粒pET-glmS-galE和pRSF-lgtA-NmlgtB的工程菌(即菌株SA1)获得了1.168g/L的最高产量(见图3)。
表4.模块化组合乳酰-N-新四糖代谢通路关键基因构建的工程菌的详细信息
实施例4:质粒与基因组无抗菌株组合发酵
将实施例2中筛选得到的最优质粒组合pET-glmS-galE和pRSF-lgtA-NmlgtB转化至实施例3构建的EL6,产生菌株EL7。将构建的工程菌EL7接种于LB液体培养基,37℃,200rpm,摇瓶培养12h,得到种子液;再将种子液以2mL/100mL的接种量接入50mL发酵培养基,37℃,200rpm,摇瓶培养至OD600为0.6;加入终浓度为0.4mM的IPTG,同时加入葡萄糖至葡萄糖浓度为10g/L,25℃,200rpm的条件下诱导培养48h。
发酵培养基:甘油20g/L,葡萄糖10g/L,磷酸二氢钾13.5g/L,柠檬酸1.7g/L,磷酸氢二氨4.0g/L,七水硫酸镁1.4g/L,酵母提取物10g/L,微量金属溶液10mL/L(柠檬酸三铁10g/L,七水硫酸镁2.25g/L,五水硫酸铜1.0g/L,一水硫酸锰0.35g/L,硼砂0.23g/L,钼酸铵0.11g/L,二水氯化钙2.0g/L),pH 6.8。
发酵全程定时取样并测定菌体OD600,1mL发酵液煮沸15min使细胞破碎完全,12000r/min离心10min,上清液经0.22μm膜过滤处理,发酵过程中利用HPLC检测乳糖和乳酰-N-新四糖的生成量以及葡萄糖和甘油的消耗量(图4)。结果显示,发酵结束后(共发酵48h),胞外乳酰-N-新四糖的浓度可达3.41g/L。
表5.基因组整合质粒乳酰-N-新四糖代谢通路的工程菌的详细信息
实施例5:3L发酵罐分批补料生产乳酰-N-新四糖
为了制备高产量的乳酰-N-新四糖,使用无抗菌株EL6和有抗菌株EL7在3L发酵罐进行高密度的补料分批发酵,其中,无抗菌株EL6的发酵培养基中不添加抗生素,也无需IPTG诱导,有抗菌株EL7的发酵培养基中应添加抗生素和终浓度为0.4mM的IPTG。
发酵条件:50mL过夜培养的种子液接种于1L的发酵培养基,培养温度37℃,初始甘油和葡萄糖的浓度为20和10g/L,发酵全程使用NH4OH控制罐体pH恒定为6.80。为了维持菌体生长以及乳酰-N-新四糖的合成,待初始甘油消耗完后流加浓度为800g/L的甘油(含20g/L的MgSO4·7H2O)以补充碳源,通过pH反馈调节(设置流速为20mL/h)使甘油在发酵体系中的浓度维持在较低浓度水平(甘油用于菌体生长和代谢,浓度约为2~3g/L)至发酵结束,待初始葡萄糖消耗完后手动补加浓度为300g/L的葡萄糖并使其在发酵体系中的终浓度维持在10±0.5g/L左右,发酵过程中若葡萄糖消耗至较低浓度时继续补加葡萄糖至发酵结束。发酵过程中系统级联控制,通过调节转速,通气量和氧气使罐内溶氧为30±5%。
发酵全程定时取样并测定菌体OD600,1mL发酵液煮沸15min使细胞破碎完全,12000r/min离心10min,上清液经0.22μm膜过滤处理,发酵过程中利用HPLC检测乳糖和乳酰-N-新四糖的生成量以及葡萄糖和甘油的消耗量(图5和图6)。结果显示,产物乳糖在发酵过程中维持在6-10g/L,发酵结束后(共发酵64小时),无抗基因工程菌EL6和有抗基因工程菌EL7在无乳糖添加的条件下生产乳酰-N-新四糖的能力分别达到15.42g/L和30.05g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主进行基因编辑,所述重组大肠杆菌为(a)或(b):
(a)敲除基因组上β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶基因wecB;敲除基因组上葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABCGlc组件编码基因crr和ptsG,并在crr和ptsG位点分别整合了setA和glf;敲除基因组上泛醌依赖性丙酮酸脱氢酶基因poxB,并在该位点整合了β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA;敲除基因组上磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶基因簇pta-ackA,并在该位点整合了谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS;敲除基因组上甲酸裂解酶基因pflB,并在该位点整合了N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿酸基转移酶基因glmU;敲除基因组上UDP-乳糖-6-脱氢酶基因ugd,并在该位点整合了尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因galE;敲除基因组上乳糖激酶基因glk,并在该位点整合了来源于脑膜炎奈瑟球菌的β-1,4-半乳糖基转移酶基因NmlgtB;
(b)在(a)的基础上,游离表达基因glmS、galE、lgtA和NmlgtB。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌以pETDuet-1质粒表达基因glmS和galE,以pRSFDuet-1质粒表达基因lgtA和NmlgtB。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述β-半乳糖苷酶基因lacZ的NCBI登录号为NP_414878.1,UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶基因wecB的NCBI登录号为YP_026253.1,所述葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABCGlc组件编码基因包括crr和ptsG,crr的Gene ID为946880,ptsG的Gene ID为945651。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述葡萄糖转运蛋白基因glf来源于运动发酵单胞菌,糖外排转运蛋白基因setA来源于伯氏耶尔森氏菌ATCC 43970,其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA和β-1,4-半乳糖基转移酶NmlgtB基因来源于脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriaceaemeningitidis),其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述泛醌依赖性丙酮酸脱氢酶基因poxB的Gene ID为946132,磷酸乙酰转移酶基因pta的Gene ID为946778,乙酸激酶基因ackA的Gene ID为946775,甲酸裂解酶基因pflB的Gene ID为945514,UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugd的Gene ID为946571,葡萄糖激酶基因glk的Gene ID为946858,尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因galE的Gene ID为945354,谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS的Gene ID为948241,N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿酸基转移酶基因glmU的Gene ID为948246。
6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿酸基转移酶基因glmU、尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因galE、β-1,4-半乳糖基转移酶基因NmlgtB、setA和glf均利用启动子T7启动表达。
7.一种生产乳酰-N-新四糖中的方法,其特征在于,所述方法为以所述重组大肠杆菌为发酵菌株,在以甘油、葡萄糖为碳源的发酵体系中生产乳酰-N-新四糖。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,将权利要求1~6任一所述重组大肠杆菌接种至含有发酵培养基的发酵罐中,进行初始发酵,待初始碳源消耗完后,流加碳源;所述碳源为甘油或葡萄糖。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,待初始甘油消耗完后流加甘油,使得甘油的浓度为2~3g/L;待初始葡萄糖消耗完后补加葡萄糖,使其浓度维持在10±0.5g/L。
10.权利要求1~6任一所述重组大肠杆菌在生产含有乳酰-N-新四糖的产品中的应用。
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