JP2024516207A - インベルターゼ／スクロースヒドロラーゼを発現する微生物株 - Google Patents

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Abstract

本開示は、発現時に細胞質ゾルから移行され、且つ非リン酸化スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる単一の異種酵素の発現後、エネルギー源及び炭素源としてスクロースを利用することができる遺伝子改変細胞に関する。その未修飾形態におけるスクロースを加水分解することができ、且つそれ自体、細胞が炭素源及び／若しくはエネルギー源として又は主要な及び／若しくは唯一の炭素源及び／若しくはエネルギー源としてスクロースを利用することを可能にし、すなわち他の酵素及び／又はトランスポーターなど、いくつかの他の異種ポリペプチドを含む多重遺伝子スクロース利用系を必要としない効率的な酵素の同定は、それが大規模生産プロセスにおけるスクロースの費用効率的な使用を可能にすることから非常に有利である。【選択図】図１

Description

発明の詳細な説明
［分野］
本開示は、発現時に細胞質ゾルから移行され、且つ非リン酸化スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる単一の異種酵素の発現後、エネルギー源及び炭素源としてスクロースを利用することができる遺伝子改変細胞に関する。
［背景］
有用な化学物質及び医薬品などの生合成生産における微生物細胞の使用は、過去数十年間にわたって継続的に開発されている。この点において、生物工学産業は、スクロースのような豊富で安価な炭素源を燃料とする好気性／嫌気性バイオプロセスの開発に取り組んでいる。これは、母乳オリゴ糖の生合成生産及び他の生合成産物の生産の両方に当てはまる。
母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒトの発達における重要な機能が発見されたことから、過去１０年間で大きい関心を集めてきた。ＨＭＯは、そのプレバイオティクス特性に加えて、さらなるプラスの効果にも関連付けられており、その応用分野が拡大している。ＨＭＯの健康上の利点により、乳児用調製粉乳及び乳児用食品などの食品及び消費者向け健康製品での使用が承認されている。
現在まで、少なくとも１１５のＨＭＯの構造が特定されており、ヒトの母乳には、大幅により多くのものが存在する可能性がある。
ＨＭＯの入手可能性は、限られているため、効率的な商業的生産、すなわち大規模生産が非常に望ましい。食品及び医療用途に必要な量及び品質を化学合成で大量に製造することは、依然として提供されていない。さらに、ＨＭＯへの化学合成経路は、いくつかの有害な化学物質を伴い、最終製品に汚染リスクを課す。
ＨＭＯの化学合成に関連する欠点を回避するために、いくつかの酵素的方法及び発酵的アプローチが開発されている。発酵ベースのプロセスは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースなどのいくつかのＨＭＯのために開発されている。発酵ベースのプロセスは、典型的には、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの遺伝子改変細菌株又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））などの酵母を利用する（例えば、Ｂｙｃｈ ｅｔ ａｌ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５６：１３０－１３７；及びＬｕ ｅｔ ａｌ ２０２１ ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．１０：９２３－９３８を参照されたい）。
改変された細菌株におけるＨＭＯの生合成生産は、ＨＭＯ製造のための有価値であり、費用効果が高く、大規模に適用可能な解決策である。それは、所望のオリゴ糖の合成に必要なグリコシルトランスフェラーゼを発現するように構築された遺伝子改変細菌に依存し、ＨＭＯ前駆体として細菌の生来のヌクレオチド糖のプールを利用する。
ＨＭＯの生物工学的生産における最近の開発により、細菌発現系の特定の固有の制限を克服することが可能になった。例えば、ＨＭＯ産生細菌細胞は、細菌内のヌクレオチド糖の限定的な細胞内プールを増加させるため（国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット）、ＨＭＯ産生に関与する酵素の活性を向上させるため（国際公開第２０１６／０４０５３１号パンフレット）、又は合成されたＨＭＯの細胞外培地への分泌を促進するため（国際公開第２０１０／１４２３０５号パンフレット、国際公開第２０１７／０４２３８２号パンフレット）に遺伝子改変され得る。さらに、組換え細胞における目的の遺伝子の発現は、国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレットに最近記載されたように、特定のプロモーター配列又は他の遺伝子発現調節因子を使用することによって調節され得る。
このようなＨＭＯの生合成生産の代謝経路は、主に単純炭素構成要素である炭素源を必要とする。典型的には、グリセロール、グルコース又はラクトースが使用される（例えば、国際公開第２００１／０４３４１号パンフレット；Ｐｒｉｅｍ ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１２，２３５（２００２）；Ｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２５５８（２００５）；Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５，１７７８（２００６）；国際公開第２０１０／０７０１０４号パンフレット；国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット；国際公開第２０１３／１８２２０６号パンフレット；国際公開第２０１４／０４８４３９号パンフレットを参照されたい）。
さらに、野生型大腸菌の約５０％は、炭素源及びエネルギー源として又は唯一の炭素源及びエネルギー源としてスクロースを利用することができるが、それらのほとんどは、病原性である。しかしながら、場合により、スクロースがより安価な唯一の炭素源及び唯一のエネルギー源となる可能性がある。スクロースは、直接発酵させるか（サトウキビの搾り汁又は糖蜜として）、高温結晶化によって簡単に純粋な砂糖にし得る一方、グルコースは、粉砕及び酵素加水分解によってデンプンから変換されなければならない。さらに、スクロースベースのバイオプロセスは、グルコースベースのバイオプロセスよりも環境に優しく、持続可能である。最後に、スクロース分子には化学反応性の還元末端がないため、グルコースと比較した場合、加熱滅菌及び発酵後の不純物プロファイルがよりクリーンになる。これらの主な要因の結果、関連するバイオプロセス全体のコストは、グルコースを使用した場合と比較して減少する。さらに、スクロースは、非常に豊富に存在し、容易に入手可能である。
この理由から、スクロース上で生きて増殖し得る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の新たな非病原性株（Ｓｕｃ＋）を作成し（例えば、Ｓａｂｒｉ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７９，４７８（２０１３））、それらによりアミノ酸、バイオ燃料、カロテノイドなどの産業的に収益性の高い製品を生産する試みが行われてきた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、主に石油化学製品などの化学物質を合成するための産業において、スクロース異化能力をスクロース非利用株に移入することによって操作されてきた。しかしながら、Ｓｕｃ－株と比較して、これらのＳｕｃ＋形質転換体は、一般に生産性が低い（Ｋｈａｍｄｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，１２６７（２００９））。そのため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上に統合されたとき、効率的なスクロース異化をもたらす完全なスクロース利用カセット系が移植されている（Ｂｒｕｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０，１００１（２０１２））。
国際公開第２０１２／００７４８１号パンフレット及び国際公開第２００９／０７８６８７号パンフレットは、スクロースホスホリラーゼ、スクロース－６－リン酸ヒドロラーゼ又はスクロースインベルターゼのいずれかをフルクトキナーゼと組み合わせて発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体を記載している。それにより、微生物は、主要な炭素源としてスクロースを利用して２’－フコシルラクトースを産生することができる。さらに、国際公開第２０１４／０６７６９６号パンフレットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がスクロース上で増殖し、フコースを産生することができるようにする、スクロースパーミアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースヒドロラーゼ及び転写抑制因子（それぞれ遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲ）を含むｃｓｃ遺伝子クラスターを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体を記載している。
国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレットは、スクロース特異的ポリン、スクロース輸送タンパク質及びスクロース－６－リン酸ヒドロラーゼを含有する異種ＰＴＳ依存性スクロース利用輸送系を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を記載している。このようにして、グルコース－６－リン酸及びフルクトースの酸化は、生物自体の代謝系による生物学的エネルギー源を提供する。グルコース－６－リン酸及びフルクトースは、細胞の自然な生合成経路で糖ヌクレオチドを生成するための炭素源としても機能する。このように生成された糖ヌクレオチドは、炭水化物受容体（例えば、ラクトース）のグリコシル化のためのドナーであり、細胞によって特定のパーミアーゼを介して内在化され、それにより目的のオリゴ糖が製造される。グリコシル化は、異種遺伝子の発現によって直接生成される１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼによって媒介される。この生物は、細胞内の受容体又はオリゴ糖産物のいずれかを分解する酵素を欠いている。
本開示は、単一の異種酵素の発現後、エネルギー源及び／又は炭素源としてスクロースを利用することができる遺伝子改変細胞を初めて示し、したがってエネルギー源及び炭素源としてのスクロースの利用を可能にするための複数のタンパク質及びタンパク質複合体の発現の必要性を克服する。
［概要］
本明細書で開示されるのは、発現時に細胞質ゾルから十分な程度に移行され、且つ非リン酸化スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる単一の異種酵素の発現後、エネルギー源及び炭素源としてスクロースを利用することができる遺伝子改変細胞である。したがって、本明細書に記載の遺伝子改変細胞は、スクロースをその主要な又はいくつかの実施形態ではその唯一の炭素源及びエネルギー源としてさえ利用することができる。
その未修飾形態におけるスクロースを加水分解することができ、且つ単独で又はそれ自体、細胞が炭素源及び／若しくはエネルギー源として又は主要な及び／若しくは唯一の炭素源及び／若しくはエネルギー源としてスクロースを利用することを可能にし、すなわち他の酵素及び／又はトランスポーターなど、いくつかの他の異種ポリペプチドを含む多重遺伝子スクロース利用カセット系を必要としない効率的な酵素の同定は、それが大規模生合成生産プロセスにおけるスクロースの費用効率的な使用を可能にすることから非常に有利である。それは、最終産物の精製中に発酵産物から副産物及び代謝産物を除去する必要性並びにそれに関連するコストを大幅に削減する。遺伝子改変細胞の細胞外又はペリプラズム側でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができるスクロース加水分解酵素を使用することのさらなる利点は、スクロースが細胞に入らないことであり、細胞内でスクロースが過剰である場合、代謝オーバーフローの一因となり、乳酸、酢酸及びエタノールなどの代謝産物の形成につながり、細胞の増殖及び生産能力に悪影響を及ぼし得る。
したがって、その最も広い意味において、本開示は、発現時に細胞質ゾルから少なくとも十分な程度に移行されて細胞外、ペリプラズムに位置し、且つ／又は膜結合型若しくは膜包埋型になり、且つ細胞外側又は細胞周辺腔内でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞に関し、前記異種ポリペプチドの単独又はそれ自体での発現は、スクロースが宿主細胞の細胞質ゾルに入ることなく、前記遺伝子改変細胞の主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。ポリペプチドは、発現後、典型的には細胞外、及び／又は細胞周辺腔内、及び／又は細胞質膜内に位置する。前記異種ポリペプチドがインベルターゼである場合、それは、非リン酸化スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる。
したがって、本発明の一態様は、インベルターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞に関し、前記インベルターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
異種核酸配列は、エピソーム的（すなわち多コピープラスミドにより）及び／又は染色体的（すなわちゲノム統合により）に細胞に提供され得る。それは、例えば、インベルターゼをコードする異種核酸配列の少なくとも２つのゲノム統合コピーなど、異種遺伝子の単一コピー又は複数コピーを含み得る。実施形態では、異種核酸配列は、インベルターゼのエピソーム及び／又はゲノム統合コピーをコードする。
異種ポリペプチドは、非リン酸化スクロース、すなわちその未修飾形態におけるスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる。一実施形態では、異種ポリペプチドは、インベルターゼである。異種ポリペプチドは、それ自体、スクロースを輸送せず、完全なスクロース利用系をコードしない。別の実施形態では、インベルターゼは、非リン酸化スクロースを加水分解することができる。この点において、本発明のインベルターゼは、細胞の細胞周辺腔内及び／又は細胞外側でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができるインベルターゼである。さらに、実施形態では、前記インベルターゼの発現は、本発明の遺伝子改変細胞の主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。この点において、実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、完全なスクロース利用系を含有しない。
さらに、遺伝子改変細胞では、内因性グルコース輸送系は、完全に又は部分的に不活性化される。したがって、好ましい実施形態では、細胞膜グルコースパーミアーゼをコードする遺伝子改変細胞のｐｔｓＧ遺伝子は、完全に又は部分的に不活化される。
現在好ましい実施形態では、本開示による遺伝子改変細胞は、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）をさらに産生することができる。
一実施形態では、異種ポリペプチドは、配列番号１若しくは２のいずれか１つ又は配列番号１若しくは２のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号１又は２のいずれか１つの機能的相同体である。
現在好ましい実施形態では、異種ポリペプチドは、配列番号１（ＳａｃＣ Ａｇａｌ）に示されるアビバクテリウム・ガリナルム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）由来のグリコシドヒドロラーゼファミリー３２タンパク質又は配列番号１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
別の現在好ましい実施形態では、異種ポリペプチドは、配列番号２（Ｂｆｆ）に示されるアルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ ３０６２由来のβーフルクトフラノシダーゼタンパク質又は配列番号２と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
異種核酸配列は、例えば、１つ若しくは複数の誘導性プロモーター配列及び／又は１つ若しくは複数の構成的プロモーター配列を含む、異種核酸配列の発現を調節するための調節エレメントをさらに含み得る。調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）、若しくはＰｌａｃ（配列番号５１）、若しくはＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号３８）、若しくはＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号３９）、若しくはＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号４０）又は表６で同定されるこれらのプロモーターの変異型からなる群から選択されるプロモーターであり得る。
異種核酸配列は、遺伝子改変細胞のペリプラズム及び／又は発酵培地への前記異種ポリペプチドの連続分泌を増強することができるシグナルペプチドをさらにコードし得る。好ましい実施形態では、前記シグナルペプチドは、表１から選択され、好ましくは配列番号２８のシグナルペプチドである。
典型的には、前述の請求項のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞は、原核細胞又は真核細胞などの単細胞生物である。特定の実施形態では、遺伝子改変細胞は、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）若しくはハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の酵母細胞又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の糸状菌から選択される。代わりに、実施形態では、遺伝子改変細胞は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種からなる群から選択される。特に、本開示に従った遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり得る。
本発明は、生合成生産のための、本発明による遺伝子改変細胞の使用にも関する。特に、本発明は、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産に関する。その点において、本発明は、１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法であって、ａ）本発明による遺伝子改変細胞を提供するステップと、ｂ）炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中で（ａ）の細胞を培養するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）で産生されたＨＭＯを採取するステップとを含む方法に関する。したがって、本発明の１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法において、ステップａ）の遺伝子改変細胞内のインベルターゼは、それ自体、前記遺伝子改変細胞の細胞外側及び／又は細胞周辺腔内でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができ、酵素の発現は、前記遺伝子改変細胞の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするのに十分である。したがって、実施形態において、ステップｂ）のスクロースは、主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源である。
代わりに、本発明は、所望の生合成産物を産生することができる遺伝子改変宿主細胞において生合成生産する方法であって、ａ）非スクロース利用性（Ｓｕｃ－）宿主細胞又は所望の生合成産物を産生することができるスクロースを利用する限定された及び／若しくは非効率的な能力を有する宿主細胞を提供するステップと、ｂ）インベルターゼをコードする異種核酸配列を前記宿主細胞に導入するステップであって、前記インベルターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、ステップと、ｃ）炭素源として、主要な及び／若しくは唯一の炭素源として、且つ／又はエネルギー源として、主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中で（ｂ）の細胞を培養するステップと、ｄ）ステップｃ）で産生された生合成産物を採取するステップとを含む方法にも関する。任意選択的に、グルコースパーミアーゼをコードする前記宿主細胞のｐｔｓＧ遺伝子は、完全に又は部分的に不活化される。
本開示による改変細胞は、本明細書に記載の異種ポリペプチドの発現のために使用され得、この異種ポリペプチドは、採取、精製及び／又は単離されて、スクロースからのフルクトースとグルコースとの生体外生産に使用され得る。
本開示による改変細胞は、フルクトース及びグルコースを生産するために使用され得る。
本開示による改変細胞は、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産のために使用され得る。
本発明は、生合成生産で使用するための、スクロースをグルコースとフルクトースとに加水分解することができるインベルターゼであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体であるインベルターゼにも関する。さらに、インベルターゼは、生合成生産で使用される細胞の細胞周辺腔内及び／又は細胞外側で非リン酸化スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる。したがって、本発明のインベルターゼは、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産でも使用され得る。
したがって、本開示は、１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法であって、（ａ）本開示による遺伝子改変細胞を提供するステップと、ｂ）炭素源の１つとして、又は主要な炭素源として、又は唯一の炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培地中で（ａ）の細胞を培養するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で生産されたＨＭＯを採取するステップとを含む方法にさらに関する。
本開示の枠組みで説明されるように、単一の異種酵素を発現することのみにより、エネルギー源及び炭素源としてスクロースを利用することができる遺伝子改変細胞である。このような異種酵素の考えられる局在は、細胞外部（１）、ペリプラズム（２）又は細胞質（３）の数字によって示される。 主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするタンパク質を発現する又は発現しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のスクロース上でのバッチ増殖プロファイルである。ＳｃｒＹＡ－ＳｃｒＢＲ：国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレットに記載のスクロース利用技術、ＳａｃＣ＿Ｍｓｕｃ＆ＳａｃＡ＿Ｂｓｕｃ：国際公開第２００９／０７８６８７Ａ２号パンフレットに記載のスクロース加水分解のために使用される酵素、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ＆Ｂｆｆ：本開示に記載のスクロース利用のための酵素。 酵素ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ又はスクロース利用系ＳｃｒＢＲＹＡを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のスクロース上でのバッチ増殖プロファイルである。ＳｃｒＹＡ－ＳｃｒＢＲ：国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレットに記載のスクロース利用技術、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ（×１、×２、×３）：本開示に記載のスクロース利用のための酵素。異なる株におけるＳａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のコピー数が括弧内に示されており；×１は、１つのＳａｃＣ＿Ａｇａｌコピーを、×２は、２つのＳａｃＣ＿Ａｇａｌコピーを、×３は、３つのＳａｃＣ＿Ａｇａｌコピーを示す。 炭素源及び／若しくはエネルギー源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一の炭素源及び／若しくはエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするタンパク質を発現する株又は発現しない株のバッチ式培養におけるスクロース上での相対増殖速度である。ＳｃｒＹＡ－ＳｃｒＢＲ：国際公開第２０１５１９７０８２号パンフレットに記載のスクロース利用技術、ＳａｃＣ＿Ｍｓｕｃ＆ＳａｃＡ＿Ｂｓｕｂ：国際公開第２００９０７８６８７Ａ２号パンフレットに記載のスクロース加水分解のために使用される酵素、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ：本開示に記載のスクロース利用のための酵素。異なる株におけるＳａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のコピー数が括弧内に示されており；×１は、１つのＳａｃＣ＿Ａｇａｌコピーを、×２は、２つのＳａｃＣ＿Ａｇａｌコピーを、×３は、３つのＳａｃＣ＿Ａｇａｌコピーを示す。 酵素又はスクロース利用系ＳｃｒＢＲＹＡ（ＭＰ２）を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（最大発現量を１００％に設定）と比較した、ＰｌｇｐＦプロモーター制御下（ＭＰ９及びＭＰ１０）又はＰｓｃｒプロモーター制御下（ＭＰ１１及びＭＰ１２）でＳａｃＣ＿Ａｇａｌを２コピー発現する大腸菌細胞のＬＮｎＴ相対産生量である。さらに、ＭＰ１０及びＭＰ１２は、ｐｔｓＧ遺伝子の欠失がある。 スクロース上でのＭＰ１３、ＭＰ１４及びＭＰ１５株の増殖である。主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするタンパク質を発現する又は発現しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のスクロース上でのバッチ増殖プロファイルである。ＭＰ１３株は、スクロースを利用できないが、ＭＰ１４株及びＭＰ１５株は、それぞれ１つ又は２つのＰｇｌｐＦ駆動型ゲノムコピーから細胞外スクロースヒドロラーゼＳａｃＣ＿Ａｇａｌを発現する。
［詳細な説明］
本開示は、微生物の生合成プロセスにおいて、炭素源及び／若しくはエネルギー源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一の炭素源及び／若しくはエネルギー源としてスクロースを使用する新しい手段を提供する。例えば、スクロース上で生存し、増殖し得る非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＳｕｃ＋株を作り出そうとする以前の試みは、一般にＳｕｃ－株よりも生産性が低いか、又はいくつかの異種遺伝子を含む完全なシステムを宿主細胞に導入する必要があった。
本開示は、非スクロース利用性（Ｓｕｃ－）細胞又は非効率的スクロース利用性細胞の遺伝子改変を初めて開示し、これにより単一の異種ポリペプチドの発現後に細胞がエネルギー源及び／又は炭素源としてスクロースを効率的に利用できるようにする。単一の異種ポリペプチドは、発現時に細胞ゾルから細胞外腔及び／又は細胞質ゾル及び／又はペリプラズム膜に移行し、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる。したがって、本開示は、改変前に非スクロース利用性（Ｓｕｃ－）であったか、又は改変前にスクロースを限定的にのみ利用でき、且つ／若しくは非効率的にのみ利用できた遺伝子改変細胞を初めて開示するが、遺伝子改変細胞は、単一の異種ポリペプチドの発現後、エネルギー源及び／又は炭素源としてスクロースを利用できるようになり、異種ポリペプチドは、発現時、細胞ゾルから細胞外腔並びに／又は細胞質ゾル及び／若しくはペリプラズム膜に移行し、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる。
本発明の一態様は、異種ポリペプチド酵素、好ましくはインベルターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞に関し、インベルターゼは、発現時、それ自体、十分な量で細胞外、ペリプラズム内に位置し、且つ／又は膜結合型若しくは膜包埋型になり、前記異種ポリペプチド酵素は、遺伝子改変細胞の細胞外側及び／又はペリプラズムでスクロースとフルクトースとグルコースとに加水分解することができ、さらに前記異種ポリペプチド酵素の発現は、前記遺伝子改変細胞の炭素源及び／又はエネルギー源として、スクロースを利用できるようにするのに十分である。好ましい実施形態では、異種ポリペプチド酵素は、遺伝子改変細胞の細胞外及び／又はペリプラズム内に位置する。
その点において、本発明は、インベルターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞にも関し、前記インベルターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
それ自体、遺伝子改変された以前の（Ｓｕｃ－）細胞又はスクロースを限定的にのみ利用できた細胞が、炭素源及び／若しくはエネルギー源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一の炭素源及び／若しくはエネルギー源としてスクロースを利用できるようにし、すなわちトランスポーター、ポリン、パーミアーゼ、キナーゼ及び／又はホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）など、スクロース利用を補助する他の異種ポリペプチドの細胞内への導入を必要としない、スクロースを加水分解することができる新しい効率的なポリペプチドの同定は、大規模な生合成生産プロセスにおいて、スクロースの費用対効果の高い使用ができるようになるため、非常に有利である。炭素源としてスクロースを使用する利点は、例えば、低コストであることである。さらに、炭素源としてグルコースを使用する場合に問題となり得るグルコース分解産物が回避される一方、炭素源としてスクロースを使用する場合にはスクロースベースの不純物は、ほとんど観察されない。スクロースは、タンパク質がその二次構造を保持し、有害な外部要因から保護できるようにするなど、追加の利点も有し得る。
ｓｕｃ－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株をｓｕｃ＋株に変換する以前の努力では、例えば、ＰＴＳ系のような完全スクロース利用カセット系と称されるいくつかの異種遺伝子を組み込む必要があり、これらの組み合わせにより、遺伝子改変細胞が、唯一の炭素源及び／又は唯一のエネルギー源としてスクロースを利用できるようになる。これらの系は、典型的には、１つ又は複数のポリン、１つ又は複数のパーミアーゼ及び１つ又は複数のホスホグリコシルヒドロラーゼの組み込みを含む。ポリンとトランスポーターとは、スクロースの細胞膜を越える能動輸送を促進し、スクロースは、細胞質ゾルに入ると、スクロース－６－Ｐヒドロラーゼによって認識されるようにリン酸化（６－Ｐ－スクロース）を受け、これによりスクロース－６－Ｐのグルコース－６－Ｐ及びフルクトースへの加水分解が促進され、したがってグルコース－６－Ｐが中心的な炭素代謝に組み込まれるようになる。したがって、これらの系は、複数の異種遺伝子の組み込みを必要とし、異種トランスポーターを介した細胞ゾルへのスクロースの能動輸送と、スクロース－６－Ｐを加水分解することができる特定のグリコシド加水分解酵素によって認識されるスクロースのリン酸化とに依存する。
［スクロースの利用］
本開示は、天然には関連遺伝子を含有しない宿主生物に、スクロースを利用する新たな能力を提供するか、又は既存であるが、非効率なスクロース利用能力を増強するための簡単で効率的な手段に関する。
したがって、開示された本発明の遺伝子改変細胞は、細胞の細胞質ゾルの外側でスクロースを加水分解することができる異種ポリペプチド（酵素）をコードする単一遺伝子を備え、それによりスクロースを細胞の細胞質ゾルに輸送することなく、炭素源として且つエネルギー源としてスクロースを異化利用する能力を細胞に提供する。
細胞がスクロースを利用できるようにする遺伝子は、異種遺伝子（すなわち異なる生物に由来し、従来の組換えＤＮＡ操作技術によって遺伝子改変された細胞に移入されたもの）である。
本発明の一実施形態では、細胞によって発現されるスクロースを加水分解することができる酵素は、細胞のペリプラズム内又は細胞外腔内に位置する。
典型的には、Ｓｕｃ＋微生物によって２種類のスクロース異化作用が利用される。ホスホエノールピルビン酸糖ホスホトランスフェラーゼ（ＰＥＰ－ＰＴＳ）系及び非ＰＴＳ系である。ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）依存性ホスホトランスフェラーゼ系（「ＰＴＳ」）では、スクロースは、スクロース特異的ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼを介して細胞膜を越えて輸送されるが、非ＰＴＳ系では、スクロースは、スクロースパーミアーゼによって取り込まれる。同時進行で、スクロースは、次に、細胞質ゾル内でリン酸化されて細胞内スクロース－６－リン酸が生成し、これは、グルコース－６－リン酸とフルクトースとに加水分解され、これらは、次に、細胞の中心的な炭素代謝に向けられる。
しかしながら、本発明は、インベルターゼ又はスクロース－６－リン酸ヒドロラーゼの使用に関するものであり、これらは、発現時、細胞質ゾルから細胞質膜、ペリプラズム膜及び／又は細胞外腔に移行して、スクロースを細胞質ゾルに輸送する必要なく、細胞が炭素源及びエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。インベルターゼ自体は、加水分解前にスクロースがリン酸化されることも必要としない。
したがって、本発明は、細胞質、ペリプラズム又は細胞外培地において、宿主細胞のスクロースの新規の又は少なくとも改善されたスクロース加水分解を促進し、それによりグルコース及びフルクトースの形態で炭素源及びエネルギー源を細胞に提供する。
スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができるスクロース加水分解酵素を、スクロースを取り込むことができない遺伝子改変細胞の細胞外側又はペリプラズム内で使用することの利点は、大規模な流加プロセス及び連続プロセスで出現する高濃度の糖を含む局所的勾配（Ｌａｒａ ｅｔ ａｌ ２００６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：ｐ３５５－３８１）が、生産細胞には即座に利用できないことである。
代わりに、スクロースは、勾配内に存在する加水分解酵素のごく一部によってのみ作用されるため、スクロースは、非常に低い速度で加水分解される。続いて、これにより、スクロースが発酵容器内でより均等に分布し、移出された加水分解酵素のより大きい割合に曝されるまでスクロースの加水分解が延期される。スクロースからのグルコーストフルクトースの放出が遅延すると、代謝的に利用可能な糖の勾配が減少又は消失し、したがって細胞内のオーバーフロー代謝が減少又は消失する。大規模発酵において、供給物の混合不足により炭素源の勾配が現れた場合に誘発されるオーバーフロー代謝は、酢酸などの代謝産物の形成及び維持エネルギー必要量の増加につながり、それは次に細胞増殖及び生成物収量に影響を及ぼす。したがって、本発明のスクロース加水分解酵素の使用は、大規模発酵においてより安定した生産宿主及びより高い生成物収量をもたらし得る。
本発明は、例えば、天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴＳ系のグルコース特異的ＥＩＩＣＢ構成要素をコードするｐｔｓＧなどのグルコーストランスポーター遺伝子を欠失させることなど、細胞外で形成されたグルコースの細胞への取り込み速度を低下させることにより、これがなおさらに改善され得ることを示している。理論により拘束されることなく、ｐｔｓＧの欠失は、細胞によるグルコース取り込み速度を低下させ、それにより細胞内のグルコース－６－リン酸の形成速度を制限し、したがってオーバーフロー代謝をさらに低下させると考えられる。
実施例は、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる単一ポリペプチドを、遺伝子改変細胞の細胞外側又はペリプラズム内で使用するという、本明細書で初めて開示されたアプローチが、先行技術に記載されているＰＥＰ－ＰＴＳ系の使用よりも優れていることを明確に示している。
［唯一の炭素源として］
本発明の遺伝子改変細胞は、唯一の炭素源としてスクロースを利用し得るため、それにより発酵プロセスにおける他の糖の添加に依存しない。代わりに、細胞は、スクロースの加水分解から生じるフルクトースとグルコースを炭素源として利用し得る。
［細胞外、ペリプラズム及び／又は膜結合型若しくは膜包埋型異種ポリペプチド。］
本発明の実施において、スクロースを加水分解することができる異種ポリペプチドをコードする異種核酸は、本発明の遺伝子改変細胞における主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする機能が保持される限り、細胞質ゾル、ペリプラズム及び／又は細胞外で発現し得る。異種ポリペプチドの機能は、スクロースを加水分解することであり、それがインベルターゼである場合、非リン酸化スクロースを加水分解する。異種ポリペプチドが発現すると、それは、細胞外培地に移行するが、このプロセスでそのスクロース加水分解機能も発揮され得、したがって細胞質ゾル内及び／又はペリプラズム内のスクロースを少なくともある程度加水分解する。活性ポリペプチドが細胞のペリプラズム又は細胞外側に移出される前に、スクロースの細胞質ゾルへの受動的輸送が起こる場合、細胞質ゾルにおけるスクロースの加水分解は、限定的な範囲で起き得る。
本開示に従って膜に移行すると、酵素は、前記膜に埋め込まれ、且つ／又は膜に付着する。酵素は、膜を貫通するか（膜貫通型）、又は膜の片側若しくは反対側に結合し得る（内在性モノトピック）。酵素は、細胞膜と一体的に、末梢的に又は一過性に会合し得る。
本発明の別の実施形態では、スクロースを加水分解することができる酵素は、可溶性であり（すなわち膜結合していない）、細胞のペリプラズム内又は細胞外腔内に位置する。
これに関連して、膜は、ペリプラズム膜及び／又は細胞質膜である。
一実施形態では、本発明の異種ポリペプチドは、原形質膜、ペリプラズム及び／又は細胞質膜である膜に埋め込まれ、且つ／又はそれに付着される。一実施形態では、膜は、原形質膜であり、酵素は、膜のペリプラズム側、細胞外側及び／又はサイトゾル側のいずれかに固定され、埋め込まれ、且つ／又は付着される。
本開示に関連して、膜は、ポリペプチドがその機能を発揮できるようにポリペプチドが埋め込まれ、且つ／又は付着している膜である限り、細胞質ゾル膜／内膜及び／又はペリプラズム膜／外膜であり得る。異種ポリペプチドが遺伝子改変細胞の細胞ゾル質／内膜に結合している場合、それは、好ましくは、細胞周辺腔に面する側である。
［「スクロース利用系をコードしない」という用語。］
上で説明したように、主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用は、４つの異なる酵素の相互作用を必要とする多成分系であるホスホエノールピルビン酸依存性糖ホスホトランスフェラーゼ（ＰＥＰ－ＰＴＳ）系の発現によって得ることができる。一例は、ｓｃｒ ＰＥＰ－ＰＴＳ系（国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレット）であり、ここでは遺伝子ｓｃｒＡがスクロース輸送タンパク質酵素ＩＩＳｃｒをコードし、それは、細胞膜を介した能動輸送及びそれに伴うリン酸化により、細胞外のスクロースから細胞内のスクロース－６－リン酸を供給する。スクロース特異的ＳｃｒＹポリン（ｓｃｒＹによってコードされる）は、外膜を介したスクロースの拡散を促進する。ＳｃｒＢインベルターゼ酵素（ｓｃｒＢによってコードされる）は、加水分解によって蓄積されたスクロース－６－リン酸をグルコース－６－リン酸とフルクトースに分割する。抑制因子タンパク質（ｓｃｒＢによってコードされる）はｓｃｒＹＡＢ遺伝子の発現を負に制御し、スクロース若しくはフルクトース又はスクロースパーミアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロースヒドロラーゼ及び転写抑制因子の遺伝子（それぞれ遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲ）を含む、国際公開第２０１４／０６７６９６号パンフレットに記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｃｓｃ ＰＥＰ－ＰＴＳ系によって誘導される。しかしながら、ＰＥＰ－ＰＴＳ系は、複数の遺伝子の挿入前にはスクロースを利用できなかったか、又は少なくとも効率的にスクロースを利用できず、すなわち、主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてスクロースを利用できなかった細胞は、それを利用できるようにするために、すなわち主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするために、複数の異なる異種ポリペプチドの発現を必要とするため、それは、本発明の範囲内ではない。したがって、本発明は、異種核酸配列が完全なスクロース利用系をコードしない、すなわち細胞がｓｃｒＹＡＢＲ（配列番号６５～６８など）又はｃｓｃＢＫＡＲをコードしない、上記のような遺伝子改変細胞に関する。
したがって、一実施形態では、本発明は、上記のような遺伝子改変細胞に関し、遺伝子改変細胞は、ポリン、スクロース輸送体及び非リン酸化スクロースを加水分解することができないインベルターゼを含む完全な多成分スクロース利用系を発現しない。さらなる実施形態では、本発明は、上記のような遺伝子改変細胞に関し、遺伝子改変細胞は、ポリン、スクロース輸送体及び非リン酸化スクロースを加水分解することができないインベルターゼを含むスクロース利用系を含む１つ又は複数の異種核酸配列を含まない。
本発明の一実施形態では、スクロースを加水分解することができる酵素は、ｓｃｒＢ（配列番号６７など）又はｃｓｃＡではない。
［異種ポリペプチド］
実験セクションで実証されるように、本開示は、それ自体、以前の（Ｓｕｃ－）又はスクロースを限定的又は非効率的にのみ利用できた遺伝子改変宿主細胞において、主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてスクロースを利用できるようにし、すなわち、限定されないが、完全スクロース利用カセットなどの異種完全スクロース利用系を宿主細胞に導入する必要がない異種起源のポリペプチドを同定する。
したがって、本発明の異種ポリペプチドは、それ自体、スクロースを加水分解することができる酵素に関する。特に、本発明の異種ポリペプチドは、非リン酸化スクロースを加水分解することができる酵素に関する。
典型的には、前記酵素は、インベルターゼである。特に、前記酵素は、細胞内、ペリプラズム及び細胞外でその機能を発揮できるインベルターゼである。特に、ここでも、本明細書に記載の異種ポリペプチドは、発現時に細胞質ゾルから細胞外腔並びに／又は細胞質ゾル及び／若しくはペリプラズム膜に移行し、非リン酸化ポリペプチドなどのスクロースを細胞の外側又は細胞周辺腔内でフルクトースとグルコースとに加水分解することができるインベルターゼに関する。
本発明に関連して、インベルターゼという用語は、酵素エントリーＥＣ３．２．１．２６に記載されているように、スクロース中のβ－Ｄ－フルクトフラノシド残基など、β－Ｄ－フルクトフラノシド中の末端の非還元性β－Ｄ－フルクトフラノシド残基を加水分解することができる酵素に関する。
本発明の一実施形態では、インベルターゼは、非リン酸化スクロースの加水分解に有利に機能する。
本発明の別の実施形態では、前記酵素は、ＥＣ３．１．Ｂ３として分類されるスクロース－６－リン酸ヒドロラーゼであり、本開示によれば、これは、驚くべきことに、非リン酸化スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解するインベルターゼとして機能し得る。代わりに、前記酵素は、細胞外スクロース－６－リン酸加水分解酵素として機能する。
それにより、本開示の異種ポリペプチドは、宿主細胞の細胞外及び／またペリプラズム内でスクロースからのグルコースとフルクトースの生成を触媒することにより、主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。
本開示は、これまでエネルギー源及び／又は炭素源としてスクロースを利用できなかったか又は非効率的にのみ利用できた細胞において、エネルギー源及び／又は炭素源としてのスクロースの利用を可能にする２つの例示的な異種ポリペプチド配列を開示する。実験セクションで実証されるように、これは、エネルギー源及び／又は炭素源としてスクロース利用を促進することを意図するさらなる遺伝子改変を行わずに達成される。
現在好ましい実施形態では、異種ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ）を有するアビバクテリウム・ガリナルム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）由来のグリコシドヒドロラーゼファミリー３２（ＧＨ３２）タンパク質又は配列番号１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
別の現在好ましい実施形態では、異種ポリペプチドは、配列番号２（Ｂｆｆ）に示されるアルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ ３０６２由来のβーフルクトフラノシダーゼタンパク質又は配列番号２と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％若しくは例えば少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ］
記載されているように本発明を実施できる、現在同定されている異種ポリペプチドは、本明細書では「ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ」及び「Ｂｆｆ」として同定される。
本明細書で配列番号１に示されるＳａｃＣ＿ＡｇａＩと称されるポリペプチドは、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿１０３８５３２１０．１と１００％同一であり、グリコシドヒドロラーゼ及びスクロース－６－リン酸ヒドロラーゼとして特徴付けられ、本開示によれば、未修飾スクロースを加水分解するインベルターゼとして機能できる。
本明細書で配列番号２に示されるＢｆｆと称されるポリペプチドは、ＧｅｎｅＢａｎｋ ＩＤ：ＢＡＤ１８１２１．１と１００％同一であり、β－フルクトフラノシダーゼタンパク質として分類され、本開示の実施例１に示されるように、本開示の遺伝子改変細胞の主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。
したがって、現在好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２及び配列番号１又は２のいずれか１つと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有する配列番号１又は２のいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される異種ポリペプチドを発現する遺伝子改変細胞に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞に関し、コードされたポリペプチドは、配列番号１［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ］に示されるアビバクテリウム・ガリナルム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）由来のグリコシドヒドロラーゼファミリー３２タンパク質又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
なおも別の好ましい実施形態では、本発明は、異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞に関し、コードされたポリペプチドは、配列番号２［Ｂｆｆ］に示されるアルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ ３０６２由来のβ－フルクトフラノシダーゼタンパク質又は配列番号２と少なくとも８０％、などの少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
［機能的相同体］
配列番号１に示されるポリペプチドＳａｃＣ＿ＡｇａＩ又は配列番号２に示されるポリペプチドＢｆｆの機能的相同体は、例えば、変異誘発によって得ることができる。機能的相同体は、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能と比較して少なくとも５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％などの残存機能を有する必要がある。機能的相同体は、配列番号１及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能と比較してより高い機能を有し得る。配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的相同体は、遺伝子改変細胞の炭素源及びエネルギー源として、主要な及び／又は唯一の炭素源として、主要な及び／又は唯一のエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするはずである。
実験セクションで実証されるように、機能性は、本開示による異種ポリペプチドを、スクロース上で増殖できない宿主細胞、すなわち（Ｓｕｃ－）株に導入し、その後、例えば、限定されないが、主要な又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源として、例えば１５ｇ／Ｌのスクロースを含有する培地中で２８℃において、遺伝子改変株をバッチ式で選択された培養条件下において増殖させることによって容易に試験される。
（Ｓｕｃ－）株が、当業者には知られていないが、完全なスクロース利用カセット系の又はさらなる異種ポリペプチドと組み合わされて遺伝子改変細胞が主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするＰＥＰ－ＰＴＳ系の一部ではあるが十分ではないいくつかの異種遺伝子を既に含む可能性を排除するために、簡単なＰＣＲを実施して、このような構成要素が同定され得る。
［異種融合ポリペプチド］
本発明の異種ポリペプチドは、２つ以上の異種ポリペプチドを組換えた異種融合ポリペプチドでもあり得、例えば、ポリペプチドの一部は、膜貫通型ポ又は膜包埋型ポリペプチドであり、組換えポリペプチドの第２の部分は、上記のように、例えばＢｆｆ又はＳａｃＣ＿ＡｇａＩなど、スクロースを加水分解することができる異種ポリペプチドである。したがって、一実施形態では、本発明のインベルターゼは、融合ポリペプチドに組換えられ、１つの断片は、融合ポリペプチドを特定の細胞膜に誘導、及び／又は固定、及び／又は挿入する。本発明によれば、膜は、ペリプラズム膜及び／又はサイトゾル膜であり得る。
異種ポリペプチドが融合ポリペプチドの一部である実施形態では、融合ポリペプチドの他の部分は、異種ポリペプチド自体の一部ではないため、本明細書に記載のアミノ酸配列同一性を判定する際にはカウントされない。
［シグナルペプチド］
本開示による組換え融合ポリペプチドは、例えば、細胞質ゾル内の発現後、宿主細胞に酵素の移動を促すように機能し得る酵素及びシグナルペプチドを含み得る。一般に、シグナルペプチドは、発現したポリペプチドを特定の細胞内区画及び／若しくは細胞小器官又はペリプラズムに誘導し得るか、又は細胞排泄のためのシグナルを送り得る。これに関連して、シグナルペプチドは、好ましくは、発現したポリペプチドを原形質膜、ペリプラズム膜、ペリプラズム又は細胞排泄に誘導する。
シグナルペプチドは、典型的には、１６～３０アミノ酸長であり、新たに合成されたポリペプチドのＮ末端に存在する。本発明の核酸コンストラクトに関して、シグナルペプチドは、本発明によるポリペプチドをコードする異種核酸配列に作動可能に連結され得る核酸配列によってコードされる。シグナルペプチドは、３０を超えるアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドタグでもあり得る。
シグナルペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドの分泌を促進するポリペプチドタグなど、本発明のポリペプチドの分泌を選択的に促進し、すなわちＢｆｆ及び／又はＳａｃＣ＿ＡｇａＩの分泌を促進するポリペプチドタグとして作用する。
コードされたポリペプチドがスクロースの加水分解を可能にする本発明に関連して、スクロースは、外部から細胞内に非常に低い程度にのみ浸透できるため、炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの細胞利用は、促進されないか又は少なくとも非常に限られていることから、ペリプラズム又は細胞外腔へのポリペプチドの分泌が有利である。
シグナルペプチドは、典型的には、以下の表１に列挙されるシグナル配列からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
Figure 2024516207000002
一実施形態では、異種ポリペプチドは、シグナル配列を含む融合ポリペプチドの一部であり、シグナル配列は、それ自体、異種ポリペプチドの一部ではないため、本明細書に記載のアミノ酸配列同一性を判定する際にカウントされない。
好ましい実施形態では、本発明の異種酵素（ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ又はＢｆｆなど）をコードする異種核酸配列は、配列番号２８のシグナルペプチド、好ましくは本発明の異種酵素のＮ末端もコードし、代わりに本発明の異種酵素のＣ末端をコードする。
［核酸コンストラクト］
本発明の異種ポリペプチドは、個々の異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトから発現される。本発明の核酸コンストラクトは、例えば、ポリペプチドの適切な発現レベルを確実にする調節配列など、さらなるエレメント並びに本発明の発現ポリペプチドの転移並びに／又は適切な選別及び／若しくは分泌を確実にする１つ又は複数のシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み得る。したがって、本発明は、（Ｓｕｃ－）宿主細胞又はスクロースを非効率的にのみ利用できる宿主細胞に挿入されると、前記遺伝子改変細胞が主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする核酸コンストラクトにも関する。
本開示による核酸コンストラクトは、ベクターＤＮＡの一部であり得る。別の実施形態では、核酸コンストラクトは、宿主細胞のゲノムに統合された発現カセット／カートリッジである。したがって、本明細書における「核酸コンテクスト」という用語は、人工的に構築された核酸のセグメント、特に例えば微生物細胞などの宿主細胞に導入されることが意図される核酸セグメントを意味する。本発明に関連して、核酸コンストラクトは、異種ポリペプチドをコードする組換え及び／又は異種核酸配列を含む。
典型的には、組換え及び／又は異種核酸配列は、例えば、スクロース加水分解酵素をコードする１つ又は複数のコード核酸配列などのプロモーター核酸配列及び目的の遺伝子などであるが、これらに限定されない、調節核酸配列を含む１つ又は複数の非コーディング核酸配列を本質的に含み、これは、（Ｓｕｃ－）宿主細胞又はスクロースを非効率的にのみ利用できる宿主細胞に挿入されると、前記遺伝子改変細胞が主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源として、好ましくは主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。
さらに、組換え及び／又は異種核酸配列は、遺伝子改変細胞における母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の生産に有用である、例えば、限定されないが、例えばグリコシルトランスフェラーゼをコードする配列など、非コード配列及び／又はコード配列をさらに含み得る。代わりに、遺伝子改変細胞におけるＨＭＯの生産に有用な前記非コード配列及び／又はコード配列は、別の核酸配列によって宿主細胞に導入され得、且つ／又は導入されていることができる。一実施形態では、遺伝子改変細胞は、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を有する酵素の群から選択される少なくとも１つの組換えグリコシルトランスフェラーゼを含む。ＨＭＯの生産に適したグリコシルトランスフェラーゼは、以下の「１つ又は複数のＨＭＯの生合成生成における機能的酵素」のセクションに記載されている。
本発明に関して、「異種」という用語は、細胞又は生物にとって外来性のポリペプチド、アミノ酸配列、核酸分子、核酸配列又はヌクレオチド配列、すなわち前記細胞又は生物に天然には存在しないポリペプチド、アミノ酸配列、核酸酸分子、核酸配列又はヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「異種配列」又は「異種核酸」又は「異種ポリペプチド」は、本明細書の用法では、特定の宿主細胞にとって外来性の供給源（例えば、異なる個体、株又は種から）に由来するもの又は同じ供給源に由来する場合、その元の形態から改変されているものである。したがって、プロモーターに作動可能に連結される異種核酸は、プロモーターが由来したものと異なる供給源に由来するか又は同じ供給源に由来する場合、その元の形態から改変されている。異種配列は、例えば、形質移入、形質転換、接合又は形質導入により、微生物宿主細胞のゲノムに安定に導入され得、それにより宿主細胞を遺伝子改変宿主細胞にする。宿主細胞並びに導入される配列に依存する技術が適用され得る。様々な技術が当業者に知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａ／．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に開示されている。
その点において、本開示による核酸コンストラクトは、現在好ましい実施形態では、
ａ）発現時、細胞外、ペリプラズムに位置し、且つ／又は膜結合型若しくは膜包埋型になり、スクロースをフルクトース及びグルコースに加水分解することができる異種ポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｂ）前記核酸配列の発現を調節できる調節エレメントを含む核酸配列と、任意選択的に、
ｃ）遺伝子改変細胞のペリプラズム及び／又は発酵培地への前記ポリペプチドの連続分泌ができるようにするシグナルペプチドをコードする核酸配列と
を含む核酸コンストラクトであり、前記ポリペプチドの発現は、遺伝子改変細胞の主要な及び／若しくは唯一の炭素として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。
一実施形態では、本開示による核酸コンストラクトは、配列番号１に示される異種ポリペプチドをコードする核酸配列又は配列番号１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含む。別の実施形態では、本開示の核酸コンストラクトは、配列番号２に示される異種ポリペプチドをコードする核酸配列又は配列番号２と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を含む。
好ましい実施形態では、本発明による核酸コンストラクトは、
ａ）インベルターゼをコードする核酸配列と、
ｂ）前記核酸配列の発現を調節できる調節エレメントを含む核酸配列と、任意選択的に、
ｃ）遺伝子改変細胞のペリプラズム及び／又は発酵培地への前記ポリペプチドの連続分泌ができるようにするシグナルペプチドをコードする核酸配列と
を含み、前記インベルターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。
一実施形態では、ｂ）の調節エレメントは、プロモーター配列である。
現在好ましい実施形態では、本発明による核酸コンストラクトは、
ａ）インベルターゼをコードする核酸配列と、
ｂ）前記核酸配列の発現を調節できる調節エレメントを含む核酸配列と、任意選択的に、
ｃ）シグナルペプチドをコードする核酸配列と
を含み、前記インベルターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体であり、調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）、若しくはＰｌａｃ（配列番号５１）、若しくはＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号３８）、若しくはＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号３９）、若しくはＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号４０）又は表６で同定されるこれらのプロモーターの変異型からなる群から選択されるプロモーターであり、シグナルペプチドは、表１から選択され、好ましくは配列番号２８のシグナルペプチドである。
別の好ましい実施形態では、本発明による核酸コンストラクトは、
ａ）インベルターゼをコードする核酸配列であって、前記インベルターゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＢｆｆであるか、又は配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、核酸配列と、
ｂ）前記核酸配列の発現を調節できる調節エレメントを含む核酸配列であって、調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）、若しくはＰｌａｃ（配列番号５１）、若しくはＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号３８）、若しくはＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号３９）、若しくはＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号４０）又は表６で同定されるこれらのプロモーターの変異型からなる群から選択されるプロモーターである、核酸配列と、任意選択的に、
ｃ）シグナルペプチドをコードする核酸配列であって、シグナルペプチドは、表１から選択され、好ましくは配列番号２８のシグナルペプチドである、核酸配列と
を含む。
さらに、本発明の核酸コンストラクトは、遺伝子改変細胞のゲノムに統合され得るか、又は細菌プラスミド、人工染色体、ファージミド及び／又は別のウイルスベクターなどの発現ベクターに含まれ得る。
本明細書の用法では、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、特に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で核酸とハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、その相補的配列を含む。
［それ自体でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる酵素をコードする異種核酸配列］
一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、配列番号１［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ］に示されるアビバクテリウム・ガリナルム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）由来のグリコシドヒドロラーゼファミリー３２タンパク質であるポリペプチド又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体をコードする。したがって、核酸コンストラクトは、配列番号３［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ］の核酸配列又は配列番号３［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ］と少なくとも７０％、例えば配列番号３［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ］と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。
一実施形態では、配列番号１［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ］のポリペプチドをコードする核酸配列又は配列番号１［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ］と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体は、配列番号３［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ］の核酸配列である。
別の実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、コンストラクトであり、コードされたポリペプチドは、配列番号２［Ｂｆｆ］に示されるアルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ ３０６２由来のβ－フルクトフラノシダーゼタンパク質又は配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。したがって、核酸コンストラクトは、配列番号４［Ｂｆｆ］の核酸配列又は配列番号４［Ｂｆｆ］と少なくとも７０％、例えば配列番号４［Ｂｆｆ］と少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。一実施形態では、配列番号２［Ｂｆｆ］のポリペプチドをコードする核酸配列又は配列番号２［Ｂｆｆ］と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体は、配列番号４［Ｂｆｆ］の核酸配列である。
［配列同一性を判定する］
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列に関連して、「［特定の］％の配列同一性」という用語は、２つ以上の配列が比較ウインドウ又は核酸若しくはアミノ酸の指定配列全体にわたって比較され、最大の一致のためにアラインされたとき、所定の百分率で共通のヌクレオチド又はアミノ酸を有する（すなわち配列が少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）ことを意味する。核酸又はアミノ酸配列の同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎ又はＢＬＡＳＴｐ配列比較アルゴリズムをデフォルトパラメータで使用するか、又は手動アライメントと目視検査によって測定され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。この定義は、試験配列の相補体、並びに欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列にも適用される。同一性パーセントの判定及びアライメントに適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９（１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ２．２．２０＋は、本発明の核酸及び／又はアミノ酸の配列同一性パーセントを判定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。一般に使用される配列アライメントアルゴリズムは、
ＣＬＵＳＴＡＬＯｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、
ＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、
ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）、又は
ＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）
である。
好ましくは、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓＮｅｅｄｌｅ／で入手可能）のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して判定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＢＬＯＳＵＭ３０）置換マトリックスである。「最長同一性」及び標識Ｎｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得）は、パーセント同一性として使用され、以下のように計算される：（同一残基×１００）／（アライメント長さ－アライメント中のギャップ総数）。
本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムで実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前出）１０好ましくはバージョン５．０．０以降を使用して判定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、ＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。「最長同一性」と標識Ｎｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得）は、パーセント同一性として使用され、以下のように計算される：（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメント長さ－アライメント中のギャップ総数）。
［それ自体でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる酵素をコードする前記異種核酸配列の１つ又は複数のコピー］
本発明によるコンストラクトの単一コピーは、遺伝子改変細胞が主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするのに十分であり得、開示された本発明による他の所望の効果を達成するのに十分であり得る。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、異種核酸配列、調節エレメント及び／又はシグナルペプチドの１、２、３又はそれを超えるコピーを含む核酸コンストラクト及び／又は遺伝子改変細胞に関する。
いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトの単一コピーが好ましい。
このような実施形態では、本発明は、異種核酸配列がスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種ポリペプチドの単一コピーをコードする、本開示による遺伝子改変細胞に関する。
さらに、本発明者らは、実施例２から分かるように、遺伝子改変細胞が主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてスクロースを利用する能力に対する、調節エレメント及びポリペプチドＢｆｆ又はＳａｃＣ＿ＡｇａＩをコードする異種核酸配列を含むコンストラクトの１つ又は複数のコピーを含めることの効果を本明細書で開示する。
本発明の核酸コンストラクトは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の１つ又は複数のコピーを含み得；したがって、それは、１つ若しくは複数の調節エレメントの１つ若しくは複数のコピー及び／又は１つ若しくは複数のシグナルペプチドをコードする１つ若しくは複数の核酸配列も含み得る。
したがって、本発明の一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、前記異種核酸配列の１つ又は複数のコピーを含む核酸コンストラクトである。
２つ以上の異種核酸配列は、同一であるか又は異なり得る。
したがって、本発明の一実施形態では、遺伝子改変細胞は、例えば、ポリペプチドＢｆｆ又はＳａｃＣ＿ＡｇａＩをコードする異種核酸配列の２、３又は４つのゲノム統合コピーなど、ポリペプチドＢｆｆ又はＳａｃＣ＿ＡｇａＩをコードする異種核酸配列の少なくとも２つのコピーを含む。
遺伝子改変細胞が主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてスクロースを利用する能力を高める別の方法は、核酸配列を強力なプロモーターの制御下に置くことでもあり得る。
本発明の一実施形態では、ポリペプチドＢｆｆ又はＳａｃＣ＿ＡｇａＩをコードする核酸配列は、表６のＰｇｌｐＦプロモーターよりも例えば少なくとも５０％など、少なくとも２０％さらに強力なプロモーターの制御下にある。
好ましい実施形態では、ポリペプチドＢｆｆ又はＳａｃＣ＿ＡｇａＩをコードする核酸配列は、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ及びＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（表６に示される）からなる群から選択されるプロモーターの制御下にある。
本発明の核酸コンストラクトが２つ以上の調節エレメントを含む場合、調節エレメントは、本発明の１つ若しくは複数のポリペプチドをコードする異種核酸配列又は１つ若しくは複数のシグナルペプチドをコードする核酸配列と作動可能に連結されていても又はいなくてもよい。本発明の核酸コンストラクトが上記のような２つ以上の異種核酸配列を含む場合、本発明の核酸コンストラクトは、本発明の異種核酸配列に作動可能に連結されていても又はいなくてもよいシグナルペプチドをコードする１つ又は複数の核酸配列も含んでいても又はいなくてもよい。
その意味では、核酸コンストラクトは、配列が、調節エレメント、シグナルペプチドをコードする核酸配列及びポリペプチドをコードする異種核酸の配列に包含される様式で構築され得る。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、欠如していてもよいか、又はいずれかのエレメントのコピーがいくつか存在し得るか、又はそれらは、シャッフルされて異なる配列中に出現し得る。
本明細書で使用される「作動可能に連結される」という用語は、１つの核酸と第２の核酸配列との間の機能的連結を意味する。これは、例えば、第２の配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす調節エレメントを含む核酸配列であり得る。
［発現を調節するための調節エレメント］
本発明の核酸コンストラクトは、内因性若しくは異種及び／又は合成核酸配列の制御された過剰発現を可能にする調節エレメントを含み得る。「調節エレメント」という用語は、プロモーター配列、シグナル配列及び／又は転写因子結合部位のアレイを含み、これらの配列は、調節エレメントに作動可能に連結される核酸配列の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。
調節エレメントは、転写レベル及び転写後レベルで見られ、さらにそれらのレベルでの分子ネットワークを可能にする。例えば、転写後レベルでは、ｍＲＮＡの安定性、翻訳及び細胞内局在を制御する生化学的シグナルは、調節エレメントによってプロセスされる。ＲＮＡ結合タンパク質は、別のクラスの転写後調節エレメントであり、配列エレメント又は構造エレメントとしてさらに分類される。調節エレメントとして機能し得る特定の配列モチーフもｍＲＮＡ修飾に関連する。様々なＤＮＡ調節エレメントが遺伝子発現の調節に関与し、ＤＮＡ、クロマチンを構成する細胞タンパク質及び転写因子が関与する生化学的相互作用に依存している。
プロモーター及びエンハンサーは、遺伝子発現の主要なゲノム調節要素である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から１～２キロベース（ｋｂ）以内のＤＮＡ領域であり；それらは、ＲＮＡポリメラーゼ転写機構を組み立てるのに必要な短い調節エレメント（ＤＮＡモチーフ）を含有する。しかしながら、ＴＳＳのより遠位に位置するＤＮＡ調節エレメントの寄与がなければ、転写は、多くの場合、最小限に抑えられる。このような領域は、多くの場合、エンハンサーと称され、部位特異的転写因子と相互作用して細胞型の同一性を確立し、遺伝子発現を調節する、位置に依存しないＤＮＡ調節エレメントである。エンハンサーは、それらの配列状況とは無関係に、ルーピングとして知られるプロセスを通して、それらの標的遺伝子から数ｋｂ～数百ｋｂ離れたところで作用し得る。本開示に関連して、調節エレメントは、翻訳後調節因子であっても若しくはなくてもよいか、又はそれらは、翻訳調節因子であっても若しくはなくてもよい。
本発明の一実施形態では、調節エレメントは、本発明による異種核酸配列の発現を増強することができる１つ又は複数のエレメントを含む。
現在好ましい実施形態では、本発明の異種核酸の発現を調節できる調節エレメントは、プロモーター配列である。
［プロモーター配列］
「プロモーター」という用語は、通常、核酸コンストラクト中のポリペプチドをコードする異種核酸配列に先行し、ｍＲＮＡへの転写開始部位を提供する核酸配列を指す。「プロモーター」又は「コントロール」核酸配列と総称されるこれらの配列は、機能的核酸コンストラクトにおいて、ポリペプチドをコードする選択された異種核酸配列（又は一連の配列）に先行し、ポリペプチドをコードする異種核酸配列の転写（及び最終的な発現）が起こるかどうかを決定するために協力する。核酸コンストラクト中のポリペプチドをコードする異種核酸配列に「続く」、ｍＲＮＡへの転写を終了させるシグナルを提供する核酸配列は、転写「ターミネーター」配列と称される。
一般に、プロモーターは、同種、異種又は合成核酸配列からなり得、上記のような同一起源又は異なる起源の２つ以上の核酸配列を組換え、それにより同種、異種若しくは合成核酸プロモーター配列及び／又は同種、異種若しくは合成核酸調節エレメントを生成する組換え核酸配列であり得る。ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ、ＰｇｌｐＴ、ＰｇａｔＹ、Ｐｌａｃ及びＰｍｇｌＢプロモーター系に由来するプロモーター配列の幅広い選択は、国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレット及び国際公開第２０２０／２５５０５４号パンフレットに詳細に記載されており、その一部を表６に示す。
Figure 2024516207000003
プロモーターは、異種起源のものであり得、遺伝子改変細胞に天然のものであり得るか、又はそれは、異種及び／又は天然要素を組み合わせた組換えプロモーターであり得る。
生成物の生産を増加させる１つの方法は、グリコシルトランスフェラーゼ又はグリコシル供与体の生合成経路に関与する酵素など、生成物の生産に使用される所望の酵素活性の生産を調節することであり得る。
所望の酵素の発現を駆動するプロモーターの強度を高めることは、これを行う１つの方法であり得る。プロモーターの強度は、β－ガラクトシダーゼ活性が以前に記載されたように評価される、ｌａｃＺ酵素アッセイを用いてアッセイされ得る（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７２を参照されたい）。簡潔に述べると、細胞はＺ緩衝液中で希釈され、ドデシル硫酸ナトリウム（０．１％）とクロロホルムで透過処理される。ＬａｃＺアッセイは３０℃で行われる。サンプルは予熱され、２００μｌのオルト－ニトロ－フェニル－β－ガラクトシダーゼ（４ｍｇ／ｍｌ）の添加によってアッセイが開始され、サンプルがわずかに黄色になった時点で、５００μｌの１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３の添加によって停止される。その後、オルトニトロフェノールの放出が、４２０ｎｍでの光学濃度の変化として測定される。比活性は、ミラー単位（ＭＵ）［Ａ４２０／（ｍｉｎ＊ｍｌ＊Ａ６００）］で報告される。１０，０００ＭＵを超える活性を有する調節エレメントは強いと見なされ、３，０００ＭＵ未満の活性を有する調節エレメントは弱いと見なされ、その間のものは、中間の強度を有する。強力な調節エレメントの一例は、およそ１４，０００ＭＵの活性を有するＰｇｌｐＦプロモーターであり、弱いプロモーターの一例は、ＩＰＴＧによって誘導された場合におよそ２３００ＭＵの活性を有するＰｌａｃである。
したがって、本発明の一実施形態では、本発明は、１つ又は複数のプロモーター配列である１つ又は複数の調節エレメントを含む核酸コンストラクトに関する。好ましくは、表６のプロモーター配列である。本開示に照らして、プロモーターは、ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ又はＢｆｆの発現を促進する。
プロモーター配列は、構成的又は誘導的様式で、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進及び／又は増強することができる配列である。
本発明は、１つ又は複数のプロモーター配列が、１つ又は複数の誘導性プロモーター及び／又は１つ又は複数の構成的プロモーターである、上記のような核酸コンストラクトに関する。
［誘導性プロモーター］
本発明の一実施形態では、１つ又は複数のプロモーター配列は、１つ又は複数の誘導性プロモーターである。したがって、別の実施形態では、１つ又は複数のプロモーター配列は、１つ又は複数の構成的プロモーターである。
本発明の実施形態では、本発明の選択された核酸配列の発現は、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）、若しくはＰｌａｃ（配列番号５１）、若しくはＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号３８）、若しくはＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号３９）、若しくはＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号４０）、若しくはＰｇａｔＹ（配列番号４１）又は表６で定されるこれらのプロモーターの変異型の制御下にある。
特定のＰｇｌｐＦ変異型は、配列番号３６、４３、４４、４５、４７、４８、４９、５２又は５３からなる群から選択され得る。特定のＰｌａｃ変異型は、配列番号３２である。特定のＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ変異型は、配列番号２９、３０、３１、３３、３４、３５、３７又は４６からなる群から選択され得る。
ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲプロモーター配列のさらなる適切な変異型は、それぞれ国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレット及び国際公開第２０２０／２５５０５４号パンフレット（本明細書に参照により援用される）に記載されている。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、調節エレメントは、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、ｐｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿１６ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６ａｎｄＰｇｌｐＡ＿１６ＵＴＲ、Ｐｓｃｒからなる群から選択されるプロモーター配列など、高又は中程度の強度を有するプロモーターである。
言及される一実施形態では、プロモーターは、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、ｐｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８及びＰｍｇｌＢ＿１６ＵＴＲからなる群から選択される強力なプロモーターである。
別の実施形態では、プロモーターは、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６及びＰｇｌｐＡ＿１６ＵＴＲなどの中程度の強度を有するプロモーターからなる群から選択される。
別の実施形態では、プロモーターは、Ｐｌａｃ＿ｗｔ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１などの低い強度を有するプロモーターからなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、本発明は、調節エレメントを含む上記のような核酸コンストラクトに関し、調節エレメントは、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、Ｐｘｙｌ、Ｐｔｅｔ、ＰｓａｃＢ、ＰｘｙｌＡ、ＰｒｐＲ、ＰｎｉｔＡ、ＰＢＡＤ、ＰＴ７、Ｐｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ、ＰｎｉｓＡ及びＰｂからなる群から選択されるプロモーターである。プロモーターのグループは、網羅的なものではない。さらなる例は、例えば、Ｃａｒｒｏｌ ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ ２００５，ｐ．３０７７－３０８４などの従来技術に例示されている。
したがって、本発明の核酸コンストラクトは、本発明の異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含み得、それによりｐＨ、栄養素、糖関連、調節タンパク質、リン酸などのイオン、ＩＰＴＧ又は炭水化物などの有機化学物質、温度、ｐＨなどの物理的パラメータ、シグナル伝達分子、短い核酸、毒素関連又は同様の細胞内又は細胞外関連の合図などの特定の合図に応じて前記核酸配列の発現を増強する。
したがって、本発明の一実施形態では、本発明は、調節エレメントを含む上記のような核酸コンストラクトに関し、調節エレメントは、Ｐｓｃｒ及び／又はＰｓａｃＢなどであるが、これらに限定されないスクロース誘導性プロモーターである誘導性プロモーターを含む。
本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、調節エレメントを含む上記のような核酸コンストラクトに関し、調節エレメントは、誘導性プロモーターＰｓｃｒである。
本発明の別の実施形態では、本発明は、誘導性プロモーターを含む上記のような核酸コンストラクトに関し、誘導性プロモーターは、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）及び／又はＰｌａｃ（配列番号５１）である。本発明のさらに別の実施形態では、本発明は、誘導性プロモーターを含む上記のような核酸コンストラクトに関し、誘導性プロモーターは、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）である。
［構成的プロモーター］
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明は、調節エレメントを含む上記のような核酸コンストラクトに関し、調節エレメントは、構成的プロモーターを含む。
調節エレメントが構成的プロモーターを含む場合、すなわち本発明による異種ポリペプチドをコードする異種核酸の発現を構成的に促進する場合、構成的プロモーターは、強力な構成的プロモーター又は弱い構成的プロモーターであり得る。本開示の典型的な構成的プロモーターは、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２９２，１９－３７；Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｏｓｍＹ，ａ ｒｐｏＳ－ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＧｅｎｅ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｊａｎ．１９９４，ｐ．１００－１０７；及びＪｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８ Ｊａｎ；６４（１）：８２－７に記載されている。
その点において、本発明の好ましい実施形態では、本発明は、構成的プロモーターを含む、上記のような核酸コンストラクトに関し、構成的プロモーターは、ＣＰ６、ＰｏｓｍＹ、Ｐｓｐｃ、Ｐｂｌａ、Ｐｒｒｎ１及びＰｒｒｎ２からなる群から選択される。
［シグナルペプチド］
本発明の一実施形態では、核酸コンストラクトは、上記のようなシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本開示による核酸コンストラクトは、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含み、シグナルペプチドは、スクロースを加水分解することができるポリペプチドをコードする異種核酸の上流又は下流に配置される。好ましくは、シグナルペプチドは、表１から選択され、なおもより好ましくは、シグナルペプチドは、配列番号２８である。
［遺伝子改変細胞］
本開示は、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる酵素である、細胞外、ペリプラズム及び／又は膜結合型若しくは膜包埋型の異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞に関し、前記ポリペプチドの発現は、主要な及び／又は唯一の炭素源として且つ／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする。代わりに、前記遺伝子改変細胞の主要な及び／若しくは唯一の炭素として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源として或いは唯一の炭素源及び唯一のエネルギー源としてのものである。好ましくは、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種酵素は、非リン酸化スクロースなどの未修飾のスクロースを基質として使用し得る。
本発明の一態様は、遺伝子改変細胞の細胞外側においてそれ自体でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種酵素をコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞であり、前記酵素の発現は、前記遺伝子改変細胞の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするのに十分である。
本発明の一実施形態では、酵素は、細胞のペリプラズム内又は細胞外腔内に位置する。
一実施形態では、酵素は、原形質膜のペリプラズム側、細胞外側及び／又は細胞質側のいずれかに固定され、埋め込まれ、且つ／又は付着される。
別の実施形態では、酵素は、可溶性である。
上で論じたように、発酵プロセスにおける不均等なスクロース勾配は、遺伝子改変細胞の代謝ストレスをもたらすこともある。これを回避するために、内因性グルコース輸送系の一部が完全に又は部分的に不活性化され、培地からのグルコースの取り込みが遅くされ得る。
したがって、一実施形態では、遺伝子改変細胞の内因性グルコース輸送系は、完全に又は部分的に不活性化される。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は機能的ｐｔｓＧ遺伝子を含有せず、したがって天然大腸菌グルコースＰＴＳ系のグルコース特異的ＥＩＩＣＢ構成要素（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６９７８６）を産生しない。別の好ましい実施形態では、細胞膜グルコースパーミアーゼをコードするｐｔｓＧ遺伝子は、完全に又は部分的に不活性化される。非機能的ｐｔｓＧ遺伝子を有する細胞は、機能的ｐｔｓＧ遺伝子を有する細胞と比較して、グルコースの取り込みが減少しているか又は制限されている。ｐｔｓＧは、細胞から欠失され得、代わりに編集されてｐｔｓＧ遺伝子若しくは遺伝子産物の機能が失われるか、又は変異ｐｔｓＧ遺伝子によってコードされるポリペプチドの機能が消失され得る。このような遺伝子編集に適した方法は、当業者に周知である。
遺伝子改変細胞は、一般に、細胞の天然の（遺伝子操作されていない）形態では存在しない１つ又は複数の遺伝子を含有し得る。細胞の遺伝情報の核酸配列を挿入、欠失又は改変するために、外因性核酸分子／配列を導入する技術及び／又は外因性核酸分子／配列（組換え、異種）を細胞の遺伝情報に挿入するための技術は、当業者に知られている。
遺伝子改変細胞は、細胞の天然形態に存在する１つ又は複数の遺伝子を含有し得、前記遺伝子は、人工的手段によって改変され、微生物細胞に再導入される。
「遺伝子改変された」という用語は、細胞から核酸分子を除去することなく改変された、細胞にとって内因性である核酸分を含有する細胞も包含する。このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異及び関連技術によって得られるものが挙げられる。
本発明の遺伝子改変細胞は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｗａｌｋｅｒ，”Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．による手順書に記載されているものなど、当技術分野の標準法を使用して提供され得る。
［宿主細胞］
遺伝子改変細胞については、原則として制限はなく；それらは、目的の遺伝子を挿入するための遺伝子操作を可能にし、製造規模で培養され得る限り、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）又は古細菌であり得る。好ましくは、宿主細胞は、高い細胞密度への培養を可能にする特性を有する。
一般に、適切な宿主生物は、細胞が炭素源としてのスクロースの利用を可能にする遺伝子を天然に含有しない宿主細胞であり、本発明の遺伝子を付加することによった、スクロースを利用する新たな能力を前記レシピエント生物に付与するか、又は既存の限定的なクロース利用能力を増強する。
前記宿主生物の例としては、スクロースを利用する本来の能力を有さないか、又はスクロースをあまり利用しない多種多様な微生物が挙げられる。唯一の制限は、本発明のスクロース利用遺伝子が宿主株に組み込まれるように、レシピエント生物が（遺伝子操作、交配、形質導入、形質転換などによって）遺伝子改変できなければならないことである。
本発明によるＨＭＯの組換え工業生産に適した細菌宿主細胞の非限定的な例は、エルウィニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａｈｅｒ ｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆ ｒｅｕｎｄｉｉ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）又はキサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）であり得る。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポールス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）及びバチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）をはじめとするバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌も使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ブルガリア乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）をはじめとするが、これらに限定されないラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌が本発明の方法を使用して操作され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びプロピオニバクテリウム・フリューデンレイッヒイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）も、本明細書に記載される本発明のための適切な細菌種である。本発明の一部として、本明細書に記載されるように操作された腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）及びビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ））、スポロラクトバチルス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ミクロモノスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）種、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））からの株も含まれる。
異種産物の組換え工業生産に適した真菌宿主細胞の非限定的な例は、例えば、コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞又はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｆ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、Ｆ．グラミネアラム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）を例示的な種とする、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの糸状菌である。
哺乳類細胞株の非限定的例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）及びマウス骨髄腫細胞（ＮＳ０、Ｓｐ２／０）；幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスＣ１２７；ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＫＢ－１１、ＣＡＰ及びＨｕＨ－７、ＨＥＫ２９３、ＨＴ－１０８０及びＨｅＬａ細胞などのヒト細胞である（例えば、Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ ２０１６ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６（６）：１１１０－１１２２を参照されたい）。
１つ又は複数の実施形態では、遺伝子操作細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される。
１つ又は複数の実施形態では、遺伝子操作細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
１つ又は複数の実施形態では、遺伝子操作細胞は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はＰ パストリス（Ｐ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
１つ又は複数の実施形態では、遺伝子操作細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
１つ以上の１つ又は複数の例示的な実施形態では、本発明は、遺伝子操作細胞に関し、細胞は、大腸菌Ｋ－１２株又はＤＥ３に由来する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２株は、当技術分野でよく知られており（ＥＭＧ２、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、Ｗ３３５０、Ｃ６００及びＤＨ５αなど）、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＡＴＣＣ８７３９（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ）、ＡＴＣＣ１１３０３（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ）、ＢＬ２１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ、２００７～２００８を参照されたい）及びこれらの株の誘導体で行われる遺伝子操作作業の大半の株背景である。
本開示の別の実施形態では、遺伝子改変細胞は、スクロース加水分解の能力を付与するポリペプチドをコードする核酸配列の非存在下では、炭素源及びエネルギー源としてスクロースを利用する能力が低い及び／又は最適でないＳｕｃ＋微生物細胞の群から選択され得、本開示によるポリペプチドをコードする核酸配列の導入は、既にＳｕｃ＋である微生物細胞が炭素源及びエネルギー源としてスクロースをより良好に利用できるようにする。前記実施形態では、選択されたＳｕｃ＋微生物細胞は、本開示によるポリペプチドをコードする核酸配列の導入に加えて、それらの内因性スクロースインベルターゼ／ヒドロラーゼ遺伝子の発現を増加させるようにさらに操作され得る。前記実施形態による微生物細胞は、Ｓｕｃ＋サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＳｕｃ＋バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択され得る。
［遺伝子統合］
コンストラクト（発現カセット）に含まれる目的の異種核酸のゲノムへの統合は、従来の方法により、例えばａｔｔＴｎ７部位について記載されているような、染色体上の特定部位に相同な隣接配列を含有する線状カートリッジを使用すること（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．）；組換えがファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって媒介される、核酸配列のゲノム統合の方法（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８；Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組換えに基づく方法（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）によって達成され得るか、又は陽性クローン、すなわち発現カセットを保有するクローンは、例えば、マーカー遺伝子又は遺伝子機能の喪失又は獲得によって選択され得る。
異種ポリペプチドの発現は、一実施形態では、エピソーム統合から得ることができ、すなわち、異種ポリペプチドをコードする核酸は、上記のように核酸コンストラクトに挿入され得、次に、これは、プラスミド又は別の染色体の独立発現ベクターに含まれ、発現ベクターは、場合により染色体に統合され得るが、本発明の異種ポリペプチドをコードする異種核酸の発現を得るためにそうである必要はない。エピソームの例は、例えば、トランスポゾン及び挿入配列である。
開示される本発明の範囲において、「ゲノム統合」という用語は、異種核酸の染色体又は内因性プラスミドへの統合を指し、したがって本発明の遺伝子改変細胞のゲノムに統合されることを指す。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、上記のような遺伝子改変細胞に関し、異種核酸配列は、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種ポリペプチドのエピソーム及び／又はゲノム統合コピーをコードする。
一実施形態では、本発明による異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、安定した様式で遺伝子改変細胞のゲノムに統合される。別の実施形態では、本発明による異種ポリペプチドは、遺伝子改変細胞に一過性の様式で導入される。
［生合成産物を産生することができる細胞］
本発明に関連して、生合成産物は、宿主細胞に挿入された１つ若しくは複数の異種遺伝子から直接発現する化合物或いは細胞の１つ若しくは複数の代謝経路及び／又は目的の化合物を産生するように操作された１つ若しくは複数の酵素活性を利用して産生される化合物のいずれかである。生合成産物は、例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、脂肪酸、アミノ酸、有機酸、オリゴ糖、多糖、ポリエステル又はビタミンであり得る。
生合成により生産されるタンパク質又はポリペプチドは、例えば、抗体、ワクチン、サイトカイン、血液因子、酵素、ホルモン及び成長因子などの生物医薬品化合物又は酵素などの工業用化合物である。これらは、一般に、所望のタンパク質又はポリペプチドをコードする組換え遺伝子を宿主細胞に挿入することによって生産される。
その点において、本発明は、生合成生産で使用するためのポリペプチド酵素にも関し、ポリペプチド酵素は、スクロースをグルコースとフルクトースに加水分解することができるインベルターゼであり、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるポリペプチド酵素ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。一実施形態では、ポリペプチド酵素は、１つ又は複数のオリゴ糖及び／又は多糖類の生合成生産に使用される。さらなる実施形態では、ポリペプチド酵素は、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産に使用される。
その点において、本発明は、生合成生産で使用するためのポリペプチド酵素にも関し、ポリペプチド酵素は、スクロースをグルコースとフルクトースに加水分解することができるインベルターゼであり、配列番号２のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるポリペプチド酵素Ｂｆｆであるか、又は配列番号２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％若しくは例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。一実施形態では、ポリペプチド酵素は、１つ又は複数のオリゴ糖及び／又は多糖類の生合成生産に使用される。さらなる実施形態では、ポリペプチド酵素は、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産に使用される。
生合成的に生産されるオリゴ糖及び多糖は、例えば、母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）又はバイオポリマーである。これらは、一般に、細胞に供給される前駆体分子又は宿主細胞（これも遺伝子操作され得る）内の合成経路によって生産される前駆体分子に基づいて、所望の化合物を産生することができる酵素をコードする遺伝子を挿入することによって生産される。
本発明は、遺伝子改変細胞の細胞外側においてそれ自体でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種酵素をコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞にも関し、前記酵素の発現は、前記遺伝子改変細胞の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするのに十分であり、前記細胞は、目的の生合成産物の生産を可能にする１つ又は複数の組換え遺伝子をさらに含む。
［母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる細胞］
本開示は、ＨＭＯ製造のための大規模適用可能な解決策のために、改変細菌株においてＨＭＯを生合成的に生産する改善された効率的な手段に関する。それは、所望のオリゴ糖の合成に必要なグリコシルトランスフェラーゼを発現するように構築された遺伝子改変細菌に依存し、ＨＭＯ前駆体として細菌の生来のヌクレオチド糖のプールを利用する。
したがって、本発明は、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産のための、開示された本発明による遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトの使用にも関する。
本開示による遺伝子改変細胞が１つ又は複数のＨＭＯを産生することができるようにするには、複数の遺伝子改変が必要である。これらの改変のいくつかとしては、グリコシルトランスフェラーゼの包含が挙げられ、これは、本質的にラクトースと炭素供与体から、活性化糖ヌクレオチド、活性化糖ヌクレオチドを産生するための生合成経路及びラクトースの移入又は産物の搬出のための潜在的なトランスポーターなどの、１つ又は複数のＨＭＯを生合成できるようにする。
上記の改変は、代謝工学及び多くの場合にラクトースである出発物質からの前記１つ又は複数のＨＭＯの生産を可能にする機能性酵素の導入及び発現に関する。
したがって、細胞が炭素源及びエネルギー源として、且つ／又は主要な炭素及び主要なエネルギー源として、且つ／又は唯一の炭素源及び唯一のエネルギー源としてスクロースを利用する能力と組み合わされた、細胞が１つ又は複数のＨＭＯを産生する能力は、複数の遺伝子改変を必要とし、したがって、本発明の前記遺伝子改変細胞は、本明細書で開示される本発明を満たすために、スクロースを加水分解することができる異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、前記ポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
さらに、本発明は、１つ又は複数の特定のオリゴ糖、特に１つ又は複数の特定のＨＭＯの生産のために最適化された遺伝子改変細胞に関し、前記細胞は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする異種核酸を含む。
したがって、本発明の一実施形態は、１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる遺伝子改変細胞に関し、前記遺伝子改変細胞は、スクロースを加水分解することができるポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号１又は配列番号２と７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、例えば９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。
炭素源及びエネルギー源として、又は主要な炭素源及び主要なエネルギー源として、又は唯一の炭素源及び唯一のエネルギー源としてスクロースを利用できる遺伝子改変細胞における１つ又は複数のＨＭＯの産生は、１つ又は複数の機能性酵素をさらに必要とするため、これらを以下の段落で詳細に説明する。
［ＨＭＯ］
これに関連して、「母乳オリゴ糖」又は「ＨＭＯ」という用語は、母乳に見られる複雑な炭水化物を意味する（例えば、Ｕｒａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．：Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ（２０１１）；又はＣｈｅｎ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，１１３（２０１５）を参照されたい）。ＨＭＯは、１つ若しくは複数のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ若しくは複数のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端において、ラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、α－Ｌ－フコピラノシル及び／又はα－Ｎ－アセチル－ニューラミニル（シアリル）部分で置換されている。この点において、非酸性（又は中性）ＨＭＯは、シアリル残基を欠いており、酸性ＨＭＯの構造は、少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化ＨＭＯ又は非フコシル化ＨＭＯであり得る。このような中性非コシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ／）ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴａ）、フコシル－ＬＳＴａ（ＦＬＳＴａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴｂ）、フコシル－ＬＳＴｂ（ＦＬＳＴｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴｃ）、フコシル－ＬＳＴｃ（ＦＬＳＴｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴｄ）、フコシル－ＬＳＴｄ（ＦＬＳＴｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。本開示に関連して、ラクトースは、ＨＭＯ種と見なされない。
したがって、一実施形態では、遺伝子改変細胞によって産生される１つ又は複数のＨＭＯは、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ／）ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）、ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ／）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴａ）、フコシル－ＬＳＴａ（ＦＬＳＴａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴｂ）、フコシル－ＬＳＴｂ（ＦＬＳＴｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴｃ）、フコシル－ＬＳＴｃ（ＦＬＳＴｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴｄ）、フコシル－ＬＳＴｄ（ＦＬＳＴｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、前記１つ又は複数のＨＭＯは、式１
Figure 2024516207000004
による１つ又は複数のＨＭＯであり、
式中、Ｙは、ＯＨであり、
Ｒ１は、フコシル又はＨであり、
Ｒ２は、フコシル又はＨであり、
Ｒ３は、Ｈ、シアリル基、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基から選択され、Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基は、１つ若しくは複数のＮ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又は１つ若しくは複数のラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基を保有し得；Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基のそれぞれは、１つ又は複数のシアリル及び／又はフコシル残基で置換され得、
Ｒ４は、Ｈ、シアリル基及び１つ又は複数のＮ－アセチル－ラクトサミニル基及び／又は１つ又は複数のラクト－Ｎ－ビオシル基を含むグリコシル残基によって任意選択的に置換されたＮ－アセチル－ラクトサミニル基から選択され；Ｎ－アセチル－ラクトサミニル基及びラクト－Ｎ－ビオシル基は、Ｒ２、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４基の少なくとも１つがＨと異なることを条件として、１つ又は複数のシアリル残基及び／又はフコシル残基でそれぞれ置換され得る。
［β－ガラクトシダーゼ］
例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのＨＭＯ産生に適した宿主は、内因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子又は外因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子を含み得、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、内因性ｌａｃＺ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号Ｖ００２９６（ＧＩ：４１９０１））を含む。本発明の目的のために、ＨＭＯ産生宿主細胞は、任意のβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を含まないか又は不活化されたβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を含むように遺伝子操作される。遺伝子は、細菌ゲノムからの対応する核酸配列の完全な又は部分的な欠失によって不活化され得るか、又は遺伝子配列は、それが転写されない様式で変異されるか、又は転写される場合、転写物は、翻訳されないか、又はタンパク質（すなわちβ－ガラクトシダーゼ）に翻訳される場合、そのタンパク質は、対応する酵素活性を有しない。このようにして、ＨＭＯ産生細菌は、ＨＭＯの産生に有益な細胞内ラクトースプールの増加を蓄積する。
［１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産における機能的酵素］
上記のように、細胞が１つ又は複数のＨＭＯを合成できるために、本発明の遺伝子改変細胞は、主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする異種核酸以外にも、少なくとも１つの追加の異種核酸を含まなければならず、追加の異種核酸配列は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する１つ又は複数の機能的酵素をコードする。グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、遺伝子改変細胞のゲノムに（染色体統合によって）統合され得るか、又は代わりに、それは、本発明の異種核酸配列について記載されたように、プラスミドに含まれてプラスミド媒介性として発現され得る。遺伝子改変細胞がＨＭＯを産生することができるようにするために、例えばＬＮＴ又はＬＮｎＴなどの２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが必要である場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する異なる酵素をコードする２つ以上の異種核酸は、発明の核酸コンストラクトに統合され得るか、又はそれは、ゲノムに統合され、且つ／又はプラスミドから発現する、例えばＬＮＴの生産のために組み合わされた、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の異種核酸配列）及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の異種核酸配列）などの個々の核酸配列であり得、第１及び第２の異種核酸配列は、互いに独立して、染色体上又はプラスミド上に統合され得るか、又はそれらは、核酸コンストラクトに組み合わされ得、任意選択的に上述の特徴も含む本発明の核酸コンストラクトに含まれる。
好ましい一実施形態では、１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１及び第２の異種核酸の両方が、遺伝子改変細胞の染色体に安定的に統合され；別の好ましい実施形態では、１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１及び第２の異種核酸は、本発明の異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列とは独立して統合される。さらなる実施形態では、１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１及び第２の異種核酸は、開示されるように本発明の核酸コンストラクトに統合される。別の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸配列の少なくとも１つは、プラスミド媒介性である。
グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質／酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）は、異なる実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を有する酵素から選択され得る。例えば、２’－ＦＬの生合成生産には、改変細胞が、活性なα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現する必要があり；３－ＦＬの生産には、改変細胞が、活性なα－１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現する必要があり；ＬＮＴの生産には、改変細胞が、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼを発現する必要があり；６’－ＳＬの生産には、改変細胞が、活性なα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ酵素とＣＭＰ－シアル酸合成経路を発現する必要があり；３’ＳＬの生産には、遺伝子改変細胞が、活性なα－２，３－シアリルトランスフェラーゼ酵素とＣＭＰ－シアル酸合成経路を発現する必要がある。生産細胞が含む組換え遺伝子によってコードされ得る、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のいくつかの非限定的実施形態は、表２の非限定的例から選択され得る。
Figure 2024516207000005
Figure 2024516207000006
Figure 2024516207000007
上述の酵素は、ＨＭＯコア構造並びにフコシル化及び／又はシアル化ＨＭＯ及びそのグリコシド誘導体の生合成生産を可能にする。上記のトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、文献に記載されている。
［活性化糖ヌクレオチド］
それぞれの活性化糖ヌクレオチドは、一般に、ヌクレオシドに結合したリン酸化グリコシル残基を含み、特定のグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、特定の糖ヌクレオチドのみを受容する。したがって、好ましくは、以下の活性化糖ヌクレオチドがグリコシル転移に関与する：ＵＤＰ－Ｇｌｃ、ＵＤＰ－Ｇａｌ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ－グルクロン酸、ＧＤＰ－Ｍａｎ、ＧＤＰ－Ｆｕｃ及びＣＭＰ－シアル酸、特にＵＤＰ－Ｇａｌ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＧＤＰ－Ｆｕｃ及びＣＭＰ－シアル酸からなる群から選択されるもの。
すなわち、それは、１つ又は複数の活性化グリコシルヌクレオチドの合成に関与する１つ又は複数の酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子セットを有し、培養すると、細胞内のグリコシルトランスフェラーゼ媒介反応におけるグリコシル化の準備が整う。遺伝子のセットは、細胞内に天然に存在するか、又は関連遺伝子をコードする核酸配列の上記で詳述した遺伝子統合によって細胞内に導入されるかのいずれかである。細胞による活性化グリコシルヌクレオチドの生合成生産は、炭素源から開始するそれぞれの糖ヌクレオチドの段階的反応シーケンスの生合成経路に関与する酵素の作用下で行われ、本開示では唯一の炭素源はスクロースである（単糖代謝に関する総説は、例えば、Ｈ．Ｈ．Ｆｒｅｅｚｅ ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｅｌｂｅｉｎ：Ｃｈａｐｔｅｒ ４：Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｉｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｄｓ．Ａ．Ｖａｒｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００９））を参照されたい）。
遺伝子改変細胞によるそれ自体の生合成経路を介した活性化糖ヌクレオチドの細胞生合成生産は、外因的に添加される非常に高価な糖ヌクレオチド型ドナーの使用を回避することから、ドナーは、細胞によって原位置で形成され、ホスファチジルヌクレオシド脱離基は、細胞内で再利用されるため、生体外バージョンの転移グリコシル化と比較して有利であることが強調されるべきである。
本発明によれば、細胞外又はペリプラズムスクロースは、一般的な糖パーミアーゼを用いて細胞に侵入し得るか、又はそれは、細胞外培地からペリプラズムに拡散し得るか、又はそれは、細胞外培地中で細胞の近くに位置し得、本発明によれば、スクロースは、インベルターゼによってグルコースとフルクトースに加水分解され、それぞれのパーミアーゼを介したグルコースとフルクトースの取り込み、且つ／又はグルコース及び／若しくはフルクトースのリン酸化がそれに続き、次に活性化糖が生成され、したがってそれらを細胞の代謝と解糖に使用できるようになり、スクロースが遺伝子改変細胞の唯一の炭素源及び唯一のエネルギー源として機能できるようになる。
［コラン酸遺伝子クラスター］
フコシル化ＨＭＯの生産には、十分なＧＤＰ－フコースの存在を確保するためにコラン酸遺伝子クラスターが重要である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）では、ＧＤＰ－フコースは、細菌細胞壁の主要なオリゴ糖である細胞外多糖コラン酸を産生する際の中間体である。本発明に関連して、コラン酸遺伝子クラスターは、ＧＤＰ－フコースのデノボ合成に関与する酵素（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａｌ、ｍａｎＢ、ｍａｎＣ）をコードする一方、ＧＤＰ－Ｌ－フコースからコラン酸への変換を防ぐために、ｗｃａＪなどのＧＤＰ－Ｌ－フコースの下流の遺伝子の１つ又は複数が欠失され得る。
ＧＤＰ－フコースの形成に関与するコラン酸遺伝子クラスターは、以下の遺伝子を含むか又はそれからなる：タンパク質ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードするｇｍｄ；タンパク質ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼをコードするｗｃａＧ（ｆｃｌ）；タンパク質ＧＤＰ－マンノースマンノシルヒドロラーゼをコードするｗｃａＨ；コラン酸生合成グリコシルトランスフェラーゼをコードするｗｃａＩ；タンパク質ホスホマンノムターゼをコードするｍａｎＢ；及びタンパク質マンノース－１－リン酸塩グアニリルトランスフェラーゼをコードするｍａｎＣ。
１つ又は複数の例示的実施形態では、ＧＤＰ－フコースの形成に関与するコラン酸遺伝子クラスターは、その天然のゲノム遺伝子座から発現し得る。発現は、積極的に調節され、ＧＤＰフコース形成を増加させ得る。発現は、天然プロモーターを目的のプロモーターで交換すること；及び／又は天然遺伝子座とは別のゲノム遺伝子座から遺伝子クラスターを発現させることにより、前記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させること；又はコラン酸遺伝子クラスター又はその特定の遺伝子をエピソーム的に発現させることによって調節され得る。
本開示に関連して、コラン酸遺伝子クラスターに関する「天然ゲノム遺伝子座」という用語は、遺伝子操作細胞のゲノムにおける遺伝子クラスターの本来の自然な位置に関する。
［シアル酸の異化経路と生合成経路］
いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、欠損したシアル酸異化経路を含有する。「シアル酸異化経路」とは、シアル酸の分解をもたらす、通常は酵素によって制御され触媒される一連の反応を指す。本明細書に記載の例示的なシアル酸異化経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）経路である。この経路では、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ；Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、全てｎａｎＡＴＥＫ－ｙｈｃＨオペロンからコードされる、酵素ＮａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）とＮａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）とＮａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン６リン酸エピメラーゼ）とによって分解され、ＮａｎＲによって抑制される（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ＥＣＯＬＩ）。欠損したシアル酸異化経路は、内因性ｎａｎＡ（Ｎ－アセチルニューラミネートリアーゼ）遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ０００６７．１（ＧＬ２１６５８８））及び／又はｎａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号（アミノ酸）ＢＡＥ７７２６５．１（ＧＬ８５６７６０１５））及び／又はｎａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ、ＧＩ：９４７７４５、参照により本明細書に援用される）遺伝子に変異を導入することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主中で発現される。任意選択的に、ｎａｎＴ（Ｎ－アセチルニューラミネートトランスポーター）遺伝子も不活性化又は変異される。シアル酸代謝の他の中間体としては、（ＭａｎＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸；（ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸；（ＧｌｃＮ－６－Ｐ）グルコサミン－６－リン酸及び（Ｆｒｕｃ－６－Ｐ）フルクトース－６－リン酸が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ｎａｎＡが変異している。他の好ましい実施形態では、ｎａｎＡとｎａｎＫが変異しているが、ｎａｎＥは、機能的なままである。別の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＥが変異しているが、ｎａｎＫは、変異又は不活性化又は欠失していない。変異とは、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴの遺伝子産物をコードする核酸配列における１つ又は複数の変化である。例えば、変異は、核酸配列において、１、２、最大５、最大１０、最大２５、最大５０又は最大１００の変化であり得る。例えば、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴ遺伝子は、ヌル変異によって変異している。本明細書に記載のヌル変異は、酵素の機能喪失（すなわち活性の低下又は欠如）又は酵素の欠失（すなわち遺伝子産物なし）のいずれかを引き起こすアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入を包含する。「欠失した」とは、（機能的）遺伝子産物が生成されないように、コード領域が完全に又は部分的に欠失していることを意味する。不活性化とは、得られる遺伝子産物が機能的に不活性であるか、又は例えば未変性の、天然に存在する、内因性の遺伝子産物の活性の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％又は２０％など、１００％未満の遺伝子産物をコードするようにコード配列が変更されていることを意味する。「変異していない」遺伝子又はタンパク質は、未変性の、天然に存在する又は内因性のコード配列と、１、２、最大５、最大１０、最大２０、最大５０、最大１００、最大２００又は最大５００コドン以上又は対応するコードされたアミノ酸配列と異ならない。
さらに、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））は、シアル酸合成能力も含み得る。例えば、細菌は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ ２－エピメラーゼ（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２７．１）又は均等物（例えば（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＲ０４５６１．１））；Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２６．１）又は均等物（例えば、フラボバクテリウム・リムノセジミニス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｎｏｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿０２３５８０５１０．１）；及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のｎｅｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２８．１）又は均等物（例えば、ビブリオ・ブラジリエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）ＣＭＰ－シアル酸シンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ ＷＰ＿００６８８１４５２．１）の提供を通したシアル酸合成能力を含む。
［ＭＦＳトランスポーター］
生合成産物は、その大きさ及び形成された時に生産細胞壁を越えて拡散する能力が変動し得る。特に、より大きい産物は、生産されたバイオ産物の搬出を促進するために、遺伝子改変細胞内で発現する活性トランスポーターの存在から恩恵を受け得る。
「主要促進因子スーパーファミリー（ＭＦＳ）」という用語は、細胞膜を越えて様々な基質を輸送する役割を担う二次活性トランスポータークラスの大規模且つ極めて多様なファミリーを意味する。
したがって、１つ又は複数の例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法による遺伝子操作細胞は、ＭＦＳトランスポーターとして作用する遺伝子産物をさらに含む。ＭＦＳトランスポーターとして作用する遺伝子産物は、遺伝子操作細胞内で発現する組換え核酸配列によってコードされ得る。ＭＦＳトランスポーターをコードする組換え核酸配列は、遺伝子操作細胞のゲノムに統合され得る。
本発明の好ましい実施形態では、ＭＦＳトランスポーターは、細胞膜を通したオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの輸送、好ましくは本明細書に記載の遺伝子操作細胞によって合成されたＨＭＯ／オリゴ糖の細胞質ゾルから細胞培地への輸送を促進する。加えて又は代替的に、ＭＦＳトランスポーターは、ラクトース、グルコース、細胞代謝産物及び／又は毒素など、ＨＭＯ又はオリゴ糖と見なされない分子の排出も促進し得る。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳトランスポータータンパク質は、Ｂａｄ、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｆｒｅｄ、Ｖａｇ及びＭａｒｃからなる群から選択される。
本明細書で同義的に、「Ｂａｄタンパク質」又は「Ｂａｄトランスポーター」又は「Ｂａｄ」として同定されるＭＦＳトランスポータータンパク質は、配列番号５９のアミノ酸配列を有し；本明細書で配列番号５９として同定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入ＩＤ ＷＰ＿０１７４８９９１４．１．を有するアミノ酸配列と１００％の同一性を有するアミノ酸配列である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はＢａｄである。
配列番号６０のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では同義的に「Ｎｅｃタンパク質」又は「Ｎｅｃトランスポーター」又は「Ｎｅｃ」として同定され；ｎｅｃタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では「Ｎｅｃコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｎｅｃ遺伝子」又は「ｎｅｃ」として同定され；本明細書で配列番号６０として同定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はＮｅｃである。さらなる実施形態では、ＭＦＳトランスポーターは、配列番号４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６０のいずれか１つと少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はＮｅｃである。
配列番号６１のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では同義的に「ＹｂｅｒＣタンパク質」又は「ＹｂｅｒＣトランスポーター」又は「ＹｂｅｒＣ」として同定され；ｙｂｅｒＣタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では「ＹｂｅｒＣコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｙｂｅｒＣ遺伝子」又は「ｙｂｅｒＣ」として同定され；本明細書で配列番号６１として同定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＩＤ ＥＥＱ０８２９８．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はＹｂｅｒＣである。さらなる実施形態では、ＭＦＳトランスポーターは、配列番号６１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６１のいずれか１つと少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はＹｂｅｒＣである。
配列番号６２のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では同義的に「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄトランスポーター」又は「Ｆｒｅｄ」として同定され；ｆｒｅｄタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では「ｆｒｅｄコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｆｒｅｄ遺伝子」又は「ｆｒｅｄ」として同定され；本明細書で配列番号６２として同定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はＦｒｅｄである。さらなる実施形態では、ＭＦＳトランスポーターは、配列番号６２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６２のいずれか１つと少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はＦｒｅｄである。
配列番号６３のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では同義的に「Ｖａｇタンパク質」又は「Ｖａｇトランスポーター」又は「Ｖａｇ」として同定され；ｖａｇタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では「Ｖａｇコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｖａｇ遺伝子」又は「ｖａｇ」として同定され；本明細書で配列番号６３として同定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＩＤ ＷＰ＿０４８７８５１３９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はｖａｇである。さらなる実施形態では、ＭＦＳトランスポーターは、配列番号６３のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６３のいずれか１つと少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はｖａｇである。
配列番号６４のアミノ酸配列を有するＭＦＳトランスポータータンパク質は、本明細書では同義的に「Ｍａｒｃタンパク質」又は「Ｍａｒｃトランスポーター」又は「Ｍａｒｃ」として同定され；ｍａｒｃタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書では「Ｍａｒｃコーディング核酸／ＤＮＡ」又は「ｍａｒｃ遺伝子」又は「Ｍａｒｃ」として同定され；本明細書で配列番号６４として同定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＩＤ ＷＰ＿０６０４４８１６９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一のアミノ酸配列である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質はｍａｒｃである。さらなる実施形態では、ＭＦＳトランスポーターは、配列番号６４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６４のいずれか１つと少なくとも７０％同一、例えば少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％同一、例えば少なくとも９０％同一、例えば少なくとも９５％同一又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する機能的相同体である。
１つ又は複数の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送タンパク質は、Ｍａｒｃである。
［１つ又は複数のＨＭＯ又は別の生合成産物を生合成生産する方法］
本発明は、１つ又は複数のＨＭＯの生合成生産における、核酸コンストラクト並びに上記のような遺伝子改変宿主細胞の使用に関する。生合成生産の特徴は、それが遺伝子改変細胞を利用することにあり、核酸コンストラクトは、上記で詳述したような前記細胞に組み込まれ、その後、遺伝子改変細胞は、主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源として、好ましくは主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてスクロースを利用できる。
１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法は、
ａ）本発明による異種核酸コンストラクトを提供するステップと、
ｂ）核酸コンストラクトを、１つ又は複数のＨＭＯを産生することができる細胞に統合又は形質転換するステップと、
ｃ）唯一の炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中でｂ）の細胞を培養するステップと、
ｄ）ステップｃ）で生産されたＨＭＯを採取するステップと
を含む。
本発明の異種核酸コンストラクトは、場合により上記のように任意の適切な方法において、１つ又は複数のＨＭＯを産生することができる細胞に組み込まれ得る。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法に関し、方法は、
ａ）本開示による遺伝子改変細胞を提供するステップと、
ｂ）唯一の炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中でａ）の細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）で生産されたＨＭＯを採取するステップと
を含む。
目的の生合成生成物を生合成生産する方法は、
ａ）本発明による異種核酸コンストラクトを提供するステップと、
ｂ）核酸コンストラクトを、目的の生合成産物を産生することができる細胞に統合又は形質転換するステップと、
ｃ）唯一の炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中でｂ）の細胞を培養するステップと、
ｄ）ステップｃ）で生産された目的の生合成産物を採取するステップと
を含む。
本発明の異種核酸コンストラクトは、場合により上記のように任意の適切な方法において、１つ又は複数のＨＭＯを産生することができる細胞に組み込まれ得る。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、目的の生合成生成物を生合成生産する方法に関し、方法は、
ａ）目的の生合成産物を産生することができる、本開示による異種ポリペプチドを有する遺伝子改変細胞を提供するステップと、
ｂ）唯一の炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中でａ）の細胞を培養するステップと、
ｃ）ステップｂ）で生産された目的の生合成産物を採取するステップと
を含む。
［培養］
本発明に従って、主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてスクロースを利用でき、且つ１つ又は複数のＨＭＯを産生することができる遺伝子改変細胞の培養中、オリゴ糖生成細胞は、成長、生殖、その構造の維持のために解糖を介してエネルギーを供給するスクロースを供給される。さらに、細胞によって取り込まれたスクロースは、上記のスクロース異化作用を介して、細胞内で起こるグリコシル化プロセスに必要な活性化糖ヌクレオチドの合成のための前駆体を提供する。ラクトースなどの内在化糖鎖受容体は、グリコシルトランスフェラーゼ誘導性グリコシル化反応に関与し、その中では、細胞によって産生された活性化ヌクレオチド供与体のグリコシル残基が転移され、その結果受容体がグリコシル化される。任意選択的に、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが細胞によって発現されると、追加のグリコシル化反応が起こり、その結果、標的オリゴ糖が形成され得る。当然のことながら、好ましくは、細胞は、細胞内で産生されるオリゴ糖誘導体を分解するような酵素活性を欠いている。
本発明によれば、「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」（又は「培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」若しくは「培養」、「発酵」とも称される）という用語は、産業界で知られている方法による制御されたバイオリアクター内の細菌発現細胞の増殖に関する。
前記方法によれば、遺伝子改変細胞、好ましくは細菌、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、オリゴ糖生産のような工業的に収益性の高い変換のために最適化された株であるが、これは、そのような株が一般にスクロースを利用する能力を有さないからである。したがって、スクロース利用を可能にするポリペプチドを、適切な発現プラスミドを使用して又は染色体統合を介して導入し、上記で詳述したようにスクロースマイナス細胞をスクロースプラス細胞に変換する必要がある。
１つ又は複数のＨＭＯを生産するために、本明細書に記載されるＨＭＯ産生微生物は、炭素源若しくはエネルギー源として又は主要な若しくは単独の炭素源として且つ主要な又は単独のエネルギー源としてのスクロースの存在下において、当技術分野で知られている手順に従って培養され、生産されたＨＭＯは、培養培地と培養プロセス中に形成されたバイオマスから採取される。その後、ＨＭＯは、例えば、国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７１５２９１８号パンフレットに記載されているような当技術分野で知られている手順に従って精製され、精製されたＨＭＯは、栄養補給食品、医薬品又は例えば研究などの任意の他の目的のために使用される。
［生合成生産］
本発明の方法は、１つ又は複数の目的の生合成産物の生産、特に１つ又は複数のＨＭＯの生産に関する。本発明の方法は、大規模生産における目的の生合成産物又はＨＭＯの製造も包含する。目的の生合成産物又はＨＭＯの製造は、通常、大量の培養を行うことによって達成される。
「製造」又は「製造規模」又は「大規模生産」又は「大規模発酵」という用語は互換的に使用され、本発明の意味において、最小容量１００Ｌ、例えば１０００Ｌ、例えば１０，０００Ｌ、例えば１００，０００Ｌ、例えば２００，０００Ｌの培養ブロスによる発酵を定義する。通常、「製造規模」プロセスは、例えば、治療用化合物又は組成物の場合、毒性試験、臨床試験並びに市場供給の要求を満たす量の目的のＨＭＯ産物をもたらす大量処理が可能であることによって定義される。振盪フラスコ培養のような単純な実験室規模の方法とは対照的に、製造規模の方法は、大容量に加えて、撹拌、通気、栄養供給、プロセスパラメーター（ｐＨ、温度、溶存酸素濃度、背圧など）の監視と制御のための装置を備えたバイオリアクター（発酵槽）の技術システムの使用によって特徴付けられる。開示の実施例に記載されている、振盪フラスコ、卓上バイオリアクター又は深型ウェルフォーマットなどの実験室規模の方法における発現系の挙動は、バイオリアクターの複雑な環境におけるその発現系の挙動をかなりの程度予測することを可能にする。
発酵プロセスで使用される適切な細胞培地に関しては、本発明に関して、培地が一次炭素源及びエネルギー源としてスクロースを含有することを除いて、制限はない。
［採取］
本発明に関連して、「採取」という用語は、発酵の終了後、生産されたＨＭＯを収集することに関する。異なる実施形態では、バイオマス（すなわち遺伝子改変細胞）と培養培地との両方に含まれるＨＭＯ、すなわちバイオマスから発酵ブロスを分離する前に／分離なしに収集することを含み得る。他の実施形態では、生産されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスとは別々に、すなわち培養培地（すなわち発酵ブロス）からのバイオマスの分離後／それに続いて収集され得る。培地からの細胞の分離は、任意の適切なタイプの遠心分離又は濾過など、当業者によく知られた任意の方法で実施され得る。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスを採取した直後又は適切な条件で発酵ブロスを保存した後の段階でも行われ得る。残りのバイオマス（又は発酵全体）からの生産されたＨＭＯの回収には、バイオマス（生産細胞）からのＨＭＯの抽出が含まれる。それは、例えば、超音波処理、煮沸、均質化、リゾチームを使用する酵素溶解又は凍結及び粉砕による当技術分野の任意の適切な方法によって行われ得る。
発酵からの回収後、ＨＭＯはさらなる処理と精製のために利用可能である。
発酵によって生産されたＨＭＯの精製は、国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレット、国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット、米国特許第２０１９／０１１９３１４号明細書に記載されている適切な手順を用いて行い得る。
［生体外でのスクロース加水分解酵素の使用］
上記のように、発酵ベースの製造に適した糖の調製は、現時点ではコストが高く、非効率的である。スクロースは、豊富に存在し、取り扱いが簡単であるため、他の糖に代わる費用効果が高い代替品である。これも上述したように、スクロースは、例えば、グルコースよりも発酵の準備が容易である。それにもかかわらず、製造に使用される多くの生産細胞は、炭素源及びエネルギー源としてスクロースを、たとえあったとしても十分に利用できない。したがって、本発明の一態様は、スクロースからのグルコースとフルクトースの調製における、本発明のインベルターゼ、すなわちＢｆｆ及びＳａｃＣ＿ＡｇａＩの使用に関する。
したがって、本発明の一実施形態は、グルコース及び／又はフルクトースの生産及び／又は製造における、配列番号１又は２のいずれか１つ［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ又はＢｆｆ］のポリペプチド又は配列番号１又は２のいずれか１つと７０％を超えて同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号１又は２のいずれか１つの機能的相同体の使用に関する。本発明の別の実施形態は、グルコース及びフルクトースの生成における、配列番号１又は２［ＳａｃＣ Ａｇａｌ又はＢｆｆ］のいずれか１つのポリペプチド又は配列番号１又は２のいずれか１つと７０％を超える、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号又は２のいずれか１つの機能的相同体の使用に関する。
本発明の別の実施形態は、
ａ）スクロースを、配列番号１又は２のいずれか１つのポリペプチド［ＳａｃＣＡｇａｌ及びＢｆｆ］又は配列番号１又は２のいずれか１つと７０％を超える、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号１又は２の機能的相同体と反応させるステップと、
ｂ）反応完了後に反応組成物から前記ポリペプチドを抽出するステップと、
ｃ）反応組成物からグルコース及び／又はフルクトースを抽出及び／又は精製するステップと
を含む、スクロースからグルコース及び／又はフルクトースを得る方法に関する。
［配列ＩＤ］
本出願は、テキスト形式及び電子形式の配列表を含み、優先権出願ＤＫ ＰＡ ２０２１ ７０２４８号明細書及びＤＫ ＰＡ ２０２２ ７０１３８号明細書の修正配列リストに列挙されている配列と同様に、参照により本明細書に援用される。以下は、表１又は６に表されていない配列の概要である。
配列番号１［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ、インベルターゼタンパク質］
配列番号２［Ｂｆｆ、インベルターゼタンパク質］
配列番号３［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩ、インベルターゼをコードするＤＮＡ］
配列番号４［Ｂｆｆ、インベルターゼをコードするＤＮＡ］
配列番号５５［ｌｇｔＡタンパク質、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ］
配列番号５６［ｇａｌＴ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ］
配列番号５７［ｇａｌＴＫ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ］
配列番号５８［Ｓｍｏｂ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ］
配列番号５９［Ｂａｄ、ＭＦＳトランスポーター］
配列番号６０［Ｎｅｃ、ＭＦＳトランスポーター］
配列番号６１［ＹｂｅｒＣ、ＭＦＳトランスポーター］
配列番号６２［Ｆｒｅｄ、ＭＦＳトランスポーター］
配列番号６３［Ｖａｇ、ＭＦＳトランスポーター］
配列番号６４［Ｍａｒｃ、ＭＦＳトランスポーター］
配列番号６５［ＳｃｒＹ、ｓｃｒ ＰＥＰ－ＰＴＳ系中のポリン］
配列番号６６［ＳｃｒＡ、ｓｃｒ ＰＥＰ－ＰＴＳ系中のスクロース輸送タンパク質酵素ＩＩＳｃｒ］
配列番号６７［ＳｃｒＢ、ｓｃｒ ＰＥＰ－ＰＴＳ系中のインベルターゼ］
配列番号６８［ＳｃｒＲ、ｓｃｒ ＰＥＰ－ＰＴＳ中の抑制因子タンパク質］
［一般事項］
説明された本発明に関連して上述された任意の特徴及び／又は態様は、本明細書に記載された方法に類推適用されるものと理解されるべきである。
ラクト－Ｎ－トリオース、ＬＮＴ－ＩＩ／、ＬＮＴＩＩ、ＬＮＴ２及びＬＮＴ２という用語は、同義的に使用される。
核酸配列及びヌクレオチド配列という用語は、同義的に使用される。
以下では、本開示を説明するための図面及び実施例を示す。これらは、例証を意図し、いかなる意味でも限定的に解釈されるものではない。
［項目］
１．異種酵素をコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞であって、それ自体、遺伝子改変細胞の細胞外側及び／又は細胞周辺腔内でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができ、前記酵素の発現は、前記遺伝子改変細胞の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするのに十分である、遺伝子改変細胞。
２．酵素は、細胞のペリプラズム内又は細胞外腔内に存在する、項目１に記載の遺伝子改変細胞。
３．酵素は、原形質膜のペリプラズム側、細胞外側及び／又は細胞質側のいずれかに固定され、埋め込まれ、且つ／又は付着している、項目１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
４．酵素は、可溶性である、項目１又は２に記載の遺伝子改変細胞。
５．１つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる、項目１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
６．異種酵素は、非リン酸化スクロースを加水分解することができる、前述の項目のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
７．異種酵素は、インベルターゼである、前述の項目のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
８．インベルターゼは、ｓｃｒＢ又はｃｓｃＡによってコードされない、項目７に記載の遺伝子改変細胞。
９．異種核酸配列は、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種酵素のエピソーム及び／又はゲノム統合コピーをコードする、前述の項目のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
１０．酵素をコードする異種核酸配列のゲノム統合単一コピーは、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる、項目９に記載の遺伝子改変細胞。
１１．前記酵素の発現は、前記遺伝子改変細胞の主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする、前述の項目のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
１２．異種酵素は、スクロースを輸送しない、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
１３．完全なスクロース利用系を含有しない、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
１４．異種酵素の添加前にスクロース上で増殖を維持できなかった、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
１５．異種核酸配列は、配列番号１若しくは２の酵素［ＳａｃＣ Ａｇａｌ若しくはＢｆｆ］又は配列番号１若しくは２のいずれか１つと７０％を超えて同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号１若しくは２のいずれか１つに記載の機能的相同体をコードする、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
１６．コードされた酵素は、配列番号１［ＳａｃＣ Ａｇａｌ］に示されるアビバクテリウム・ガリナルム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）由来のグリコシドヒドロラーゼファミリー３２タンパク質又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、前述の項目のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
１７．コードされた酵素は、配列番号２［Ｂｆｆ］に示されるアルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ ３０６２由来のβ－フルクトフラノシダーゼタンパク質又は配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、前述の項目のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
１８．酵素をコードする核酸配列の少なくとも２つのコピーは、細胞のゲノム中に存在する、項目１６又は１７に記載の遺伝子改変細胞。
１９．異種核酸配列は、異種核酸配列の発現を調節するための１つ又は複数の調節エレメントをさらに含む、前述の項目のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
２０．調節エレメントは、配列番号１若しくは２に示されるアミノ酸配列の１つ又は配列番号１若しくは２のいずれか１つと８０％を超えて同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号１若しくは２のいずれか１つに記載の機能的相同体から選択される特定の異種酵素の発現を調節する、項目１９に記載の遺伝子改変細胞。
２１．調節エレメントは、１つ若しくは複数の誘導性プロモーター配列及び／又は１つ若しくは複数の構成的プロモーター配列を含む、項目１９又は２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
２２．調節エレメントは、誘導性プロモーターを含む、項目１９～２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
２３．調節エレメントは、ＰＢＡＤ、Ｐｔｅｔ、Ｐｘｙｌ、Ｐｌａｃ、ＰｓａｃＢ、ＰｘｙｌＡ、ＰｒｐＲ、ＰｎｉｔＡ、ＰＴ７、Ｐｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ、ＰｎｉｓＡ，Ｐｂ、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４からなる群から選択される、項目１９～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
２４．調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）、若しくはＰｌａｃ（配列番号５１）、若しくはＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号３８）、若しくはＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号３９）、若しくはＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号４０）、若しくはＰｇａｔＹ（配列番号４１）又は表６で同定されるこれらのプロモーターの変異型からなる群から選択されるプロモーターである、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
２５．調節エレメントは、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ及びＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲからなる群から選択される、項目１９～２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
２６．調節エレメントは、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、ｐｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇａｔＹ及びＰｍｇｌＢ＿１６ＵＴＲからなる群から選択される強力なプロモーターである、項目１９～２３のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
２７．調節エレメントは、ＰｇｌｐＦプロモーター又はその変異型である、項目２３に記載の遺伝子改変細胞。
２８．調節エレメントは、構成的プロモーターを含む、項目１９～２７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
２９．構成的プロモーターは、ＣＰ６、ＰｏｓｍＹ、Ｐｓｐｃ、Ｐｂｌａ、Ｐｒｒｎ１及びＰｒｒｎ２からなる群から選択される、項目２８に記載の遺伝子改変細胞。
３０．前記異種核酸配列は、遺伝子改変細胞のペリプラズム及び／又は発酵培地への前記異種酵素の連続分泌を増強することができるシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
３１．シグナルペプチドは、配列番号２８である、項目３０に記載の遺伝子改変細胞。
３２．限定的なグルコース取り込みを有する、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
３３．機能的ｐｔｓＧ遺伝子を含有しない、項目３２に記載の遺伝子改変細胞。
３４．メジャーファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）トランスポーターをコードする異種核酸配列をさらに含む、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
３５．ＭＦＳトランスポーターは、
ａ）配列番号６０のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列又は配列番号６０と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｂ）配列番号６１のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列又は配列番号６１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｃ）配列番号５９のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列又は配列番号５９と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｄ）配列番号６２のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列又は配列番号６２と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
ｅ）配列番号６３のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列又は配列番号６３と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、及び
ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列をコードする異種核酸配列又は配列番号６４と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体
からなる群から選択される、項目３４に記載の遺伝子改変細胞。
３６．単細胞生物である、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
３７．原核細胞又は真核細胞である、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
３８．大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択される、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
３９．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、前述の項目のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
４０．核酸コンストラクトであって、
ａ）それ自体、遺伝子改変細胞の細胞外側及び／又は細胞周辺腔内でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種酵素をコードする核酸配列と、
ｂ）前記核酸配列の発現を調節できる調節エレメントを含む核酸配列と、任意選択的に、
ｃ）遺伝子改変細胞のペリプラズム及び／又は発酵培地への前記ポリペプチドの連続分泌ができるようにするシグナルペプチドをコードする核酸配列と
を含む核酸コンストラクト。
４１．調節因子は、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）、若しくはＰｌａｃ（配列番号５１）、若しくはＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号３８）、若しくはＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号３９）、若しくはＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号４０）、若しくはＰｇａｔＹ（配列番号４１）又は表６で同定されるこれらのプロモーターの変異型からなる群から選択されるプロモーターである、項目４０に記載の核酸コンストラクト。
４２．シグナルペプチドは、表１から選択される、項目４０又は４１に記載の核酸コンストラクト。
４３．シグナルペプチドは、配列番号２８である、項目４２に記載の核酸コンストラクト。
４４．生合成生産のための、項目１～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞又は項目４０～４３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトの使用。
４５．１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産するための、４４に記載の遺伝子改変細胞又は項目４０～４３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトの使用。
４６．ＨＭＯを生合成生産する方法であって、
ａ）項目１～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を提供するステップ、
ｂ）炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中で（ａ）の細胞を培養するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）で生産されたＨＭＯを採取するステップ
を含む方法。
４７．ステップｂ）のスクロースは、主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源である、項目４６に記載の１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法。
４８．所望の生合成産物を産生することができる遺伝子改変宿主細胞において生合成生産する方法であって、
ａ）非スクロース利用性（Ｓｕｃ－）宿主細胞又は所望の生合成産物を産生することができるスクロースを利用する限定された及び／若しくは非効率的な能力を有する宿主細胞を提供するステップ、
ｂ）それ自体、遺伝子改変細胞の細胞外側及び／又は細胞周辺腔内でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる異種酵素をコードする異種核酸配列を前記宿主細胞に導入するステップであって、前記酵素の発現は、前記遺伝子改変細胞の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするのに十分である、ステップ、
ｃ）炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中で（ｂ）の細胞を培養するステップ、
ｄ）ステップｃ）で生産された生合成産物を採取するステップ
を含む方法。
４９．培養培地は、主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてスクロースを含有する、項目４８に記載の方法。
［実施例］
［実施例１：単一遺伝子ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ又はｂｆｆの大腸菌ＤＨ１ Ｋ１２株への導入は、唯一の炭素源及びエネルギー源としてスクロース上で増殖する能力を付与する］
［増殖モニタリングアッセイで試験されたＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、ＭＰ４、ＭＰ５及びＭＰ６株の遺伝子型の説明］
菌株のバックグラウンド株として、細菌株ＭＤＯを使用した。ＭＤＯは、大腸菌Ｋ－１２ ＤＨ１から構築される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型は、Ｆ－、λ－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４である。大腸菌Ｋ－１２ ＤＨ１遺伝子型に加えて、ＭＤＯは以下の改変を有する：ｌａｃｚ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失とｇｍｄ遺伝子上流のＰｌａｃプロモーターの挿入（国際公開第２０１９／１２３３２４Ａ１号パンフレット、変更点は以下の表３に要約される）。
プラットフォーム株（「ＭＤＯ」、ＭＰ１）をベースに行って、完全染色体株ＭＰ２、ＭＰ３、ＭＰ４、ＭＰ５及びＭＰ６を得た。
ＭＰ２株は、四糖類のＨＭＯ、ＬＮｎＴを産生し得るが、他の株は生物工学的に興味深い産物を形成しない。ＭＰ２株は、ＬＮｎＴの生合成に関与する遺伝子、すなわち髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のｌｇｔＡ（１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする）及びＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のｇａｌＴ（β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする）並びに唯一の炭素源及びエネルギー源としてスクロース上で増殖する能力を付与する４つの追加の遺伝子を保有する。これらの４つの遺伝子は、それぞれ野生型スクロースプロモーター（Ｐｓｃｒ）及び合成デュアルプロモーター（ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１－Ｐｓｃｒ）によって制御される、ｓｃｒＢＲとｓｃｒＹＡの２つのオペロンに組織される。
上記のように、ＭＰ３、ＭＰ４、ＭＰ５及びＭＰ６株は、ＨＭＯ又は任意の他の高価値産物を産生せず、ｓｃｒＢＲ及びｓｃｒＹＡオペロンも発現しない。代わりに、これらの株のそれぞれは、スクロースヒドロラーゼ又はインベルターゼをコードする遺伝子の単一ゲノムコピーを保有し、その発現は、合成誘導性プロモーターＰｇｌｐＦによって駆動される。具体的には、ＭＰ３株は、ｓａｃＣ＿Ｍｓｕｃ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーを１つ発現し（マンヘイミア・スクシニシプロズセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、国際公開第２００９０７８６８７Ａ２号パンフレット及びＮＣＢＩ受け入れ番号ＡＡＵ３７５１６．１）；ＭＰ４株は、ｓａｃＡ＿Ｂｓｕｂ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーを１つ発現し（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、国際公開第２００９０７８６８７Ａ２号パンフレット；及びＮＣＢＩ受け入れ番号ＷＰ＿０１０８８６６３６．１）；ＭＰ５株は、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーを１つ発現し（アビバクテリウム・ガリナルム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）；ＭＰ６株は、ｂｆｆ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーを１つ発現する（アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＩＦＯ ３０６２）。
本実施例では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１ Ｋ１２株における単一遺伝子、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ又はｂｆｆのゲノム統合が、主要な及び／又は唯一の炭素源として且つ主要な及び／又は唯一のエネルギー源としてスクロース上で増殖する能力をどのように付与するかが示される。本開示は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主におけるこれらの２つの遺伝子の１つの発現が、一般にフレキシ燃料株とも称される様々な炭素源及びエネルギー源を利用できる株を生産するための株操作ツールとして有利に使用され得ることも実証し、おそらく全体的な細胞生理機能が改善されており、これは、ＳｃｒＢＲ－ＳｃｒＹＡ系（配列番号６５～６８）などの他のスクロース利用系を備えた細胞と比較して、ｂｆｆ又はｓａｃＣ＿Ａｇａｌ発現細胞が経験する代謝負荷がおそらく低いことに起因する。
Figure 2024516207000008
［増殖モニタリングアッセイ中に適用されるプロトコルの説明］
本実施例で開示された株は、４日間のプロトコルを使用して９６ウェルマイクロタイタープレート内でスクリーニングした。最初の２４時間で細胞は高密度に増殖し、次の７２時間で細胞を唯一の炭素源及びエネルギー源としてスクロースを含有する培地に移した。具体的には、１日目に、２０％グルコースを含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロスを使用して新鮮な接種材料を調製した。調製した培養物を３４℃で２４時間培養した後、細胞を硫酸マグネシウムとチアミンを添加した基礎最小培地（２００ｕＬ）に移し、それに炭素源として２０％グルコース溶液と１５ｇ／Ｌスクロース溶液を初期ボーラスとして細胞に供給した。新しい培地の接種後、細胞を１２００ｒｐｍ、２８℃で７２時間振盪した。細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＶａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダーと互換性のあるマイクロタイタープレート内で、バッチ式で培養した。
［増殖モニタリングアッセイの結果］
スクロースの存在下においてバッチ式で培養を行い、上記の７２時間プロトコルを使用して菌株を増殖モニタリングアッセイで試験した。異なる株がスクロース上で増殖する能力を、その遺伝子構成（すなわち異なるスクロース利用系に関連する異なるタンパク質の発現）の関数として評価するために、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸシステムによって報告された培養吸光度（６００ｎｍ）の生データを使用して、試験した株のスクロース上での増殖曲線を検査した。データ解析ソフトウェアＳｋａｎＩｔを使用して、これらの増殖曲線を全て抽出した。
図２に示すように、インベルターゼ又はスクロースヒドロラーゼを発現しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主（ＭＤＯ、ＭＰ１株）は、スクロース上では増殖できないと予想される（すなわち、ＭＰ１株は、実験の陰性対照として機能する）。国際公開第２００９／０７８６８７Ａ２号パンフレットに提示された結果によって予想されたように、ＳａｃＡ＿Ｂｓｕｂ及びＳａｃＣ＿Ｍｓｕｃスクロースヒドロラーゼ酵素の発現により、ＭＤＯ株は唯一の炭素源及びエネルギー源としてスクロースを利用できるようになる（すなわち、ＭＰ３及びＭＰ４株は、実験の陽性対照として機能する）。これは、４つのタンパク質、すなわちＳｃｒＢ、ＳｃｒＲ、ＳｃｒＹ及びＳｃｒＡからなる複雑なスクロース利用系を発現する細胞についても当てはまる（国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレット）（すなわちＭＰ２株も実験の陽性対照として機能する）。
図２に示すように、本開示の酵素であるＳａｃＡ＿ＡｇａｌとＢｆｆは、ＭＤＯ株にもスクロースを利用する能力を持たせるが、それぞれが互いに大きく異なる特徴的な増殖プロファイルを示すだけでなく、上述のスクロースヒドロラーゼを発現する株（ＭＰ３及びＭＰ４）によって生成される増殖プロファイルとも大きく異なる。具体的には、ｂｆｆ遺伝子の単一ゲノムコピーを発現しているＭＤＯ細胞（ＭＰ６株）は、長い誘導期を示し、その終了後、スクロース上で急速に増殖して高い光学濃度をもたらした。一方、単一ゲノムコピーからｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子を発現するＭＤＯ細胞（ＭＰ５株）は、他の３つの操作された株、すなわちＭＰ２、ＭＰ３、ＭＰ４又はＭＰ６株と比較して非常に早く高い光学濃度に達する（図２）。
ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ（又はＢｆｆ）酵素を発現する細胞が、これまで知られていた細胞外スクロースヒドロラーゼに勝ることができるという事実は驚くべきことであり、本開示の強みを際立たせている。さらに、前述の細胞外スクロースヒドロラーゼＳａｃＡ＿Ｂｓｕｂ及びＳａｃＣ＿Ｍｓｕｃ（国際公開第２００９／０７８６８７Ａ２号パンフレット及びＮＣＢＩ受け入れ番号）、細胞内スクロースヒドロラーゼＳｃｒＢ（それぞれ国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレット及びＮＣＢＩ受け入れ番号ＷＰ＿００００５６８５３．１及びＡＡＵ３７５１６．１）及び本開示のＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ酵素間で共有される配列同一性が、以下の表４に示すように低いことは、注目に値する。ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ酵素及びＳａｃＣ＿Ｍｓｕｃ酵素のみが少し高い配列同一性を共有するようであり、そのレベルは、７０％弱に達する（表４）。
Figure 2024516207000009
［実施例２ － ＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロース利用技術は多重遺伝子スクロース利用系ＳｃｒＢＲＹＡを置き換え得る］
［増殖モニタリングアッセイで試験されたＭＰ２、ＭＰ５、ＭＰ７及びＭＰ８株の遺伝子型の説明］
以前に報告されたプラットフォーム株（「ＭＤＯ」、ＭＰ１）をベースに、以下の表５にまとめた改変を行って、完全染色体株ＭＰ２、ＭＰ５、ＭＰ７及びＭＰ８を得た。
ＭＰ２株は四糖類のＨＭＯ、ＬＮｎＴを産生し得るが、他の株は生物工学的に興味深い産物を形成しない。ＭＰ２株は、ＬＮｎＴの生合成に関与する遺伝子、すなわち髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のｌｇｔＡ（１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼをコードする）及びＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のｇａｌＴ（β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする）並びに唯一の炭素源及びエネルギー源としてスクロース上で増殖する能力を付与する４つの追加の遺伝子を保有する。これらの４つの遺伝子は、それぞれ野生型スクロースプロモーター（Ｐｓｃｒ）及び合成デュアルプロモーター（ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１－Ｐｓｃｒ）によって制御される、ｓｃｒＢＲ及びｓｃｒＹＡの２つのオペロンに組織される。
上記のように、ＭＰ３、ＭＰ４、ＭＰ５及びＭＰ６株は、ＨＭＯ又は任意の他の高価値産物を産生せず、ｓｃｒＢＲ及びｓｃｒＹＡオペロンも発現しない。代わりに、これらの株のそれぞれは、酵素ＳａｃＣ＿Ａｇａｌをコードする遺伝子の１つ又は複数のゲノムコピーを保有する。具体的には、ＭＰ５株は、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーを１つ発現しＭＰ７株は、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーを２つ発現し；ＭＰ８株は、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーを３つ発現する。
本実施例では、単一遺伝子ｓａｃＣ＿Ａｇａｌの２つのＰｇｌｐＦ駆動型発現カセットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１ Ｋ１２株のゲノムへの統合は、他の単一酵素スクロース利用系（例えば、ＳａｃＣ＿Ｍｓｕｃ又はＳａｃＡ＿Ｂｓｕｂ）よりも高いレベル又は少なくとも確立されたＳｃｒＢＲ－ＳｃｒＹＡ系と同等のレベルにおいて、炭素源として又は主要な若しくは唯一の炭素源として或いはエネルギー源として又は主要な若しくは唯一のエネルギー源としてスクロース上で増殖する能力を付与することが実証された。
Figure 2024516207000010
［増殖モニタリングアッセイ中に適用されるプロトコルの説明］
本実施例で開示された株は、４日間のプロトコルを使用して９６ウェルマイクロタイタープレート内でスクリーニングした。最初の２４時間で細胞は高密度に増殖し、次の７２時間で細胞を主要な炭素源及びエネルギー源としてスクロースを含有する培地に移した。具体的には、１日目に、２０％グルコースを含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロスを使用して新鮮な接種材料を調製した。調製した培養物を３４℃で２４時間培養した後、細胞を硫酸マグネシウムとチアミンを添加した基礎最小培地（２００ｕＬ）に移し、それに炭素源として２０％グルコース溶液と１５ｇ／Ｌスクロース溶液を初期ボーラスとして細胞に供給した。新しい培地の接種後、細胞を１２００ｒｐｍ、２８℃で７２時間振盪した。細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＶａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダーと互換性のあるマイクロタイタープレート内で、バッチ式で培養した。
［増殖モニタリングアッセイの結果］
スクロースの存在下においてバッチ式で培養を行い、上記の７２時間プロトコルを使用して菌株を増殖モニタリングアッセイで試験した。異なる株がスクロース上で増殖する能力を、その遺伝子構成（すなわち異なるスクロース利用系に関連する異なるタンパク質の発現）の関数として評価するために、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸシステムによって報告された培養吸光度（６００ｎｍ）の生データを使用して、試験した株のスクロース上での増殖曲線を検査した。データ解析ソフトウェアＳｋａｎＩｔを使用して全ての増殖曲線を抽出し、試験した各菌株のスクロース上での比増殖速度をはじめとする様々な計算を実行した。
図３に示すように、単一のｓａｃＣ＿Ａｇａｌコピーを保有するＭＰ５株は、この遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型ゲノムコピーを２つ（ＭＰ７株）又は３つ（ＭＰ８株）有する株と比較して、スクロース上で増殖させるとより高い光学密度に達し得る。しかしながら、ＭＰ５株の指数増殖初期における増殖速度は、ＭＰ７株及びＭＰ８株の増殖速度よりも低い（図４）。さらに、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型ゲノムコピーを２つ（ＭＰ７株）又は３つ（ＭＰ８株）有する株は、非常によく類似した増殖プロファイルを示し（図３）、指数増殖中に同様の比増殖速度に達する（図４）。
結論として、ＳｃｒＢＲ－ＳｃｒＹＡスクロース利用系を発現するＭＰ２株とほぼ同等の効率で、ＭＤＯ株がスクロースを利用できるようにするには、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型ゲノムコピー２つで十分である。ｓａｃＣ＿Ａｇａｌによって付与された大腸菌ＤＨ１ Ｋ１２株がクロース上で効率的に増殖する能力は、バッチ培養で達する最終光学濃度と、指数増殖期に到達する増殖速度の両方の観点から、他の単一酵素スクロース利用系（例えば、ＳａｃＣ＿Ｍｓｕｃ又はＳａｃＡ＿Ｂｓｕｂ）によって付与されたものよりも優れている（図２及び３）。
このように、本開示は、おそらくｓａｃＣ＿Ａｇａｌ発現細胞の低い代謝負荷に起因する、全体的な細胞生理機能が改善されたフレキシ燃料株を生成するための効率的な株操作ツールを示す。
［実施例３ － ＨＭＯ産生宿主におけるＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロース利用技術］
本実施例では、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロースインベルターゼを表７でＭＰ２と同定されたＬＮｎＴ発現宿主細胞に導入し、ｓｃｒＹＡ、ｓｃｒＢＲ遺伝子によってコードされるＰＥＰ－ＰＴＳスクロース系をＳａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子の２つのコピーと交換した。さらに、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子をＰｇｌｐＦプロモーター（ＭＰ９株及びＭＰ１０株）又はスクロース依存性Ｐｓｃｒプロモーター（ＭＰ１１株及びＭＰ１２株）の制御下に置いた。さらに、ｐｔｓＧの欠失の効果をＭＰ１０株及びＭＰ１２株で試験した。
株の遺伝子型を表７に示す。
Figure 2024516207000011
［発酵プロトコル］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、１００ｍＬの３１．２ｇ／Ｌスクロースからなるミネラル培地並びにＨ３ＰＯ４、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、クエン酸、微量元素溶液、消泡剤及びチアミンで構成されるミネラル培地から開始して、２５０ｍＬ発酵槽（Ａｍｂｒ２５０ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）内で培養した。最初の撹拌並びにその後の７００ｒｐｍ（最大４５００ｒｐｍ）及び１ＶＶＭ（最大３ＶＶＭ）で開始する空気流のカスケードにより、溶存酸素レベルを２３％に維持した。８．５％のＮＨ４ＯＨ溶液で滴定することにより、ｐＨを６．８に保った。１０ｇ／Ｌスクロース、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、クエン酸、微量元素溶液、消泡剤及びチアミンを含む、前培養からの２％（ｖ／ｖ）接種材料で培養を開始した。バッチ培地に含有されるスクロースが枯渇した後、スクロース含有供給液を、炭素制限条件を維持する速度で発酵槽に連続的に添加した。温度は、当初、３３℃であったが、供給の２０時間後に２７℃まで低下した。ラクトースは、供給開始時に２５％ラクトース一水和物溶液のボーラス添加として添加し、その後、ラクトースが律速因子にならないように３２時間毎に添加した。細胞の増殖、代謝活性、代謝状態を反射率及びＣＯ２発生速度のオンライン測定によって追跡した。
［結果］
ＬＮｎＴの生産量は、生成された総ＨＭＯのモル％として示される。発酵は、ＭＰ１０株を除いて二連で実行した。データを図５に示す。
具体的には、ＰｇｌｐＦプロモーターの制御下でｓａｃＣ＿Ａｇａｌを発現する株（ＭＰ９株及びＭＰ１０株）は、４遺伝子ＰＥＰ－ＰＴＳスクロース系を発現する株と比較して、より多量のＬＮｎＴを産生することが分かる。特に、グルコーストランスポーターｐｔｓＧ（ＭＰ１０）がさらに欠失している株は、発酵が１１５時間目に終了したとき、ＬＮｎＴ生産が平坦域に達していないため、非常に高い力価のＬＮｎＴ生産に達する可能性があるようである。
図５から、スクロース誘導性プロモーターＰｓｃｒの制御下でｓａｃＣ＿Ａｇａｌを発現している株（ＭＰ１１株及びＭＰ１２株）では、ＰｇｌｐＦプロモーターの制御下でｓａｃＣ＿Ａｇａｌを発現している株と比較して、ＬＮｎＴの生産量が著しく少ないことが示されるように、細胞がスクロースをほとんど取り込まないことが確認された。しかしながら、ｐｔｓＧ欠失がグルコース取り込みを制御する正の効果も、ＭＰ１１株よりもＭＰ１２株で観察された。
ＭＰ１０株に関して、副産物の形成に関してさらなる分析を行った。ＭＰ１０株では、ＭＰ２株の発酵後に残存するラクトースと比較して、ラクトースは５．５倍減少した。最終産物には、限られた量のラクトースのみが許容され、発酵後の下流プロセスでラクトースを除去する必要がないことが好ましいため、発酵後のラクトースの量の減少は、好ましい。ＬＮＴ－ＩＩ及びｐＬＮｎＨなどの他の副産物もＭＰ２株と比較してＭＰ１０株で減少した（表８）。
Figure 2024516207000012
［実施例４ － 複合五糖類ＬＮＦＰ－Ｉを産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロース利用技術］
［ＭＰ１３株、ＭＰ１４株 及びＭＰ１５株の遺伝子型の説明］
実施例１に記載のプラットフォーム株（「ＭＤＯ」、ＭＰ１）をベースに、以下の表９にまとめた改変を行って、完全染色体株ＭＰ１３、ＭＰ１４及びＭＰ１５を得た。
この菌株は、五糖類ＨＭＯ ＬＮＦＰ－Ｉ、四糖類ＨＭＯ ＬＮＴ及び三糖類ＨＭＯ ２’－ＦＬを産生し得る。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのグリコシルトランスフェラーゼ酵素ＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのｇａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からのＳｍｏｂ（α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ）及びローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）からの異種ＭＦＳトランスポーターＮｅｃは、３菌株の全てに存在する。ＭＰ１３株とは対照的に、ＭＰ１４株及びＭＰ１５株は、アビバクテリウム・ガリナルム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）由来の遺伝子ｓａｃＣ＿Ａｇａｌがゲノム上のそれぞれ１つ又は２つの遺伝子座に統合されているため、炭素源及びエネルギー源としてスクロースを利用し得る。
本発明は、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌなどの細胞外インベルターゼの導入が、複合五糖類ＬＮＦＰ－Ｉを産生する改変大腸菌に、炭素源及び／又はエネルギー源としてスクロースを利用する能力を付与するためにどのように有利に使用できるかを実証する。以下の表に示すように、ＭＰ１３株とＭＰ１４株又はＭＰ１５株との間の唯一の違いは、前者にはＳａｃＣ＿Ａｇａｌ酵素が存在せず、後者の２つの株にはＳａｃＣ＿Ａｇａｌ酵素が存在することである。ＭＰ１４株は、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のコＰｇｌｐＦ駆動型コピーを１つ保有するが、ＭＰ１５株はこのようなコピーを２つ保有する。
本実施例では、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ発現細胞は、スクロースを含有するバッチ培養において強力に増殖するだけでなく、流加発酵プロセスにおいても高力価でＬＮＦＰ－１を産生することが実証される。
Figure 2024516207000013
［増殖モニタリングアッセイ中に適用されるプロトコルの説明］
本実施例で開示された株は、２．５日間のプロトコルを使用して９６ウェルマイクロタイタープレート内でスクリーニングした。最初の２４時間で細胞は高密度に増殖し、次の３６時間で細胞を主要な炭素源及びエネルギー源としてスクロースを含有する培地に移した。具体的には、１日目に、２０％グルコースを含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロスを使用して新鮮な接種材料を調製した。調製した培養物を３４℃で２４時間培養した後、細胞を硫酸マグネシウムとチアミンを添加した基礎最小培地（２００ｕＬ）に移し、それに炭素源として２０％グルコース溶液と１５ｇ／Ｌスクロース溶液を初期ボーラスとして細胞に供給した。新しい培地の接種後、細胞を１２００ｒｐｍ、２８℃で７２時間振盪した。細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＶａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダーと互換性のあるマイクロタイタープレート内で、バッチ式で培養した。
［発酵プロトコル］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、１００ｍＬの３０ｇ／Ｌグルコース又はスクロース（それぞれＡＬ－Ｘ１６及びＡＬ－Ｘ１７）からなるミネラル培地並びにＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、ＮａＯＨ、クエン酸、微量元素溶液、消泡剤及びチアミンで構成されるミネラル培地から開始して、２５０ｍＬ発酵槽（Ａｍｂｒ２５０ ＨＴ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）内で培養した。最初の撹拌並びにその後の７００ｒｐｍ（最大４５００ｒｐｍ）及び１ＶＶＭ（最大３ＶＶＭ）で開始する空気流のカスケードにより、溶存酸素レベルを２０％に維持した。８．５％のＮＨ４ＯＨ溶液で滴定することにより、ｐＨを６．８に保った。１０ｇ／Ｌグルコース（ＡＬ－Ｘ１６）又はスクロース（ＡＬ－Ｘ１７）、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、クエン酸、微量元素溶液、消泡剤及びチアミンで構成される、前培養からの２％（ｖ／ｖ）接種材料で培養を開始した。基礎最小培地に含有されるグルコース又はスクロースが枯渇した後、グルコース（ＡＬ－Ｘ１６）又はスクロース（ＡＬ－Ｘ１７）含有供給液を、炭素制限条件を維持する速度で発酵槽に連続的に添加した。温度は、当初、３３℃であったが、供給の３時間後に３０℃まで低下した。ラクトースは、供給開始の３６時間後に２５％ラクトース一水和物溶液のボーラス添加として添加し、その後、ラクトースが律速因子にならないように１９時間毎に添加した。細胞の増殖、代謝活性、代謝状態を反射率及びＣＯ２発生速度のオンライン測定によって追跡した。発酵全体を通してサンプルを採取し、ＨＰＬＣを使用して、ＨＭＯ産物、ラクトース及び他の微量副産物の濃度を判定した。
［アッセイにおける増殖モニタリングの結果］
スクロースの存在下においてバッチ式で培養を行い、上記の６０時間プロトコルを使用して菌株を増殖モニタリングアッセイで試験した。異なる株がスクロース上で増殖する能力を、その遺伝子構成（すなわちスクロースの利用に直接関連するＳａｃＣ＿Ａｇａｌ酵素の発現の有無）の関数として評価するために、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸシステムによって報告された培養吸光度（６００ｎｍ）の生データを使用して、試験した株、すなわちＭＰ１３株、ＭＰ１５株及びＭＰ１５株のスクロース上での増殖曲線を検査した。データ解析ソフトウェアＳｋａｎＩｔを使用して全ての増殖曲線を抽出し、様々な計算を実行した。
図６に示すように、ゲノム上にｓａｃＣ＿Ａｇａｌを保有しないＭＰ１３株は、調製されたバッチ培養物中に存在する培地中に提供されたスクロース上では増殖できない。わずかに増殖した後（提供された低レベルのグルコースと、培地中に存在し得る部分的に分解されたスクロースのため）、ＭＰ１３株は平坦な増殖プロファイルを有する（図６）。反対に、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーをそれぞれ１つ又は２つ保有するＭＰ１４株及びＭＰ１５株は、時間経過と共にスクロース上で良好に増殖し、ＭＰ１３株よりもはるかに高い光学密度値に達する（図６）。ＭＰ１４株及びＭＰ１５株がほぼ同じ増殖プロファイルを有することも注目に値し、これは、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子のＰｇｌｐＦ駆動型コピーが１つあれば、スクロース上での強力な増殖をサポートするのに十分であることを示している（図６）。
このように、本開示は、正常な細胞生理学を有するフレキシ燃料株（２種以上の炭素源上で増殖できる）を生産するための効率的な株操作ツールを示しており、これは、当技術分野で知られている他の多重遺伝子スクロース利用技術（例えば、ｓｃｒＢＲＹＡ）と比較して、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ発現細胞における代謝負荷がおそらく低いことを示唆し得る。
本実施例では、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロースインベルターゼを表９でＭＰ１３と同定されたＬＮＦＰ－Ｉ発現宿主細胞に導入した。詳細には、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子はＰｇｌｐＦプロモーターの制御下に置かれ、１つのコピー（ＭＰ１４株）又は２つのコピー（ＭＰ１５株）で染色体に統合された。ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ発現細胞は、スクロースを含有するバッチ培養で強力に増殖するだけでなく、以下の発酵結果に示されているように、流加発酵プロセスでも高い力価でＬＮＦＰ－Ｉを産生することがここで示された。
［発酵結果］
ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＴ、２’ＦＬ及びＬＮＴ－ＩＩの生産量は、生成された全ＨＭＯの割合％として示される。ＭＰ１３株の発酵を１回行った一方、ＭＰ９株の発酵は二連で行った。発酵終点データを表１０に示す。一般に、選択された発酵プロセスでは、ＭＰ１３株及びＭＰ１５株は、いずれも高レベル且つ同様の力価でＬＮＦＰ－１を産生していた。
具体的には、スクロース上では増殖できない株、すなわちＭＰ１３は、グルコースベースのプロセス（ＡＬ－Ｘ１６）を実行すると、３つのＨＭＯからなるＨＭＯプロファイルを提供した。詳細には、ＭＰ１３株のＨＭＯプロファイルは、およそ９５％のＬＮＦＰ－１、１％のＬＮＴ及び４％の２’－ＦＬを含有する（表１０）。それと反対に、ＰｇｌｐＦプロモーターの制御下でｓａｃＣ＿Ａｇａｌを発現する株（ＭＰ１５株）は、スクロースベースのプロセス（ＡＬ－Ｘ１７）を実行すると、ＭＰ１３株と比較してより多量の２’－ＦＬを産生した。特に、ＭＰ１５株のＨＭＯプロファイルは、およそ９０％のＬＮＦＰ－１及び１０％の２’－ＦＬを含有するが、ＬＮＴを含有しない（表１０）。
結論として、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロース利用技術は、炭素源としてグルコースを使用して得られるＨＭＯプロファイルと非常に類似したＨＭＯプロファイルを提供する、適宜操作された細胞を使用した高レベルのＬＮＦＰ－Ｉ生産を可能にする。しかしながら、発酵終了時の２’－ＦＬの量に関しては傾向があり、これはスクロース非利用ＬＮＦＰ－Ｉ株よりもスクロース利用ＬＮＦＰ－１株の方がわずかに高くなる傾向がある（約５％）が、ＬＮＴ ＨＭＯ副産物はスクロース利用株では完全に消失しており、ＬＮＦＰ－１と２’ＦＬの純粋な配合物が提供される。
Figure 2024516207000014

Claims (29)

  1. インベルターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞であって、前記インベルターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ＿Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、遺伝子改変細胞。
  2. 内因性グルコース輸送系は、完全に又は部分的に不活性化される、請求項１に記載の遺伝子改変細胞。
  3. 細胞膜グルコースパーミアーゼをコードするｐｔｓＧ遺伝子は、完全に又は部分的に不活性化される、請求項２に記載の遺伝子改変細胞。
  4. １つ又は複数の母乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を産生することができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  5. 前記異種核酸配列は、前記遺伝子改変細胞のペリプラズム及び／又は細胞外培地への前記インベルターゼの連続分泌を増強することができるシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  6. 前記シグナルペプチドは、表１から選択され、好ましくは配列番号２８のシグナルペプチドである、請求項５に記載の遺伝子改変細胞。
  7. 前記インベルターゼは、非リン酸化スクロースを加水分解することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  8. 前記インベルターゼは、前記細胞の細胞周辺腔内及び／又は細胞外側でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  9. 前記異種核酸配列は、前記インベルターゼのエピソーム及び／又はゲノム統合コピーをコードする、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  10. 前記インベルターゼをコードする前記異種核酸配列の少なくとも２つのゲノム統合コピーを含む、請求項９に記載の遺伝子改変細胞。
  11. 前記インベルターゼの発現は、前記遺伝子改変細胞の主要な及び／若しくは唯一の炭素源として且つ／又は主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  12. 前記インベルターゼは、スクロースを輸送しない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  13. 完全なスクロース利用系を含有しない、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  14. 前記異種核酸配列は、前記異種核酸配列の発現を調節するための１つ又は複数の調節エレメントをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  15. 前記調節エレメントは、１つ若しくは複数の誘導性プロモーター配列及び／又は１つ若しくは複数の構成的プロモーター配列を含む、請求項１４に記載の遺伝子改変細胞。
  16. 前記調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ（配列番号４２）、若しくはＰｌａｃ（配列番号５１）、若しくはＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号３８）、若しくはＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号３９）、若しくはＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号４０）、若しくはＰｇａｔＹ（配列番号４１）又は表６で同定される前記プロモーターの変異型からなる群から選択されるプロモーターである、請求項１４又は１５に記載の遺伝子改変細胞。
  17. 原核細胞又は真核細胞である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  18. コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）若しくはハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の酵母細胞又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の糸状菌から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  19. エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種及びカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種からなる群から選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞。
  20. 生合成生産のための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞の使用。
  21. １つ又は複数のＨＭＯの生合成生産のための、２０に記載の遺伝子改変細胞の使用。
  22. １つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法であって、
    ａ）請求項１～１９のいずれか一項に記載の遺伝子改変細胞を提供するステップ、
    ｂ）炭素源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中で（ａ）の前記細胞を培養するステップ、
    ｃ）ステップ（ｂ）で産生された前記ＨＭＯを採取するステップ
    を含む方法。
  23. ステップａ）の前記遺伝子改変細胞内の前記インベルターゼは、それ自体、前記遺伝子改変細胞の細胞外側及び／又は細胞周辺腔内でスクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができ、前記酵素の発現は、前記遺伝子改変細胞の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするのに十分である、請求項２２に記載の１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法。
  24. ステップｂ）の前記スクロースは、主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源である、請求項２２又は２３に記載の１つ又は複数のＨＭＯを生合成生産する方法。
  25. 所望の生合成産物を産生することができる遺伝子改変宿主細胞において生合成生産する方法であって、
    ａ）非スクロース利用性（Ｓｕｃ－）宿主細胞又は前記所望の生合成産物を産生することができるスクロースを利用する限定された及び／若しくは非効率的な能力を有する宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ）インベルターゼをコードする異種核酸配列を前記宿主細胞に導入するステップであって、前記インベルターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である、ステップと、
    ｃ）炭素源として、主要な及び／若しくは唯一の炭素源として、且つ／又はエネルギー源として、主要な及び／若しくは唯一のエネルギー源としてスクロースを含有する適切な細胞培養培地中で（ｂ）の前記細胞を培養するステップと、
    ｄ）ステップｃ）で産生された前記生合成産物を採取するステップと
    を含む方法。
  26. グルコースパーミアーゼをコードする前記宿主細胞のｐｔｓＧ遺伝子は、完全に又は部分的に不活化される、請求項２５に記載の方法。
  27. 生合成生産で使用するための、スクロースをグルコースとフルクトースとに加水分解することができるインベルターゼであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるＳａｃＣ Ａｇａｌ又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体であるインベルターゼ。
  28. 前記生合成生産で使用される細胞の細胞周辺腔内及び／又は細胞外側で非リン酸化スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解することができる、請求項２７に記載の生合成生産で使用するためのインベルターゼ。
  29. 生合成産物は、１つ又は複数のＨＭＯである、請求項２７又は２８に記載の生合成生産で使用するためのインベルターゼ。
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