CN107603935A - 用于生产附加值生物产品的代谢改造的生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程生物,尤其是微生物如细菌和酵母,其用于制备附加值生物产品如特殊糖,活化的糖,核苷,糖苷,糖脂或糖蛋白。更具体地,本发明涉及宿主细胞,所述宿主细胞经代谢改造以致它们能够通过绕过在生物催化或发酵生产过程中出现的典型技术问题,大量且高速率地生产所述有价值的特殊产物。
Description
本申请是国际申请号PCT/EP2011/061891,国际申请日为20110712,中国申请号201180034361.2,进入中国国家阶段日期为20130111,发明名称为“用于生产附加值生物产品的代谢改造的生物”的分案申请。
发明的技术领域
本发明涉及基因工程生物,尤其微生物如细菌和酵母,其用于生产附加值生物产品如特殊糖、糖脂和糖蛋白。更具体地,本发明涉及宿主细胞,所述宿主细胞经代谢改造以致它们能够通过绕过在生物催化或发酵生产过程中出现的典型技术问题,大量且高速率地生产所述有价值的特殊产物。
背景技术
石油资源递增的成本使得人们逐渐意识到生物生产方法的潜力。这强化了公司和研究中心为开发在经济上可行且对环境友好的技术以用于生产增加数量的生物产品,例如,生物燃料、生物化学药品和生物聚合物的研究努力。这些生物产品容易降解并且生产起来需要的能量和产生的废水最少。虽然基于工业生物技术的生产方法是有利的,但是开发对沿用已久的化学合成路线的备选方案通常过于耗时且过于昂贵以致于在经济上不可行。因此,对于更快速且更加低成本地开发新的生产菌株存在明确的需要。
目前,寡糖典型地通过生物转化方法合成。通常使用分离的和纯化的酶(所谓体外生物转化)和全细胞生物催化剂。基本上,它们将一种或多种前体转化为所需的生物产品。
然而,体外生物转化的应用常常受到阻碍,原因在于产物的合成可能需要多个酶促步骤,或者原因在于需要额外的昂贵的辅因子(NADH,NADPH,UTP,...)。
体外合成的另一个缺点在于很多酶的表达和纯化很费力并且其纯化过程可能导致酶活性的降低。此外,每种酶在所述多酶生物转化方法中具有其自身的最佳方法参数,这导致优化方案非常复杂。在这样的方法中,反应平衡也起重要作用。例如,当使用磷酸化酶时,限制产物产率的设定的底物/产物比将在手边。这导致复杂的下游加工方案以将产物与底物分离(33,35)。
代谢工程(代谢改造)是优化有附加值的生物产品如特殊糖的生产的另一种方法。通常,全细胞已经被代谢改造以用于从供应的前体开始生产有附加值的生物产品。在此语境中,所述细胞被改造以致参与前体降解的所有代谢途径被切断(3,45,70,77,100)。通过这样做,所述前体被有效且直接地转化为所需的产品。
后一种方法的主要缺点在于生物质合成和所需生物产品生物合成需要不同的起始代谢物。例如,大肠杆菌(E.coli)被代谢改造以用于从葡萄糖开始有效地生产2-脱氧-鲨肌糖。该策略使得代谢改造的大肠杆菌不适合依靠葡萄糖生长,而需要加入其他底物,例如,甘油,以允许生物质合成(45)。
全细胞生产系统的第二个缺点在于需要两个阶段,即生长阶段,其中形成生物质(或生物质合成);以及随后的所需产物的生产阶段。这意味着,生长阶段与生产阶段在时间上分离(连续的阶段)。这导致所需产物的非常低的总生产率。此外,这种类型的方法难以优化。实际上,已经开发出利用过表达生产途径基因的代谢改造的细胞的发酵方法。大量的底物被转化为生物质,导致仅小量的底物流向产物(13)。
本发明克服了上述缺点,因为它提供了能够以高生产力和保证的高产率生产所需产物的代谢改造的生物(图1)。这通过将所述生物的代谢清楚地分成两部分来实现:1)所谓的‘生产部分’或‘生产途径’,和2)‘生物质和辅因子补充’部分或‘生物质和/或生物催化酶形成途径’。所述两个部分通过将糖分解为:a)活化的糖,和b)(非活化)糖而产生。所述糖a)或b)中的每个是-或可以是-所述生产途径a)或生物质和/或生物催化酶形成途径b)的第一前体,允许细胞中的拉/推(pull/push)机制。
实际上,生物质合成(其是细胞的主要目的),将活化的糖或糖转化为生物质并且使得将糖分解为糖和活化的糖的反应的平衡移动。以此方式,细胞的维持生命的动力充当生产途径的拉动机制。该拉动作用通过生物质合成产生,所述生物质合成保证了生产途径的第一底物分子的累积,这同样地并且又推动生产途径。该策略解决了如在现有技术中所述的发生在两阶段生产策略中的生产率问题。此外,通过使糖部分的一部分发生分解代谢,细胞总是被供应以必要的辅因子和所需的能量需求以用于生产特殊生物产品。目前的策略因此也解决了如在现有技术中所述的生物催化的生产中所需的辅因子补充的问题。此外,通过本发明的改造策略,生产途径中必要的酶总是被有效合成和容易地保持。
此外,本发明公开了通过本发明的代谢改造的生物、利用来源于盘基网柄菌(Dictyostellium discoideum)的2-岩藻糖基转移酶生产2-岩藻糖基乳糖。
附图简述
图1:(a)正常平衡反应,其发生在当前生产技术中(b)拉/推原理:平衡向糖和活化的糖移动。细胞的主要目的是生长,因此它在糖(通过实例)处拉动,从而形成生物质(”生物质和/或生物催化酶形成途径”)并且在生命维持后紧接着为生产途径补充必要的辅因子。由于该拉动作用,活化的糖将在细胞中积累并且推动生产途径。
图2:载有编码蔗糖磷酸化酶的质粒的大肠杆菌转化体在基本培养基上的生长速率。(缩写在表2中给出)
图3:在野生型菌株中设计的碳流。小箭头:指示代谢中的反应,粗箭头:指示增强的或新引入的反应,交叉号:指示基因的敲除或使基因功能减弱。
图4:在基础(Base)菌株1中设计的碳流。基础菌株1中的α葡糖-1-磷酸(αG1P)库增加,因为将αG1P转化为细胞组分的主反应被切断。小箭头:指示代谢中的反应,粗箭头:指示增强的或新引入的反应,交叉号:指示基因的敲除或使基因功能减弱。
图5:在依靠葡萄糖生长的野生型大肠杆菌MG1655(WT),依靠蔗糖生长的大肠杆菌MG1655 P22-BaSP,和依靠蔗糖生长的堵塞(plug)菌株MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ P22-BaSP中的α葡糖-1-磷酸库:摇瓶实验和1.5L分批实验。
图6:在缓冲的LB培养基上培养ΔpgmΔlacZΔglgC(3KO)P22-BaSP的过程中蔗糖、乙酸和生物质浓度的演变。
图7:在缓冲的LB培养基上培养ΔpgmΔlacZΔglgC(3KO)P22-BaSP的过程中α葡糖-1-磷酸、果糖、葡萄糖和丙酮酸浓度的演变。
图8:纤维二糖生产者ΔpgmΔlacZΔglgC(3KO)P22-BaSP-CuCP的示意图。
图9:ΔpgmΔlacZΔglgCΔagp(4KO)P22-BaSP-CuCP的纤维二糖生产和产率。高磷酸盐指示0.2M磷酸盐的磷酸盐浓度,低磷酸盐指示13mM磷酸盐的浓度。
图10:由基础菌株5开始,可以生产岩藻糖基化的糖衍生物如岩藻糖基乳糖以及更具体地1,2-岩藻糖基乳糖。所述菌株被改良为迫使细胞生产作为GDP-岩藻糖的合成中的中间体的果糖-6-磷酸。然后葡萄糖或葡糖-1-磷酸(如果起始酶是蔗糖酶或蔗糖磷酸化酶)通过戊糖磷酸途径被送至中心碳代谢。图10显示向产物和生物质的路线以及实现此所需的敲除,左途径指示使用蔗糖磷酸化酶的最佳路线,而右途径指示使用转化酶并结合葡糖激酶的最佳路线。
图11:野生型染色体在pgm基因位置处的部分基因组序列。pgm基因序列被标记为粗体/斜体。
图12:突变体菌株的部分基因组序列,其中仅瘢痕(scar)保持在pgm基因的位置处。瘢痕序列被标记为粗体/斜体。
图13:pgm突变体菌株的部分基因组序列,其中pgm基因被部分的GFP蛋白序列替代。新引入的序列被标记为粗体/斜体。
图14:pgm突变体菌株的部分基因组序列,其中pgm基因被卡那霉素盒替代。新引入的序列被标记为粗体/斜体。
图15:转化有来源于青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的异源蔗糖磷酸化酶的野生型菌株和具有来源于青春双歧杆菌的异源蔗糖磷酸化酶和来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的异源基因tts的突变体菌株ΔpgmΔagpΔglgCΔlacZΔglkΔptsG在多糖水解后释放的葡萄糖的量。
图16:具有基因型ΔlacZΔglgCΔagpΔptsGΔmalPQΔycjU pCXp22MPp22KP的曲二糖生产菌株的曲二糖、麦芽糖和光密度随时间的演化。
图17:ΔpgiΔpfkAΔpfkB突变体菌株在基于蔗糖的培养基中的生长曲线(profile)和F6P累积。
图18:来自不同糖基转移酶家族的岩藻糖基转移酶的系统树,该树用MCoffee(58)构建。
图19:盘基网柄菌和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)岩藻糖基转移酶的比对,彩色标记的氨基酸是在GT家族11的2-岩藻糖基转移酶中发现的保守基序。红色指示基序1,蓝色,基序2,以及绿色,基序3(67)。
图20:利用酚红的岩藻糖基转移酶测定的LC-MS结果。上面的色谱图是没有GDP-岩藻糖的空白对照,下面的是盘基网柄菌(D.discoideum)岩藻糖基转移酶测定的样品。13.5min,2FL的峰出现在色谱图中。
图21:部分岩藻糖基转移酶的2-岩藻糖基乳糖LC MSMS分析。上面的色谱图显示100mg/l2-岩藻糖基乳糖的标准物,下面的色谱图显示酶测定的2-岩藻糖基乳糖峰。在该分析中,仅利用质谱仪扫描2-岩藻糖基乳糖的质量。
发明描述
本发明公开了代谢改造的生物,尤其微生物,其能够以高生产力以及保证的高产率生产附加值生物产品。本发明的生物被代谢改造以致两条不同的路线被构建,从而产生产物及生长/生物质。这通过以下方式实现:降低或消除将来自′生物质和/或生物催化酶和/或辅因子补充部分′的代谢物转化为来自′生产途径′部分的代谢物的酶催化反应的活性,并且反过来,例如通过减少或消除/敲除至少一个、一些或全部的编码进行将生产途径中间体转化为生物质前体的反应的酶的基因,和/或减少或消除/敲除至少一个、一些或全部的编码进行降解生产途径中间体的反应的酶的基因。此外,这些代谢/基因改变不消弱改造的细胞的生长。例如:可以将糖水解酶与糖激酶、糖合酶和糖磷酸化酶组合地引入到细胞中。后几种酶转化底物,所述底物在糖部分和活化的糖部分(例如磷酸化的糖部分,UDP,CMP,GDP,ADP,TDP或dTDP...活化的糖部分)中含有糖、寡糖、多糖或其混合物。所述细胞的另外的代谢改造涉及阻断从活化的糖部分开始向生物质成分的途径。以此方式,(非活化)糖部分被用作‘燃料’(或能量源)和结构单元以用于合成生物质,合成将进行活化的糖部分向所需产物(=例如特殊糖)的转化的多种生物催化酶和合成必要的辅因子(NADH,ATP,UTP...)。相反地,活化的糖部分也可以被用作‘燃料’,而糖部分被糖激酶活化并被‘推’入所需特殊产物的生产路线中。
使用本发明的改造的生物,通过活化的糖的转化的产物形成可以与由其他糖部分提供燃料的生长相联系(或者反之亦然)。以此方式,细胞增殖的天然动力被用作推动所需生物产品生产的财富。这意味着,在生物产品的实际生产可以开始前必须生产生物质的以前的缺点现在变成了优点。该方法学导致高生产率,而没有伴随多酶系统和两阶段发酵系统的固有问题。此外,本发明的生物可以使用如上所述的相同底物用于生长或生物质生产以及以高速率生产所需产物,因此该代谢改造策略背后的总原理是如同样在上面说明过的拉/推原理。产生生物质和辅因子的中心碳代谢拉动糖部分的一部分用于生长,而另一部分在细胞中累积,推动生产途径。
后一方法不仅可以用于生产所需特殊糖或活化的糖,而且还可以用于合成多种糖基化化合物,例如,糖、核苷、糖基磷酸、糖蛋白和糖脂。
可以将多种起始酶引入到细胞中从而结合基因敲除将代谢分解为两部分。可以用于将糖分解为糖和活化的糖的酶的非限制性实例有蔗糖磷酸化酶,蔗糖合酶,与葡糖激酶和/或果糖激酶组合的蔗糖酶(转化酶),与葡糖激酶组合的海藻糖酶,与葡糖激酶组合的麦芽糖酶,与果糖激酶组合的蔗糖-6-磷酸水解酶,麦芽糖磷酸化酶,麦芽糖合酶,与磷酸化酶或合酶或水解酶组合的淀粉酶,乳糖合酶、乳糖磷酸化酶、与半乳糖激酶和/或葡糖激酶组合的乳糖酶(或β-半乳糖苷酶)。
本发明涉及代谢改造的生物,其用于生产至少一种特殊产物,所述特殊产物选自由以下组成的组:糖、活化的糖、核苷、糖苷、糖脂和糖蛋白,其特征在于:
a)所述生物通过引入至少以下进行基因改造:i)与编码糖激酶的基因组合的编码糖水解酶的基因,ii)编码糖合酶的基因,或,iii)编码糖磷酸化酶的基因,以致所述生物能够将二糖、寡糖、多糖或其混合物分解为糖和活化的糖,并且
b)所述生物被进一步基因改造,以致使所述生物的不同于步骤a)的任何引入基因的至少一个其他基因功能减弱或功能丧失,并且其中所述其他基因编码将所述活化的糖转化为生物质和/或生物催化的酶的酶。
术语‘糖’涉及单糖如,但不限于,醛糖,酮糖,戊糖,甲基戊糖,己糖,多元醇,其具有或不具有羰基、羧基、氨基或者其中羟基被(但不限于)氢、氨基、硫醇、磷酸和/或类似基团或这些基团的衍生物替代。术语‘糖’还涉及二糖、寡糖和多糖,所述二糖、寡糖和多糖由上述一种或多种单糖组成,所述单糖彼此通过糖苷键连接。
术语‘核苷’涉及被核苷酸取代的各个单糖,例如是,但不限于,UDP、GDP、ADP、TDP、CMP或dTDP。
术语‘糖苷’涉及与其他化合物形成糖苷键的糖,所述其他化合物如,但不限于甾醇类、酚类、脂肪酸类、磷脂酰肌醇类、维生素C、类胡萝卜素和青蒿素(artimisinine)。
术语‘糖脂’涉及与脂肪酸或脂质形成糖苷键的糖。
术语‘糖蛋白’涉及与蛋白质形成糖苷键的糖。
术语‘糖基磷酸’涉及磷酸化的糖。
本发明还涉及如上所述的生物,其中所述生物通过引入将所述活化的糖转化为特殊产物的至少一个其他基因而被进一步基因改造,或者,其中所述生物的将所述活化的糖转化为特殊产物的至少一个其他内源基因被过表达。
此外,本发明涉及如上所述的生物,其中所述生物能够依靠二糖、寡糖、多糖或其混合物作为主要碳源生长。术语‘主要’是指用于生物质形成的最重要的碳源,即所需的全部碳的75、80、85、90、95、98、99%来源于上述碳源。在本发明的一个实施方案中,所述碳源是所述生物的唯一碳源,即所需的全部碳的100%来源于上述碳源。
术语‘代谢改造’是指在所述生物中实施遗传和调节过程的优化以增加某种所需物质或产物的生物生产。后者的产物因此被命名为‘特殊产物’并且具体涉及所需糖(活化或非活化)、核苷、糖苷、糖脂或糖蛋白。所述产物的一些非限制性实例有糖衍生物如1,2-岩藻糖基乳糖、1,3-岩藻糖基乳糖、1,4-岩藻糖基乳糖、1,6-岩藻糖基乳糖、肌醇半乳糖苷、水苏糖、globotriose、半乳糖(β1-4)鼠李糖、槐糖、纤维二糖、UDP-葡萄糖、槐糖脂、肌醇、L-阿拉伯糖、青蟹肌糖、糖基磷脂酰肌醇、乳-N-二糖、乳-N-四糖、乳糖胺、岩藻糖基化的半乳糖基寡糖、L-岩藻糖、N-Ac葡糖胺、唾液酸、唾液乳糖、脱乙酰壳多糖和壳多糖。
术语‘改造’涉及可以用于基因改造生物的任何公知的技术,如例如在(9,17,19,21,22,42)中所述的。
术语‘能够依靠二糖、寡糖、多糖或其混合物作为主要碳源生长的生物’是指本发明的生物可以使用相同的二糖、寡糖、多糖或其混合物用于生长(或生物质生产)和所需产物的生产两者,并且它们可以使用后者的糖作为唯一碳源以便增殖和/或具有代谢活性。简言之,本发明的生物能够在包含所述糖作为唯一碳源的培养基中或上增殖和代谢。
术语‘分解(或转化)成糖和活化的糖’是指被用作碳源的后者的糖将被本发明的生物分解(或转化)成活化的糖部分-活化的糖部分的一些非限制性实例有具有磷酸、UDP、GDP、ADP、TDP或dTDP基团的糖部分-和非活化的糖部分,所述非活化的糖部分不具有或者不结合于所述后几种基团。
术语‘生物催化酶’是指特殊糖的生产所需的所有酶。
术语‘生物质’是指所有细胞组分(即蛋白、DNA、RNA、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰甘油、腐胺、亚精胺、肽聚糖、糖原和/或脂多糖(63),所述细胞组分可以在修饰的特殊糖生产菌株中由未用于特殊糖(和其他附加值产物)生产路线的糖部分合成。
术语‘使其功能减弱或功能丧失的基因’是指技术人员熟知的技术(如使用siRNA、RNAi、miRNA、asRNA、基因突变、基因敲除、转座子诱变、...),所述技术用于改变基因以使它们生产功能性终产物的能力减弱(即与有功能的野生型基因相比统计上显著地‘能力减弱’)或完全没有能力(如被敲除的基因)生产功能性终产物(2,4,5,7,8,14,19,37,40,47,73,79,80,85,93,98)。
术语‘(基因)敲除’因此是指使基因功能丧失。
术语‘多糖’是指含有6个以上单糖亚单元的糖。
本发明还涉及如上所述的代谢改造的生物,其中步骤a)的基因改造是任选的,或,被至少以下的过表达替代:i)与编码糖激酶的内源或异源基因组合的编码糖水解酶的内源基因,ii)编码糖合酶的内源基因,或,iii)编码糖磷酸化酶的内源基因,并且其中所述生物能够将二糖、寡糖、多糖或其混合物分解为糖和活化的糖。
本发明的优选的糖水解酶是乳糖酶、转化酶、蔗糖、海藻糖酶、蔗糖-6-磷酸水解酶、麦芽糖酶或淀粉酶。本发明的优选的糖激酶是半乳糖激酶、果糖激酶、葡糖激酶或甘露糖激酶。
本发明还涉及如上所述的代谢改造的生物,其中步骤b)中的所述活化的糖被所述糖替代。因此,该实施方案中的‘活化的糖部分’被用作‘燃料’,而‘糖部分’被激酶活化并且被推入所需特殊产物的生产路线中。
本发明还涉及如上所述的代谢改造的生物,其中步骤a)中的所述基因将二糖、寡糖或多糖分解为两个相似的或不同的活化的糖或两个相似的或不同的糖。
如上所述的术语‘生物’是指选自由细菌、酵母或真菌细胞组成的列表的微生物,或,是指植物或动物细胞。后者的细菌优选属于物种大肠杆菌(Escherichia coli)。后者的酵母优选属于物种酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)。
更具体地,本发明涉及如上所述的代谢改造的生物,其中所述活化的糖选自由以下组成的组:α葡糖-1-磷酸,α半乳糖-1-磷酸,β葡糖-1-磷酸,β半乳糖-1-磷酸,果糖-6-磷酸,葡糖-6-磷酸,UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖,并且其中所述糖选自由果糖、葡萄糖和/或半乳糖组成的组。
本发明如上所述地还涉及如上所述的代谢改造的生物,其中所述糖水解酶是乳糖酶,转化酶,蔗糖酶,麦芽糖酶,海藻糖酶,蔗糖-6-磷酸水解酶和/或淀粉酶,并且,其中所述糖激酶是半乳糖激酶,果糖激酶,葡糖激酶和/或甘露糖激酶。
甚至更具体地,本发明涉及如上所述的代谢改造的生物,其中:
-步骤a)中的所述基因编码蔗糖磷酸化酶,和/或
-使步骤b)中的以下基因功能丧失:编码β-半乳糖苷酶的基因,和/或,编码葡糖磷酸变位酶的基因,和/或,编码葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的基因,和/或,编码磷酸酯酶(如但不限于葡糖-1-磷酸酯酶)的基因,和/或,编码葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖-4-差向异构酶的基因,和/或,编码UDP-葡萄糖:半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-吡喃半乳糖变位酶的基因,和/或,编码UDP-半乳糖:(葡糖基)脂多糖-1,6-半乳糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-半乳糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖醛酸转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因,和/或,编码UDP-糖水解酶的基因,和/或,编码转化酶的基因,和/或,编码麦芽糖酶的基因,和/或,和/或编码海藻糖酶的基因,和/或,编码糖转运磷酸转移酶的基因,和/或,编码己糖激酶的基因。
后者的代谢改造的生物的一个实例是这样的生物,其中:
-步骤a)中的所述基因是编码可能(但不独有地)来源于乳酸菌如青春双歧杆菌、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和/或变异链球菌(Streptococcus mutans)的蔗糖磷酸化酶基因,和/或
-步骤b)中的所述基因是:基因lacZ、基因pgm、基因ycjU、基因glgC、基因agp、基因ptsG、基因glk、基因glf、基因waaB、基因ushA、基因wcaA、基因wcaC、基因wcaE、基因wcaI、基因wcaL、基因wcaJ、基因galU、基因galF、基因galE、基因malP、基因malQ、和/或基因galT(20,25,27,28,32,46,48,49,52,54,62,82,86,87,96,97)。
如上所述的代谢改造的生物的另一个实例是这样的生物,其中:
-步骤a)中的所述基因编码可能(但不独有地)来源于乳酸菌如青春双歧杆菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌和/或变异链球菌的蔗糖磷酸化酶,和/或
-步骤b)中的所述基因是:基因PGM1、基因PGM2、基因GLG1、基因GLG2、基因INM1、基因INM2、基因GLK1、基因HXK1、基因HXK2、基因GAL10、基因GAL7、基因YHL012W、基因UGP1、基因GSY1、基因GSY2、基因DIE2、基因ALG8、基因ATG26、基因SUC2、基因MAL32、基因MAL12、基因YJL216C,和/或,基因YGR287C,和/或,FEN1,和/或,FKS1,和/或,GSC2,和/或,TPS1(10,12,15,16,18,24,30,31,36,41,51,56,57,59,61,66,76,81,84,89-91,99)。
后者的改造的生物可以,例如但不限于,用于生产作为特殊产物的纤维二糖、曲二糖、岩藻糖、L-阿拉伯糖、肌醇、棉子糖、水苏糖、L-鼠李糖或L-核糖。
本发明的另一方面涉及如上所述的代谢改造的生物,其中步骤a)的所述蔗糖磷酸化酶被蔗糖合酶、麦芽糖磷酸化酶或麦芽糖合酶替代,或,其中步骤a)的所述蔗糖磷酸化酶被乳糖磷酸化酶或乳糖合酶替代。
后者的生物可以,例如但是不限于,用于生产作为特殊产物的槐糖、UPD-葡萄糖、糖脂、黄酮3-O-β-D-葡萄糖苷(步骤a中的蔗糖合酶)、半乳糖(β1-4)鼠李糖(步骤a中的乳糖磷酸化酶),或,UDP-半乳糖、肌醇半乳糖苷、水苏糖或globotriose、鞘氨醇半乳糖苷(步骤a中的乳糖合酶)。
本发明还涉及如上所述的代谢改造的生物,其中步骤b)中的所述活化的糖被所述糖替代,并且其中:
-步骤a)中的所述基因编码蔗糖磷酸化酶,和/或
-使步骤b)中的以下基因功能丧失:编码β-半乳糖苷酶的基因,和/或,编码葡糖-6-磷酸异构酶的基因,和/或,编码葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的基因,和/或,编码磷酸酯酶(例如,葡糖-1-磷酸酯酶)的基因,和/或,编码磷酸果糖激酶A的基因,和/或,编码磷酸果糖激酶B的基因,和/或,编码磷酸葡糖酸脱水酶的基因,和/或,编码2-酮-3-脱氧葡糖酸-6-磷酸醛缩酶的基因,和/或,编码葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖-4-差向异构酶的基因,和/或,编码UDP-葡萄糖:半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-吡喃半乳糖变位酶的基因,和/或,编码UDP-半乳糖:(葡糖基)脂多糖-1,6-半乳糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-半乳糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖醛酸转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因,和/或,编码GDP-甘露糖水解酶的基因,和/或,编码UDP-糖水解酶的基因,和/或,编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因,和/或,编码UDP-N-乙酰葡糖胺烯酰基丙酮酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-N乙酰葡糖胺乙酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶的基因,和/或,编码十一异戊烯基(undecaprenyl)-磷酸-α-N-乙酰葡糖胺转移酶,和/或,葡糖-6-磷酸-1-脱氢酶的基因,和/或,编码L-谷氨酰胺:D-果糖-6-磷酸转氨酶的基因,和/或,编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因,和/或编码山梨醇-6-磷酸脱氢酶的基因,和/或,编码甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶的基因,和/或编码阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶的基因,和/或,编码转化酶的基因,和/或,编码麦芽糖酶的基因,和/或,和/或编码海藻糖酶的基因,和/或,编码糖转运磷酸转移酶的基因,和/或,编码己糖激酶的基因。
更具体地,本发明涉及如上所述的代谢改造的生物,其中:
-步骤a)中的所述基因是来源于乳酸菌如青春双歧杆菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌或变异链球菌的蔗糖磷酸化酶,和/或
-步骤b)中的所述基因是:基因lacZ、基因pgi、基因glgC、基因agp、基因pfkA、基因pfkB、基因waaB、基因ushA、基因eda、基因edd、基因wcaA、基因wcaC、基因wcaE、基因wcaI、基因wcaL、基因wcaJ、基因wcaB、基因wcaF、基因wcaK、基因wcaD、基因galU、基因galF、基因galE、基因gmm、基因galT、基因manA、基因murA、基因lpxA、基因rffE、和/或、基因rfe、基因glmS、基因srlD、基因mtlD、基因alsE和/或、zwf(6、20、25、28、29、32、43、44、46、49、52-55、62、65、75、78、82、86、87、96、97、101)。
根据本发明的另一种代谢改造的生物是这样的生物,其中:
-步骤a)中的所述基因是编码来源于乳酸菌如青春双歧杆菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌或变异链球菌的蔗糖磷酸化酶的基因,和/或
-步骤b)中的所述基因是:基因PGI1、基因PFK1、基因PFK2、基因PFK26、基因PFK26、基因PFK27、基因GND1、基因GND2、基因PMI40、基因ZWF1、基因GFA1、基因GLG1、基因GLG2、基因INM1、基因INM2、基因GLK1、基因HXK1、基因HXK2、基因GAL10、基因GAL7、基因YHL012W、基因UGP1、基因GSY1、基因GSY2、基因DIE2、基因ALG8、基因ATG26、基因SUC2、基因MAL32、基因MAL12、基因YJL216C、和/或基因YGR287C,和/或FEN1,和/或FKS1,和/或GSC2,和/或TPS1(12、15、16、24、26、30、31、34、36、38、39、41、51、56、57、59-61、64、66、74、76、83、84、89、90、95、99)。
后者的改造的生物可以,例如,用于使用来源于例如但不限于幽门螺杆菌、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、黄牛(Bos taurus)和盘基网柄菌的特定岩藻糖基转移酶来生产作为特殊产物的岩藻糖基化的糖衍生物如岩藻糖基乳糖,并且更具体地α-1,2-岩藻糖基乳糖,α-1,3-岩藻糖基乳糖,α-1,4-岩藻糖基乳糖,α-1,6-岩藻糖基乳糖。此外,所述改造的生物可以用于通过壳多糖合酶和壳多糖脱乙酰酶生产脱乙酰壳多糖,或者通过引入与肌醇单磷酸酯酶组合的肌醇-1-磷酸合酶生产肌醇。
将所述活化的糖转化为特殊产物的基因的具体实例是编码以下的基因:差向异构酶、转移酶、还原酶、(焦)磷酸化酶、(去)羧化酶、脱水酶、通透酶、合酶和/或异构酶。因此本发明涉及如上所述的代谢改造的生物,其中将所述活化的糖转化为特殊产物的基因编码差向异构酶、转移酶、还原酶、脱氢酶、氧化酶、焦磷酸化酶、(去)羧化酶、脱水酶、通透酶、合酶和/或异构酶。本发明甚至更具体地涉及后者的代谢改造的生物,其中所述差向异构酶是UDP-半乳糖-4-差向异构酶或UDP-N-乙酰葡糖胺差向异构酶,和/或,其中所述转移酶是糖基转移酶、唾液酸基转移酶或磺基转移酶。
本发明还涉及如上所述的代谢改造的生物,其中所述特殊产物是单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、寡糖、多糖、核苷、O-糖苷、S-糖苷、N-糖苷、C-糖苷、糖蛋白、糖脂或活化的糖,诸如但不限于肌醇、L-阿拉伯糖、青蟹肌糖、糖基磷脂酰肌醇、乳-N-二糖、乳-N-四糖、乳糖胺、岩藻糖基化的半乳糖基寡糖(GOS)、L-岩藻糖、N-Ac葡糖胺、唾液酸、唾液乳糖、脱乙酰壳多糖、壳多糖、1,2-岩藻糖基乳糖、1,3-岩藻糖基乳糖、1,4-岩藻糖基乳糖、1,6-岩藻糖基乳糖、肌醇半乳糖苷、水苏糖、globotriose、半乳糖(β1-4)鼠李糖、槐糖、纤维二糖、UDP-葡萄糖和槐糖脂。
本发明还涉及生产如上所述的特殊产物的方法,所述方法包括:
i)代谢改造如上所述的微生物,以及
ii)培养所述基因工程微生物,以及
iii)提取并纯化所述特殊产物。
清楚的是,在本发明中可以使用本领域中已知的用于培养微生物以及从所述培养物中提取和纯化特殊产物的任何方法。
此外,本发明涉及来源于盘基网柄菌并且具有由SEQ ID NO:1给出的氨基酸序列的2-岩藻糖基转移酶,或,其具有2-岩藻糖基转移酶活性的片段,或,其具有至少75%的序列同一性并且具有2-岩藻糖基转移酶活性的变体在生产2-岩藻糖基乳糖(α1,2-岩藻糖基乳糖)中的用途。具有如上所述的2-岩藻糖基转移酶活性的具体片段由SEQ ID NO:4给出。
使用编码如上所述的2-岩藻糖基转移酶的核酸,并且具体地其中所述核酸由SEQID NO:2或SEQ ID NO:3(两者都编码SEQ ID NO:1)给出,以生产岩藻糖基乳糖也是本发明的部分。编码SEQ ID NO:4的核酸由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6给出,并且也是本发明的部分。
术语‘片段’是指这样的蛋白质(或肽或多肽),其与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比包含较少的氨基酸,并且其保持所述2-岩藻糖基转移酶活性。所述片段可以-例如-是缺失了C末端和/或N末端处的氨基酸的总数的10%以下的蛋白质,或者可以对应于SEQ ID NO:4。术语“变体”是指这样的蛋白质,其与SEQ ID NO:1或其片段具有至少75%序列同一性,优选具有至少76-85%序列同一性,更优选具有至少86-90%序列同一性或最优选具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性,并且编码保持所述2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
因此,直向同源物,或(除SEQ ID NO:1所来源的盘基网柄菌以外的)其他属和种中的、在氨基酸水平具有至少75%同一性并且具有所述功能的基因是本发明的部分。氨基酸序列同一性的百分比通过两个序列的比对以及鉴定具有相同氨基酸的位置的数目来确定,所述具有相同氨基酸的位置的数目除以所述序列中较短者的氨基酸的数目并x 100。后者的‘变体’也可以仅以保守取代和/或修饰区别于如SEQ ID NO:1所示的蛋白,以使所述蛋白具有2-岩藻糖基转移酶活性的能力被保持。″保守取代″是这样的取代,其中氨基酸被具有相似性质的另一个氨基酸取代,以使蛋白质化学领域的技术人员将预期所述蛋白的性质基本不变。通常,以下的氨基酸组表示保守改变:(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his;和(5)phe、tyr、trp、his。
变体还可以(或备选地)是如本文所述的蛋白,所述蛋白例如通过缺失或添加对如以上所定义的2-岩藻糖基转移酶活性、酶的二级结构和亲水性质影响最小的氨基酸被修饰。
以下具体序列,如上所指出,是本发明的部分:
SEQ ID NO:1:盘基网柄菌的2-岩藻糖基转移酶的完整氨基酸序列:
MNDSPIISVVLPFLIKDNDDKSLNYQGINNLIISIDSIIEQTFKEWELILVDDGSNNEILEQLLSKRYSTDNRIKFIINKENKGIVKSLNDAILNHCSPTSKYIARMDSDDISHPTRLQSQLKYLQSNETIDILGCPIKMFNNNKLIEILNNNNNNNNINNNVKELINIINNEESFKFIQHPDKDILMWSMFFNCCIVHPSVIFKRSIFTIEHCYEENNQFPFIEDYLFWLKSLIMKGLNISNIQSSTPLLYLRKHNNSISFKNIEKQKDSTANASCYYLNILFKRFNIDSEIIQNSSLSMKEIIQFFQLSPSSLSKINNISIELFEFAFKYLELIEKSCTKQQPNYSNSIKDAANEKMGELVSLCLSNYPNNQKSSLLWEKWLSRNPTSQLLSLLSNLNVKSSTTIINNNINNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNSILNFISGINSNKINTPKSNNNKFKENGIRIICFSKDRAFQLKEYLRTFFKYLKNDDNGNDKFEIIVDVLFTYSNEKFKNSYQLVIESFPQVNFIKEENFTDQLINLVQKTNKLEYVMFSVDDILYYNEFNLKEYCLSLNSEPLALGFYMKLNKNITYCHTCNQDITIPLNSNTISRTENNFKYLKWNRNDNDCKKDWNYPWDLCSTIYRCNDIDSIINGIVKYYGIRNGINHPNRFEFNGNRPIIQKQIYQNKPYCLCLSDHYSPMSVVTINRVQDVYDNPIYDQTLSLDDLDQLLYSNKSLNDEKYKENSLSLNFKSVHIGELFIS
SEQ ID NO:2:用于在大肠杆菌中表达的编码SEQ ID NO:1的密码子优化的核苷酸序列:
ATGAACGATAGCCCGATTATTAGCGTTGTTCTGCCGTTTCTGATCAAAGATAACGATGATAAAAGCCTGAACTACCAGGGCATTAACAACCTGATTATTAGCATCGATAGCATCATCGAGCAGACCTTTAAAGAATGGGAACTGATTCTGGTTGATGATGGCAGCAATAACGAAATTCTGGAACAGGCTGCTGAGCAAACGTTATAGCACCGATAACCGCATCAAATTTATTATTAATAAAGAAAATAAAGGCATTGTGAAAAGCCTGAATGATGCCATTCTGAATCATTGTAGCCCGACCAGCAAATATATTGCACGTATGGATAGCGACGATATTAGCCATCCGACCCGTCTGCAGAGCCAGCTGAAATATCTGCAGAGCAATGAAACCATTGATATTCTGGGTTGCCCGATCAAAATGTTTAATAATAATAAACTGATTGAAATTCTGAATAATAATAACAATAACAACAATATTAATAATAATGTGAAAGAACTGATTAATATTATTAATAATGAAGAAAGCTTTAAATTTATTCAGCATCCGGATAAAGATATTCTGATGTGGTCCATGTTCTTCAATTGCTGTATTGTTCATCCGAGCGTGATTTTTAAACGCAGCATTTTTACCATCGAGCACTGCTATGAAGAGAATAATCAGTTTCCGTTCATCGAGGATTACCTGTTTTGGCTGAAATCCCTGATTATGAAAGGCCTGAACATTAGCAATATCCAGAGCAGCACACCGCTGCTGTATCTGCGTAAACATAATAACAGCATTAGCTTTAAAAATATTGAAAAACAGAAAGATAGCACCGCCAATGCCAGCTGTTATTATCTGAACATTCTGTTCAAACGCTTTAACATCGACAGCGAAATTATTCAGAATAGCAGCCTGAGCATGAAAGAAATCATCCAGTTTTTTCAGCTGAGCCCGAGCAGCCTGTCCAAAATTAATAACATTAGCATCGAACTGTTTGAATTTGCCTTTAAATATCTGGAACTGATCGAGAAAAGCTGTACCAAACAGCAGCCGAATTATAGCAACAGCATTAAAGATGCAGCCAACGAAAAAATGGGTGAACTGGTTAGCCTGTGTCTGAGCAATTATCCGAATAATCAGAAAAGCAGTCTGCTGTGGGAAAAATGGCTGAGCCGTAATCCGACCAGCCAGCTGCTGAGTCTGCTGAGCAATCTGAATGTTAAAAGCAGCACCACCATTATTAATAACAATATTAACAACAACAATAATAATAACAACAATAATAACAATAACAATAACAATAATAACAACAACAACAATAATAATAATAACAACAACAGCATTCTGAATTTTATTAGCGGCATTAATAGCAATAA.AATTAATACCCCGAAAAGCAACAATAACAAATTTAAAGAGAATGGCATTCGCATTATTTGCTTCAGCAAAGATCGTGCATTCCAGCTGAAAGAATATCTGCGCACCTTCTTCAAATATCTGAAAAATGATGATAATGGCAATGATAAATTTGAAATTATTGTGGATGTGCTGTTTACCTATAGCAATGAAAAATTCAAAAATAGCTATCAGCTGGTGATCGAAAGCTTTCCGCAGGTTAACTTTATTAAAGAAGAAAACTTTACCGATCAGCTGATTAACCTGGTGCAGAAAACCAACAAACTGGAATATGTGATGTTCAGCGTGGATGATATCCTGTATTACAACGAGTTCAATCTGAAAGAGTATTGCCTGAGCCTGAATAGCGAACCGCTGGCACTGGGTTTTTATATGAAACTGAATAAAAATATTACCTATTGCCATACCTGCAACCAGGATATTACCATTCCGCTGAATAGCAATACCATTAGCCGCACCGAAAATAACTTTAAATACCTGAAATGGAATCGCAACGATAATGATTGCAAAAAAGACTGGAACTATCCGTGGGATCTGTGTAGCACCATTTATCGTTGCAACGACATTGACAGCATCATTAATGGTATTGTGAAATATTATGGTATTCGCAACGGCATTAATCATCCGAATCGCTTTGAATTTAATGGCAACCGTCCGATTATTCAGAAACAAATCTACCAGAACAAACCGTATTGTCTGTGCCTGAGCGATCATTATTCACCGATGAGCGTTGTTACCATTAATCGTGTTCAGGATGTGTATGATAACCCGATTTATGATCAGACCCTGAGCCTGGATGATCTGGATCAACTGCTGTATAGCAATAAATCCCTGAACGATGAAAAATATAAAGAAAACAGCCTGAGTCTGAACTTCAAAAGCGTTCATATTGGCGAACTGTTCATCAGCTAA
SEQ ID NO:3:编码SEQ ID NO:1(盘基网柄菌的2-岩藻糖基转移酶)的天然核苷酸序列:
ATGAATGATTCACCAATAATAAGTGTAGTTTTACCTTTTTTAATAAAGGACAATGACGATAAATCATTAAATTACCAAGGAATAAATAATTTAATAATATCAATAGATAGCATTATTGAACAAACTTTTAAAGAATGGGAATTAATTTTAGTTGATGATGGATCAAATAATGAAATTTTGGAGCAATTACTTTCAAAAAGATATAGTACAGATAATAGAATTAAATTCATAATAAATAAAGAGAATAAAGGTATTGTTAAAAGTTTAAATGATGCAATTTTAAATCATTGTTCACCAACTTCAAAATATATTGCTCGTATGGATTCAGATGATATTTCTCATCCAACAAGATTACAATCTCAACTTAAATATCTTCAATCAAATGAAACAATTGATATATTAGGTTGTCCAATTAAAATGTTTAATAATAATAAATTAATTGAAATTTTAAATAATAATAATAATAATAATAATATTAATAATAATGTGAAAGAGTTAATTAATATAATTAATAATGAAGAATCTTTTAAATTTATTCAACATCCTGATAAAGATATTTTAATGTGGTCAATGTTTTTCAATTGTTGTATTGTTCACCCTTCTGTAATATTTAAAAGATCGATATTCACTATTGAACATTGTTATGAAGAAAACAACCAATTTCCATTCATTGAAGATTACTTATTTTGGTTAAAATCCTTAATAATGAAAGGTTTAAATATTTCAAATATCCAATCATCAACACCATTACTATATTTAAGAAAACATAATAACTCTATATCTTTTAAAAATATTGAAAAACAAAAAGATTCCACTGCTAATGCATCTTGTTATTATCTAAATATACTTTTTAAAAGATTTAATATTGATTCTGAAATTATTCAAAATTCTTCACTCTCAATGAAAGAAATTATTCAGTTCTTTCAACTTTCACCATCATCTTTATCAAAAATCAATAATATTTCAATTGAATTATTTGAATTTGCATTTAAATATCTAGAATTAATTGAAAAATCATGTACAAAACAACAACCAAACTATTCAAACAGTATAAAAGATGCAGCAAATGAAAAAATGGGTGAATTAGTATCTTTATGTTTATCAAATTATCCAAATAATCAAAAATCATCATTACTTTGGGAAAAATGGTTATCAAGAAATCCAACCTCACAATTACTATCACTTTTATCAAATTTAAATGTAAAATCTTCAACTACTATAATTAATAATAATATTAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATTCAATTTTAAATTTTATATCTGGCATTAATAGTAATAAAATAAATACTCCAAAATCTAATAATAATAAATTTAAAGAAAATGGAATTAGAATAATTTGTTTCTCAAAAGATAGAGCATTTCAATTAAAAGAATATCTTAGAACATTTTTTAAATATTTAAAAAATGATGATAATGGAAATGATAAATTTGAAATTATTGTTGATGTATTATTTACATATTCAAATGAGAAATTCAAAAACTCTTATCAATTAGTTATTGAAAGTTTTCCACAAGTTAATTTTATTAAAGAAGAGAATTTCACTGATCAATTAATTAATTTAGTTCAAAAAACAAATAAACTTGAATATGTCATGTTTTCAGTTGATGATATTCTTTATTATAATGAATTCAATCTCAAAGAATATTGTTTATCTTTGAATAGTGAGCCATTGGCATTAGGTTTCTATATGAAGTTAAATAAAAATATTACCTATTGTCATACTTGTAATCAAGATATAACAATACCATTAAATTCAAATACTATTAGTAGAACAGAGAATAATTTTAAATATTTAAAATGGAATAGAAATGATAATGATTGTAAAAAGGATTGGAATTATCCATGGGATTTATGTTCAACCATTTATAGATGTAATGATATTGATTCAATCATTAATGGTATAGTTAAATATTATGGAATTAGAAATGGTATTAATCATCCAAATAGATTCGAATTCAATGGTAATAGACCAATCATTCAAAAGCAAATCTATCAAAATAAACCCTACTGTTTATGTTTATCAGATCACTATTCTCCAATGTCTGTTGTAACTATTAATAGAGTTCAAGATGTCTATGATAATCCAATTTATGACCAAACCCTATCTTTAGATGATTTAGATCAATTACTTTATTCAAACAAATCATTAAATGATGAAAAATATAAAGAAAATAGTTTATCTTTAAATTTTAAAAGTGTTCATATTGGTGAACTTTTTATTTCTTAA
SEQ ID NO:4:具有岩藻糖基转移酶活性的SEQ ID NO:1的片段的氨基酸序列:
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SEQ ID NO:5:编码SEQ ID NO:4的、加入ATG的、密码子优化的核酸序列:
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SEQ ID NO:6:编码SEQ ID NO:4的天然核酸序列:
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本文以下通过具体的工作实施例说明本发明。
实施例
实施例1.材料和方法
培养基
Luria Broth(LB)培养基由1%胰蛋白胨(Difco,Erembodegem,Belgium)、0.5%酵母提取物(Difco)和0.5%氯化钠(VWR,Leuven,Belgium)组成。用于摇瓶实验的培养基包含2.00g/l NH4Cl、5.00g/l(NH4)2SO4、2.993g/l KH2PO4、7.315g/l K2HPO4、8.372g/l MOPS、0.5g/l NaCl、0.5g/l MgSO4·7H2O、14.26g/l蔗糖或当在实施例中指定时的另一种碳源,1ml/l维生素溶液,100μl/l钼酸盐溶液,和1ml/l硒溶液。用1M KOH将培养基设置到pH 7。
维生素溶液由3.6g/l FeCl2·4H2O、5g/l CaCl2·2H2O、1.3g/l MnCl2·2H2O、0.38g/l CuCl2·2H2O、0.5g/l CoCl2·6H2O、0.94g/l ZnCl2、0.0311g/l H3BO4、0.4g/lNa2EDTA·2H2O和1.01g/l硫胺·HCl组成。钼酸盐溶液含有0.967g/l Na2MoO4·2H2O。硒溶液含有42g/l SeO2。
用于发酵的基本培养基含有6.75g/l NH4Cl,1.25g/l(NH4)2SO4,1.15g/l KH2PO4(低磷酸盐培养基)或2.93g/l KH2PO4和7.31g/l KH2PO4(高磷酸盐培养基),0.5g/l NaCl,0.5g/l MgSO4·7H2O,14.26g/l蔗糖,1ml/l维生素溶液,100μl/l钼酸盐溶液,和组成与上述相同的1ml/l硒溶液。
复合培养基通过高压灭菌(121℃,21’)来灭菌,而基本培养基通过过滤(0.22μmSartorius)来灭菌。如果有必要,通过添加抗生素(氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素)使培养基具有选择性。
培养条件
将来自LB平板上的单菌落的在5ml LB培养基中的预培养物在轨道摇床上以200rpm在37℃温育8小时。从该培养物,将2ml转移至在500ml摇瓶中的100ml基本培养基中,并且在定轨摇床上以200rpm在37℃温育16小时。将4%接种物用于工作体积为1.51的21Biostat B Plus培养瓶(Sartorius Stedim Biotech,Melsungen,德国)。培养条件为:37℃,以800rpm搅拌,气体流速为1.5l/min。通过喷射空气保持有氧条件。用0.5M H2SO4和4MKOH将pH保持在7。通过排气冷却器(Frigomix 1000,Sartorius Stedim Biotech,Melsungen,德国)将排出的气体冷却至4℃。在发酵过程中当泡沫上升时加入有机硅消泡剂(BDH 331512K,VWR Int Ltd.,Poole,England)的10%溶液(约10μl)。用EL3020废气分析仪(ABB Automation GmbH,60488 Frankfurt am Main,德国)测量废气。用Sartorius MFCS/win v3.0系统(Sartorius Stedim Biotech,Melsungen,德国)记录所有数据。
将所有菌株至少培养两次,并且给出的关于产率和速率的标准偏差是基于在重复的实验期间采集的至少10个数据点。
取样
生物反应器在其内部包含收集管(BD Spinal Needle,1.2x152mm(BDMedicalSystems,Franklin Lakes,NJ-USA),所述收集管与反应器端口相连,向外连接到Masterflex-14管道(Cole-Parmer,Antwerpen,Belgium),之后是带有隔膜的用于取样的收集端口。该收集端口的另一侧通过Masterflex-16管道向回连接到反应容器。该系统被称为快速取样环路。在取样期间,反应器培养液环绕地泵入取样环路。估计以150ml/min的流速,反应器培养液需要0.04s以到达收集端口并且需要3.2s以再进入反应器。以50%的pO2水平,在37℃在液体中有大约3mg/l的氧。pO2水平应当不低于20%以避免微-有氧条件。因此在通过收集环的运输期间可能消耗1.8mg/l的氧。假定0.4g氧/g生物质/h的摄氧速率(在μmax处发现的最大摄氧速率),这产生5g/l生物质,2g/l/h或0.56mg/l/s的摄氧速率,该摄氧速率乘以3.2s(在环中的滞留时间)得到1.8mg/l氧消耗。
为了在取样期间使细胞的代谢猝灭,通过收集端口将反应器培养液吸入用在-20℃预冷的62g不锈钢小珠填充的注射器中,以将5ml培养液立即冷却至4℃。立即取样,之后进行低温离心(15000g,5min,4℃)。在分批实验期间,每小时使用快速取样环路以及低温不锈小珠取样法获取样品以测量OD600nm、CDW和胞外代谢物。当达到指数生长时,取样频率增加至每20至30分钟。
培养液取样
使用快速取样,其与发酵罐相连,在0.5s内从发酵罐中取出1ml培养液的样品。将样品直接放入含5ml在-40℃预冷的猝灭溶液的管中,在取样后通过涡流振荡立即混合。通过在取样前和取样后给所述管称重来通过重量分析量化准确的样品大小。
滤液取样
利用在室温没有小珠的注射器过滤(孔径0.45μm,醋酸纤维素)获得胞外培养液的样品-在除去细胞后直接过滤培养液样品,将获得的滤液或上清立即与5ml的猝灭溶液混合从而以与培养液样品相同的方式处理这些样品。在此情况中,同样通过重量分析来量化获得的样品的准确的量。
猝灭过程
所使用的猝灭溶液是60%(v/v)甲醇水溶液。在培养液样品在于-40℃预冷的猝灭溶液中猝灭后,将样品/猝灭溶液混合物在冷却的离心机(-20℃)中使用在-40℃预冷的转子以8000g离心5min。在倾析后,将上清(QS)存储于-40℃直至提取。随后,将细胞沉淀重悬于5ml的-40℃猝灭溶液中并再次离心。该第二上清(WS)也存储于-40℃直至提取。对于在总培养液以及在培养物滤液中的代谢物的测量来说,应用相同的猝灭过程;然而,对猝灭的总培养液混合物(B)或猝灭的培养物滤液(F)不进行离心,而是在彻底的涡流振荡后,取出500μl的这些混合物用于代谢物提取。
代谢物提取过程
利用热乙醇法[34]进行从细胞沉淀中以及从来自猝灭的总培养液的500-μl样品中提取代谢物。在75%的沸腾乙醇(3min,90℃)中提取代谢物。在冷却后,将因此获得的提取物在RapidVap(Labconco Corporation,Kansas,Missouri,USA)中在110min内在真空下蒸发至干燥。在将每种残余物重悬于500μL的H2O中后,通过在5min内以5000g离心除去细胞碎片。在倾析后,将上清存储于-80℃直至进一步分析。
分析方法
通过测量600nm处的光密度(Uvikom 922分光光度计,BRS,Brussel,Belgium)频繁地监测培养物的细胞密度。通过离心在预干燥和称重的falcon中的20g反应器培养液(15min,5000g,GSA rotor,Sorvall RC-5B,Goffin Meyvis,Kapellen,Belgium)获得细胞干重。随后将沉淀用20ml生理溶液(9g/l NaCl)洗涤一次,并在70℃干燥至恒重。为了能够将OD600nm测量值转化为生物质浓度,制作OD600nm对生物质浓度的相关曲线。通过以下方式确定葡萄糖和有机酸的浓度:在Varian Prostar HPLC系统(Varian,Sint-Katelijne-Waver,Belgium)上,使用Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad,Eke,Belgium),所述柱于65℃被加热,并配备有1cm前置柱,使用5mM H2SO4(0.6ml/min)作为流动相。将双波长UV-VIS(210nm和265nm)检测器(Varian Prostar 325)和示差折光率检测器(Merck LaChrom L-7490,Merck,Leuven,Belgium)用于峰检测。通过区分在265和210nm处的峰的吸收,可以识别峰。所述区分产生对于特定化合物典型的定值(Beer-Lambert的公式)。
糖测量
通过HPLC使用Hypercarb柱(100x4,6mm;5μm粒度)测量葡萄糖、果糖、蔗糖和葡糖-1-磷酸,并且使用ELSD检测仪或质谱仪进行检测(Antonio等,2007;Nielsen等,2006)。蔗糖和G1P的LOQ分别为30和20mg/l。在检测仪的线性范围内稀释所有样品,该范围是在LOQ和大约100mg/l的代谢物之间。当多种磷酸化的糖和核苷酸糖存在于培养液中时,使用Bucholz等的方法的改进(11)。在此情况中,使用milliQ水(A)和20mM醋酸铵(B)的梯度以分离分析物。该梯度始于流速为1ml/min的100%A,并在10分钟内改变至1ml/min的100%B。然后将100%B的洗脱液(eluens)组成以1ml/min保持4分钟,并且然后在1分钟内改变至1ml/min的100%A,其后将流速增加至1.2ml/min并且保持3分钟以减少柱的平衡时间。在这3分钟后,在2分钟内再次减小流速至1ml/min。利用ELSD检测仪或质谱仪检测所有分析物。
对于单糖、二糖和寡糖的分析,使用Prevail Carbohydrate ES(5μ;250x 4.6mm)柱,并且使用100%丙酮(A),100%乙腈(B)和100%水(C)的梯度。梯度以20%A、60%B和20%C开始。这在15分钟内变为15%A、45%B和40%C,并且然后在1分钟内变回20%A、60%B和20%C。然后以其初始条件将所述柱平衡6分钟。利用ELSD或质谱仪测量所有分析物。
细胞干重的测量
从培养液样品,将4×10g转移至离心管,细胞被旋转沉降(spin down)(5000g,4℃,5min),并且将细胞用0.9%NaCl溶液洗涤两次。将含有细胞沉淀的离心管在烘箱中在70℃干燥48h直至恒重。通过重量分析获得细胞干重;在称重前将所述管在干燥器中冷却。
槐糖多糖测量
为确定由其中表达异源tts基因(50)的突变体菌株生产的槐糖多糖的量,将处于大约OD 6的该突变体和野生型菌株的100ml培养物离心(5500rpm,4℃,5分钟,HerausBiofuge stratos)。然后用2体积的冷的乙醇(100%,-20℃)来沉淀80ml的上清,并在6℃存储过夜。通过离心(5500rpm,4℃,5min,Hereaus Biofuge stratos)将沉淀与上清分离,并将其重悬于25ml蒸馏水中(88)。然后用2.25M HCl(终浓度)在pyrex硅酸硼管(26x 100mm)中将2ml的该多糖溶液在105℃水解4h。为中和该溶液以用于葡萄糖测量,在温育和冷却后向该溶液加入等摩尔量的NaOH。利用YSI生化分析仪(YSI(UK)Ltd.)确定溶液中葡萄糖的量。
用于盘基网柄菌α1,2-岩藻糖基转移酶表征的菌株和质粒
来源于盘基网柄菌的密码子优化的α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌中被异源表达,所述大肠杆菌在质粒上具有基因型ΔlacZΔglgCΔmanAΔCA,所述质粒如Aerts等(1)所述进行构建。CA表示在由Stevenson等(86)所述的编码可拉酸(colanic acid)生物合成途径的基因簇中的所有基因。
酶分离方法学
在37℃和200rpm过夜培养(100ml,在500ml摇瓶中)中使菌株在LB(10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母提取物和10g/l NaCL)中生长。通过离心(15分钟,7500rpm和4℃)收集细胞。将该沉淀重悬于5ml PBS缓冲液中,并在冰水上超声处理3次4分钟(循环50%,强度3)。将细胞碎片以7500rpm和4℃再次离心15分钟。将上清用作粗细胞提取物。
蛋白测定
利用Pierce BCA Protein Assay Kit(蛋白测定试剂盒)(Thermo)如在产品手册中说明地测量酶提取物的蛋白含量。
用于表达异源和同源基因的质粒构建
如由Aerts等(1)所述地构建的质粒。
遗传方法
将质粒保持在宿主大肠杆菌DH5α(F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1)中。
质粒.pKD46(Red辅助质粒,氨苄青霉素抗性),pKD3(含侧翼有FRT的(FRT-flanked)氯霉素抗性(cat)基因),pKD4(含侧翼有FRT的卡那霉素抗性(kan)基因),和pCP20(表达FLP重组酶活性)质粒获得自J-P Hemalsteens博士教授(Vrije UniversiteitBrussel,Belgium)。将质粒pBluescript(Fermentas,St.Leon-Rot,德国)用于构建具有启动子文库或者具有带有点突变的等位基因的pKD3和pKD4的衍生物。
突变.突变分别在于基因破坏(敲除,KO),人工启动子代替内源启动子(敲入,KI)中。使用Datsenko和Wanner(19)的概念将它们引入。
在30℃,使载有Red辅助质粒的转化体在含氨苄青霉素(100mg/l)和L-阿拉伯糖(10mM)的10ml LB培养基中生长至OD600nm为0.6。通过第一次用50ml的冰冷的水以及第二次用1ml冰冷的水洗涤它们,使细胞处于电感受态(electro competent)。然后,将细胞重悬于50μl的冰冷的水中。通过使用Gene PulserTM(BioRad)(600Ω,25μFD,和250伏),使用50μl的细胞和10-100ng的线性双链DNA产物进行电穿孔。
在电穿孔后,将细胞加入到1ml LB培养基中,在37℃温育1h,并且最后涂抹在LB-琼脂上,所述LB-琼脂含有25mg/l的氯霉素或50mg/l的卡那霉素以选择抗生素抗性转化体。通过PCR使用在修饰区域上游和下游的引物检验所选择的突变体,并使其在42℃生长在LB-琼脂中以遗失辅助质粒。测试突变体的氨苄青霉素敏感性。
消除抗生素抗性基因
用pCP20质粒转化所选择的突变体(具有氯霉素或卡那霉素抗性),pCP20质粒是具有氨苄青霉素或氯霉素抗性的质粒,其显示温度敏感性复制和FLP合成的热诱导。在30℃选择具有氨苄青霉素抗性的转化体,其后在LB中在42℃进行菌落纯化并且然后检验所有抗生素抗性和FLP辅助质粒的丧失。用对照引物校验基因敲除和敲入,并测序。
用于构建各种敲除和敲入突变体的引物列表于表1中。
表1:用于构建基因敲除的引物
实施例2.基础菌株1的改造和用途(碳源:蔗糖;通过蔗糖磷酸化酶转化为葡糖-1- 磷酸和果糖)-不同蔗糖磷酸化酶的筛选
对于‘基础菌株1’的成功来说,一个重要的要求是存在有效的蔗糖磷酸化酶。然而,虽然大肠杆菌具有推定的蔗糖磷酸化酶(SP),但是它不能以蔗糖作为唯一碳源在基本培养基上生长。因此,筛选来自多种微生物来源的6种蔗糖磷酸化酶(表2)。
为此,构建野生型大肠杆菌的6种转化体,其各自载有编码列表于表2中的蔗糖磷酸化酶(SP)中的一个的质粒[pCX-启动子-SP]。在摇瓶中,使用蔗糖作为唯一碳源,评估这些菌株的表现。将野生型菌株(WT)结合到实验设计中作为对照(μWT=0)。
表2:筛选的蔗糖磷酸化酶
在该筛选实验中,监视不同转化体的生长速率并将其与蔗糖磷酸化酶的表现相联系。根据该推理,生长最好的菌株具有表现最佳的蔗糖磷酸化酶。
不同转化体的生长速率显示在图2中,应用的用于生产特殊糖的原理显示在图1中:(a)正常平衡反应,其发生在目前的生产技术中(b)拉/推原理:平衡向糖和活化的糖移动。细胞的主要目的是生长,因此在该图中它在糖处进行拉动以形成生物质。由于该拉动作用,活化的糖将在细胞中积累并推动生产途径。
实施例3.青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶的表征
插入不同的人工组成型启动子以评估启动子强度对生长速率的影响。为此,引入来自启动子文库的弱启动子、中等强度启动子和强启动子,所述启动子文库可以在工业生物技术和生物催化技术中心(The Centre of Expertise-Industrial Biotechnology andBiocatalysis)(Ghent University)获得。最终保留产生最高生长速率的中等强度启动子。
确定载有编码青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶的质粒的大肠杆菌菌株的亲和常数和最大生长速率。为此,进行分批和恒化器实验。同样校验磷酸盐浓度对这些参数的影响(表3)。
改造的菌株的动力学性质列表于表3中。清楚的是,考虑到未来的工业应用,改造的菌株的动力学性质是适合的。
表3:载有青春双歧杆菌蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌的生长特性。高PO4 3-=64mM;低PO4 3-=8,5mM。
实施例4.用于增加α葡糖-1-磷酸供应的改造策略
为检验改造策略的合理性,重要的是证明与在野生型(图4)中的α葡糖-1-磷酸库相比,在突变体菌株(图3)中的α葡糖-1-磷酸的库增加。在‘基础菌株1’中,微生物代谢被分为两个分离的部分,原因在于能够将α葡糖-1-磷酸转化为生物质生产的主要反应被消除。一部分的代谢将果糖部分转化为生物质和多种生物催化酶(经典中心代谢)。另一部分转化蔗糖的α葡糖-1-磷酸部分。
确定野生型和一些改造的菌株的α葡糖-1-磷酸浓度。为此,使用蔗糖作为唯一碳源,进行分批实验。
α葡糖-1-磷酸库:比较野生型和堵塞菌株
为评估所设想代谢改造策略的潜力,在以下各菌中确定α葡糖-1-磷酸库:
·依靠葡萄糖生长的野生型大肠杆菌MG1655,
·依靠蔗糖生长的大肠杆菌MG1655 p22BaSP,
·依靠蔗糖生长的大肠杆菌MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ p22BaSP
该库的大小是较重要的,因为要被生产的不同特殊糖的代谢改造的途径都使用α葡糖-1-磷酸作为主要前体。因此,α葡糖-1-磷酸库越大,可用于生产不同特殊糖的前体就越多。
摇瓶结果显示在图5中。胞内葡糖-1-磷酸浓度分别是4.03 10-3mmol/gcDW、0.26mmol/gcDW和1.27mmol/gcDW。因此已经实现G1P库的>20000%的增加。该增加的库使得可以有效生产多种特殊糖。
在野生型大肠杆菌MG1655菌株中,葡糖-1-磷酸是细胞壁相关组分、糖原等的前体。有限的碳流(典型地来自α葡糖-6-磷酸)足以给细胞供应充足的α葡糖-1-磷酸以生产这些次要生物质部分。因此,α葡糖-1-磷酸库具有有限的大小(4.03 10-3mmol/gcDW)。
这与提出的使用蔗糖作为碳源的策略形成对比。与野生型大肠杆菌MG1655菌株相比,在含有有效蔗糖磷酸化酶的突变体菌株中显示增加的葡糖-1-磷酸库,所述蔗糖磷酸化酶将便宜的糖蔗糖有效分解为果糖和α葡糖-1-磷酸。
在1.5L分批反应器中获得的结果显示在图6中。胞内α葡糖-1-磷酸浓度分别为4.03 10-3mmol/gcDW、0.65mmol/gcDW和0.89 mmol/gcDW。
通过ΔpgmΔlacZΔglgC(3KO)P22-BaSP依靠缓冲的LB培养基以反应器量级生产α
葡糖-1-磷酸
检验ΔpgmΔlacZΔglgC P22-BaSP生产α葡糖-1-磷酸的能力。为此,利用缓冲的LB培养基和约15g/L蔗糖进行培养。在约15h,加入含磷酸盐的浓蔗糖溶液。在图7和图6中,显示了最重要的(副)产物的浓度。分批阶段期间的最大生长速率是约0,552h-1。
在分批阶段期间,每降解1摩尔蔗糖生成0.74摩尔的葡糖-1-磷酸。理想地,可以生成1摩尔的α葡糖-1-磷酸。然而,所研究的3KO仍然含有其产物能够转化α葡糖-1-磷酸的基因,例如,agp。
从所有蔗糖都耗尽的时刻起,葡糖-1-磷酸的浓度下降,而葡萄糖的浓度上升,这是由于Agp的活性导致。
随后,在约15h加入额外的蔗糖,其再次被转化为葡糖-1-磷酸并累积在培养基中。果糖也在培养基中累积,这表明细胞进一步代谢该化合物的手段被限制(0.64摩尔的果糖/摩尔的蔗糖)。
在随后的实验中,在发酵期间以规则的时间间隔加入蔗糖和磷酸盐。实现约57g/L的最大α葡糖-1-磷酸浓度。
实施例5.编码葡糖磷酸变位酶的基因的失活
为了根据实施例1-4将代谢分开,必须将编码葡糖磷酸变位酶的基因敲除。通过由Datsenko和Wanner(19)描述的经典方法,敲除导致大约84个碱基对的染色体瘢痕。其中该基因被以此方式除去的菌株似乎在复合培养基上生长,但是出乎我们的意料,不在如在材料和方法部分中所述的基本培养基上生长。然而,当留下卡那霉素盒时,菌株可以在基本培养基上生长。显然,去除该染色体位置的原有序列似乎干扰在基本培养基上的生长,但是用相似长度的序列替代该编码葡糖磷酸变位酶的具体序列(pgm基因)则不。该事实通过用与pgm基因具有完全相同的大小的部分的GFP基因替代pgm基因得到检验。这还产生能够在基本培养基上生长的突变体菌株。这些菌株在pgm的染色体位置处的序列显示在图11、图12、图13和图14中。
实施例6.大肠杆菌中的纤维二糖生产
已经从‘基础菌株1’开始构建了生产纤维二糖的菌株(图8)。为此,将含有蔗糖磷酸化酶(青春双歧杆菌)和纤维二糖磷酸化酶(潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda))两者的质粒插入到野生型中,插入到大肠杆菌MG1655ΔΔglgC Δpgm ΔlacZ(3KO)中,以及插入到大肠杆菌MG1655 Δagp ΔglgCΔpgm ΔlacZ(4KO)中(表4)。另外被敲除的基因是glk和ptsG,因为这两者将葡萄糖转化为葡糖-6-磷酸。
表4生产纤维二糖的菌株
比较野生型和堵塞菌株
为评估所设想代谢改造策略生产特殊糖的潜力,在多种改造的菌株中研究纤维二糖的生产:
·大肠杆菌MG1655(WT)P22-BaSP P22-CuCP
·大肠杆菌MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ(3KO)P2-BaSP P22-CuCP
·大肠杆菌MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ Δagp(4KO)P22-BaSP P22-CuCP
为此,进行摇瓶实验。培养基含有缓冲的LB培养基,并且向摇瓶加入等量的蔗糖和葡萄糖,以使在摇瓶中实现1.978g纤维二糖/L的终浓度(表5)。摇瓶结果显示在图5中。所需产物纤维二糖的(胞外)浓度随引入的突变的数目而增加。
表5多种改造的菌株的纤维二糖生产
通过ΔpgmΔlacZΔglgCΔagp(4KO)P22-BaSP P22-CuCP在缓冲的LB培养基上以
反应器量级生产纤维二糖。
在初步实验中在反应器量级上检验ΔpgmΔlacZΔglgCΔagp P22-BaSP P22-CuCP生产纤维二糖的能力。为此,利用缓冲的LB培养基进行培养。在约9h以及在特殊的时间点,将含500g/L蔗糖和250g/L葡萄糖的溶液加入到培养物中。
达到约30%(mol生产的纤维二糖/mol消耗的蔗糖)的转化效率,并且蔗糖的约40%的葡萄糖部分终止于纤维二糖或葡糖-1-磷酸。在培养的结尾达到纤维二糖的约15g/L的效价。
其次,从70g/l蔗糖开始用高浓度的磷酸盐和低浓度的磷酸盐在分批培养中检验纤维二糖的生产。高磷酸盐表示0.2M磷酸盐的磷酸盐浓度,低磷酸盐表示13mM磷酸盐的浓度。这显著影响生产。高浓度的磷酸盐导致大约20g/l的最终效价和0.33g/g的产率,而低磷酸盐浓度导致42g/l的最终效价和0.84g/g的相对于消耗的蔗糖的产率(图9)。
实施例7.改造基础菌株2(蔗糖-蔗糖合酶)及其用途
通过代谢改造大肠杆菌构建这样的基础菌株,所述基础菌株是其途径始于UDP-葡萄糖的特殊糖和它们的衍生物的有效生产者。
通过引入(例如,来自马铃薯(Solanum tuberosum)的)蔗糖合酶,蔗糖被分解为果糖和UDP-葡萄糖。通过另外地敲除编码属于可拉酸操纵子(ca)的、编码UDP-葡萄糖4差向异构酶(galE)、UDP-葡萄糖半乳糖-1-P尿苷酰基转移酶(galT)、葡糖-1-P尿苷酰基转移酶(galU,galF)、5′-核苷酸酶/UDP-糖水解酶(ushA)、UDP-葡萄糖6-脱氢酶(ugd)的基因,构建累积UDP-葡萄糖的突变体(表6)。
表6基础菌株UDP-葡萄糖
实施例8.蔗糖合酶在大肠杆菌中的表达
使用体外测定确定蔗糖合酶的活性。来自马铃薯的蔗糖合酶在大肠杆菌BL21中异源表达。从该培养物制备酶提取物,并将其与500mM蔗糖和2mM UDP温育。产生的UDP-葡萄糖的量的演化在表7中给出。
表7蔗糖合酶酶测定表明蔗糖合酶(含500mM蔗糖和2mM UDP的混合物)的切割反应的活性
实施例9.槐糖生产
从基础菌株2开始(UDP-葡萄糖),构建生产大量的作为槐糖单元的聚合物的槐糖的菌株。这通过另外地引入来自肺炎链球菌的基因tts(50)实现。槐糖单元可以以两种方式自槐糖聚合物产生,即,通过酸水解或通过酶转化。这样的酶也可以在生产者菌株中(过)表达。
为了评估代谢改造策略的潜力,通过使大肠杆菌MG1655 P22-BaSP P22-tts和6KOP22-BaSP P22-tts菌株(大肠杆菌MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ Δagp ΔptsG Δglk)在含乳糖作为唯一碳源的基本培养基上生长,对这些菌株进行槐糖聚合物的确定。结果显示在图15中。这些结果表示:与野生型菌株相比,突变体菌株生产显著更多的槐糖聚合物。
实施例10.改造基础菌株3(乳糖-乳糖磷酸化酶)及其用途
通过引入乳糖磷酸化酶(20),乳糖被分解为葡萄糖和半乳糖-1-P。通过另外地敲除编码agp、galE、galT、lacZ的基因,代谢被分为两个分离的部分。然而,这些基因所有可能的组合导致半乳糖-1-磷酸的累积增加。代替敲除这些基因,该目的也可以通过使它们有缺陷或通过减少它们的表达来实现(表8)。
表8基础菌株3半乳糖-1-磷酸(乳糖-乳糖磷酸化酶)
实施例11.半乳糖(β1-4)L-鼠李糖生产:
从基础菌株3开始,通过另外地引入编码(Ga)乳-N-二糖D-半乳糖基-(β1-4)-L-鼠李糖磷酸化酶的基因构建Gal(β1-4)L-Rha生产者,所述(Ga)乳-N-二糖D-半乳糖基-(β1-4)-L-鼠李糖磷酸化酶将半乳糖-1-磷酸和鼠李糖转化为Gal(β1-4)L-Rha和磷酸。
使用乳糖作为主要碳源进行发酵产生大量的Gal(β1-4)L-Rha。将L-鼠李糖添加到培养基中。通过敲除参与鼠李糖降解的基因(rhaA,rhaB,rhaC,rhaD)防止不希望有的鼠李糖的降解。
实施例12.改造基础菌株4(乳糖-乳糖合酶)及其用途
通过引入乳糖合酶(71,72),乳糖被分解为葡萄糖和UDP-半乳糖。通过另外地敲除编码属于可拉酸操纵子(ca)的、编码β-半乳糖苷酶(lacZ)、UDP-葡萄糖、半乳糖-1-P尿苷酰基转移酶(galT)UDP-葡萄糖4差向异构酶(galE)、5′-核苷酸酶/UDP-糖水解酶(ushA)、UDP-葡萄糖6-脱氢酶(uga)的基因,构建累积UDP-半乳糖的突变体(表9)。
表9:基础菌株4UDP-半乳糖(乳糖合酶)
实施例13.肌醇半乳糖苷生产:
从基础菌株4开始,通过另外地引入编码肌醇3-α-半乳糖基转移酶的基因构建肌醇半乳糖苷生产者,所述肌醇3-α-半乳糖基转移酶催化以下转化:
UDP-半乳糖+肌醇=UDP+O-α-D-半乳糖基-(1→3)-1D-肌醇
使用乳糖作为主要碳源进行发酵,产生大量的肌醇半乳糖苷,其中向培养基添加肌醇。
实施例14.Globotriose生产:
从基础菌株4开始,通过另外地引入来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的编码α-1,4-Gal转移酶的基因lgtC(3)构建globotriose生产者,所述α-1,4-Gal转移酶催化以下转化:UDP-Gal+乳糖→UDP+Globotriose。使用乳糖作为主要碳源进行发酵产生大量的globotriose。
实施例15.改造基础菌株5和生产岩藻糖基化的糖
从累积果糖-6-磷酸的基础菌株5(描述于实施例20和实施例28中)开始,可以生产岩藻糖基化的糖衍生物如岩藻糖基乳糖和更具体地1,2-岩藻糖基乳糖。为此,修饰该菌株以迫使细胞生产作为GDP-岩藻糖的前体的果糖-6-磷酸。然后通过戊糖磷酸途径将葡萄糖或葡糖-1-磷酸(如果起始的酶是蔗糖酶或蔗糖磷酸化酶)进料至中心碳代谢。图10显示向产物和生物质的路线以及为实现此所需的敲除。为避免通过糖解损失果糖-6-磷酸,敲除pfkA、pfkB和pgi。为避免丙酮酸的累积,敲除Entner Douderoff路线(edd和eda)。
因为GDP-岩藻糖是可拉酸生物合成途径的中间体,所以该途径必须被修饰。来自可拉酸操纵子的、可以潜在地减少产物产率的基因被敲除。这些基因是gmm、wcaA、wcaBi、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、wcaI、wcaJ、wcaK、wcaL和/或wcaM。基因manA、cpsG、cpsB、gmd和fcl(分别编码甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶、GDP-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-岩藻糖合酶)的表达被增强以增加向GDP-岩藻糖的通量。可拉酸操纵子被完全敲除,并重新引入所需基因,所述所需基因利用来自启动子文库的人工启动子过表达;或者修饰所述操纵子以使上述基因被逐个敲除并通过用人工组成型启动子替换所述操纵子的启动子使所述操纵子中剩余的基因的表达增强(23)。最终,通过α-1,2-岩藻糖基转移酶将GDP-岩藻糖与乳糖相连成为α-1,2-岩藻糖基乳糖。检验的岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、人(Homosapiens)、小家鼠(Mus musculus)、黄牛(Bos taurus)和盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)。
实施例16.改造大肠杆菌基础菌株3(半乳糖-1-P)及其用途
通过敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp),UDP-葡萄糖,半乳糖-1-P尿苷酰基转移酶(galT),UDP-葡糖-4-差向异构酶(galE)的基因,构建累积半乳糖-1-P的突变体。通过另外地过表达编码半乳糖激酶(galK)和/或半乳糖-1-差向异构酶(galM)的基因,增强半乳糖-1-P的形成(表10)。
表10基础菌株半乳糖-1-磷酸
实施例17.改造基础菌株3(半乳糖-1P)及其用途
通过敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp),UDP-葡萄糖,半乳糖-1-P尿苷酰基转移酶(galT),UDP-葡糖-4-差向异构酶(galE)的基因以及通过另外地过表达编码半乳糖激酶(galK)的基因,构建累积半乳糖-1-P的突变体(表11)。
表11大肠杆菌基础菌株半乳糖-1-磷酸
为评估代谢改造策略的潜力,通过使野生型、大肠杆菌MG1655ΔgalET P22galK、大肠杆菌MG1655 ΔgalETKM Δagp P22galK、大肠杆菌MG1655ΔgalET P22galK和大肠杆菌MG1655 ΔgalETKM Δagp P22 galK+乳清酸(2g/L)在含乳糖(15g/L)作为主要碳源的基本培养基上生长,确定这些菌株的半乳糖-1-磷酸浓度。结果显示在表12中。
表12不同大肠杆菌突变体的半乳糖-1-P浓度
实施例18.使用蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中生产葡糖-6-磷酸
通过引入蔗糖磷酸化酶,蔗糖被分解为葡糖-1-P和果糖。通过另外地敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp)、葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶(zwf)、磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(glgC)的基因,构建累积葡糖-6-P的突变体。
以这样的方式选择KO突变体以使代谢被分为两个分离的部分。然而,这些基因的所有可能的组合导致供应增加。代替敲除这些基因,该目的也通过使它们有缺陷或通过减少它们的表达来实现。
通过代谢改造大肠杆菌,构建这样的基础菌株,所述基础菌株是其途径始于葡糖-6-P的特殊糖及其衍生物的有效生产者(表13)。
表13基础菌株葡糖-6-磷酸,使用蔗糖磷酸化酶
实施例19.使用转化酶在大肠杆菌中生产葡糖-6-磷酸
通过引入蔗糖水解酶/转化酶,蔗糖被分解为葡萄糖和果糖。通过另外地敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp)、葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶(zwf)、磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(glgC)、葡糖磷酸变位酶(pgm)的基因,构建累积葡糖-6-P的突变体(表14)。
表14:基础菌株葡糖-6-磷酸,使用转化酶,在大肠杆菌中
实施例20.使用转化酶在大肠杆菌中生产果糖-6-磷酸
通过引入蔗糖水解酶/转化酶,蔗糖被分解为葡萄糖和果糖。通过另外地敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp)、磷酸果糖激酶(pfkA和pfkB)、磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(glgC)、葡糖磷酸变位酶(pgm)的基因,构建累积果糖-6-磷酸的突变体(表15)。
表15基础菌株果糖-6-磷酸
实施例21.使用麦芽糖磷酸化酶在大肠杆菌中生产β-葡糖-1-磷酸
通过引入麦芽糖磷酸化酶,麦芽糖被分解为β-D-葡萄糖1-磷酸和葡萄糖。通过另外地敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp,yfbT)、葡糖磷酸变位酶(ycjU)、麦芽糖水解酶(malPQ)的基因,构建累积β-葡糖-1-P的突变体。以这样的方式选择KO突变体以使代谢被分为两个分离的部分。然而,这些基因的所有可能的组合导致供应增加。代替敲除这些基因,该目的也通过使它们有缺陷或通过减少它们的表达来实现(表16)。
表16:基础菌株β-D-葡糖-1-磷酸,使用麦芽糖磷酸化酶,在大肠杆菌中
实施例22.使用海藻糖磷酸化酶在大肠杆菌中生产β-葡糖-1-磷酸
通过引入海藻糖磷酸化酶,海藻糖被分解为β-D-葡萄糖1-磷酸和葡萄糖。通过另外地敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp,yfbT)、葡糖磷酸变位酶(ycjU)、非所需的天然海藻糖降解酶(treABC、treC、treE、treF)的基因,构建累积β-葡糖-1-磷酸的突变体(表17)。
以这样的方式选择KO突变体以使代谢被分解为两个分离的部分。然而,这些基因的所有可能的组合导致提高的生产率。代替敲除这些基因,该目的通过使它们有缺陷或通过减少它们的表达来实现。
表17基础菌株β-D-葡糖-1-磷酸,使用海藻糖磷酸化酶,在大肠杆菌中
实施例23.生产曲二糖
通过另外地在累积β-D-葡萄糖1-磷酸的菌株中引入曲二糖磷酸化酶以及另外地敲除编码葡糖激酶(glk)和磷酸转移酶系统(ptsG)的基因,构建生产曲二糖的突变体。
利用大肠杆菌突变体菌株(ΔlacZΔglgCΔagpΔptsGΔmalPQΔycjUpCXp22MPp22KP),使用麦芽糖和葡萄糖作为主要碳源进行发酵,产生曲二糖。(图16)。
实施例24.通过蔗糖磷酸化酶由蔗糖生产UDP葡萄糖
通过引入(例如,来源于青春双歧杆菌的)蔗糖磷酸化酶,蔗糖被分解为果糖和葡糖-1-P。由累积葡糖-1-磷酸的菌株(见以上实施例)开始并且通过另外地敲除编码UDP-葡萄糖4差向异构酶(galE)、UDP-葡萄糖半乳糖-1-P尿苷酰基转移酶(galT)、5′-核苷酸酶/UDP-糖水解酶(ushA)、UDP-葡萄糖6-脱氢酶(ugd)的基因,通过另外地过表达编码(例如来源于双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的)UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因,构建累积UDP-葡萄糖的突变体(表18)。
表18基础菌株UDP-葡萄糖,由蔗糖,通过蔗糖磷酸化酶,在大肠杆菌中
实施例25.在大肠杆菌中利用蔗糖-6-磷酸合酶组合蔗糖PTS生产UDP-葡萄糖
通过引入蔗糖PTS(94)和蔗糖-6-磷酸合酶(69),蔗糖被转化为果糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖。由在实施例4中所述的菌株开始,在没有蔗糖磷酸化酶的情况下,并且通过另外地敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp)、UDP-葡萄糖4差向异构酶(galE)、UDP-葡萄糖半乳糖-1-P尿苷酰基转移酶(galT)、5′-核苷酸酶/UDP-糖水解酶(ushA)、UDP-葡萄糖6-脱氢酶(ugd)的基因,通过另外地过表达编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(双歧双歧杆菌)的基因,构建累积UDP-葡萄糖的突变体(表19)。
表19基础菌株UDP-葡萄糖,利用蔗糖-6-磷酸合酶,组合蔗糖PTS
实施例26.通过半乳糖激酶生产UDP半乳糖
通过过表达编码半乳糖激酶(galK)和半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(例如来源于双歧双歧杆菌)的基因,UDP-半乳糖的形成被增强,通过另外地敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp)、UDP-葡萄糖、半乳糖-1-P尿苷酰基转移酶(galT)、UDP-葡糖-4-差向异构酶(galE)的基因,构建累积半乳糖-1-P的突变体(表20)。
表20基础菌株UDP-半乳糖,通过半乳糖激酶
实施例27.通过乳糖磷酸化酶生产UDP半乳糖
通过引入乳糖磷酸化酶(20),乳糖被分解为葡萄糖和半乳糖-1-P。通过敲除编码一个或多个磷酸酯酶(agp)、UDP-葡萄糖、半乳糖-1-P尿苷酰基转移酶(galT)、UDP-葡糖-4-差向异构酶(galE)的基因,构建累积半乳糖-1-P的突变体。通过另外地过表达编码(例如来源于双歧双歧杆菌的)半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶的基因,UDP-半乳糖的形成被增强(表21)。
以这样的方式选择KO突变体以使代谢被分为两个分离的部分。然而,这些基因的所有可能的组合导致增加的生产率。代替敲除这些基因,该目的通过使它们有缺陷或通过减少它们的表达来实现。
表21基础菌株UDP-半乳糖,通过乳糖磷酸化酶
实施例28.在大肠杆菌中的果糖-6-磷酸累积
将代谢分开以累积果糖-6-磷酸。这通过敲除编码磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶活性的基因实现。在大肠杆菌中,这些活性由基因pgi、pfkA和pfkB编码。对于依靠葡萄糖和蔗糖的生长,缺少这些活性的菌株的生长速率描述于表22中。与依靠葡萄糖生长相比,在引入蔗糖磷酸化酶后,当依靠蔗糖生长时,野生型菌株的生长速率稍受影响,然而引入pgi敲除和pfkA和pfkB双突变导致生长速率显著下降,其中当依靠葡萄糖生长时后者尤其低(0.02h-1)。惊人地,突变体菌株ΔpgiΔplkAΔpfkB具有与Δpgi单突变体的生长速率相似的生长速率。
表22:糖解敲除菌株在基本培养基上利用葡萄糖和蔗糖的具体生长速率。在依靠蔗糖生长的菌株中引入编码蔗糖磷酸化酶的质粒。
当依靠蔗糖生长时,仅ΔpgiΔpfkAΔpfkB突变体菌株在培养基中累积果糖-6-磷酸,其他菌株未显示任何F6P累积。该菌株的生长曲线和F6P累积显示在图17中。
实施例29.在酿酒酵母中的α葡糖-1-磷酸累积
因为酿酒酵母天生分解蔗糖,所以将由基因SUC2、MAL32、MAL12、YJL216C、YGR287c编码的所有备选蔗糖降解反应(转化酶)敲除。为避免α-葡糖-1-磷酸的同化,使转化该活化的糖的酶功能减弱或功能丧失。这些酶有由PGM1和PGM2编码的葡糖磷酸变位酶,以及由INM1和INM2编码的葡糖-1-磷酸酯酶。通过引入(例如,来源于青春双歧杆菌的)蔗糖磷酸化酶,类似于大肠杆菌的分解代谢(见以上实施例)。酿酒酵母代谢被分为两部分,导致α葡糖-1-磷酸的累积。
实施例30.利用酿酒酵母的纤维二糖生产
因为酿酒酵母天生分解蔗糖,所以将由基因SUC2、MAL32、MAL12、YJL216C、YGR287c编码的所有备选的蔗糖降解反应(转化酶)敲除。为避免α-葡糖-1-磷酸的同化,使转化该活化的糖的酶功能减弱或功能丧失。这些酶是由PGM1和PGM2编码的葡糖磷酸变位酶,以及由INM1和INM2编码的葡糖-1-磷酸酯酶。通过引入(例如,来源于青春双歧杆菌的)蔗糖磷酸化酶,类似于大肠杆菌的分解代谢(见以上实施例)。酿酒酵母代谢被分为两部分,导致α葡糖-1-磷酸的累积。通过引入来源于潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)的纤维二糖磷酸化酶基因,酿酒酵母能够生产纤维二糖。
为避免葡萄糖的降解,由GLK1编码的葡糖激酶活性也被敲除。因为己糖激酶在酿酒酵母中不是特异性的,所以这些被特定的异源底物特异性己糖激酶代替。来源于大肠杆菌或青春双歧杆菌的果糖激酶显示对于葡萄糖的较低的活性,并且可以代替编码天然己糖激酶(由HXK1和HXK2编码)的基因。
实施例31.通过引入蔗糖磷酸化酶的在酿酒酵母中的果糖-6-磷酸累积
因为酿酒酵母天生分解蔗糖,所以将由基因SUC2、MAL32、MAL12、YJL216C、YGR287c编码的所有备选的蔗糖降解反应(转化酶)敲除。通过引入来自青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶,蔗糖被分解为果糖和葡糖-1-磷酸。为避免果糖-6-磷酸转化为生物质,通过使基因PGM1、PFK1和PFK2功能减弱或功能丧失,分别降低或消除酶磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶的活性。
实施例32.在酿酒酵母中的半乳糖-1-磷酸累积
半乳糖-1-磷酸衍生自二糖乳糖。因为酿酒酵母天生不分解乳糖,所以引入异源的β-半乳糖苷酶(例如来自大肠杆菌)。这导致乳糖降解为半乳糖和葡萄糖。目的是增加向特殊糖生物合成途径供应的半乳糖-1-磷酸。因此,半乳糖-1-磷酸可以不再被转化为生物质,所述转化是由UDP-葡糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、醛糖还原酶催化的。这通过分别敲除编码UDP-葡糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶和醛糖还原酶(GAL7和GRE3)的基因实现。为避免所述半乳糖-1-磷酸的降解,编码半乳糖-1-磷酸酯酶的基因被敲除。这些是INM1和INM2。过表达半乳糖激酶以增强从半乳糖形成半乳糖-1-磷酸。
实施例33.在酿酒酵母中通过其本身的转化酶的葡糖-6-磷酸累积
为了将酿酒酵母代谢分为两部分(以增强葡糖-6-磷酸的供应以使其可以被用作特殊糖的结构单元),将分别由基因ZWF1、PGM1和PGM2以及PGI1编码的葡糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖磷酸变位酶和磷酸葡萄糖异构酶敲除。在所述菌株中,蔗糖通过本身的转化酶被分解为果糖和葡萄糖,并通过本身的己糖激酶磷酸化为果糖-6-磷酸和葡糖-6-磷酸。然后葡糖-6-磷酸被供应到特殊糖生物合成途径,并且果糖-6-磷酸被转化为生物质。
实施例34.在酿酒酵母中通过蔗糖磷酸化酶的葡糖-6-磷酸累积
酿酒酵母被修饰成利用来源于青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶由蔗糖生产葡糖-6-磷酸。因为蔗糖磷酸化酶与转化酶竞争蔗糖,所以编码转化酶活性的基因被敲除。这些基因是SUC2、MAL32、MAL12、YJL216C和YGR287c。然后葡糖-1-磷酸利用由PGM1和PGM2编码的葡糖磷酸变位酶进一步转化为葡糖-6-磷酸。为避免葡糖-1-磷酸降解为葡萄糖,编码葡糖-1-磷酸酯酶(由INM1和INM2编码)的基因被敲除。通过消除细胞中的UTP葡糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶活性,通过使基因YHL012W和UGP1功能减弱或功能丧失,进一步降低该活化的糖的同化。果糖部分由本身的由HXK1和HXK2编码的己糖激酶磷酸化并被转化为生物质。
实施例35.在酿酒酵母中通过蔗糖合酶增强UDP-葡萄糖形成
因为酿酒酵母天生分解蔗糖,所以将由基因SUC2、MAL32、MAL12、YJL216C、YGR287c编码的所有备选的蔗糖降解反应(转化酶)敲除。引入例如来源于马铃薯的蔗糖合酶以使蔗糖分解为UDP-葡萄糖和果糖。为避免UDP-葡萄糖转化为生物质,使酶UDP-葡糖二磷酸化酶、UDP-葡糖4-差向异构酶、UDP-葡糖-己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡糖-糖原葡糖基转移酶、UDP-葡糖-1,3-β-D-葡聚糖葡糖基转移酶、UDP-葡糖-葡萄糖磷酸葡糖基转移酶的活性功能减弱或功能丧失,这些酶分别由基因UGP1和YHL012W、GAL10、GAL7、GSY1和GSY2、FEN1和FKS1和GSC2以及TPS1编码。果糖部分被本身的由HXK1和HXK2编码的己糖激酶磷酸化,并被转化为生物质。
实施例36.在酿酒酵母中通过蔗糖蔗糖磷酸化酶增强UDP-葡萄糖形成
为了增加酿酒酵母中的UDP-葡萄糖供应,通过过表达编码UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶的基因GAL7进一步修饰如在实施例29中所述的菌株,UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶催化α-葡糖-1-磷酸转化为UDP-葡萄糖。
实施例37.在酿酒酵母中通过β-半乳糖苷酶增强UDP-半乳糖形成
为了增加酿酒酵母中的UDP-半乳糖供应,通过过表达编码UTP-半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(例如来自双歧双歧杆菌)的基因进一步修饰如在实施例32中所述的菌株,UTP-半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶催化α-半乳糖-1-磷酸转化为UDP-半乳糖。
实施例38.盘基网柄菌α1,2-岩藻糖基转移酶活性
导言
盘基网柄菌α1,2-岩藻糖基转移酶(FT)是相当新的糖基转移酶类的一部分。所有已知的FT属于分类GT11,而盘基网柄菌FT属于分类GT74。到目前为止,这样的FT仅在两种其他的生物(即Desulfococcus oleovorans和Desulfotomaculum reducens)中发现。第三类是GT37,其仅包括植物FT(图18)。clustalW和Tcoffee比对表明与幽门螺杆菌(H.pylori)的同一性仅分别为9.7%和15.5%。GT11的保守基序显示在图19中,并且这些根本不在网柄菌(Dictyostelium)蛋白中出现(67)。这些结构域在转移酶的岩藻糖基化活性方面有所区别。前两个基序对于α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-6-岩藻糖基转移酶是相同的,而第三个基序使所述酶彼此区别。α-1,3-岩藻糖基转移酶包含两个完全不同的保守基序。
然而,盘基网柄菌FT被描述为仅对乳-N-二糖有活性,而对半乳糖苯基-β-半乳糖苷、Galβ1-6-GlcNac、乳糖、Galβ1-6Gal、Xyl、Glc、GlcNAc和GalNac没有活性(92)。
在图20中,显示盘基网柄菌岩藻糖基转移酶测定的LC MSMS分析。该测定惊人地显示该异源表达的岩藻糖基转移酶在乳糖作为受体且GDP-岩藻糖作为岩藻糖供体的情况下是有活性的。该酶的活性为0.19±0.01U/mg蛋白,并且遵循Persson和Palcic(68)的方法确定。
因为盘基网柄菌的酶仅有一半负责其α1,2-岩藻糖基转移酶活性,所以以与完整酶相似的方式克隆该部分,不同之处在于在核苷酸序列的前面有额外的起始密码子(由ATG编码)。在ΔlacZΔglgCΔmanAΔCA突变体菌株中生产该新的酶,并且利用LC MSMS分析其α1,2-岩藻糖基转移酶活性。图21清楚地显示该部分的酶仍然能够由GDP-岩藻糖和乳糖形成2-岩藻糖基乳糖。
实施例39.在大肠杆菌中生产肌醇
由累积葡糖-6-磷酸的基础菌株开始,通过另外地引入编码肌醇-1-磷酸合酶(INO1,来源于酿酒酵母)和肌醇-1(或4)-单磷酸酯酶(INM1和INM2,来源于酿酒酵母)的基因构建肌醇生产者。
实施例40.在大肠杆菌中生产乳-N-二糖
由累积半乳糖-1-磷酸的基础菌株开始,通过另外地引入编码乳-N-二糖磷酸化酶(lnbp,长双歧杆菌(Bifidobacterium longum))的基因构建乳-N-二糖生产者。使用乳糖和N-乙酰葡糖胺作为碳源进行发酵。通过消除任何N-乙酰-D-葡糖胺激酶活性(nagK)和N-乙酰葡糖胺PTS活性(nagE、ptsH、ptsI、manXYZ)在生产者菌株中抑制N-乙酰葡糖胺的降解。
本文所用缩写列表
3KO 基因pgm、lacZ和glgC被敲除的突变体菌株
4KO 基因pgm、lacZ、glgC和agp被敲除的突变体菌株
6PG 6-磷酸葡糖酸
BA 青春双歧杆菌
BaSP 来源于青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶
CA 由Stevenson等(86)定义的可拉酸操纵子
CDW 细胞干重
CuCP 潮湿纤维单胞菌纤维二糖磷酸化酶
F6P 果糖-6-磷酸
FBP 果糖-1,6-二磷酸
Fru 果糖
FT α1,2-岩藻糖基转移酶
G1P 葡糖-1-磷酸
GallP 半乳糖-1-磷酸
Glc 葡萄糖
Glu 葡萄糖
KI 敲入
KO 除
KP 曲二糖磷酸化酶
LA 嗜酸乳杆菌
LB Luria Bertani培养液
LM 肠膜明串珠菌
MP 麦芽糖磷酸化酶
P22 De Mey等(2007)的启动子文库的启动子22
pCXp22 包含根据Aerts等(1)的P22启动子的质粒
PEP 磷酸烯醇丙酮酸
Pi 无机磷酸
PPi 焦磷酸
Pyr 丙酮酸
rpm 转/分钟
SM 变异链球菌
SP 蔗糖磷酸化酶
Suc 蔗糖
UDP-gal UDP-半乳糖
UDP-glc UDP-葡萄糖
WT 野生型菌株
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Claims (28)
1.一种代谢改造的微生物,其用于生产至少一种选自由以下组成的组的特殊产物:糖、活化的糖、核苷、糖苷、糖脂和糖蛋白,其特征在于:
a)所述微生物通过引入至少:i)与编码糖激酶的基因组合的编码糖水解酶的基因,ii)编码糖合酶的基因,或,iii)编码糖磷酸化酶的基因进行基因改造,以致所述微生物在所述微生物内将二糖、寡糖、多糖或其混合物分解为糖和活化的糖,
b)所述微生物被进一步基因改造,以致使所述微生物的不同于步骤a)的任何引入基因的至少一个其他基因功能减弱或功能丧失,并且其中所述其他基因编码将所述活化的糖转化为生物质和/或生物催化的酶的酶,和
其中所述活化的糖被转化为所述特殊产物,和其中所述糖被转化为生物质和/或生物催化的酶,
其中所述微生物是细菌或酵母。
2.根据权利要求1的代谢改造的微生物,其中所述微生物通过引入将所述活化的糖转化为特殊产物的至少一个其他基因被进一步基因改造,或,其中所述微生物的至少一个其他内源基因被过表达,所述内源基因将所述活化的糖转化为特殊产物。
3.根据权利要求1至2的代谢改造的微生物,其中所述微生物能够依靠二糖、寡糖、多糖或其混合物作为主要碳源生长。
4.根据权利要求1至3的代谢改造的微生物,其中步骤a)的所述基因改造是任选的,或,被过表达至少:i)与编码糖激酶的基因组合的编码糖水解酶的内源基因,ii)编码糖合酶的内源基因,或,iii)编码糖磷酸化酶的内源基因来代替,并且其中所述微生物能够在所述微生物内将二糖、寡糖、多糖或其混合物分解为糖和活化的糖。
5.根据权利要求1,3或4的代谢改造的微生物,其中基因改造b)是在编码酶的基因内,所述酶将所述糖转化为生物质和/或生物催化的酶,其中所述糖被转化为所述特殊产物,和其中所述活化的糖被转化为生物质和/或生物催化的酶,和其中所述糖被激酶活化。
6.根据权利要求5所述的代谢改造的微生物,其中所述微生物被进一步基因改造以引入至少一种其它基因,所述至少一种其它基因将所述糖转化为特殊产物,或其中所述微生物的将所述糖转化为特殊产物的至少一种其它内源基因被过表达。
7.根据权利要求1-4的代谢改造的微生物,其中步骤a)中的所述基因将二糖、寡糖或多糖分解为两种活化的糖或分解为两种糖。
8.根据权利要求1的代谢改造的微生物,其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli),或者其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)。
9.根据权利要求1-8的代谢改造的微生物,其中所述活化的糖选自由以下组成的组:α-葡糖-1-磷酸、α-半乳糖-1-磷酸、β-葡糖-1-磷酸、β-半乳糖-1-磷酸、UDP-葡萄糖、葡糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和UDP-半乳糖,并且其中所述糖选自由以下组成的组:果糖、葡萄糖和半乳糖。
10.根据权利要求1-9的代谢改造的微生物,其中所述糖水解酶是乳糖酶、转化酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、海藻糖酶、蔗糖-6-磷酸水解酶和/或淀粉酶,并且其中所述糖激酶是半乳糖激酶、果糖激酶、葡糖激酶和/或甘露糖激酶。
11.根据权利要求1-3、7-10的代谢改造的微生物,其中:
-步骤a)中的所述基因编码蔗糖磷酸化酶,和/或
-使步骤b)中的以下基因功能丧失:编码β-半乳糖苷酶的基因,和/或,编码葡糖磷酸变位酶的基因,和/或,编码葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的基因,和/或,编码磷酸酯酶的基因,和/或,编码葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖-4-差向异构酶的基因,和/或,编码UDP-葡萄糖:半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-吡喃半乳糖变位酶的基因,和/或,编码UDP-半乳糖:(葡糖基)脂多糖-1,6-半乳糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-半乳糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖醛酸转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因,和/或,编码UDP-糖水解酶的基因,和/或,编码转化酶的基因,和/或,编码麦芽糖酶的基因,和/或,编码海藻糖酶的基因,和/或,编码糖转运磷酸转移酶的基因,和/或,编码己糖激酶的基因。
12.根据权利要求11的代谢改造的微生物,其中:
-步骤a)中的所述基因编码蔗糖磷酸化酶,
-步骤b)中的所述基因是:基因lacZ、基因pgm、基因ycjU、基因glgC、基因agp、基因ptsG、基因glk、基因glf、基因waaB、基因ushA、基因wcaA、基因wcaC、基因wcaE、基因wcaI、基因wcaL、基因wcaJ、基因galU、基因galF、基因galE、基因galT、基因malP和/或基因malQ。
13.根据权利要求11的代谢改造的微生物,其中:
-步骤a)中的所述基因编码蔗糖磷酸化酶,
-步骤b)中的所述基因是:基因PGM1、基因PGM2、基因GLG1、基因GLG2、基因INM1、基因INM2、基因GLK1、基因HXK1、基因HXK2、基因GAL10、基因GAL7、基因YHL012W、基因UGP1、基因GSY1、基因GSY2、基因DIE2、基因ALG8、基因ATG26、基因SUC2、基因MAL32、基因MAL12、基因YJL216C,和/或,基因YGR287C,和/或,FEN1,和/或,FKS1,和/或,GSC2,和/或,TPS1。
14.根据权利要求12-13的代谢改造的微生物,其中所述蔗糖磷酸化酶来源于乳酸菌,并且其中所述乳酸菌是青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)或变异链球菌(Streptococcus mutans)。
15.根据权利要求11-14的代谢改造的微生物,其中步骤a)的所述蔗糖磷酸化酶被蔗糖合酶、麦芽糖磷酸化酶或麦芽糖合酶代替。
16.根据权利要求11-14的代谢改造的微生物,其中步骤a)的所述蔗糖磷酸化酶被乳糖磷酸化酶或乳糖合酶代替。
17.根据权利要求5或6的代谢改造的微生物,其中:
-步骤a)中的所述基因编码蔗糖磷酸化酶,和/或
-使步骤b)中的以下基因功能丧失:编码β-半乳糖苷酶的基因,和/或,编码葡糖-6-磷酸异构酶的基因,和/或编码葡糖-1-磷酸腺苷酰转移酶的基因,和/或,编码葡糖-1-磷酸酯酶的基因,和/或,编码磷酸果糖激酶A的基因,和/或,编码磷酸果糖激酶B的基因,和/或,编码磷酸葡糖酸脱水酶的基因,和/或,编码2-酮-3-脱氧葡糖酸-6-磷酸醛缩酶的基因,和/或,编码葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖-4-差向异构酶的基因,和/或,编码UDP-葡萄糖:半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-吡喃半乳糖变位酶的基因,和/或,编码UDP-半乳糖:(葡糖基)脂多糖-1,6-半乳糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-半乳糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖基转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡糖醛酸转移酶的基因,和/或,编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶的基因,和/或,编码GDP-甘露糖水解酶的基因,和/或,编码UDP-糖水解酶的基因,和/或,编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因,和/或,编码UDP-N-乙酰葡糖胺烯酰基丙酮酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-N乙酰葡糖胺乙酰转移酶的基因,和/或,编码UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶的基因,和/或,编码十一异戊烯基-磷酸-α-N-乙酰葡糖胺转移酶的基因,和/或,编码葡糖-6-磷酸-1-脱氢酶的基因,和/或,编码L-谷氨酰胺:D-果糖-6-磷酸转氨酶的基因,和/或,编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因,和/或编码山梨醇-6-磷酸脱氢酶的基因,和/或,编码甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶的基因,和/或编码阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶的基因,和/或,编码转化酶的基因,和/或,编码麦芽糖酶的基因,和/或,编码海藻糖酶的基因,和/或,编码糖转运磷酸转移酶的基因,和/或,编码己糖激酶的基因。
18.根据权利要求17的代谢改造的微生物,其中:
-步骤a)中的所述基因是编码蔗糖磷酸化酶的基因,
-步骤b)中的所述基因是:基因lacZ、基因pgi、基因glgC、基因agp、基因pfkA、基因pfkB、基因waaB、基因ushA、基因eda、基因edd、基因wcaA、基因wcaC、基因wcaE、基因wcaI、基因wcaL、基因wcaJ、基因wcaB、基因wcaF、基因wcaK、基因wcaD、基因galU、基因galF、基因galE、基因gmm、基因galT、基因manA、基因murA、基因lpxA、基因rffE、基因rfe、基因glmS、基因srlD、基因mtlD、基因alsE和/或zwf。
19.根据权利要求18的代谢改造的微生物,其中:
-步骤a)中的所述基因是编码蔗糖磷酸化酶的基因,
-步骤b)中的所述基因是:基因pgil、基因PFK1、基因PFK2、基因PFK26、基因PFK26、基因PFK27、基因GND1、基因GND2、基因PMI40、基因ZWF1、基因GFA1、基因GLG1、基因GLG2、基因INM1、基因INM2、基因GLK1、基因HXK1、基因HXK2、基因GAL10、基因GAL7、基因YHL012W、基因UGP1、基因GSY1、基因GSY2、基因DIE2、基因ALG8、基因ATG26、基因SUC2、基因MAL32、基因MAL12、基因YJL216C,和/或,基因YGR287C,和/或,FEN1,和/或,FKS1,和/或,GSC2,和/或,TPS1。
20.根据权利要求18-19的代谢改造的微生物,其中所述蔗糖磷酸化酶来源于乳酸菌,并且其中所述乳酸菌是青春双歧杆菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌或变异链球菌。
21.根据权利要求2-20的代谢改造的微生物,其中将所述活化的糖转化为特殊产物的基因编码差向异构酶、转移酶、还原酶、(焦)磷酸化酶、(去)羧化酶、脱水酶、通透酶、合酶、脱氢酶、氧化酶或异构酶。
22.根据权利要求21的代谢改造的微生物,其中所述差向异构酶是UDP-半乳糖-4-差向异构酶或UDP-N-乙酰葡糖胺差向异构酶,和/或,其中所述转移酶是糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸基转移酶或磺基转移酶。
23.根据权利要求1-22的代谢改造的微生物,其中所述特殊产物是单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、多糖、核苷、O-糖苷、S-糖苷、N-糖苷、C-糖苷、糖蛋白、糖脂或活化的糖。
24.一种生产根据权利要求1-23中任一项的特殊产物的方法,所述方法包括:
i)代谢改造根据权利要求1-23中任一项的微生物,以及
ii)培养所述基因工程微生物,以及
iii)提取并纯化所述特殊产物。
25.具有通过SEQ ID NO:1给出的氨基酸序列的来源于盘基网柄菌(Dictyostelliumdiscoideum)的2-岩藻糖基转移酶、或其具有2-岩藻糖基转移酶活性的片段、或其具有至少75%的序列同一性并具有2-岩藻糖基转移酶活性的变体用于生产岩藻糖基乳糖的用途。
26.根据权利要求25的用途,其中具有2-岩藻糖基转移酶活性的所述片段具有通过SEQID NO:4给出的氨基酸序列。
27.编码根据权利要求25和26中任一项的2-岩藻糖基转移酶的核酸用于生产岩藻糖基乳糖的用途。
28.根据权利要求27的用途,其中所述核酸具有通过SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6给出的核酸序列。
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