TW202221134A - 半乳糖化雙醣與寡醣的產生 - Google Patents

Abstract

本發明屬於合成生物學與代謝工程學的技術領域。本發明描述一種新形態半乳糖基轉移酶的用途，其用於產生半乳糖化雙醣與寡醣。本發明也描述產生半乳糖化雙醣與寡醣的方法及純化半乳糖化雙醣與寡醣的方法。再者，本發明屬於經代謝改造細胞發酵的領域。本發明提供經代謝改造的細胞以產生半乳糖化雙醣與寡醣。

Description

半乳糖化雙醣與寡醣的產生

本發明屬於合成生物學與代謝工程學的技術領域，且亦屬於經代謝改造細胞發酵的領域。

一般以結合蛋白質與脂質的醣結合形式存在的雙醣或寡醣涉及許多生命現象，例如分化、發育、與受精的發育及進展相關的生物識別過程、胚胎形成、發言、轉移(metastasis)以及宿主病原體黏著。寡醣在體液與人乳中也可以未結合聚醣的形式存在，其中它們也調節了重要的發育與免疫過程(Bode, Early Hum. Dev. 1-4 (2015); Reily et al., Nat. Rev. Nephrol. 15, 346-366 (2019); Varki, Glycobiology 27, 3-49 (2017))。科學界與商業界對半乳糖化雙醣與寡醣具有相當廣泛的功能而受到科學界與商業界的關注。然而，半乳糖化雙醣與寡醣的可得性有限，因為其生產依賴 化學或化學酵素合成，或須從如動物乳汁的自然來源進行純化而得。化學合成方法耗時耗力且因為涉及大量步驟而難以量產。使用醣基轉移酶的酵素方法相較於化學合成提供了許多優點。醣基轉移酶從活化核苷酸糖供給者(donor)催化糖的部分(sugar moiety)轉移至醣類或非醣類接受者(acceptor) (Coutinho et al., J. Mol. Biol. 328 (2003) 307-317)。這些醣基轉移酶是生物科技學者合成寡醣的來源，且亦用於(化學)酵素方法以及細胞生產系統中。然而，醣基轉移酶與身為醣基轉移轉移酶一份子的半乳醣基轉移酶的立體特異性(stereospecificity)與位置選擇性(regioselectivity)仍是一項艱鉅的挑戰。此外，化學酵素方法需要於原位(in situ)再生核苷酸糖供給者。雙醣與寡醣的細胞生產需要在互補醣基轉移酶附近嚴格控管足夠水平的核苷酸糖供給者的時空可用性。

本發明的一目的是提供可以有效率、省時與經濟實惠的方式生產半乳糖化雙醣與寡醣的工具與方法，若有需要，也可以連續的製程生產半乳糖化雙醣與寡醣。

根據本發明，藉由提供一種新型半乳糖基轉移酶在生產半乳糖化雙醣與寡醣的用途、生產半乳糖化雙醣與寡醣的方法與細胞來達到此目的及其他目的，其中細胞係經基因改造以生產半乳糖化雙醣與寡醣。

令人訝異的是，現在已發現可以用一種新型的半乳糖基轉移酶來生產半乳糖化雙醣與寡醣，更具體而言是一種新型的N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶。本發明提供一種新型N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的用途，其半乳糖化接受者如作為雙醣及/或寡醣的一部分且位於寡醣的非還原端的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺。本發明提供所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途以生產半乳糖化雙醣與寡醣。本發明提供利用所述半乳糖基轉移酶來生產半乳糖化雙醣與寡醣的方法及細胞。方法包括提供UDP-半乳糖與任一所述的新型半乳糖基轉移酶，且在半乳糖基轉移酶催化一或多種接受者的半乳糖化的條件下，使任一所述半乳糖基轉移酶及UDP-半乳糖與一或多個接受者接觸。一種方法包括以下步驟：提供可合成UDP-半乳糖與任一或多個所述接受者且可表現能半乳糖化所述接受者的任一所述半乳糖基轉移酶的細胞，以及在能夠生產所述半乳糖化雙醣或寡醣的條件下培養所述細胞。接著，本發明亦提供分離所述半乳糖化雙醣或寡醣的方法。再者，本發明提供代謝改造細胞以生產半乳糖化雙醣或寡醣。

根據第一態樣，本發明提供N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶在合成半乳糖化雙醣或寡醣的用途。於本文中，所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶半乳糖化作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺，及/或半乳糖化作為雙醣及/或寡醣的一部分且位於所述雙醣及/或寡醣的非還原端的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺，以產生所述半乳糖化的雙醣或寡醣。在本申請中，「雙醣或寡醣(di- or oliogosaccharide(s)」的表現方式較佳以「寡醣oliogosaccharide(s)」取代。在本申請中，所述雙醣及/或寡醣較佳為哺乳動物乳汁寡醣(mammalian milk oligosaccharide, MMO)，較佳為人乳寡醣。

在本發明的範圍內，N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶用以從核苷酸糖供給者UDP-半乳糖轉移半乳糖殘基至作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺及/或在其非還原端具有N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣或寡醣，以產生如本文所定義的半乳糖化雙醣或寡醣。

根據本發明，N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，其分別以β-1,3鍵結或β-1,4鍵結從UDP-半乳糖轉移半乳糖殘基至作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺及/或在其非還原端具有N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣或寡醣，以產生如本文所定義的半乳糖化雙醣或寡醣。

根據本發明的半乳糖化雙醣是由兩個單醣組成的醣類，其非還原端的半乳糖殘基是以 β-1,3 或 β-1,4的方式連接至還原端的 GlcNAc或GalNAc，且半乳糖化寡醣是三個或更多單醣的醣類，在其非還原端有一個以 β-1,3 或 β-1,4的方式連接至GlcNAc或GalNAc的末端半乳糖殘基。

根據本發明，N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，其具有：1) PFAM結構域PF00535，且(i) 包括具有SEQ ID NO: 1的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17；或(ii) 包括具有SEQ ID NO: 2的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17且m為100至115；或(iii) 包括SEQ ID NO: 3或4任一者所示的多肽序列；或 (iv) 為SEQ ID NO: 3或4任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 3或4的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或(v) 包括來自SEQ ID NO: 3或4任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或(vi) 為SEQ ID NO: 3或4任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或(vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 3或4任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 3或4任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或者，N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，其具有：2) PFAM結構域IPR002659，且(i) 包括具有SEQ ID NO: 5的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，非A、G、S)(X _p)(X，非F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至16、m為35至70且p為20至45；或(ii) 包括SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者所示的多肽序列；或(iii) 為SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 6、7、8或9的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或(iv) 包括來自SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或(v) 為SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或(vi) 包括包含相對於SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性。在一較佳實施例中，本文所揭示的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶不是UniProt ID為D3QY14來自大腸桿菌O55:H7的wbgO。

或者，根據本發明，N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，其具有：1) PFAM結構域PF01755，且(i) 包括具有SEQ ID NO: 10的序列EXXCXXSHX[AFILTY]LW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或(ii) 包括具有SEQ ID NO: 11的序列EXXCXXSH[LR]VLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或(iii) 包括具有SEQ ID NO: 12的序列EXXCXXSH[VHI]SLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或(iv) 包括具有SEQ ID NO: 13的序列EXXCXXSHYMLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或(v) 包括具有SEQ ID NO: 14的序列EXXCXXSHXX(X，非V)Y(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或(vi) 包括SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者所示的多肽序列；或(vii) 為SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(viii) 包括來自SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(ix) 為SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(x) 包括包含相對於SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或者，N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，其具有：2) PFAM結構域PF00535，且(i) 包括具有SEQ ID NO: 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75且m為10至30；或(ii) 包括具有SEQ ID NO: 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75、m為10至30且p為20至25；或(iii) 包括SEQ ID NO: 26或27任一者所示的多肽序列；或(iv) 為SEQ ID NO: 26或27任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 26或27的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(v) 包括來自SEQ ID NO: 26或27任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(vi) 為SEQ ID NO: 26或27任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 26或27任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 26或27任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或者N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，其具有：3) PFAM結構域PF02709且非PFAM結構域PF00535，且(i) 包括具有SEQ ID NO: 28的序列[FWY]XX[FWY](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是IP或NL的組合，且其中n為21至26；或(ii) 包括SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者所示的多肽序列；或(iii) 為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(iv) 包括來自SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(v) 為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(vi) 包括包含相對於SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或者，N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，其具有：4) PFAM結構域PF03808，且(i) 包括具有SEQ ID NO: 35的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25；或(ii) 包括具有SEQ ID NO: 36的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25、m為40至50且p為22至30；或(iii) 包括SEQ ID NO: 37、38或39任一者所示的多肽序列；或(iv) 為SEQ ID NO: 37、38或39任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 37、38或39的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(v) 包括來自SEQ ID NO: 37、38或39任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(vi) 為SEQ ID NO: 37、38或39任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或(vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 37、38或39任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 37、38或39任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性。在一較佳實施例中，本文揭示的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶不是腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitides)的lgtB (UniProt ID為Q51116)。

本文使用的PFAM結構域PF00535、IPR002659、PF01755、PF02709、PF03808是2020年6月11日釋出版本Pfam33.1的PFAM資料庫中所註解的蛋白結構域。PF00535存在於醣基轉移酶2(GT2)家族其包括從UDP-葡萄糖、UDP-N-乙醯-半乳醣胺、GDP-甘露糖或CDP-阿比可糖(CDP-abequose)轉移糖至一系列受質的酵素，受質包括纖維素、多萜醇磷酸鹽(dolichol phosphate)和磷壁酸(teichoic acid)。

IPR002659存在於醣基轉移酶家族31(GH31)，其包括具有一些已知活性的酵素，包括N-乙醯乳糖胺β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶 (2.4.1.149)、β-1,3-半乳糖基轉移酶(2.4.1)、岩藻糖特異性β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶(2.4.1)、脂醯鞘胺醇三己糖苷β-1,3-GalNAc轉移酶(globotriosylceramide β-1,3-GalNAc transferase)(2.4.1.79)。PF01755存在於醣基轉移酶25(GT25)家族。醣基轉移酶25家族是參與脂多醣生物合成的醣基轉移酶家族。這些酵素於生物合成時催化轉移各種糖至成長中的脂多醣鍊上。PF02709指的是Glyco_transf_7C家族。亦即，這是來自各種後生動物(Metazoa)的半乳糖基轉移酶家族的 N 端結構域，具有三種相關的半乳糖基轉移酶活性，在某些情況下，這三種相關的半乳糖基轉移酶活性由一個序列所擁有：EC:2.4.1.90、N-乙醯乳糖胺合成酶、EC:2.4.1.38、β-N-乙醯葡萄糖胺基-糖肽β-1,4-半乳糖基轉移酶、及EC:2.4.1.22乳糖合成酶。PF03808指的是醣基轉移酶26(GT26)家族，其包括具有像是以下所列活性的酵素：β-N-乙醯甘露糖胺醛酸苷轉移酶(β-N-acetyl mannosaminuronyltransferase)(EC 2.4.1.-)、β-N-乙醯甘露糖胺基轉移酶 (EC 2.4.1.-)、β-1,4-葡萄糖基轉移酶 (EC 2.4.1.-) 和 β-1 ,4-半乳糖基轉移酶 (EC 2.4.1.-)。

具有與所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶或所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的每一類所指明的相同PFAM結構域與模體(motif)的蛋白質可透過如本發明中舉例說明的RegEX分析而進行檢索。RegEX，或Regular Expression，是特殊的字符序列，其使用模式中的特殊語法以匹配或查找其他字串或字串集。許多程式可用以進行RegEx檢索。其中之一是Python模組「re」，其為Python中的Regular Expression提供完整的支援。本發明所屬技術領域中具有通常知識者習知的詳細資訊位於2019年4月6日釋出的頁面：https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2。

全體序列相似度度可利用整體比對演算法(global alignment algorithm)而決定，例如程式GAP(GCG Wisconsin Package, Accelrys)中的Needleman Wunsch演算法，較佳的是使用預設參數以及成熟蛋白質的序列(即，不考慮分泌訊號或轉運胜肽)。與全體序列相似度度相比，序列相似度在僅考慮保守結構域或模體時一般較高。

如本文所使用的，相較於SEQ ID NO: 03、04、06、07、08、09、15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38或39任一多肽的全長至少有80%的全體序列相似度度應理解為，相較於SEQ ID NO: 03、04、06、07、08、09、15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38或39的任一多肽至少分別有80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、或99 %的全體序列相似度度。來自SEQ ID NO: 03、04、06、07、08、09、15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38或39的任一多肽至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個連續胺基酸殘基的寡肽序列應理解為，來自SEQ ID NO: 03、04、06、07、08、09、15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38或39的任一多肽分別至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20至胺基酸殘基總數的連續胺基酸殘基的任一寡肽序列，較佳的是其中若存在PFAM結構域，則所述寡肽沒有與PFAM結構域完全重疊，更佳的是其中若存在PFAM結構域，則所述寡肽沒有與PFAM結構域重疊。

在第二態樣中，本發明提供一種以本文所述的N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途來合成半乳糖化雙醣或寡醣的方法。

在較佳實施例中，合成包括以下步驟： a. 提供UDP-半乳糖與如本文所定義的任一所述半乳糖基轉移酶，其中所述半乳糖基轉移酶可從所述UDP-半乳糖的供給者將半乳糖殘基轉移至一或多個接受者；且 b. 在半乳糖基轉移酶催化從所述UDP-半乳糖將半乳糖殘基轉移至所述接受者的條件下，使任一所述半乳糖基轉移酶及UDP-半乳糖與一或多個接受者接觸； c. 較佳的是，分離所述半乳糖化雙醣或寡醣。

在本發明的範圍內，用語「半乳糖基轉移酶催化從所述UDP-半乳糖轉移半乳糖殘基至所述接受者的條件」應理解為關於物理或化學參數的條件，其包括但不限於溫度、pH、壓力、滲透壓、及產物/前驅物/接受者濃度。

在本發明的較佳實施例中，上述條件可包括30+/-20度C的溫度範圍以及7+/-3的pH範圍。

在本發明的較佳實施例中，單醣N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、單醣N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)、雙醣及/或寡醣的非還原N-乙醯葡萄糖胺(即，在雙醣及/或寡醣非還原端的N-乙醯葡萄糖胺) 及/或雙醣及/或寡醣的非還原N-乙醯半乳糖胺(即，在雙醣及/或寡醣非還原端的N-乙醯半乳糖胺)為所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的接受者。具有非還原GlcNAc及/或GalNAc的所述雙醣與寡醣分別包括如本文所定義的雙醣與寡醣。

本發明的另一較佳實施例為如本文所揭露的方法，其中任一所述半乳糖基轉移酶與至少兩個不同的接受者接觸，較佳為至少與三個不同的接受者接觸，更佳為至少與四個不同的接受者接觸，至少與五個不同的接受者接觸，以透過本文所述的N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途來合成半乳糖化雙醣及/或寡醣的混合物。根據本發明，所述混合物包括或由下列所組成：至少兩種不同的雙醣或寡醣，較佳至少三種不同的雙醣或寡醣，更佳至少三種不同的雙醣或寡醣。較佳的是，所述混合物包括或由中性雙醣/寡醣所組成。更佳的是，所述混合物包括或由帶電及/或中性雙醣或寡醣所組成。在方法及/或細胞的較佳實施例中，帶電雙醣或寡醣為唾液酸化雙醣或寡醣。在方法及/或細胞的較佳實施例中，中性雙醣或寡醣為岩藻糖化的。在方法及/或細胞的另一較佳實施例中，中性雙醣或寡醣不是岩藻糖化的。

所述N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺及/或在非還原端包含N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣及/或雙醣，即本文所揭露N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的較佳接受者，利用包括以下的方法所產生：從天然來源萃取、生物技術製程、物理製程、化學製程及前述之組合。

在本發明的方法及/或細胞的更一較佳實施例中，更透過提供醣基轉移酶與作為所述醣基轉移酶的供給者的核苷酸糖來醣基化如本文所述而合成的半乳糖化雙醣或寡醣。所述醣基轉移酶是擇自包含以下所列的名單的一或多種醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸基轉移酶、半乳醣醛酸基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醇醯神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醇鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯-β-L-阿卓糖胺轉胺酶(UDP-4-amino-4,6-dideoxy-N-acetyl-β-L-altrosamine transaminase)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶(UDP-N-acetylglucosamine enopyruvyl transferase)及岩藻糖胺基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，所述岩藻糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，所述唾液酸轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，所述半乳糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，所述葡萄糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，所述甘露糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，所述N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，所述N-乙醯半乳糖胺基轉移酶為α-1,3-N-乙醯半乳糖胺基轉移酶。

所述核苷酸-糖較佳擇自包含以下所列的名單：GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、CMP-N-乙醯神經胺酸(CMP-Neu5Ac)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖 (UDP-Gal)、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿拉伯-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-arabino-4-hexulose)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-來蘇-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-lyxo-4-hexulose)、UDP-N-乙醯-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙醯-L-6-脫氧塔羅糖胺(UDP-L-PneNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖)、UDP-N-乙醯胞壁酸(UDP-N-acetylmuramic acid)、UDP-N-乙醯-L-異鼠李糖(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖)、GDP-L異鼠李糖(GDP-L-quinovose)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4,5Ac2、CMP-Neu5,7Ac2、CMP-Neu5,9Ac2、CMP-Neu5,7(8,9)Ac2、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、GDP-木糖(UDP-xylose)。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，本文所述的半乳糖化雙醣或寡醣係額外以一或多個GlcNAc部分(moiety)進行修飾，且所述醣基轉移酶為一或多種N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶，較佳為半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶及/或β-1,6-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶，且所述核苷酸活化糖為UDP-GlcNAc。

在本發明的方法及/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，本文所述的半乳糖化雙醣或寡醣係額外進行唾液酸化，所述醣基轉移酶為一或多種唾液酸轉移酶，較佳為α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及/或α-2,8-唾液酸轉移酶，且所述所述核苷酸活化糖為CMP-Neu5Ac及/或CMP-Neu5Gc。

在本發明的方法及/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，本文所述的半乳糖化雙醣或寡醣係額外進行岩藻糖基化，所述醣基轉移酶為一或多種岩藻糖基轉移酶，較佳為α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及/或α-1,6-岩藻糖基轉移酶，且所述核苷酸活化糖為UDP-岩藻糖。

較佳的是，提供至少兩種、更佳至少三種、更佳至少四種、更佳至少五種、最佳至少六種醣基轉移酶以進一步醣基化如本文合成的所述雙醣或寡醣。

根據本發明，所述半乳糖化雙醣或寡醣(或如本文所述其進一步醣基化的形式)可使用無細胞系統，亦即，於無細胞系統中產生。或者，利用細胞，較佳為單一細胞來產生所述半乳糖化雙醣或寡醣(或如本文所述其進一步醣基化的形式)。上述細胞可以是非代謝改造細胞或本文所揭露的代謝改造細胞。

在此背景下，較佳實施例為所述細胞可產生(i) 如本文定義的任一所述半乳糖基轉移酶，及/或(ii) UDP-半乳糖，及/或(iii) 如本文定義的一或多個接受者，其中所述細胞為經培養成長以獲得充足的細胞而以期望規模用於根據本發明的方法中。細胞成長至期望細胞密度後，對細胞進行處理以用於本發明的方法。例如，一般對細胞進行穿孔或者破碎細胞，以使醣接受者進入細胞之中(若所述細胞沒有產生或由另一細胞產生)。然而，在一些情況下，細胞所產生的半乳糖基轉移酶及/或UDP-半乳糖可從細胞擴散至胞外的液體，或可如本文所述被主動運輸。穿孔細胞而不顯著降低酵素活性與核苷酸糖穩定性的方法對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言是習知的。可對細胞進行濃縮、乾燥、冷凍乾燥、介面活性劑處理、超音波處理、機械式破碎、酵素處理等。具有通常知識者將能理解，上述(i)至(iii)的一或多者可由相同細胞或不同細胞所產生。例如，一種細胞可提供所述的半乳糖基轉移酶，而另一種細胞可提供一或多種接受者。上述(i)至(iii)的任一者也可以不由細胞產生。如此一來，本發明提供合成半乳糖化雙醣或寡醣的方法，其包括以下步驟： a. 提供UDP-半乳糖與如本文所定義的任一所述半乳糖基轉移酶，其中所述半乳糖基轉移酶可從所述UDP-半乳糖的供給者將半乳糖殘基轉移至一或多個接受者；且 b. 在半乳糖基轉移酶催化從所述UDP-半乳糖將半乳糖殘基轉移至所述接受者的條件下，使任一所述半乳糖基轉移酶及UDP-半乳糖與一或多個接受者接觸； c. 較佳的是，分離所述半乳糖化雙醣或寡醣； 其中提供所述UDP-半乳糖、半乳糖基轉移酶與接受者至少其中一者，較佳為利用細胞產生，較佳為單一細胞。

在此背景下，另一較佳實施例為所述半乳糖化雙醣或寡醣是由細胞所產生，較佳為單一細胞，上述細胞可以是非代謝改造細胞或本文所揭露的代謝改造細胞。

所述N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯半乳糖胺及/或在非還原端包含作為接受者的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣及/或雙醣可由細胞攝入及/或合成。在本發明的背景下，應能理解的是，根據本發明的所述半乳糖化雙醣或寡醣較佳為在胞內合成的。具有通常知識者將更能理解的是，一部分或實質上所有合成的半乳糖化雙醣或寡醣保留於胞內，及/或透過被動或主動運輸分泌至細胞外。如此一來，本發明提供合成半乳糖化雙醣或寡醣的方法，其包括以下步驟： a. 如本文所述，提供細胞，較佳為單一細胞(較佳為本發明的第二與第三態樣)， b. 視需要地提供如本文所數的一或多個接受者， c. 在允許產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的條件下培育及/或培養細胞， d. 較佳的是，分離所述半乳糖化雙醣或寡醣。

本發明的第三態樣是關於經代謝改造成使用如本文揭露之N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶來合成半乳糖化雙醣或寡醣(或如本文所述其醣基化形式)的細胞。在本申請中，除非另有明確說明，否則「基因改造細胞」或「代謝改造細胞」較佳分別指的是經基因改造的細胞或經代謝改造的細胞，以產生根據本發明的半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的背景下，半乳糖化雙醣或寡醣較佳不存在於所述代謝改造細胞的野生型前驅細胞(progenitor)中。

較佳的是，如本文所述的細胞(較佳為本發明的第二與第三態樣)： -表現所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的任一者；且 -可為所述半乳糖基轉移酶合成作為供給者的UDP-半乳糖(UDP-Gal)。

更佳的是，如本文所述的細胞(較佳為本發明的第二與第三態樣)： -可合成如本文揭露的一或多個所述接受者；且 -表現所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的任一者；且 -可為所述半乳糖基轉移酶合成作為供給者的UDP-半乳糖(UDP-Gal)。

在另一實施例中，細胞可合成擇自包含以下所列的名單的一或多種核苷酸-糖供給者：GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、CMP-N-乙醯神經胺酸(CMP-Neu5Ac)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-半乳糖 (UDP-Gal) (、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿拉伯-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-arabino-4-hexulose)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-來蘇-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-lyxo-4-hexulose)、UDP-N-乙醯-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙醯-L-6-脫氧塔羅糖胺(UDP-L-PneNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖)、UDP-N-乙醯胞壁酸(UDP-N-acetylmuramic acid)、UDP-N-乙醯-L-異鼠李糖(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖)、GDP-L異鼠李糖(GDP-L-quinovose)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、GDP-木糖(UDP-xylose)。

或者或較佳的是，細胞可表現擇自包含以下所列的名單的一或多種醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸基轉移酶、半乳醣醛酸基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醇醯神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醇鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯-β-L-阿卓糖胺轉胺酶(UDP-4-amino-4,6-dideoxy-N-acetyl-β-L-altrosamine transaminase)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶(UDP-N-acetylglucosamine enopyruvyl transferase)及岩藻糖胺基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的更佳實施例中，細胞可表現擇自包含以下所列的名單的岩藻糖基轉移酶：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一更佳實施例中，細胞可表現擇自包含以下所列的名單的唾液酸轉移酶：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一更佳實施例中，細胞可表現擇自包含以下所列的名單的半乳糖基轉移酶：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一更佳實施例中，細胞可表現擇自包含以下所列的名單的葡萄糖基轉移酶：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一更佳實施例中，細胞可表現擇自包含以下所列的名單的甘露糖基轉移酶：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一更佳實施例中，細胞可表現擇自包含以下所列的名單的N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，細胞可表現的N-乙醯半乳糖胺基轉移酶為α-1,3-N-乙醯半乳糖胺基轉移酶。

醣基轉移酶家族是一個非常廣泛的酵素家族，能夠催化從活化的供給者分子轉移糖部分至特定的接受者分子，以形成糖苷鍵。對於將使用核苷酸二磷酸糖、核苷酸單磷酸糖和糖磷酸以及相關蛋白質的醣基轉移酶分類為不同的基於序列的家族已有相關描述((Campbell et al., Biochem. J. 326, 929-939 (1997))且其位於CAZy(Carbohydrate-Acitive EnZymes)網站中(www.cazy.org)。

或者或較佳的是，本文所數的細胞為代謝改造細胞。較佳的是，代謝改造細胞是以基因表現模組進行修飾，其中任一所述表現模組的表現為持續的(constitutive)或由天然誘導子(inducer)所產生的。

所述表現模組也稱為轉錄單位且包括重組基因表現的多核苷酸，重組基因包括編碼基因序列以及與編碼基因有效連接的適當轉錄及/或轉譯控制訊號。所述控制訊號包括啟動子序列、未轉譯區、核醣體結合位點與終止子序列。所述表現模組可包括一個單一重組基因的表現單元，但也可包括更多重組基因的表現單元，或可以組織為操縱子(operon)結構以整合表現兩個或兩個以上的重組基因。可利用使用本領域習知的技術的重組DNA技術來產生所述多核苷酸。建構表現模組方法對於本發明所屬技術領域具有通常知識者而言是習知的，其包括如試管內(in vitro)重組DNA技術、合成技術與體內(in vivo)基因重組。參照如Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989及每年更新版本)中所述的技術。

根據本發明的較佳實施例，細胞係以一或多個表現模組進行修飾。表現模組可整合至所述細胞的基因體中，或可以載體(vector)的形式呈現給所述細胞。所述載體可以質體、黏接質體(cosmid)、嗜菌體、脂質體或病毒的形式存在，被穩定地轉形/轉染至所述代謝改造細胞中。這類載體其中包括染色體的(chromosomal)、的游離(episomal)與衍生自病毒的載體，例如衍生自細菌質體、嗜菌體、酵母菌游離基因體(episome)、插入單元、酵母菌染色體單元的載體及衍生自前述組合的載體，例如衍生自質體與嗜菌體基因單元的載體，例如黏接質體與嗜菌粒(phagemid)。這些載體可包含選擇標記(selection marker)，例如但不限於抗生素標記、營養缺陷(auxotrophic)標記、毒素-抗毒素標記或RNA正股/反股標記。表現系統構築體(construct)可包括調控與引起表現的控制區域。一般而言，任何適合於在宿主中維持、增殖或表現多核苷酸及/或表現多肽的系統或載體均可用於在這方面的表現。可以透過多種眾所周知的常規技術中的任何一種將合適的 DNA 序列插入到表現系統中，例如Sambrook等人中所述的技術。對於重組生產而言，可基因改造細胞以併入表現系統或其部分或本發明的多核苷酸。可利用許多標準實驗室操作手冊中所述的方法來將多核苷酸導入至細胞中，例如如前文所述的Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), and Sambrook et al., 1989。

如本文所使用的，表現模組包括表現至少一重組基因的多核苷酸。所述重組基因涉及作用於所述半乳糖化雙醣或寡醣合成中的多肽的表現，例如醣基轉移酶，涉及直接參與如本文所數的核苷酸活化糖或膜運輸蛋白的合成中的多肽的表現，或者所述重組基因連接至所述宿主細胞的其他其他途徑但沒有涉及所述半乳糖化雙醣或寡醣的合成。所述重組基因以經修飾的表現量或活性編碼內源性蛋白質，較佳為所述內源性蛋白質為過度表現的，或所述重組基因編碼異源導入或表現於所述修飾細胞的異源性蛋白質，較佳為過度表現的。內源性蛋白質在細胞中可具有修飾的表現量，所述細胞也可表現異源性蛋白質。

根據本發明的較佳實施例，每個所述表現模組的表現是持續的或利用天然誘導子所產生。如本文所使用的，持續的表現應被理解為生物體中持續轉錄的基因表現。利用天然誘導子所產生的表現應被理解為基因兼性或調節性的表現，僅在宿主的某種自然條件下而表現(例如，在分娩或哺乳期的生物體)，被理解為對於環境變化的反應(例如，包括但不限於荷爾蒙、熱、冷、光線、氧化壓力或滲透壓/訊號)，或被理解為取決於發育階段的位置或所述宿主細胞的細胞週期，其包括但不限於細胞凋亡與細胞自嗜。

根據本發明的更一實施例，重組多核苷酸適應個別細胞或表現系統的密碼子使用偏好。

在本文所述的方法與細胞中，細胞較佳包括編碼一個蛋白質的相同編碼DNA序列的多個拷貝。本發明的背景下，所述蛋白質可為醣基轉移酶、膜運輸蛋白或本文所揭露的任何其他蛋白質。在本申請中，「多個」的表達方式指的是至少2個、較佳至少3個、更佳至少4個、且更佳至少5個。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，本文所使用的細胞係經基因改造以產生擇自群組的核苷酸-糖：UDP-半乳糖 (UDP-Gal) 、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿拉伯-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-arabino-4-hexulose)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-來蘇-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-lyxo-4-hexulose)、UDP-N-乙醯-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙醯-L-6-脫氧塔羅糖胺(UDP-L-PneNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖)、UDP-N-乙醯胞壁酸(UDP-N-acetylmuramic acid)、UDP-N-乙醯-L-異鼠李糖(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖)、GDP-L異鼠李糖(GDP-L-quinovose)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)或GDP-木糖(UDP-xylose)。在更一實施例中，細胞係經基因改造以最佳化任一所述核苷酸-糖的產生。

根據本發明方法及/或細胞的一實施例，細胞可合成或產生UDP-半乳糖。較佳的是，最佳化細胞UDP-半乳糖的產生。在一可選實施例中，細胞係經修飾UDP-葡萄糖4-表異構酶GalE的表現量或活性，UDP-葡萄糖4-表異構酶GalE可將UDP-葡萄糖轉變成UDP-半乳糖。

在本發明的更一實施例中，細胞合成的核苷酸-糖為UDP-半乳糖，且醣基轉移酶為N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，本文使用的細胞可產生核苷酸-糖GDP-岩藻糖。可由細胞中表現的酵素或由細胞代謝而提供GDP-岩藻糖。產生GDP-岩藻糖的這類細胞可表現將如添加至細胞的岩藻糖轉變成GDP-岩藻糖的酵素。此酵素可以為雙功能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶，例如脆弱類桿菌( Bacteroides fragilis)的Fkp，或一個別的岩藻糖激酶與一個別的岩藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶的組合，其可來自許多物種，包括人類( Homo sapiens)、野豬( Sus scrofa)及褐鼠 ( Rattus norvegicu)。較佳的是，細胞係經修飾以產生GDP-岩藻糖。更佳的是，細胞係經修飾以增強GDP-岩藻糖的產生。所述修飾可以是選自以下群組的任一或多種：剔除編碼UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖1-磷酸轉移酶(UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase)基因、過度表現GDP-L-岩藻糖合成酶的基因、過度表現GDP-甘露糖4,6-脫水酶(GDP-mannose 4,6-dehydratase)的基因、過度表現編碼甘露糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶的基因、過度表現磷酸甘露糖變位酶(phosphomannomutase)的基因與過度表現編碼甘露糖-6-磷酸異構酶的基因。

在本發明的方法及/或細胞的另一附加及/或較佳實施例中，本文使用的細胞可產生核苷酸-糖CMP-N-乙醯神經胺酸(CMP-唾液酸)。可由細胞中表現的酵素或由細胞代謝而提供CMP-N-乙醯神經胺酸。較佳的是，細胞係經修飾以產生CMP-N-乙醯神經胺酸。更佳的是，細胞係經修飾以增強CMP-N-乙醯神經胺酸的產生。所述修飾可以是選自包括下列的群組的一或多種：過度表現編碼CMP-唾液酸合成酶的基因、過度表現編碼唾液酸鹽合成酶(sialate synthase)的基因與過度表現N-乙醯-D-葡萄糖胺-2-表異構酶的基因。

CMP-N-乙醯神經胺酸的合成使用GlcNAc，但如本文所述細胞中的GlcNAc可作為所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的接受者。因此，細胞中CMP-N-乙醯神經胺酸的產生可降低產生感興趣醣類(即，半乳糖化雙醣或寡醣)可用的GlcNAc。需要最佳化CMP-N-乙醯神經胺酸與GlcNAc兩者以確保CMP-N-乙醯神經胺酸與GlcNAc兩者的高水平。這樣的最佳化可包括有效率的平衡與調整涉及CMP-N-乙醯神經胺酸與GlcNAc兩者合成的多肽表現水平。

在本發明的方法及/或細胞的另一附加及/或較佳實施例中，如本文揭露的細胞係經修飾所述細胞中表現的任何醣基轉移酶的表現量或活性，較佳為本文所述的任何醣基轉移酶。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，所述細胞係經修飾酵素的表現或活性，所述酵素係擇自以下群組：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶。根據本發明，所列包括葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶的酵素為經修飾表現量或活性的內源性蛋白質，較佳的是所述內源性蛋白質為過度表現的，或者所列群組的酵素為可由細胞異源表現的異源性蛋白質。異源表現的蛋白質接著將被導入或表現，較佳為過度表現。在另一實施例中，內源性蛋白質於細胞中可具有修飾的表現，所述細胞也表現外源性蛋白質。異源表現可以來自宿主的基因體或來自導入如本文所述的細胞的載體。

在另一較佳實施例中，本文所述的細胞表現至少一葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶與磷酸酶以合成N-乙醯葡萄糖胺。在此較佳實施例中，所述葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶在細胞中可將葡萄糖胺6-磷酸轉變成N-乙醯葡萄糖胺6-磷酸，且所述磷酸酶在細胞中可去磷酸化N-乙醯葡萄糖胺6-磷酸以產生N-乙醯葡萄糖胺。對於來自HAD超家族與類HAD家族的磷酸酶在本領域中已有相關描述。如WO18122225中所述，來自這些家族的範例可見於從大腸桿菌的基因 yqaB、 inhX、 yniC、 ybiV、 yidA、 ybjI、 yigL或 cof表現的酵素，或可見於從包括aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU的大腸桿菌基因的其中一或多種表現的酵素，或可見於從戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP表現的酵素，或可見於從酵母菌的ScDOG1表現的酵素，或可見於從枯草桿菌的BsAraL表現的酵素。催化此反應的一種磷酸酶於愛默生小芽枝黴菌( Blastocladiella emersonii)中鑑定出。磷酸酶一般是非特異性的且活性一般與家族或結構無關。因此，其他範例可見於所有磷酸酶家族。特定的磷酸酶可利用Fahs等人(ACS Chem. Biol. 11(11), 2944-2961 (2016))所述的習知方法來進行鑑定與篩選。在較佳實施例中，所述磷酸酶是由異源性核酸所編碼。換言之，所述磷酸酶較佳是於所述細胞中異源表現。在另一較佳實施例中，所述葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶是由異源性核酸所編碼。換言之，所述葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶較佳是於所述細胞中異源表現。

在更佳實施例中，所述葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶 (i) 為UniProt ID P43577的多肽序列，或(ii) 為UniProt ID P43577的所述多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於UniProt ID P43577的所述多肽的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶的活性，或(iii) 為UniProt ID P43577的所述多肽的功能性片段，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶的活性，或(iv) 包括包含相對於UniProt ID P43577的所述多肽的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於UniProt ID P43577的所述多肽的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶的活性。在另一較佳實施例中，所述L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶(i) UniProt ID P17169的多肽序列，或(ii) 為UniProt ID P17169的所述多肽的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於UniProt ID P17169的所述多肽的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的活性，或(iii) 為UniProt ID P17169的所述多肽的功能性片段，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的活性，或(iv) 包括包含相對於UniProt ID P17169的所述多肽的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於UniProt ID P17169的所述多肽的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的活性。在一替代實施例中，所述L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶(i) 為與大腸桿菌的glmS不同的glmS*54的多肽序列，UniProt ID為P17169，如Deng等人(Biochimie 88, 419-29 (2006))所述具有A39T、R250C與G472S突變，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的活性，或(ii) 為所述突變glmS*54多肽的功能性同源物、變體或衍生物，所述glmS*54多肽與大腸桿菌的glmS不同，其UniProt ID為P17169，具有A39T、R250C與G472S突變，所述突變glmS*54多肽的功能性同源物、變體或衍生物相對於UniProt ID P17169的所述glmS*54多肽的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的活性，或(iii) 為所述突變glmS*54多肽的功能性片段，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的活性，所述glmS*54多肽與大腸桿菌的glmS不同，其UniProt ID為P17169，具有A39T、R250C與G472S突變，或(iv) 包括包含相對於所述突變glmS*54多肽的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於所述突變glmS*54多肽的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的活性，所述glmS*54多肽與大腸桿菌的glmS不同，其UniProt ID為P17169，具有A39T、R250C與G472S突變。

在本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例中，細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉變成葡萄糖胺-6-磷酸，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸轉變成果糖-6-磷酸。在細胞中，N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸可透過如nagA的N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶的活性而轉變成葡萄糖胺-6-磷酸，且葡萄糖胺-6-磷酸可透過如nagB的葡萄糖胺-6-磷酸去胺酶的活性而轉變成果糖-6-磷酸。這類N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶及/或葡萄糖胺-6-磷酸去胺酶可透過誘發突變(mutagenesis)或部分或完全缺失編碼序列對應的多核苷酸或利用本領域周知的方法誘發突變控制對應編碼的多核苷酸表現的啟動子序列而獲得降低的表現量或降低的活性。

在如本文所述的方法及/或細胞的更一較佳實施例中，細胞係經修飾以增加UDP-半乳糖的產生，且其中修飾係擇自包含以下所列的群組：剔除編碼5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶的基因或剔除編碼半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)的基因。

在本發明的方法及/或細胞的更一較佳實施例中，細胞使用如WO/2012/007481所述具有產生途徑與生物量途徑的分解代謝(split metabolism)，WO/2012/007481透過引用的方式併入本文。例如，所述細胞可經基因修飾以透過改變選自下列的基因而累積果糖-6-磷酸：磷酸葡萄醣異構酶基因、磷酸果糖激酶基因、果糖-6-磷酸醛醇縮酶(fructose-6-phosphate aldolase)基因、果糖異構酶基因及/或果糖:PEP磷酸轉移酶基因。

在根據本發明的方法/或細胞的較佳實施例中，細胞表現膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽，藉此將化合物運輸穿越細胞壁的外膜。在本發明的方法/或細胞的另一較佳實施例中，細胞表現一種以上的膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽，藉此將化合物運輸穿越細胞壁的外膜。在本發明的方法/或細胞的更佳實施例中，細胞係經修飾所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽的表現或活性。所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽為細胞具有修飾的表現或活性的內源性蛋白質，較佳的是所述內源性膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽是過度表現的；或者，所述內源性膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽為異源導入至所述細胞並於細胞中表現的異源性蛋白質，較佳的是其為過度表現的。所述內源性膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽在細胞中可具有修飾的表現，所述細胞也表現異源性膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽。

在本發明的方法/或細胞的更佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽係擇自於包含以下所列的名單：運輸蛋白(porter)、P-P鍵結水解驅動運輸蛋白、β桶孔蛋白(β-barrel porin)、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白(putative transport protein)及磷酸轉移驅動基團轉位蛋白(phosphotransfer-driven group translocator)。在本發明的方法/或細胞的更佳實施例中，運輸蛋白(porter)包括MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵體輸出蛋白(siderophore exporter)。在本發明的方法/或細胞的另一更佳實施例中，P-P鍵結水解驅動運輸蛋白包括ABC運輸蛋白與螯鐵體輸出蛋白。

在本發明的方法/或細胞的另一較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制所述半乳糖化雙醣或寡醣於細胞壁外膜的流動。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物於細胞壁外膜的流動，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一所述半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣的混合物於細胞壁外膜的流動，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣包含至少一所述半乳糖化寡醣。

在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制一或多種前驅物於細胞壁外膜的流動，所述一或多種前驅物用以產生所述的半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制一或多種前驅物於細胞壁外膜的流動，所述一或多種前驅物用以產生帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣的所述混合物，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一所述半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制一或多種前驅物於細胞壁外膜的流動，所述一或多種前驅物用以產生帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣的所述混合物，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣包含至少一所述半乳糖化寡醣。

在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制一或多種接受者於細胞壁外膜的流動，所述一或多種接受者用以產生所述的半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制一或多種接受者於細胞壁外膜的流動，所述一或多種前驅物用以產生帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣的所述混合物，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一所述半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制一或多種接受者於細胞壁外膜的流動，所述一或多種前驅物用以產生帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣的所述混合物，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣包含至少一所述半乳糖化寡醣。

在本發明的方法/或細胞的另一較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽改善所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生。在本發明的方法/或細胞的另一較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽改善帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣的所述混合物的產生，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一所述半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的方法/或細胞的另一較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽改善帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣的所述混合物的產生，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣包含至少一所述半乳糖化寡醣。

在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽使所述半乳糖化雙醣或寡醣得以流出。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽使帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣的所述混合物得以流出，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一所述半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽使帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣的所述混合物得以流出，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣包含至少一所述半乳糖化寡醣。

在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽增強所述半乳糖化雙醣或寡醣的流出。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽增強帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣的所述混合物的流出，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一所述半乳糖化雙醣或寡醣。在本發明的方法/或細胞的替代及/或額外較佳實施例中，膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽增強帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣的所述混合物的流出，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣包含至少一所述半乳糖化寡醣。

在本發明的方法/或細胞的另一較佳實施例中，細胞表現選自包括以下所列的群組：如LacY或lac12通透酶(permease)的乳糖運輸蛋白、葡萄糖運輸蛋白、半乳糖運輸蛋白、岩藻糖運輸蛋白、核苷酸活化糖的運輸蛋白，例如UDP-Gal、UDP-GlcNAc、GDP-Fuc或CMP-唾液酸。如此一來，所述運輸蛋白內化(internalize)添加至培養基的前驅物及/或接受者以用於合成半乳糖化雙醣或寡醣、帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一所述半乳糖化雙醣或寡醣、或帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣的混合物，所述帶電(較佳為唾液酸化)及/或中性寡醣包含至少一所述半乳糖化寡醣。

在本發明的方法/或細胞的更佳實施例中，細胞表現屬於MFS運輸蛋白家族的膜運輸蛋白，例如來自以下物種的多藥運輸蛋白MdfA家族的MdfA多肽，包括大腸桿菌(UniProt ID P0AEY8)、穆汀斯克羅諾桿菌( Cronobacter muytjensii)(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、楊氏檸檬酸桿菌( Citrobacter youngae) (UniProt ID D4BC23)與雷金斯堡預研菌( Yokenella regensburgei)(UniProt ID G9Z5F4)。在本發明的方法/或細胞的另一更佳實施例中，細胞表現屬於糖流出運輸蛋白家族的膜運輸蛋白，例如來自以下物種的SetA家族的SetA多肽，包括大腸桿菌(UniProt ID P31675)、克氏檸檬酸桿菌( Citrobacter koseri)(UniProt ID A0A078LM16)、克雷伯氏肺炎桿菌( Klebsiella pneumoniae)(UniProt ID A0A0C4MGS7)。在本發明的方法/或細胞的另一更佳實施例中，細胞表現屬於敖鐵蛋白輸出蛋白(siderophore exporter)家族的膜運輸蛋白，例如大腸桿菌的entS(UniProt ID P24077)與大腸桿菌的iceT(UniProt ID A0A024L207)。在本發明的方法/或細胞的另一更佳實施例中，細胞表現屬於ABC運輸蛋白家族的膜運輸蛋白，例如來自大腸桿菌的oppF(UniProt ID P77737)、來自乳酸乳球菌亞種雙乙酸乳酸變種( Lactococcus lactis subsp. lactis bv. Diacetylactis)的ImrA(UniProt ID A0A1V0NEL4)與嬰兒長雙歧桿菌亞種( Bifidobacterium longum subsp. Infantis)的Blon_2475 (UniProt ID B7GPD4)。在本發明的方法/或細胞的更佳實施例中，細胞表現的選自包含以下所列的名單的膜運輸蛋白：如LacY或lac12通透酶的乳糖運輸蛋白、岩藻糖運輸蛋白、葡萄糖運輸蛋白、半乳糖運輸蛋白、核苷酸活化糖的運輸蛋白，例如UDP-Gal、UDP-GlcNAc、GDP-Fuc或CMP-唾液酸。

在本發明的方法/或細胞的較佳實施例中，細胞使用醣基化反應中的乳糖以產生寡醣。乳糖可由細胞所產生(例如，透過細胞代謝及/或透過本領域具有通常知識者所知的目的而對細胞進行代謝改造)，較佳為胞內產生，或可添加至細胞，細胞可透過被動或主動運輸輸入所述乳糖。細胞乳糖的產生可透過表現N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶與UDP-葡萄糖4-表異構酶而達成。更佳的是，細胞係經修飾以增加乳糖的產生。所述修飾可以選自包含下列的群組的一或多種：過度表現N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶及過度表現UDP-葡萄糖4-表異構酶。

在本發明的方法/或細胞的較佳實施例中，使用醣基化反應中的乳糖作為接受者的細胞較佳為具有從培養中攝入乳糖的運輸蛋白。更佳的是，細胞係經過乳糖攝入的最佳化。所述最佳化可以是乳糖運輸蛋白的過度表現，乳糖運輸蛋白如來自大腸桿菌或乳酸克魯維酵母菌( Kluyveromyces lactis)的乳糖通透酶。較佳的是，細胞持續地表現乳糖通透酶。乳糖可於培養的一開始添加，或是可在培養成長階段形成足夠的生物量時添加，亦即，添加乳糖至培養而起始的寡醣產生階段與成長階段去耦合。在較佳實施例中，乳糖於培養的一開始及/或於培養時添加，亦即成長階段與產生階段未去耦合。

在本發明的方法/或細胞的較佳實施例中，當在乳糖與一種或多種其他碳源結合的環境中生長時，細胞會抵抗乳糖殺傷(lactose killing)的現象。「乳糖殺傷」一詞指的是細胞在含有乳糖和另一種碳源的培養基中生長受阻。在較佳實施例中，如WO 2016/075243中所述，細胞係經過基因修飾，即使在高乳糖濃度下，也能保留至少50%的乳糖流入而不會經歷乳糖殺傷。所述基因修飾包括透過沒有造成乳糖殺傷表現型的異源性啟動子的外源性及/或內源性乳糖運輸基因的表現及/或過度表現，及/或修飾乳糖運輸蛋白的密碼子使用偏好以產生沒有造成乳糖殺傷表現型的所述乳糖運輸蛋白改變的表現。WO 2016/075243的內容在這方面透過引用的方式併入本文。在本發明的背景下，乳糖較佳為由本文揭露的細胞所攝入，其中所述乳糖進一步由本文揭露的醣基轉移酶而醣基化以合成MMO，較佳為HMO。

根據本發明的方法及/或細胞的另一實施例，細胞可產生磷酸烯醇丙酮酸鹽(phosphoenolpyruvate, PEP)。根據本發明的方法及/或細胞的另一實施例，細胞包括產生半乳糖化雙醣或寡醣的途徑，其包括產生PEP的途徑。在本發名的方法及/或細胞的較佳實施例中，與未修飾的前驅細胞相比，細胞係經修飾以增強PEP的產生與供應。

在另一較佳實施例中，細胞包括產生半乳糖化雙醣或寡醣的途徑，其包括與未修飾的前驅細胞相比增強PEP的產生與供應的一或多種修飾。

在較佳實施例中且作為增強PEP的產生與供應的方法，一種或多種 PEP依賴性糖運輸磷酸轉移酶系統被破壞，例如但不限於：1) N-乙醯-D-葡萄糖胺Npi-磷酸轉移酶(EC 2.7.1.193)，由如大腸桿菌或桿菌物種的nagE基因(或叢集nagABCD)所編碼，2) ManXYZ，其編碼輸入外源性六碳糖(甘露糖、葡萄糖、葡萄糖胺、果糖、2-去氧葡萄糖、甘露糖胺、N-乙醯葡萄糖胺等)且釋出磷酸酯至細胞質的酵素II Man複合體(甘露糖PTS通透酶、蛋白質-Npi-磷酸組胺酸-D-甘露糖磷酸轉移酶(protein-Npi-phosphohistidine-D-mannose phosphotransferase)，3) 葡萄糖特異性PTS運輸蛋白(例如由PtsG/Crr所編碼)，其攝入葡萄糖並於細胞質中形成葡萄糖-6-磷酸，4) 蔗糖特異性運輸蛋白，其攝入蔗糖並於細胞質中形成蔗糖-6-磷酸，5) 果糖特異性運輸蛋白(例如由基因fruA與fruB及基因fruK所編碼)，其攝入果糖並在第一步驟形成果糖-1-磷酸，且在第二步驟形成果糖1,6-二磷酸，6) 乳糖PTS運輸蛋白(例如由乾酪乳桿菌( Lactococcus casei)中的lacE所編碼)，其攝入乳糖並形成乳糖-6-磷酸，7) 半乳糖醇特異性PTS酵素，其攝入半乳糖醇及/或山梨醇並分別形成半乳糖醇-1-磷酸或山梨醇-6-磷酸，8) 甘露醇特異性PTS酵素，其攝入甘露醇及/或山梨醇並分別形成甘露醇-1-磷酸或山梨醇-6-磷酸，及9) 海藻糖特異性PTS酵素，其攝入海藻糖並形成海藻糖-6-磷酸。

在另一及/或額外較佳實施例中且作為增強PEP的產生與供應的方法，透過破壞PtsIH/Crr基音叢集來破壞完整的PTS系統。PtsI(酵素I)為細胞質蛋白質，其作為大腸桿菌K-12的磷酸烯醇丙酮酸鹽:糖磷酸轉移酶系統(PTS糖)的閘道(gateway)。PtsI是PTS糖兩個糖非特異性蛋白組成(PtsI與PtsH)的其中之一，其與糖特異性內膜通透酶造成磷酸轉移反應(cascade)，而磷酸轉移反應導致耦合磷酸化以及一系列醣受質的運輸。HPr(含組胺酸蛋白質)為是PTS糖兩個糖特異性蛋白組成的其中之一。HPr叢磷酸化酵素I(PtsI-P)接受磷酸基團，並接著轉移至PTS醣的許多糖特異性酵素的任一者的EIIA結構域。Crr或EIIAGlc是被需要PtsH與PtsI的反應中的PEP所磷酸化。

在另一及/或較佳實施例中，透過導入及/或過度表現對應的通透酶，細胞經進一步的修飾以補償碳源的PTS系統的缺失。這些是如通透酶或ABC運輸蛋白，其包括但不限於特異性輸入乳糖的運輸蛋白，例如由來自大腸桿菌的LacY基因所編碼的運輸蛋白，特異性輸入蔗糖的運輸蛋白，例如由來自大腸桿菌的cscB基因所編碼的運輸蛋白，特異性輸入葡萄糖的運輸蛋白，例如由來自大腸桿菌的galP基因所編碼的運輸蛋白，特異性輸入果糖的運輸蛋白，例如由來自變種鏈球菌( Streptococcus mutans)的fruI基因所編碼的運輸蛋白，或者是山梨醇/甘露醇ABC運輸蛋白，例如類球紅細菌( Rhodobacter sphaeroides)的叢集SmoEFGK所編碼的運輸蛋白，海藻糖/蔗糖/麥芽糖運輸蛋白，例如苜蓿中華根瘤菌( Sinorhizobium meliloti)的叢集ThuEFGK所編碼的運輸蛋白，以及N-乙醯葡萄糖胺/半乳糖/葡萄糖運輸蛋白，例如奧奈達希瓦氏菌( Shewanella oneidensis)的NagP所編碼的運輸蛋白。PTS缺失與替代運輸蛋白過度表現的組合範例為：1) 缺失葡萄糖PTS系統，例如ptsG基因，結合導入及/或過度表現葡萄糖通透酶(例如galP或glcP)，2) 缺失果糖PTS系統，例如fruB、fruA、fruK基因的一或多種，結合導入及/或過度表現果糖通透酶，例如fruI，3) 缺失乳糖PTS系統，結合導入及/或過度表現乳糖通透酶，例如LacY，及/或4) 缺失蔗糖PTS系統，結合導入及/或過度表現蔗糖通透酶，例如cscB。

在更佳實施例中，透過導入及/或過度表現醣激酶，細胞經修飾以補償碳源的PTS系統的缺失，醣激酶如葡萄糖激酶(EC 2.7.1.1、EC 2.7.1.2、EC 2.7.1.63)、半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)及/或果糖激酶(EC 2.7.1.3、EC 2.7.1.4)。PTS缺失與替代運輸蛋白與激酶過度表現的組合範例為：1) 缺失葡萄糖PTS系統，例如ptsG基因，結合導入及/或過度表現葡萄糖通透酶(例如galP或glcP)，結合導入及/或過度表現葡萄糖激酶(例如，glk)，及/或2) 缺失果糖PTS系統，例如fruB、fruA、fruK基因的一或多種，結合導入及/或過度表現果糖通透酶，例如fruI，結合導入及/或過度表現果糖激酶(例如frk或mak)。

在另一及/或額外較佳實施例中且作為增強PEP的產生與供應的方法，透過導入或修飾以下所列的一或多種來修飾細胞：磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶活性(EC: 2.7.9.2，例如由大腸桿菌中的ppsA所編碼)、磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶活性(EC 4.1.1.32或EC 4.1.1.49，例如分別由麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)中的PCK或由大腸桿菌中的pckA所編碼)、磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶活性(EC 4.1.1.31，例如由大腸桿菌中的ppc所編碼)、草醯醋酸鹽去羧酶(oxaloacetate decarboxylase)活性(EC 4.1.1.112，例如由大腸桿菌的eda所編碼)、丙酮酸激酶活性(EC 2.7.1.40，例如由大腸桿菌中的pykA與pykF所編碼)、丙酮酸羧酶活性(EC 6.4.1.1，例如由枯草桿菌中的pyc所編碼)、以及蘋果酸去氫酶活性(EC 1.1.1.38或EC 1.1.1.40，例如分別由大腸桿菌中的maeA或maeB所編碼)。

在更佳實施例中，細胞係經修飾以過度表現包含以下任一或多種的多肽：大腸桿菌的ppsA(UniProt ID P23538)、麩胺酸棒狀桿菌( C.glutamicum)的PCK(UniProt ID Q6F5A5)、大腸桿菌的pcka(UniProt ID P22259)、大腸桿菌的eda(UniProt ID P0A955)、大腸桿菌的maeA(UniProt ID P26616)以及大腸桿菌的maeB(UniProt ID P76558)。

在另一及/或額外的較佳實施例中，細胞係經修飾以表現任一或多種多肽，所述多肽具有磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶活性、草醯醋酸鹽去羧酶活性或蘋果酸去氫酶活性。

在另一及/或額外的較佳實施例中且作為增強PEP的產生與供應的方法，透過減少磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶活性及/或丙酮酸激酶活性來修飾細胞，較佳為缺失編碼磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶、丙酮酸羧酶及/或丙酮酸激酶的基因。

在一例示性實施例中，細胞透過不同的適應(adaptation)來進行修飾，例如過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現草醯醋酸鹽去羧酶結合缺失丙酮酸激酶基因；過度表現草醯醋酸鹽去羧酶結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現蘋果酸去氫酶結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因、及/或蘋果酸去氫酶結合缺失丙酮酸羧酶基因。

在另一例示性實施例中，細胞透過不同的適應來進行修飾，例如過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現蘋果酸去氫酶；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現蘋果酸去氫酶、過度表現草醯醋酸鹽去羧酶結合過度表現蘋果酸去氫酶；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶以及過度表現草醯醋酸鹽去羧酶；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶以及過度表現蘋果酸去氫酶；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶、過度表現草醯醋酸鹽去羧酶以及過度表現蘋果酸去氫酶；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶以及過度表現蘋果酸去氫酶；及/或過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶以及過度表現蘋果酸去氫酶。

在另一例示性實施例中，細胞透過不同的適應來進行修飾，例如過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現草醯醋酸鹽去羧酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶、過度表現草醯醋酸鹽去羧酶、及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因；以及過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因。

在另一例示性實施例中，細胞透過不同的適應來進行修飾，例如過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現草醯醋酸鹽去羧酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶、過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因；以及過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶基因。

在另一例示性實施例中，細胞透過不同的適應來進行修飾，例如過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現草醯醋酸鹽去羧酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶、過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因；以及過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸羧酶基因。

在另一例示性實施例中，細胞透過不同的適應來進行修飾，例如過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現草醯醋酸鹽去羧酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶、過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；以及過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因。

在另一例示性實施例中，細胞透過不同的適應來進行修飾，例如過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現草醯醋酸鹽去羧酶結合過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現草醯醋酸鹽去羧酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶、過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽羧化激酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因；以及過度表現磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶結合過度表現草醯醋酸鹽去羧酶及過度表現蘋果酸去氫酶並結合缺失丙酮酸激酶的基因、丙酮酸羧酶的基因與磷酸烯醇丙酮酸鹽羧酶的基因。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，細胞與未經修飾的前驅細胞(progenitor)相比包括減少乙酸鹽(acetate)產生的修飾。所述修飾可以是選自包括下列的群組的一或多種：過度表現乙醯輔酶A合成酶、完全或部分剔除或致使較低功能性的丙酮酸去氫酶、及完全或部分剔除或致使較低功能性的乳酸脫氫酶。

在本發明的方法及/或細胞的更一實施例中，細胞係經修飾至少一乙醯輔酶A合成酶(acetyl-coenzyme A synthetase, acs)的表現或活性，例如來自大腸桿菌、酵母菌、人類或小鼠( M. musculus)的acs。在較佳實施例中，所述乙醯輔酶A合成酶為具有修飾的表現或活性的細胞的內源性蛋白質，較佳的是所述內源性乙醯輔酶A合成酶為過度表現的；或者，所述乙醯輔酶A合成酶為異源導入所述細胞並於所述細胞中表現的異源性蛋白質，較佳為過度表現的。所述內源性乙醯輔酶A合成酶在細胞中可具有修飾的表現，而所述細胞也表現異源性乙醯輔酶A合成酶。在更佳實施例中，細胞係經修飾來自大腸桿菌的乙醯輔酶A合成酶acs(UniProt ID P27550)的表現或活性。在另一及/或額外較佳實施例中，細胞係經修飾來自大腸桿菌的乙醯輔酶A合成酶acs(UniProt ID P27550)的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於來自大腸桿菌的所述多肽(UniProt ID P27550)具有至少80%的全體序列相似度，且具有乙醯輔酶A合成酶的活性。

在本發明的方法及/或細胞的更一替代及/或額外實施例中，細胞係經修飾至少一丙酮酸去氫酶的表現或活性，例如來自大腸桿菌、酵母菌、褐鼠( R. norvegicus)的丙酮酸去氫酶。在較佳實施例中，透過本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般所知的方法導致至少一種蛋白質具有較少的功能或失去丙酮酸去氫酶活性，細胞係經過修飾以具有至少一部分或完全剔除的或突變之編碼丙酮酸去氫酶的基因。在更佳實施例中，細胞編碼poxB的基因被完全剔除，導致細胞缺少丙酮酸去氫酶活性。

在本發明的方法及/或細胞的更一替代及/或額外實施例中，細胞係經修飾至少一乳酸脫氫酶的表現或活性，例如來自大腸桿菌、酵母菌、褐鼠( R. norvegicus)的乳酸脫氫酶。在較佳實施例中，透過本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般所知的方法導致至少一種蛋白質具有較少的功能或失去乳酸脫氫酶活性，細胞係經過修飾以具有至少一部分或完全剔除的或突變之編碼乳酸脫氫酶的基因。在更佳實施例中，細胞編碼ldhA的基因被完全剔除，導致細胞缺少乳酸脫氫酶活性。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，細胞與未經修飾的前驅細胞相比包括以下任一或多種蛋白質降低或減少的表現及/或經破壞、削弱、減少或延遲的活性，所述一或多種蛋白質包括：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷 O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白(N-acetylglucosamine repressor)、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖1-磷酸轉移酶(UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase)、L-岩藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶(L-fucose isomerase)、N-乙醯神經胺酸裂解酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1(ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1)、ATP 依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶 2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(glucose-specific translocating phosphotransferase)酵素IIBC組成ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(phosphotransferase, PTS)酵素IIBC組成malX、酵素IIAGlc、β-葡萄糖苷特異性PTS酵素II、果糖特異性PTS多磷醯基轉移蛋白FruA與FruB、乙醇脫氫酶、醛脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)、乙酸激酶、磷酸醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶及丙酮酸脫羧酶。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，細胞包括選擇的單醣、雙醣或寡醣至少部分失活的分解途徑，所述單醣、雙醣或寡醣涉及半乳糖化雙醣或寡醣的產生及/或是產生所述半乳糖化雙醣或寡醣所需的。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，細胞使用產生半乳糖化雙醣或寡醣的前驅物，較佳的是所述前驅物是由培養基提供給所述細胞。根據方法及/或細胞更佳的態樣，細胞使用產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的至少兩種前驅物，較佳的是所述前驅物是由培養基提供給所述細胞。根據本發明的方法及/或細胞另一較佳的態樣，細胞產生用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的至少一種前驅物，較佳為至少兩種前驅物。在方法及/或細胞的較佳實施例中，細胞用於產生半乳糖化雙醣或寡醣的前驅物完全轉變成所述半乳糖化雙醣或寡醣。

根據本發明的方法及/或細胞的另一較佳實施例，細胞於全培養液(whole broth)及/或上清液中產生90g/L或90g/L以上的半乳糖化雙醣或寡醣。在更佳實施例中，以全培養液及/或上清液中產生的半乳糖化雙醣或寡醣及其前驅物的總量進行測量，全培養液及/或上清液中產生的所述半乳糖化雙醣或寡醣具有至少80%的純度。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，細胞可分解代謝擇自包含以下所列的名單的碳源：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽寡醣、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液(corn-steep liquor)、糖蜜(molasses)、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。

在本發明的方法及/或細胞的替代實施例中，本文所述的細胞可在以單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇(polyol)、甘油、包括糖蜜、玉米浸液、蛋白腖(peptone)、胰腖(tryptone)、酵母萃取物或其混合物作為主要碳源的複合培養基中成長，例如混合原料(feedstock)，較佳為混合單醣原料如水解蔗糖。「複合培養基」一詞指的是實際組成未確定的培養基。「主要」一詞指的是對於半乳糖化雙醣或寡醣、生物量形成、二氧化碳及/或副產物形成而言最重要的碳源例如，酸及/或醇類如乙酸、乳酸及/或乙醇)，亦即，所有所需碳源的百分之20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、98、99來自上述碳源。在本發明的一實施例中，所述碳源對於所述生物體而言是唯一碳源，即所有所需碳源的百分之100來自上述碳源。常見的主要碳源包括但不限於葡萄糖、甘油、果糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯醣、麥芽寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖(rhamnose)、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜(molasses)、玉米浸液(corn-steep liquor)、高果糖漿、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。「複合培養基」一詞指的是實際組成未確定的培養基。範例為糖蜜、玉米浸液、蛋白腖(peptone)、胰腖(tryptone)或酵母萃取物。

本發明的另一實施例提供一種方法與一種細胞，其中半乳糖化雙醣或寡醣是由本文所述的真菌、酵母菌、細菌、昆蟲、動物、植物或原生細胞所產生。細胞是選自包含以下所列的名單：細菌、酵母菌、原生動物或真菌，或指的是植物或動物細胞。後者的細菌較佳屬於變形菌門(Proteobacteria)或後壁菌門(Firmicutes)或藍綠菌門(Cyanobacteria)或異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)。屬於變形菌門的後者細菌較佳屬於腸桿菌科( Enterobacteriaceae)，較佳屬於大腸桿菌種。後者的細菌較佳屬於大腸桿菌種的任何菌株，例如但不限於大腸桿菌B( Escherichia coliB)、大腸桿菌C( Escherichia coliC)、大腸桿菌W( Escherichia coliW)、大腸桿菌K12( Escherichia coliK12)、大腸桿菌Nissle( Escherichia coliNissle)。更具體而言，後者一詞是關於培養的大腸桿菌菌株，其指定為大腸桿菌K12菌株，對於實驗室環境適應良好，且與野生行菌株不同的是失去在腸道生存的能力。大腸桿菌K12菌株眾所周知的範例為K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111與AA200。因此，本發明特別是關於如前文所述的突變及/或轉形的大腸桿菌細胞或菌株，其中所述大腸桿菌菌株為K12菌株。更佳的是，大腸桿菌K12菌株為大腸桿菌MG1655。屬於後壁菌門(Firmicutes)的後者細菌較佳屬於桿菌(Bacilli)，較佳為乳酸桿菌(Lactobacilliales)，其成員有乳酸乳酸桿菌( Lactobacillus lactis)、腸膜明串珠菌( Leuconostoc mesenteroides)，或較佳為核衣細菌目(Bacillales)，其成員如來自桿菌屬( Bacillus)，例如枯草桿菌( Bacillus subtilis)或芽孢枯草桿菌( B.amyloliquefaciens)。屬於放線菌門(Actinobacteria)的後者細菌較佳屬於棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)，其成員有麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)或非發酵棒桿菌( C. afermentans)，或較佳屬於鏈絲菌科(Streptomycetaceae)，其成員有灰色鏈黴菌( Streptomyces griseus)或弗氏鏈黴菌( S. fradiae)。後者的酵母菌較佳屬於子囊菌門(Ascomycota)或擔子菌門(Basidiomycota)或半知菌門(Deuteromycota)或接合菌門(Zygomycetes)。後者的酵母菌較佳屬於酵母菌屬( Saccharomyces)(其成員如啤酒酵母菌( Saccharomyces cerevisiae)、貝酵母菌( S. bayanus)、布拉迪酵母( S. boulardii))、畢赤酵母菌屬( Pichia)(甲醇酵母( Pichia pastoris)、異常畢赤酵母( P. anomala)、克魯維畢赤酵母( P. kluyveri))、克馬格特勒酵母菌屬( Komagataella)、漢遜氏酵母菌屬( Hansenula)、克魯維酵母菌屬( Kluyveromyces)(其成員如乳酸克魯維酵母( Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母( K. marxianus)、耐熱克魯維酵母( K. thermotolerans))、德巴利酵母菌屬( Debaromyces)、子囊菌酵母屬( Yarrowia)(例如，解脂耶氏酵母( Yarrowia lipolytica))、或擬球酵母菌屬( Starmerella)(例如，擬球酵母菌( Starmerella bombicola))。後者的酵母菌較佳選自甲醇酵母( Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母( Yarrowia lipolytica)、啤酒酵母菌( Saccharomyces cerevisiae)與乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)。後者的真菌較佳屬於酒麴菌屬(Rhizopus)、網柄菌屬(Dictyostelium)、青黴菌屬(Penicillium)、白黴菌屬(Mucor)或麴菌屬(Aspergillus)。植物細胞包括開花植物與非開花植物的細胞，以及藻類細胞，例如單胞藻屬(Chlamydomonas)、綠球藻屬(Chlorella)等。較佳的是，所述植物為煙草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、油菜籽、大豆、玉米或玉米植物。後者的動物細胞較佳為衍生自非人類哺乳類 (例如，牛、水牛、豬、羊、小鼠、大鼠)、鳥類(例如，雞、鴨、鴕鳥、火雞、野雞(pheasant))、魚類(例如，劍魚、鮭魚、金槍魚、鱸魚、鱒魚、鯰魚)、無脊椎動物(例如，龍蝦、螃蟹、蝦、蛤蜊、牡蠣、貽貝、海膽)、爬蟲類(例如，蛇、短吻鱷、烏龜)、兩棲類(例如，青蛙)或昆蟲類(例如，果蠅、線蟲)，或是衍生自胚胎幹細胞之外的人類細胞的基因修飾細胞株。人類與非人類哺乳類細胞較佳皆可選自包含以下所列的名單：上皮細胞如乳腺上皮細胞、胚胎腎細胞(例如，HEK293或HEK 293T細胞)、纖維母細胞、COS細胞、中華倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster ovary cell, CHO cell)、鼠類骨髓瘤細胞(例如，N20、SP2/0或YB2/0 cell)、NIH-3T3細胞、非哺乳類成人幹細胞或其衍生細胞，例如如WO21067641中所述。後者的昆蟲細胞較佳是衍生自秋行軍蟲( Spodoptera frugiperda)(例如，sf9或sf21細胞)、蠶( Bombyx mori)、甘藍夜蛾( Mamestra brassicae)、粉紋夜蛾( Trichoplusia ni)(例如，BTI-TN-5B1-4細胞)或黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)(例如，果蠅S2細胞)。後者的原生動物細胞較佳為狼蛛利什曼原蟲( Leishmania tarentolae)細胞。

在本發明的方法及/或細胞的較佳實施例中，細胞為活革蘭氏陰性菌，所述活革蘭氏陰性菌與未經修飾的前驅細胞相比包括聚N-乙醯葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG)、腸細菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen, ECA)、纖維素、可拉酸(colonic acid)、核心寡醣、滲透調節間質葡聚醣(osmoregulated perplasmic glucan, OPG)、葡萄糖苷甘油(glucosylglycerol)、聚醣(glycan)及/或海藻糖減弱或經破壞的合成。

在本發明的方法及/或細胞的更佳實施例中，透過對參與合成任一或多種的聚N-乙醯葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG)、腸細菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen, ECA)、纖維素、可拉酸(colonic acid)、核心寡醣、滲透調節間質葡聚醣(osmoregulated perplasmic glucan, OPG)、葡萄糖苷甘油(glucosylglycerol)、聚醣(glycan)及/或海藻糖的一或多種醣基轉移酶進行突變，以提供聚N-乙醯葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG)、腸細菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen, ECA)、纖維素、可拉酸(colonic acid)、核心寡醣、滲透調節間質葡聚醣(osmoregulated perplasmic glucan, OPG)、葡萄糖苷甘油(glucosylglycerol)、聚醣(glycan)及/或海藻糖減弱或經破壞的合成，其中所述突變提供任一所述的醣基轉移酶的缺失或較低的表現。所述醣基轉移酶包括編碼下述的醣基轉移酶基因：聚-N-乙醯-D-葡萄糖胺合成酶次單元、UDP-N-乙醯葡萄糖胺-十一異戊烯基-磷酸N-乙醯葡萄糖胺磷酸轉移酶(UDP-N-acetylglucosamine—undecaprenyl-phosphate N-acetylglucosaminephosphotransferase)、Fuc4NAc(4-乙醯胺基-4,6-二去氧-D-半乳糖)轉移酶、UDP-N-乙醯-D-甘露糖胺醛酸轉移酶(UDP-N-acetyl-D-mannosaminuronic acid transferase)、編碼下述的醣基轉移酶基因：纖維素合成酶催化次單元、纖維素生合成蛋白、可拉酸生合成醛酸基轉移酶(colanic acid biosynthesis glucuronosyltransferase)、可拉酸生合成半乳糖基轉移酶、可拉酸生合成岩藻糖基轉移酶、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖1-磷酸轉移酶(UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase)、推定(putative)可拉酸生合成醣基轉移酶、UDP-葡萄糖醛酸鹽:LPS(HepIII)醣基轉移酶、ADP-庚糖-LPD庚糖基轉移酶2(ADP-heptose—LPS heptosyltransferase 2)、ADP-庚糖:LPS庚糖基轉移酶1(ADP-heptose:LPS heptosyltransferase 1)、推定ADP-庚糖:LPS庚糖基轉移酶4、脂多醣核心生合成蛋白、UDP-葡萄糖:(葡萄糖基)LPSα-1,2-葡萄糖基轉移酶(UDP-glucose:(glucosyl)LPS α-1,2-glucosyltransferase)、UDP-葡萄糖:(葡萄糖基)LPSα-1,3-葡萄糖基轉移酶、UDP-D-半乳糖:(葡萄糖基)脂多醣-1,6-D-半乳糖基轉移酶、脂多醣葡萄糖基轉移酶I、脂多醣核心庚糖基轉移酶3、β-1,6-半乳呋喃糖基轉移酶(β-1,6-galactofuranosyltransferase)、十一異戊烯基-磷酸4-去氧-6-甲醯胺基-L-阿拉伯糖轉移酶(undecaprenyl-phosphate 4-deoxy-4-formamido-L-arabinose transferase)、脂質IVA4-胺基-4-去氧-L-阿拉伯糖基轉移酶(lipid IVA 4-amino-4-deoxy-L-arabinosyltransferase)、細菌聚異平醇糖基轉移酶(bactoprenol glucosyl transferase)、推定家族2醣基轉移酶、滲透調節間質葡聚醣(osmoregulated perplasmic glucan, OPG)生合成蛋白質G、滲透調節間質葡聚醣生合成蛋白質H、葡萄糖甘油酸磷酸化酶(glucosylglycerate phosphorylase)、肝糖合成酶、1,4-α-葡聚醣分支酵素(1,4-α-glucan branching enzyme)、4-α-葡聚醣轉移酶(4-α-glucanotransferase)及海藻糖-6-磷酸合成酶。在一例示性實施例中，細胞係經突變包含下列的一或多種醣基轉移酶：pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA與yaiP，其中所述突變提供任一所述醣基轉移酶的缺失或較低的表現。

在方法及/或細胞替代及/或額外的較佳實施例中，透過過度表現編碼碳儲存調控蛋白的基因、缺失編碼Na+/H+反向運輸蛋白的基因及/或缺失編碼感測組胺酸激酶的基因而提供所述聚N-乙醯葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG)減弱或經破壞的合成。

根據本發明方法的另一實施例，允許產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的條件包括使用包含用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的至少一前驅物及/或接受者的培養基。較佳的是，培養基包含選自包括以下的群組的至少一前驅物：乳糖、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、GlcNAc、GalNAc、乳糖-N-雙糖(lacto-N-biose)、N-乙醯乳糖胺(LacNAc)。

根據本發明的方法的替代及/或額外實施例，允許產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的條件包括對培養基添加提供用以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的至少一前驅物及/或接受者。

根據本發明的方法的替代實施例，允許產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的條件包括使用培養基以培養本發明用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的細胞，其中所述培養基缺少任何用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的前驅物及/或接受者，且對所述培養基進一步添加提供用以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的至少一前驅物及/或接受者。

在較佳實施例中，本文所述產生半乳糖化雙醣或寡醣的方法包括至少其中一下述步驟： i) 使用包括至少一前驅物及/或接受者的培養基； ii) 將至少一前驅物饋料及/或接受者饋料添加至反應器中的培養基，其中總反應器體積介於250mL至10.000m3(立方公尺)，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述前驅物及/或接受者饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍； iii) 將至少一前驅物饋料及/或接受者饋料添加至反應器中的培養基，其中總反應器體積介於250mL至10.000m3，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述前驅物及/或接受者饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍，且其中較佳的是，所述前驅物及/或接受者饋料的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述前驅物及/或接受者饋料的溫度維持在20℃與80℃之間； iv) 以進料溶液的形式將至少一前驅物及/或接受者饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基； v) 以進料溶液的形式將至少一前驅物及/或接受者饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基，且其中較佳的是，所述進料溶液的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述進料溶液的溫度維持在20℃與80℃之間； 所述方法產生出最終培養濃度為至少為50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，且更佳為至少200g/L的所述半乳糖化雙醣或寡醣。

在另一及/或額外實施例中，本文所述產生半乳糖化雙醣或寡醣的方法包括至少其中一下述步驟： i) 使用包括每公升初始反應器體積至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，且更佳為至少150克的乳糖的培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)； ii) 將至少一前驅物及/或接受者以一次脈衝(pulse)或非連續性的方式添加至反應器中的培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)，較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述前驅物及/或接受者饋料脈衝之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍； iii) 將至少一前驅物及/或接受者以一次脈衝(pulse)或非連續性(脈衝)的方式添加至反應器中的培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)，較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述前驅物及/或接受者或饋料脈衝之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍，且其中較佳的是，所述前驅物及/或接受者饋料脈衝的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述前驅物及/或接受者饋料脈衝的溫度維持在20℃與80℃之間； iv) 以進料溶液的形式將至少一前驅物及/或接受者以非連續性(脈衝)的方式在5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、10小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天內添加至反應器中的培養基； v) 以進料溶液的形式將至少一前驅物及/或接受者以非連續性(脈衝)的方式在5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、10小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天內添加至反應器中的培養基，且其中較佳的是，所述進料溶液的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述進料溶液的溫度維持在20℃與80℃之間； 所述方法產生出最終培養濃度為至少為50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，且更佳為至少200g/L的半乳糖化雙醣或寡醣。

在本文所述方法的更一實施例中，宿主細胞連續培養至少約60、80、100或約120小時。

在較佳實施例中，於培養基中提供較佳為蔗糖的碳源3天或3天以上，較佳至多7天；及/或於培養基中連續提供每公升初始培養體基至少100、較佳至少105、較佳至少110、更佳至少120克的蔗糖，使得培養基的最終體積在進行培養之前不超過培養體積的三倍、較佳不超過兩倍、且更佳小於兩倍。

較佳的是，當進行本文所述的方法時，透過在第二階段添加前驅物至培養之前添加碳源至培養基而提供指數型細胞成長的第一階段，碳源較佳為葡萄糖或蔗糖。

在本發明的方法的另一較佳實施例中，透過添加碳基受質至培養基而提供指數型細胞成長的第一階段，碳基受質較佳為葡萄糖或蔗糖，且培養基包括前驅物，接著進行第二階段，其中僅添加碳基受質至培養基，碳基受質較佳為葡萄糖或蔗糖。

在本發明的方法的另一較佳實施例中，透過添加碳基受質至培養基而提供指數型細胞成長的第一階段，碳基受質較佳為葡萄糖或蔗糖，且培養基包括前驅物，接著進行第二階段，其中添加碳基受質與前驅物至培養基，碳基受質較佳為葡萄糖或蔗糖。

在替代較佳的實施例中，在如本文所述的方法中，前驅物與碳基受質已在指數型細胞成長的第一階段添加。

根據本發明，本文所述的方法較佳包括分離所述半乳糖化雙醣或寡醣。

「分離」一詞指的是從酵素反應或細胞及/或其成長的培養基收穫(harvesting)、收集或回收所述半乳糖化雙醣或寡醣。

所述半乳糖化雙醣或寡醣可以常規方式從酵素混合物或細胞成長於其中的水溶液培養基分離。在所述醣類仍存在於產生所述醣類的細胞中的情況下，可使用從細胞中釋放或萃取所述醣類的常規方式，例如使用高pH值破碎細胞、熱休克、超音波、法式破碎法(French Press)、均質化、酵素水解、化學水解、溶劑水解、介面活性劑、水解等。然後可以將酵素反應混合物、培養基及/或細胞萃取物一起和個別進一步用於分離所述醣類。這較佳涉及澄清所述含醣混合物去除懸浮顆粒和污染物，特別是細胞、細胞組分、不溶性代謝物和透過培養基因修飾細胞產生的碎片。在此步驟中，所述含醣混合物可利用常規方式進行澄清。較佳的是，所述含醣混合物透過離心、絮凝(flocculation)、傾析(decantation)及/或過濾而進行澄清。從所述含醣混合物分離所述醣類的另一步驟較佳涉及從所述含醣混合物實質上去除所有蛋白質以及胜肽、胺基酸、RNA與DNA及可能會影響後續分離步驟的任何內毒素或醣脂質，較佳為在所述含醣混合物澄清之後。在此步驟中，可利用常規方式從所述含醣混合物去除蛋白質及相關的不純物。較佳的是，透過超過濾(ultrafiltration)、奈米過濾(nanofiltration)、二相分配(two-phase partitioning)、逆滲透、微過濾(microfiltration)、活性碳或碳處理、以非離子型界面活性劑處理、酵素切割、切向流高效能過濾(tangential flow high-performance filtration)、切向流超過濾、電泳(例如，使用層板聚丙醯胺(slab-polyacrylamide)或十二烷基硫酸鈉-聚丙醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE))、親和性色層分析(使用親和性配體，包括DADE瓊脂糖(DEAE-Sepharose)、聚-L-離胺酸、多黏菌素-B(polymyxin-B)及內毒素選擇性吸收基質)、離子交換色層分析(例如但不限於陽離子交換、陰離子交換、混合床離子交換(mixed bed ion exchange)、由內而外的配體附著(inside-out ligand attachment))、疏水性作用色層分析及/或凝膠過濾(即，粒徑篩析層析法(size exclusion chromatography))，特別是色層分析，更特別是離子交換色層分析或疏水性作用色層分析或配體交換色層分析。除了粒徑篩析層析法，利用色層分析介質或選擇膜保留蛋白質及相關的不純物，所述醣類保留於包含混合物的所述醣類中。

在更佳實施例中，本文所述的方法也提供所述半乳糖化雙醣或寡醣的純化。所述醣類的純化可透過下列方式而實現，例如，使用活性碳或碳、使用木炭、奈米過濾、超過濾或離子交換，以移除剩餘的DNA、蛋白質、LPS、內毒素或其他不純物。也可使用如乙醇的醇類與醇類水溶液的混合物。另一純化步驟可透過下列方式而實現：結晶、蒸發或沉澱產物。另一純化步驟為乾燥， 例如噴霧乾燥、冷凍乾燥(lyophilization)、噴霧冷凍乾燥(spray freeze drying)、帶式乾燥(band drying或belt drying)、真空帶式乾燥(vacuum band drying或vacuum belt drying)、滾筒式乾燥(drum drying或roller drying)或真空滾筒式乾燥(vacuum drum drying或vacuum roller drying)所產生的醣類。

在例示性實施例中，分離與純化以包括任何順序的下列步驟進行： a) 使培養物或其澄清形式與奈米過濾膜接觸，奈米過濾膜具有600-3500Da的截止分子量(molecular weight cut-off, MWCO)以確保滯留所產生的醣類並使至少一部份的蛋白質、鹽類、副產物、色素及其他不純物通過； b) 使用所述膜以及無機電解質的水溶液對步驟a)的滯留物進行透析過濾(diafiltration)，接著視需要地以純水進行透析過濾以移除過多的電解質； c) 以及從所述電解質的陽離子中以鹽的形式收集富含醣類的滯留物，較佳的是對滯留物進行噴霧乾燥。

在替代的例示性實施例中，分離與純化所述半乳糖化雙醣或寡醣以包括任何順序的下列步驟進行：使用不同的膜對培養物或其澄清形式進行兩個膜過濾步驟，其中一個膜具有約300至約500Da之間的截止分子量，而另一個膜具有約600至約800Da之間的截止分子量。

在替代的例示性實施例中，分離與純化所述半乳糖化雙醣或寡醣以包括任何順序的下列步驟進行：用H+形式的強陽離子交換樹脂和游離鹼形式的弱陰離子交換樹脂處理培養物或其澄清形式，較佳的是進行噴霧乾燥。

在替代的例示性實施例中，分離與純化所述半乳糖化雙醣或寡醣以下列方式進行。對包括所產生的寡醣、生物量(biomass)、培養基成分與污染物的培養物進行以下列純化步驟： i) 從培養物分離生物量； ii) 進行陽離子交換處理以移除帶正電物質； iii) 進行陰離子交換處理以移除帶負電物質； iv) 奈米過濾步驟及/或電泳步驟； 其中包括所產生醣類的純化溶液的純度大於或等於80%。視需要地，純化溶液以選自包括下列的名單的一或多種乾燥步驟進行乾燥：噴霧乾燥、冷凍乾燥(lyophilization)、噴霧冷凍乾燥(spray freeze drying)、帶式乾燥(band drying或belt drying)、真空帶式乾燥(vacuum band drying或vacuum belt drying)、滾筒式乾燥(drum drying或roller drying)或真空滾筒式乾燥(vacuum drum drying或vacuum roller drying)。

在替代的例示性實施例中，分離與純化所述半乳糖化雙醣或寡醣以包括任何順序的下列步驟進行：對培養物進行酵素處理；從培養物移除生物量；超過濾；奈米過濾；以及管柱色層分析步驟。較佳的是，管柱色層分析為單一管柱或多個管柱。更佳的是，管柱色層分析步驟為模擬移動床色層分析(simulated moving bed chromatography)。模擬移動床色層分析較佳包括：i) 至少四個管柱，其中只少一個管柱包括弱或強陽離子交換樹脂；及/或ii) 具有不同流速的四個區域 I、II、III 和 IV；及/或iii) 包含水的洗脫液(eluent)；及/或 iv) 15至60度C的操作溫度。視需要地，純化溶液以選自包括下列的名單的一或多種乾燥步驟進行乾燥：噴霧乾燥、冷凍乾燥(lyophilization)、噴霧冷凍乾燥(spray freeze drying)、帶式乾燥(band drying或belt drying)、真空帶式乾燥(vacuum band drying或vacuum belt drying)、滾筒式乾燥(drum drying或roller drying)或真空滾筒式乾燥(vacuum drum drying或vacuum roller drying)。

在特定實施例中，本發明提供所述產生的半乳糖化雙醣或寡醣，其係以選自包括下列的名單的一或多種乾燥步驟來乾燥成粉末：噴霧乾燥、冷凍乾燥(lyophilization)、噴霧冷凍乾燥(spray freeze drying)、帶式乾燥(band drying或belt drying)、真空帶式乾燥(vacuum band drying或vacuum belt drying)、滾筒式乾燥(drum drying或roller drying)或真空滾筒式乾燥(vacuum drum drying或vacuum roller drying)，其中乾燥粉末包含小於15重量%的水，較佳小於10重量%的水，更佳小於7重量%的水，最佳小於5重量%的水。

為了鑑定本文所述產生的半乳糖化雙醣或寡醣，可利用本領域習知的標準方法來鑑定單體構件(building block)(例如，單醣或聚醣單元組成)、側鏈的變旋異構構型(anomeric configuration)、取代基團的存在與位置、聚合程度/分子量及連結模式，例如，甲基分析、還原式切割(reductive cleavage)、水解、氣相速層分析-質譜法(GC-MS)、基質輔助雷射脫附游離-質譜法 (MALDI-MS)、電灑游離-質譜法(ESI-MS)、以紫外光或折射率偵測的高效能液相層析(HPLC)、以脈衝電流偵測的高效能陰離子交換層析(HPAEC-PAD)、毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)、遠紅外光/拉曼光譜及核磁共振(NMR)譜量技術。可利用固態NMR、傅立葉-遠紅外光光譜法(FT-IR)及廣角X光散射法來解析晶體結構。聚合程度(degree of polymerization, DP)、DP分佈與多分散性(polydispersity)可利用如黏度計與高效能液相層析來決定。為了鑑定醣類的單體組成，可利用如酸催化水解、高效能液相層析或氣相-液相層析法(轉化為糖醇乙酸酯後)。為了決定糖苷鍵，醣類以在DMSO中的碘甲烷和強鹼進行甲基化、進行水解、還原為部分甲基化的糖醇，乙醯化為甲基化的糖醇乙酸酯，並通過與質譜耦合的氣相液相層析(GLC/MS)來進行分析。為了決定醣類的序列，利用酸或酵素進行部分去聚合以決定結構。為了鑑定出變旋異構構型，對醣類進行酵素分析，即，使其接觸對特定性泰的連結有特異性的酵素，例如，β-半乳糖苷酶或α-葡萄糖苷酶，且可使用NMR分析產物。

本發明提供N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶在合成半乳糖化雙醣或寡醣的用途。在較佳實施例中，本發明提供N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶在合成帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物的用途，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。在另一較佳實施例中，本發明提供N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶在合成帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物的用途，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。

本發明也提供如本文所述經代謝改造用於產生半乳糖化雙醣或寡醣的細胞的用途。在較佳實施例中，本發明提供如本文所述經代謝改造用於產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物的細胞的用途，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。在另一較佳實施例中，本發明提供如本文所述經代謝改造用於產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物的細胞的用途，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。在另一較佳實施例中，本文所述的代謝改造細胞是用於產生半乳糖化雙醣或寡醣。在另一較佳實施例中，本文所述的代謝改造細胞是用於產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物的細胞的用途，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。在另一較佳實施例中，本文所述的代謝改造細胞是用於產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物的細胞的用途，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。本發明也提供如本文所述產生半乳糖化雙醣或寡醣的方法的用途。在較佳實施例中，本發明提供如本文所述產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物的方法的用途，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。在另一較佳實施例中，本發明也提供如本文所述帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物的方法的用途，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。

本發明中所產生包括半乳糖化寡醣(或其進一步醣基化的形式)的產物

在一些實施例中，如本文所述產生的半乳糖化寡醣(或其進一步醣基化的形式)添加至食物(例如人類食物或飼料)、膳食補充劑、藥物成分、化妝品成分或藥物。在一些實施例中，如本文所述產生的半乳糖化寡醣(或其進一步醣基化的形式)與一或多種適用於食物、飼料、膳食補充劑、藥物成分、化妝品成分或藥物的成分混合。

在一些實施例中，膳食補充劑包括至少一異生菌(probiotic)成分及/或至少一異菌生(prebiotic)成分。

「異菌生(prebiotic)」是一種促進對宿主有益的微生物生長的物質，特別是胃腸道微生物。在一些實施例中，膳食補充劑提供多種異菌生，包括透過本說明書中公開的方法產生及/或純化的半乳糖化寡醣，以促進一種或多種有益微生物的生長。用於膳食補充劑的異菌生成分的例子包括其他異菌生分子(如 HMO)和植物多醣(如菊糖(inulin)、果膠、β-葡聚醣和低聚木糖)。「益生菌(probiotic)」產品通常含有活的微生物，它們取代或添加到胃腸道微生物群中而為接受者提供助益。這類微生物的範例包括乳酸桿菌種(Lactobacillus)(例如，嗜酸乳酸桿菌(L. acidophilus)和保加利亞乳酸桿菌(L. bulgaricus))、雙歧桿菌種(Bifidobacterium)(例如，動物雙歧桿菌(B. animalis)、長雙歧桿菌(B. longum)和嬰兒雙歧桿菌(B. infantis)(例如 Bi-26))和布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)。在一些實施例中，透過本說明書的方法產生及/或純化的半乳糖化寡醣與此類微生物結合口服施用。

膳食補充劑的其他成分的例子包括雙糖(例如乳糖)、單醣(例如葡萄糖和半乳糖)、增稠劑(例如阿拉伯樹膠)、酸度調節劑(例如檸檬酸三鈉)、水、脫脂牛奶和調味劑。

在一些實施例中，如本文所述產生的半乳糖化寡醣(或其進一步醣基化的形式)添加至人類嬰兒食物(例如，嬰幼兒配方奶粉)。嬰幼兒配方奶粉一般是作為完全或部分取代人類母乳來餵養嬰兒所製造的食物。在一些實施例中，嬰幼兒配方奶粉以粉末的形式販售，且在瓶中與水混合或以杯子與水混合後餵養嬰兒。嬰兒配方奶粉的成分通常被設計為大致模仿人類母乳。在一些實施例中，透過本說明書中的製程產生及/或純化的半乳糖化寡醣(或其進一步醣基化的形式)包含於嬰幼兒配方奶分中以提供類似於人類母乳中寡醣所提供的營養益處。在一些實施例中，半乳糖化寡醣與嬰幼兒配方奶粉的一或多種成分混合。嬰幼兒配方奶粉成分的範例包括脫脂奶、碳水化合物來源(例如乳糖)、蛋白質來源(例如濃縮乳清蛋白和酪蛋白)、脂肪來源(例如植物油如棕櫚油、高油酸紅花油、菜籽油、椰子油及/或葵花籽油；和魚油)、維生素(例如維生素 A、Bb、Bi2、C 和 D)、礦物質(例如檸檬酸鉀、檸檬酸鈣、氯化鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和磷酸鈣)以及可能包括人乳寡醣(HMO)。例如，這類HMO可包括DiFL、乳糖-N-丙糖II、LNT、LNnT、乳糖-N-岩藻戊糖I、乳糖-N-新岩藻戊糖、乳糖-N-岩藻戊糖II、乳糖-N-岩藻戊糖III、乳糖-N-岩藻戊糖V、乳糖-N-新岩藻糖戊糖V、乳糖-N-二岩藻糖己糖I、乳糖-N-二岩藻糖己糖 II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳糖-N-己糖以及乳糖-N-新己糖。

在一些實施例中，一或多種嬰幼兒配方奶分可包括乳糖、乳清蛋白濃縮物及/或高油酸紅花油。

在一些實施例中，嬰幼兒配方奶粉中的半乳糖化寡醣(或其進一步醣基化的形式)的濃度大約與人類母乳中一般存在的寡醣濃度相同。在一些實施例中嬰幼兒配方奶粉中的半乳糖化寡醣的濃度大約與人類母乳中一般存在的寡醣濃度相同。

在一些實施例中，嬰幼兒配方奶粉中的半乳糖化寡醣(或其進一步醣基化的形式)添加至飼料製品中，其中所述飼料選自包括下列的名單：寵物食品、動物代乳品、獸醫產品、斷奶後飼料或教槽飼料(creep feed)。

在一些實施例中，食品、飼料、膳食補充劑、藥物成分及/或藥物包括至少一免疫調節成分。

「免疫調節」成分是一種改變免疫反應或免疫系統功能的物質。「免疫調節」成分可以透過增加(免疫刺激劑)或減少(免疫抑制)血清抗體的產生來改變免疫反應。免疫刺激劑用於增強針對傳染病、腫瘤、原發性(primary)或繼發性(secondary)免疫缺陷以及抗體轉移改變的免疫反應。免疫抑製成分用於降低對移植器官的免疫反應，並治療自身免疫性疾病，如天皰瘡(pemphigus)、狼瘡或過敏症。在一些實施例中，免疫調節成分具有抗發炎活性。在一些實施例中，食品、飼料、膳食補充劑、藥物成分和/或藥物提供多種免疫調節劑，包括透過本說明書中揭露的方法產生及/或純化的半乳糖化寡醣(或其進一步的醣基化形式，以適應免疫系統正常運行。在可區分的生命階段中免疫力差異很大。不同的食物成分會影響特定的免疫反應，這取決於偏離代謝過程的特徵以及消費者和患者。補充有免疫調節成分的食品也稱為功能性食品。 功能性食品是對特定消費者群體具有特定健康益處的食品。存在於功能性食品以及飼料和膳食補充劑中的免疫調節成分的例子包括其他免疫調節分子，例如本說明書中指明的半乳糖化寡醣和脂肪酸(PUFA、魚油、胺基酸(例如精胺酸和麩醯胺酸)、凝集素(如選擇素(selectin))、維生素(如維生素 A、B6、C、E、硫胺素(thiamine)、葉酸)和礦物質(如鋅)。這些半乳糖化寡醣可包括LNB、LacNAc、聚-LacNAc、新-LNP I(novo-LNP I)、Gal-β1,4-GlcNAc-β1,6-(GlcNAc-β1,3)-Gal-β1,4-Glc、3-FLN (Gal-β1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc、SLNPa (Gal-β1,4-GlcNAc-β1,6-(Neu5Ac-a2,3-Gal-β1,3)-Gal-β1,4-Glc)、LNT、異-LNT、新-LNT(novo-LNT))、Gal-新-LNP I(Gal-novo-LNP I)、Gal-新-LNP II(Gal-Novo-LNP II)、LNnT、LNnH、DGal-LNnH、Gal-LNFP III、DF DGal-LNnH、DF DGal-LNnT、TF DGal-LNnH a、TF DGal-LNnH b、FS Gal-LNnH、Galili五糖(galilipentasaccharide)、對-LNnH(para-LNnH)。此外，存在於藥物成分和藥物中的免疫調節成分的範例包括其他免疫調節分子，例如本說明書中指明的半乳糖化寡醣和介白素、脂多醣、葡聚醣、干擾素γ和特異性抗體。存在於藥物混合物和/或藥物中的此類半乳糖化寡醣可包括LNB、LacNAc、聚-LacNAc、新-LNP I(novo-LNP I)、Gal-β1,4-GlcNAc-β1,6-(GlcNAc-β1,3)-Gal-β1,4-Glc、3-FLN (Gal-β1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc、SLNPa (Gal-β1,4-GlcNAc-β1,6-(Neu5Ac-a2,3-Gal-β1,3)-Gal-β1,4-Glc)、LNT、異-LNT、新-LNT(novo-LNT))、Gal-新-LNP I(Gal-novo-LNP I)、Gal-新-LNP II(Gal-Novo-LNP II)、LNnT、LNnH、DGal-LNnH、Gal-LNFP III、DF DGal-LNnH、DF DGal-LNnT、TF DGal-LNnH a、TF DGal-LNnH b、FS Gal-LNnH、Galili五糖(galilipentasaccharide)、對-LNnH(para-LNnH)。

除非另有明確說明，否則在本發明的一態樣的背景下揭露的每個實施例也在本發明的所有其他態樣的背景下揭露。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語通常具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。一般而言，本文所用的命名法和細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學以及前後文所述的雜交中的實驗室流程是本領域習知和常用的命名法與流程。 標準技術用於核酸和胜肽合成。一般而言，純化步驟是根據製造商的說明書而進行的。

進一步的優點來自於具體的實施例、實例和附圖。不言而喻，在不脫離本發明的範圍的情況下，上述特徵和下文解釋的特徵不僅可以以各自指明的組合使用，而且可以以其他組合或單獨使用。

本發明是關於以下特定的實施例： 1. 一種N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶在合成半乳糖化雙醣或寡醣的用途，其中所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶： -半乳糖化作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺；及/或 -半乳糖化作為雙醣及/或寡醣的一部分且位於所述雙醣及/或寡醣的非還原端的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺； 其特徵在於，所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為： A. N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，其具有： a. PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 1的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 2的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17且m為100至115；或 iii) 包括SEQ ID NO: 3或4任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 3或4任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 3或4的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 3或4任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 b. PFAM結構域IPR002659，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 5的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，非A、G、S)(X _p)(X，非F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至16、m為35至70且p為20至45；或 ii) 包括SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者所示的多肽序列；或 iii) 為SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 6、7、8或9的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 iv) 包括來自SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 B. N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，其具有： a. PFAM結構域PF01755，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 10的序列EXXCXXSHX[AFILTY]LW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 11的序列EXXCXXSH[LR]VLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 iii) 包括具有SEQ ID NO: 12的序列EXXCXXSH[VHI]SLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 iv) 包括具有SEQ ID NO: 13的序列EXXCXXSHYMLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 v) 包括具有SEQ ID NO: 14的序列EXXCXXSHXX(X，非V)Y(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 vi) 包括SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者所示的多肽序列；或 vii) 為SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 viii) 包括來自SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 b. PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75且m為10至30；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75、m為10至30且p為20至25；或 iii) 包括SEQ ID NO: 26或27任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 26或27任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 26或27的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 26或27任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 c. PFAM結構域PF02709且非PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 28的序列[FWY]XX[FWY](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是IP或NL的組合，且其中n為21至26；或 ii) 包括SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者所示的多肽序列；或 iii) 為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 iv) 包括來自SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 d. PFAM結構域PF03808，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 35的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 36的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25、m為40至50且p為22至30；或 iii) 包括SEQ ID NO: 37、38或39任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 37、38或39任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 37、38或39的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 37、38或39任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性。 2. 一種使用如實施例1所述之N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途來合成半乳糖化雙醣或寡醣的方法。 3. 如實施例2所述之方法，其中所述合成步驟包括以下步驟： a. 提供UDP-半乳糖與任一所述半乳糖基轉移酶，其中所述半乳糖基轉移酶可從所述UDP-半乳糖的供給者將半乳糖殘基轉移至一或多個接受者；且 b. 在半乳糖基轉移酶催化從所述UDP-半乳糖將半乳糖殘基轉移至所述接受者的條件下，使任一所述半乳糖基轉移酶及UDP-半乳糖與一或多個接受者接觸； c. 較佳的是，分離所述半乳糖化雙醣或寡醣。 4. 如實施例3所述之方法，其中所述接受者為作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺，及/或在其非還原端具有N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣或寡醣。 5. 如實施例2至4中任一項所述之方法，其中所述半乳糖化雙醣或寡醣係於無細胞系統中所產生。 6. 如實施例2至4中任一項所述之方法，其中所述半乳糖化雙醣或寡醣係由細胞所產生。 7. 如實施例6所述之方法，其中所述細胞： -可合成一或多個所述接受者；且 -表現所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的任一者；且 -可為所述半乳糖基轉移酶合成作為供給者的UDP-半乳糖(UDP-Gal)。 8. 如實施例6或7所述之方法，其中所述細胞更可合成擇自包含以下所列的名單的一或多種核苷酸-糖供給者：GDP-Fuc、CMP-Neu5Ac、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、GDP-木糖(UDP-xylose)。 9. 如實施例6至8中任一項所述之方法，其中所述細胞更可表現擇自包含以下所列的名單的一或多種醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸基轉移酶、半乳醣醛酸基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醇醯神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶。 10. 如實施例6至9中任一項所述之方法，其中所述細胞為代謝改造細胞。 11. 如實施例6至10中任一項所述之方法，其中所述細胞係經修飾酵素的表現或活性，所述酵素係擇自包含以下所列的群組：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶。 12. 如實施例6至11中任一項所述之方法，其中所述細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉換成葡萄糖胺-6-磷酸，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸轉換成果糖-6-磷酸。 13. 如實施例6至12中任一項所述之方法，其中所述細胞係經修飾以增加UDP-半乳糖的產生，且其中所述修飾係擇自包含以下所列的群組：剔除編碼5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶的基因或剔除編碼半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)的基因。 14. 如實施例6至13中任一項所述之方法，其中所述細胞可分解代謝擇自包含以下所列的名單的碳源：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽寡醣、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液(corn-steep liquor)、糖蜜(molasses)、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。 15. 如實施例3至14中任一項所述之方法，其中所述分離的步驟包括至少一下述步驟：澄清(clarification)、超過濾(ultrafiltration)、奈米過濾(nanofiltration)、逆滲透、微過濾(microfiltration)、活性碳或碳處理、切向流高效能過濾(tangential flow high-performance filtration)、切向流超過濾、親和性色層分析、離子交換色層分析、疏水性作用色層分析及/或凝膠過濾、配位基交換色層分析。 16. 如實施例3至15中任一項所述之方法，更包括純化所述半乳糖化雙醣或寡醣。 17. 如實施例16所述之方法，其中所述純化的步驟包括至少一下述步驟：使用活性碳或碳、使用木炭、奈米過濾、超過濾或離子交換、使用醇類、使用醇類水混合物、結晶、蒸發、沉澱、乾燥、噴霧乾燥或冷凍乾燥(lyophilization)。 18. 一種細胞，其係經代謝改造成以如實施例1所述之N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途來合成半乳糖化雙醣或寡醣。 19. 如實施例18所述之細胞，其中所述細胞： -表現所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的任一者；且 -可為所述半乳糖基轉移酶合成作為供給者的UDP-半乳糖(UDP-Gal)；且 -可合成一或多種所述半乳糖基轉移酶，其中所述接受者為作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺，及/或在其非還原端具有N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣或寡醣。 20. 如實施例18或19中任一項所述之細胞，其中所述細胞更可合成擇自包含以下所列的名單的一或多種核苷酸-糖供給者：GDP-Fuc、CMP-Neu5Ac、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、GDP-木糖(UDP-xylose)。 21. 如實施例18至20中任一項所述之細胞，其中所述細胞更可表現擇自包含以下所列的名單的一或多種醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸基轉移酶、半乳醣醛酸基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醇醯神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶。 22. 如實施例18至21中任一項所述之細胞，其中所述細胞係經修飾酵素的表現或活性，所述酵素係擇自包含以下所列的群組：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶。 23. 如實施例18至22中任一項所述之細胞，其中所述細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉換成葡萄糖胺-6-磷酸，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸轉換成果糖-6-磷酸。 24. 如實施例18至23中任一項所述之細胞，其中所述細胞係經修飾以增加UDP-半乳糖的產生，且其中所述修飾係擇自包含以下所列的群組：剔除編碼5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶的基因或剔除編碼半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)的基因。 25. 如實施例18至24中任一項所述之細胞，其中所述細胞可分解代謝擇自包含以下所列的名單的碳源：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽寡醣、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液(corn-steep liquor)、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。 26. 如實施例18至25中任一項所述之細胞或如實施例3至17中任一項所述之方法，其中所述細胞係選自由下列所組成之群組：微生物、植物或動物細胞，較佳的是所述微生物為細菌、真菌或酵母菌，較佳的是所述植物為水稻、番茄、棉花、油菜籽、大豆、玉米(maize)或玉米植物(corn plant)，較佳的是所述動物是昆蟲、魚類、鳥類或非人類哺乳動物，較佳的是所述動物細胞為哺乳類細胞株。 27. 如實施例18至26中任一項所述之細胞或如實施例3至17與26中任一項所述之方法，其中所述細胞為細菌細胞，較佳為大腸桿菌( Escherichia coli)菌株，更佳為K-12菌株的大腸桿菌菌株，更佳的是大腸桿菌K-12菌株為 E. coliMG1655。 28. 如實施例18至27中任一項所述之細胞或如實施例3至17與26中任一項所述之方法，其中所述細胞為酵母菌細胞。

再者，本發明是關於以下較佳的特定實施例： 1. 一種N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶在合成半乳糖化雙醣或寡醣的用途，其中所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶： -半乳糖化作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺；及/或 -半乳糖化作為雙醣及/或寡醣的一部分且位於所述雙醣及/或寡醣的非還原端的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺； 其特徵在於，所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為： A. N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，其具有： a. PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 1的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 2的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17且m為100至115；或 iii) 包括SEQ ID NO: 3或4任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 3或4任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 3或4的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 3或4任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 為SEQ ID NO: 3或4任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 3或4任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 3或4任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 b. PFAM結構域IPR002659，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 5的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，非A、G、S)(X _p)(X，非F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至16、m為35至70且p為20至45；或 ii) 包括SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者所示的多肽序列；或 iii) 為SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 6、7、8或9的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 iv) 包括來自SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 為SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 包括包含相對於SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性； 或 B. N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，其具有： a. PFAM結構域PF01755，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 10的序列EXXCXXSHX[AFILTY]LW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 11的序列EXXCXXSH[LR]VLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 iii) 包括具有SEQ ID NO: 12的序列EXXCXXSH[VHI]SLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 iv) 包括具有SEQ ID NO: 13的序列EXXCXXSHYMLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 v) 包括具有SEQ ID NO: 14的序列EXXCXXSHXX(X，非V)Y(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 vi) 包括SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者所示的多肽序列；或 vii) 為SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 viii) 包括來自SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 ix) 為SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 x) 包括包含相對於SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 b. PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75且m為10至30；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75、m為10至30且p為20至25；或 iii) 包括SEQ ID NO: 26或27任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 26或27任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 26或27的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 26或27任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 為SEQ ID NO: 26或27任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 26或27任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 26或27任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 c. PFAM結構域PF02709且非PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 28的序列[FWY]XX[FWY](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是IP或NL的組合，且其中n為21至26；或 ii) 包括SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者所示的多肽序列；或 iii) 為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 iv) 包括來自SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 包括包含相對於SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 d. PFAM結構域PF03808，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 35的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 36的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25、m為40至50且p為22至30；或 iii) 包括SEQ ID NO: 37、38或39任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 37、38或39任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 37、38或39的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 37、38或39任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 為SEQ ID NO: 37、38或39任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 37、38或39任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 37、38或39任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性。 2. 一種使用如較佳實施例1所述之N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途來合成半乳糖化雙醣或寡醣的方法。 3. 如較佳實施例2所述之方法，其中所述合成步驟包括以下步驟： a. 提供UDP-半乳糖與任一所述半乳糖基轉移酶，其中所述半乳糖基轉移酶可從所述UDP-半乳糖的供給者將半乳糖殘基轉移至一或多個接受者；且 b. 在半乳糖基轉移酶催化從所述UDP-半乳糖將半乳糖殘基轉移至所述接受者的條件下，使任一所述半乳糖基轉移酶及UDP-半乳糖與一或多個接受者接觸； c. 較佳的是，分離所述半乳糖化雙醣或寡醣。 4. 如較佳實施例3所述之方法，其中所述接受者為作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺，及/或在其非還原端具有N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣或寡醣。 5. 如較佳實施例2至4中任一項所述之方法，其中所述半乳糖化雙醣或寡醣係於無細胞系統中所產生。 6. 如較佳實施例2至4中任一項所述之方法，其中所述半乳糖化雙醣或寡醣係由細胞所產生。 7. 如較佳實施例6所述之方法，其中所述細胞： -可合成一或多個所述接受者；且 -表現所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的任一者；且 -可為所述半乳糖基轉移酶合成作為供給者的UDP-半乳糖(UDP-Gal)。 8. 如特定實施例6或7任一項所述之方法，其中所述細胞更可合成擇自包含以下所列的名單的一或多種核苷酸-糖供給者：GDP-Fuc、CMP-Neu5Ac、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿拉伯-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-arabino-4-hexulose)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-來蘇-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-lyxo-4-hexulose)、UDP-N-乙醯-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙醯-L-6-脫氧塔羅糖胺(UDP-L-PneNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖)、UDP-N-乙醯胞壁酸(UDP-N-acetylmuramic acid)、UDP-N-乙醯-L-異鼠李糖(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖)、GDP-L異鼠李糖(GDP-L-quinovose)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4,5Ac2、CMP-Neu5,7Ac2、CMP-Neu5,9Ac2、CMP-Neu5,7(8,9)Ac2、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、GDP-木糖(UDP-xylose)。 9. 如較佳實施例6至8中任一項所述之方法，其中所述細胞更可表現擇自包含以下所列的名單的一或多種醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸基轉移酶、半乳醣醛酸基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醇醯神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醇鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯-β-L-阿卓糖胺轉胺酶(UDP-4-amino-4,6-dideoxy-N-acetyl-β-L-altrosamine transaminase)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶(UDP-N-acetylglucosamine enopyruvyl transferase)及岩藻糖胺基轉移酶； -較佳的是，所述岩藻糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶； -較佳的是，所述唾液酸轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶； -較佳的是，所述半乳糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶； -較佳的是，所述葡萄糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶； -較佳的是，所述甘露糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶； -較佳的是，所述N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶；且 -較佳的是，所述N-乙醯半乳糖胺基轉移酶為α-1,3-N-乙醯半乳糖胺基轉移酶。 10. 如較佳實施例6至9中任一項所述之方法，其中所述細胞為代謝改造細胞。 11. 如較佳實施例10所述之方法，其中利用一或多種基因表現模組(gene expression module)來改造所述細胞，其特徵在於，源自任何所述基因表現模組的表現為持續性的(constitutive)或係透過自然誘導物(natural inducer)而產生。 12. 如較佳實施例10或11中任一項所述之方法，其中所述細胞包括編碼一個蛋白質的相同編碼DNA序列的多個拷貝。 13. 如較佳實施例6至12中任一項所述之方法，其中所述細胞係經修飾酵素的表現或活性，所述酵素係擇自包含以下所列的群組：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶。 14. 如較佳實施例6至13中任一項所述之方法，其中所述細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉換成葡萄糖胺-6-磷酸，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸轉換成果糖-6-磷酸。 15. 如較佳實施例6至14中任一項所述之方法，其中所述細胞係經修飾以增加UDP-半乳糖的產生，且其中所述修飾係擇自包含以下所列的群組：剔除編碼5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶的基因或剔除編碼半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)的基因。 16. 如較佳實施例6至15中任一項所述之方法，其中所述細胞使用一或多種前驅物以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣，所述前驅物是由培養基提供給所述細胞。 17. 如較佳實施例6至16中任一項所述之方法，其中所述細胞產生一或多種前驅物以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣。 18. 如較佳實施例16或17所述之方法，其中用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的所述前驅物完全轉變為所述半乳糖化雙醣或寡醣。 19. 如較佳實施例6至18中任一項所述之方法，其中所述細胞於胞內產生所述半乳糖化雙醣或寡醣，且其中一部分或實質上所有所述產生的半乳糖化雙醣或寡醣保留於胞內，及/或透過被動或主動運輸分泌至所述細胞之外。 20. 如較佳實施例6至19中任一項所述之方法，其中所述細胞表現膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽，藉此將化合物運輸穿越細胞壁的外膜，較佳的是，所述細胞係經修飾所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽的表現或活性。 21. 如較佳實施例20所述之方法，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽係擇自於包含以下所列的名單：運輸蛋白(porter)、P-P鍵結水解驅動運輸蛋白、β桶孔蛋白(β-barrel porin)、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白(putative transport protein)及磷酸轉移驅動基團轉位蛋白(phosphotransfer-driven group translocator)，較佳的是，所述運輸蛋白(porter)包括MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵體輸出蛋白(siderophore exporter)，較佳的是，所述P-P鍵結水解驅動運輸蛋白包括ABC運輸蛋白與螯鐵體輸出蛋白。 22. 如較佳實施例20或21所述之方法，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制所述半乳糖化雙醣或寡醣及/或用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的一或多種前驅物及/或接受者於細胞壁外膜的流動。 23. 如較佳實施例20至22中任一項所述之方法，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽改良所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生，及/或使所述半乳糖化雙醣或寡醣得以流出，及/或增強所述半乳糖化雙醣或寡醣的流出。 24. 如較佳實施例6至23中任一項所述之方法，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞(progenitor)相比包括減少乙酸鹽(acetate)產生的修飾。 25. 如較佳實施例24所述之方法，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞相比包括以下任一或多種蛋白質降低或減少的表現及/或經破壞、削弱、減少或延遲的活性，所述一或多種蛋白質包括：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷 O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白(N-acetylglucosamine repressor)、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖1-磷酸轉移酶(UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase)、L-岩藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶(L-fucose isomerase)、N-乙醯神經胺酸裂解酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1(ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1)、ATP 依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶 2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(glucose-specific translocating phosphotransferase)酵素IIBC組成ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(phosphotransferase, PTS)酵素IIBC組成malX、酵素IIAGlc、β-葡萄糖苷特異性PTS酵素II、果糖特異性PTS多磷醯基轉移蛋白FruA與FruB、乙醇脫氫酶、醛脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)、乙酸激酶、磷酸醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶及丙酮酸脫羧酶。 26. 如較佳實施例6至25中任一項所述之方法，其中所述細胞可產生磷酸烯醇丙酮酸鹽(phosphoenolpyruvate, PEP)。 27. 如較佳實施例6至26中任一項所述之方法，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞相比係經修飾以增加磷酸烯醇丙酮酸鹽的產生及/或供應。 28. 如較佳實施例6至27中任一項所述之方法，其中所述細胞包括選擇的單醣、雙醣或寡醣至少部分失活的分解途徑，所述單醣、雙醣或寡醣涉及所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生及/或是產生所述半乳糖化雙醣或寡醣所需的。 29. 如較佳實施例6至28中任一項所述之方法，其中所述細胞生長於乳糖結合一或多種其他的碳源的環境時抵抗乳糖殺傷(lactose killing)的現象。 30. 如較佳實施例6至29中任一項所述之方法，其中所述細胞於全培養液(whole broth)及/或上清液中產生90g/L或90g/L以上的所述半乳糖化雙醣或寡醣，及/或其中以全培養液及/或上清液中的所述半乳糖化雙醣或寡醣及其前驅物的總量進行測量，全培養液及/或上清液中的所述半乳糖化雙醣或寡醣具有至少80%的純度。 31. 如較佳實施例6至30中任一項所述之方法，其中所述細胞穩定培養於培養基中。 32. 如較佳實施例6至31中任一項所述之方法，其中所述條件包括： -使用包括至少一前驅物及/或接受者的培養基，以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣；及/或 -於培養基添加至少一前驅物及/或接受者饋料(feed)，以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣。 33. 如較佳實施例6至32中任一項所述之方法，所述方法包括至少其中一下述步驟： i) 使用包括至少一前驅物及/或接受者的培養基； ii) 將至少一前驅物饋料及/或接受者饋料添加至反應器中的培養基，其中總反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述前驅物及/或接受者饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍； iii) 將至少一前驅物饋料及/或接受者饋料添加至反應器中的培養基，其中總反應器體積介於250mL至10.000m ³，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述前驅物及/或接受者饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍，且其中較佳的是，所述前驅物及/或接受者饋料的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述前驅物及/或接受者饋料的溫度維持在20℃與80℃之間； iv) 以進料溶液的形式將至少一前驅物及/或接受者饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基； v) 以進料溶液的形式將至少一前驅物及/或接受者饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基，且其中較佳的是，所述進料溶液的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述進料溶液的溫度維持在20℃與80℃之間； 所述方法產生出最終培養濃度為至少為50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，且更佳為至少200g/L的所述半乳糖化雙醣或寡醣。 34. 如較佳實施例3至32中任一項所述之方法，其中所述方法包括至少其中一下述步驟： i) 使用包括每公升初始反應器體積至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，且更佳為至少150克的乳糖的培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)； ii) 將包括每公升初始反應器體積至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，且更佳為至少150克乳糖的乳糖饋料添加至培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述乳糖饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍； iii) 將包括每公升初始反應器體積至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，且更佳為至少150克乳糖的乳糖饋料添加至培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述乳糖饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍，且其中較佳的是，所述乳糖饋料的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述乳糖饋料的溫度維持在20℃與80℃之間； iv) 以進料溶液的形式將乳糖饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基； v) 以進料溶液的形式將乳糖饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基，且其中所述乳糖進料溶液的濃度為50g/L，較佳為75g/L，更佳為100g/L，更佳為125g/L，更佳為150g/L，更佳為175g/L，更佳為200g/L，更佳為225g/L，更佳為250g/L，更佳為275g/L，更佳為300g/L，更佳為325g/L，更佳為350g/L，更佳為375g/L，更佳為400g/L，更佳為450g/L，更佳為500g/L，更佳為550g/L，且最佳為600g/L，且其中較佳的是，所述進料溶液的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述進料溶液的溫度維持在20℃與80℃之間； 所述方法產生出最終培養濃度為至少為50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，且更佳為至少200g/L的所述半乳糖化雙醣或寡醣。 35. 如較佳實施例34所述之方法，其中所述乳糖進料是透過於培養開始添加濃度至少5mM的乳糖而完成，乳糖的濃度較佳為30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM，且更佳為大於300mM。 36. 如較佳實施例34或35所述之方法，其中所述乳糖進料是透過將乳糖以一定濃度添加至培養基而完成，使得在培養的整個生產階段乳糖濃度至少為5mM，且較佳為10mM或30mM。 37. 如較佳實施例6至36中任一項所述之方法，其中所述細胞培養至少約60小時、約80小時、約100小時或約120小時，或以連續的方式進行培養。 38. 如較佳實施例6至37中任一項所述之方法，其中所述培養基包含擇自包含下述的群組的至少一前驅物：乳糖、半乳糖、岩藻糖與唾液酸。 39. 如較佳實施例6至38中任一項所述之方法，其中將碳基受質(carbon-based substrate)，較佳為葡萄糖或蔗糖，添加至包括前驅物的培養基而提供指數型細胞成長的第一階段，接著進行第二階段，其中僅將碳基受質，較佳為葡萄糖或蔗糖，添加至培養基。 40. 如較佳實施例6至38中任一項所述之方法，其中將碳基受質(carbon-based substrate)，較佳為葡萄糖或蔗糖，添加至包括前驅物的培養基而提供指數型細胞成長的第一階段，接著進行第二階段，其中將碳基受質，較佳為葡萄糖或蔗糖，及前驅物添加至培養基。 41. 如較佳實施例6至38中任一項所述之方法，其中所述細胞可分解代謝擇自包含以下所列的名單的碳源：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽寡醣、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液(corn-steep liquor)、糖蜜(molasses)、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。 42. 如較佳實施例1至5中任一項所述之方法，其中所述方法產生帶電及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。 43. 如較佳實施例1至5中任一項所述之方法，其中所述方法產生帶電及/或中性寡醣的混合物，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。 44. 如較佳實施例6至41中任一項所述之方法，其中所述細胞產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。 45. 如較佳實施例6至41中任一項所述之方法，其中所述細胞產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。 46. 如較佳實施例3至45中任一項所述之方法，其中所述分離的步驟包括至少一下述步驟：澄清(clarification)、超過濾(ultrafiltration)、奈米過濾(nanofiltration)、二相分配(two-phase partitioning)、逆滲透、微過濾(microfiltration)、活性碳或碳處理、以非離子型界面活性劑處理、酵素切割、切向流高效能過濾(tangential flow high-performance filtration)、切向流超過濾、親和性色層分析、離子交換色層分析、疏水性作用色層分析及/或凝膠過濾、配位基交換色層分析。 47. 如較佳實施例3至46中任一項所述之方法，更包括純化所述半乳糖化雙醣或寡醣。 48. 如較佳實施例47所述之方法，其中所述純化的步驟包括至少一下述步驟：使用活性碳或碳、使用木炭、奈米過濾、超過濾、電泳、酵素處理或離子交換、使用醇類、使用醇類水混合物、結晶、蒸發、沉澱、乾燥、噴霧乾燥、冷凍乾燥(lyophilization)、噴霧冷凍乾燥(spray freeze drying)、帶式乾燥(band drying或belt drying)、真空帶式乾燥(vacuum band drying或vacuum belt drying)、滾筒式乾燥(drum drying或roller drying)或真空滾筒式乾燥(vacuum drum drying或vacuum roller drying)。 49. 一種細胞，其係經代謝改造成以如實施例1所述之N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途來合成半乳糖化雙醣或寡醣。 50. 如較佳實施例49所述之細胞，其中所述細胞： -表現所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的任一者；且 -可為所述半乳糖基轉移酶合成作為供給者的UDP-半乳糖(UDP-Gal)；且 -可合成一或多種所述半乳糖基轉移酶，其中所述接受者為作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺，及/或在其非還原端具有N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣或寡醣。 51. 如較佳實施例49或50所述之細胞，其中利用一或多種基因表現模組來改造所述細胞，其特徵在於，源自任何所述基因表現模組的表現為持續性的或係透過自然誘導物而產生。 52. 如較佳實施例49至51中任一項所述之細胞，其中所述細胞包括編碼一個蛋白質的相同編碼DNA序列的多個拷貝。 53. 如較佳實施例49至52中任一項所述之細胞，其中所述細胞更可合成擇自包含以下所列的名單的一或多種核苷酸-糖供給者：GDP-Fuc、CMP-Neu5Ac、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿拉伯-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-arabino-4-hexulose)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-來蘇-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-lyxo-4-hexulose)、UDP-N-乙醯-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙醯-L-6-脫氧塔羅糖胺(UDP-L-PneNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖)、UDP-N-乙醯胞壁酸(UDP-N-acetylmuramic acid)、UDP-N-乙醯-L-異鼠李糖(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖)、GDP-L異鼠李糖(GDP-L-quinovose)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、GDP-木糖(UDP-xylose)。 54. 如較佳實施例49至53中任一項所述之細胞，其中所述細胞更可表現擇自包含以下所列的名單的一或多種醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸基轉移酶、半乳醣醛酸基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醇醯神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醇鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯-β-L-阿卓糖胺轉胺酶(UDP-4-amino-4,6-dideoxy-N-acetyl-β-L-altrosamine transaminase)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶(UDP-N-acetylglucosamine enopyruvyl transferase)及岩藻糖胺基轉移酶； -較佳的是，所述岩藻糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶； -較佳的是，所述唾液酸轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶； -較佳的是，所述半乳糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶； -較佳的是，所述葡萄糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶； -較佳的是，所述甘露糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶； -較佳的是，所述N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶； -較佳的是，所述N-乙醯半乳糖胺基轉移酶為α-1,3-N-乙醯半乳糖胺基轉移酶；且 -較佳的是，所述細胞係經修飾所述更多的醣基轉移酶的表現或活性。 55. 如較佳實施例49至54中任一項所述之細胞，其中所述細胞係經修飾酵素的表現或活性，所述酵素係擇自包含以下所列的群組：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶。 56. 如較佳實施例49至55中任一項所述之細胞，其中所述細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉換成葡萄糖胺-6-磷酸，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸轉換成果糖-6-磷酸。 57. 如較佳實施例49至56中任一項所述之細胞，其中所述細胞係經修飾以增加UDP-半乳糖的產生，且其中所述修飾係擇自包含以下所列的群組：剔除編碼5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶的基因或剔除編碼半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)的基因。 58. 如較佳實施例49至57中任一項所述之細胞，其中所述細胞使用一或多種前驅物以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣，所述前驅物是由培養基提供給所述細胞。 59. 如較佳實施例49至58中任一項所述之細胞，其中所述細胞產生一或多種前驅物以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣。 60. 如較佳實施例49至59所述之細胞，其中用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的所述前驅物完全轉變為所述半乳糖化雙醣或寡醣。 61. 如較佳實施例49至60中任一項所述之細胞，其中所述細胞於胞內產生所述半乳糖化雙醣或寡醣，且其中一部分或實質上所有所述產生的半乳糖化雙醣或寡醣保留於胞內，及/或透過被動或主動運輸分泌至所述細胞之外。 62. 如較佳實施例49至61中任一項所述之細胞，其中所述細胞表現膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽，藉此將化合物運輸穿越細胞壁的外膜，較佳的是，所述細胞係經修飾所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽的表現或活性。 63. 如較佳實施例62所述之細胞，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽係擇自於包含以下所列的名單：運輸蛋白(porter)、P-P鍵結水解驅動運輸蛋白、β桶孔蛋白(β-barrel porin)、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白(putative transport protein)及磷酸轉移驅動基團轉位蛋白(phosphotransfer-driven group translocator)，較佳的是，所述運輸蛋白(porter)包括MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵體輸出蛋白(siderophore exporter)，較佳的是，所述P-P鍵結水解驅動運輸蛋白包括ABC運輸蛋白與螯鐵體輸出蛋白。 64. 如較佳實施例62或63所述之細胞，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制所述半乳糖化雙醣或寡醣及/或用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的一或多種前驅物及/或接受者於細胞壁外膜的流動。 65. 如較佳實施例62至64中任一項所述之細胞，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽改良所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生，及/或使所述半乳糖化雙醣或寡醣得以流出，及/或增強所述半乳糖化雙醣或寡醣的流出。 66. 如較佳實施例49至65中任一項所述之細胞，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞(progenitor)相比包括減少乙酸鹽(acetate)產生的修飾。 67. 如較佳實施例66所述之細胞，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞相比包括以下任一或多種蛋白質降低或減少的表現及/或經破壞、削弱、減少或延遲的活性，所述一或多種蛋白質包括：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷 O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白(N-acetylglucosamine repressor)、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖1-磷酸轉移酶(UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase)、L-岩藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶(L-fucose isomerase)、N-乙醯神經胺酸裂解酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1(ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1)、ATP 依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶 2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(glucose-specific translocating phosphotransferase)酵素IIBC組成ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(phosphotransferase, PTS)酵素IIBC組成malX、酵素IIAGlc、β-葡萄糖苷特異性PTS酵素II、果糖特異性PTS多磷醯基轉移蛋白FruA與FruB、乙醇脫氫酶、醛脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)、乙酸激酶、磷酸醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶及丙酮酸脫羧酶。 68. 如較佳實施例49至67中任一項所述之細胞，其中所述細胞可產生磷酸烯醇丙酮酸鹽(phosphoenolpyruvate, PEP)。 69. 如較佳實施例49至68中任一項所述之細胞，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞相比係經修飾以增加磷酸烯醇丙酮酸鹽的產生及/或供應。 70. 如較佳實施例49至69中任一項所述之細胞，其中所述細胞包括選擇的單醣、雙醣或寡醣至少部分失活的分解途徑，所述單醣、雙醣或寡醣涉及所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生及/或是產生所述半乳糖化雙醣或寡醣所需的。 71. 如較佳實施例49至70中任一項所述之細胞，其中所述細胞生長於乳糖結合一或多種其他的碳源的環境時抵抗乳糖殺傷(lactose killing)的現象。 72. 如較佳實施例49至71中任一項所述之細胞，其中所述細胞可分解代謝擇自包含以下所列的名單的碳源：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽寡醣、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液(corn-steep liquor)、糖蜜(molasses)、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。 73. 如較佳實施例49至72中任一項所述之細胞或如較佳實施例6至48中任一項所述之方法，其中所述細胞為細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、動物細胞或原生動物細胞(protozoan cell)， -較佳的是，所述細菌為大腸桿菌( Escherichia coli)菌株，更佳為K-12菌株的大腸桿菌菌株，更佳的是大腸桿菌K-12菌株為 E. coliMG1655； -較佳的是，所述真菌屬於擇自包含以下所列的群組的屬：黑黴菌屬( Rhizopus)、網柱黏菌屬( Dictyostelium)、青黴菌屬( Penicillium)、白黴菌屬( Mucor)或麴菌屬( Aspergillus)； -較佳的是，所述酵母菌屬於擇自包含以下所列的群組的屬：酵母菌屬( Saccharomyces)、接合酵母菌屬( Zygosaccharomyces)、畢赤酵母菌屬( Pichia)、克馬格特勒酵母菌屬( Komagataella)、漢遜氏酵母菌屬( Hansenula)、子囊菌酵母屬( Yarrowia)、擬球酵母菌屬( Starmerella)、克魯維酵母菌屬( Kluyveromyces)或德巴利酵母菌屬( Debaromyces)； -較佳的是，所述植物細胞為藻細胞，或衍生自煙草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、油菜籽、大豆、玉米(maize)或玉米植物(corn plant)； -較佳的是，所述動物細胞是衍生自非人類哺乳動物、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬蟲類、兩棲類或昆蟲，或是衍生自胚胎幹細胞以外的人類哺乳類細胞的基因改造細胞株，更佳的是，所述人類與非人類哺乳類細胞為上皮細胞、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中華倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster ovary cell, CHO cell)、鼠類骨髓瘤細胞、NIH-3T3細胞、非哺乳類成人幹細胞或其衍生細胞，更佳的是，所述昆蟲細胞是衍生自秋行軍蟲( Spodoptera frugiperda)、蠶( Bombyx mori)、甘藍夜蛾( Mamestra brassicae)、粉紋夜蛾( Trichoplusia ni)或黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)；且 -較佳的是，所述原生動物細胞為狼蛛利什曼原蟲( Leishmania tarentolae)細胞。 74. 如較佳實施例73所述之細胞或如較佳實施例73所述之方法，其中所述細胞為活革蘭氏陰性菌，所述活革蘭氏陰性菌與未經修飾的前驅細胞相比包括聚N-乙醯葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG)、腸細菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen, ECA)、纖維素、可拉酸(colonic acid)、核心寡醣、滲透調節間質葡聚醣(osmoregulated perplasmic glucan, OPG)、葡萄糖苷甘油(glucosylglycerol)、聚醣(glycan)及/或海藻糖減弱或經破壞的合成。 75. 如較佳實施例49至74中任一項所述之細胞，其中所述細胞產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。 76. 如較佳實施例49至74中任一項所述之細胞，其中所述細胞產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。 77. 一種如較佳實施例49至74中任一項所述之細胞或如較佳實施例1至42、73至74中任一項所述的方法的用途，其係用於產生半乳糖化雙醣或寡醣。 78. 一種如較佳實施例49至75中任一項所述之細胞或如較佳實施例1至42、73至74中任一項所述的方法的用途，其係用於產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。 79. 一種如較佳實施例49至76中任一項所述之細胞或如較佳實施例1至42、73至74中任一項所述的方法的用途，產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。

以下實施例將用以對本發明做進一步說明，而非用以限制本發明。

實施例

實施例1：材料與方法 大腸桿菌

培養基

Luria培養液(Luria Broth, LB)培養基由1%胰蛋白腖(tryptone peptone)(Difco, Erembodegem, Belgium)、0.5%酵母萃取物(Difco)與0.5%氯化鈉(VWR. Leuven, Belgium)所組成。培養實驗中96 孔盤或搖瓶中所使用的培養基含有2.00 g/L NH ₄Cl、5.00 g/L (NH ₄) ₂SO ₄、2.993 g/L KH ₂PO ₄、7.315 g/L K ₂HPO ₄、8.372 g/L MOPS、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO ₄‧7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1 ml/L維生素溶液、100 µl/L鉬酸鹽(molybdate)溶液與1 mL/L硒(selenium)溶液。如個別實施例中所指明，將0.30 g/L唾液酸(sialic acid)、20 g/L乳糖、20 g/L LacNAc及/或20 g/L LNB作為前驅物額外加入培養基中。將培養基以1M KOH設為pH為7。維生素溶液由 3.6 g/L FeCl ₂‧4H ₂O、5 g/L CaCl ₂‧2H ₂O、1.3 g/L MnCl ₂‧2H ₂O、0.38 g/L CuCl ₂‧2H ₂O、0.5 g/L CoCl ₂‧6H ₂O、0.94 g/L ZnCl ₂、0.0311 g/L H ₃BO ₄、0.4 g/L Na ₂EDTA‧2H ₂O與1.01 g/L硫胺素‧HCl(thiamine‧HCl)所組成。鉬酸鹽溶液含有0.967 g/L NaMoO ₄‧2H ₂O。硒溶液含有42 g/L SeO ₂。

用於發酵的基本培養基(minimal medium)，其含有 6.75 g/L NH ₄Cl、1.25 g/L (NH ₄) ₂SO ₄、2.93 g/L KH ₂PO ₄與7.31 g/L KH ₂PO ₄、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO ₄‧7H ₂O、30 g/ L蔗糖或 30 g/L甘油、具有上述相同組成的1 mL/L維生素溶液、100 µL/L鉬酸鹽溶液與1 mL/L硒溶液。如個別實施例中所指明，將0.30 g/L唾液酸、20 g/L乳糖作為前驅物額外加入發酵的基本培養基中。

複合培養基(complex medium)藉由高壓滅菌(autoclaving)(121℃，21分鐘)進行滅菌，而基本培養基藉由過濾(0.22 µm Sartorius)進行滅菌。必要時，通過添加一抗生素使培養基具有選擇性：如氯黴素(chloramphenicol) (20 mg/L)、卡本西林(carbenicillin)(100 mg/L)、奇黴素(spectinomycin)(40 mg/L)及/或康黴素(kanamycin)(50 mg/L)。

質體(plasmid)

pKD46(Red輔助質體，胺苄青黴素(Ampicillin)抗性)、pKD3(包含毗鄰FRT(FRT-flanked)的氯黴素抗性(cat)基因)、pKD4(包含毗鄰FRT的康黴素抗性(kan)基因)與pCP20(表現FLP重組酶活性)質體為獲自R. Cunin教授(比利時布魯塞爾自由大學(Vrije Universiteit Brussel)，2007年)。

質體維持於購自Invitrogen的宿主大腸桿菌DH5alpha(F ^-, phi80dlacZΔM15, Δ( lacZYA-argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk ^-, mk ⁺), phoA, supE44, lambda ^-, thi-1, gyrA96, relA1)。

菌株(Strains)與突變(mutations)

大腸桿菌K12 MG1655 [λ ^-, F ^-, rph-1] 於2007年3月從大腸桿菌遺傳儲備中心(Coli Genetic Stock Center)(US)獲得(CGSC Strain#: 7740)。使用Datsenko與Wanner (PNAS 97 (2000), 6640-6645)發表的技術進行基因破壞(gene disruption)、基因導入(gene introduction)與基因置換(gene replacement)。此種技術是基於藉由λ Red重組酶(lambda Red recombinase)進行同源重組(homologous recombination)後的抗生素選擇(antibiotic selection)。隨後的內翻轉酶(flippase)重組酶的催化作用確保了在最終生產菌株(final production strain)中去除抗生素選擇匣(antibiotic selection cassette)。

攜帶Red輔助質體pKD46的轉形體(transformant)在10 mL具有胺苄青黴素(100 mg/L)與L-阿拉伯糖(10 mM)的LB培養基中於30℃下生長至OD ₆₀₀nm為0.6。藉由第一次以50 mL冰冷水洗滌細胞與第二次以1mL冰冷水洗滌細胞，而使細胞為電勝任的(electrocompetent)。之後，將細胞重新懸浮於50 µL冰冷的水中。以Gene Pulser ^TM(BioRad)(600Ω，25μFD及250Volts)並使用50µL的細胞與10-100ng的線性雙股DNA產物來完成電穿孔。

電穿孔後，將細胞加入到1 mL LB培養基中，在37℃下培養1小時，最後塗於含有25 mg/L之氯黴素或50 mg/L康黴素的LB-瓊脂上，以選擇抗生素抗性的轉形體。選擇的突變體用修飾區上游與下游的引子通過 PCR 驗證，並在 42°C 的 LB-瓊脂中生長以消除輔助質體。測試突變體的氨芐青黴素敏感性。

使用 pKD3、pKD4 及其衍生物作為模板，並利用PCR獲得線性 ds-DNA擴增子(amplicon)。所用引子的一部分序列與模板互補，另一部分與染色體DNA上必須發生重組的一側互補。對於基因體剔除而言，同源區域被設計在感興趣基因的起始密碼子與終止密碼子的上游 50-nt 與下游 50-nt。對於基因體敲入而言，必須顧及轉錄起點 (+1)。PCR 產物進行 PCR 純化，用 DpnI 進行切割，從瓊脂糖凝膠中重新純化，並以洗脫緩衝液(5 mM Tris，pH 8.0)重新懸浮。

選擇的突變體用 pCP20質體轉形，pCP20質體是一種胺芐青黴素與氯黴素抗性質體，展現出 FLP 合成的溫度敏感複製與熱誘導。在 30°C 下選擇胺芐青黴素抗性轉形體，然後在 42°C 下於LB中純化一些菌落，然後測試所有抗生素抗性與 FLP 輔助質體的喪失。使用控制引子檢查基因剔除與敲入。

在產生GDP-岩藻糖與岩藻糖化寡醣的一實施例中，突變株是源自大腸桿菌K12 MG1655，其包括大腸桿菌 wcaJ與 thyA基因的剔除及持續表現構築體的基因體敲入，持續表現構築體含有蔗糖運輸蛋白如源自大腸桿菌的CscB(UniProt ID E0IXR1)、果糖激酶如源自重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的frk(ZmFrk)(UniProt ID Q03417)、蔗糖磷酸化酶如源自青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的BaSP(UniProt ID A0ZZH6)，突變株額外包括具有α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511))的持續表現構築體，以及具有作為選擇標記的大腸桿菌thyA(UniProt ID P0A884) 的持續表現構築體的表現質體。岩藻糖基轉移酶基因的持續表現構築體也可以透過基因體敲入而存在於突變大腸桿菌菌株中。如WO2016075243與WO2012007481中所述，透過基因體剔除包括 glgC、 agp、 pfkA、 pfkB、 pgi、 arcA、 iclR、 pgi及 lon的大腸桿菌基因，可進一步優化突變大腸桿菌菌株中的GDP-岩藻糖生產。GDP-岩藻糖生產可額外進行優化，包括基因體敲入以下的的持續表現構築體：甘露糖-6-磷酸異構酶如來自大腸桿菌的manA (UniProt ID P00946)、磷酸甘露糖變位酶(phosphomannomutase)如來自大腸桿菌的 manB (UniProt ID P24175)、甘露糖 1-磷酸鳥苷酸轉移酶(mannose-1-phosphate guanylyltransferase)如來自大腸桿菌的 manC (UniProt ID P24174)、GDP-甘露糖 4,6-脫水酶如來自大腸桿菌的gmd(UniProt ID P0AC88)和GDP-L-岩藻糖合成酶如來自大腸桿菌的fcl(UniProt ID P32055)。GDP-岩藻糖生產也可以透過基因體剔除大腸桿菌 fucK和 fucI基因以及基因體敲入含有岩藻糖通透酶(例如來自大腸桿菌的fucP(UniProt ID P11551))與具有岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶活性(例如來自脆弱類桿菌( Bacteroides fragilis)的fkp(UniProt ID SUV40286.1))的雙功能酶的持續表現構築體來達成。如果產生 GDP-岩藻糖的突變菌株是想要製造岩藻糖化乳糖結構，則該菌株還需要透過基因體剔除大腸桿菌 LacZ、 LacY和 LacA基因以及基因體敲入乳糖通透酶(例如，大腸桿菌LacY(UniProt ID P02920))的持續表現構築體來進行修飾。

或者及/或更甚者，可以在突變大腸桿菌菌株中以持續轉錄單位的基因體敲入進一步優化GDP-岩藻糖及/或岩藻糖化寡醣的產生，其中持續轉錄單位包含膜運輸蛋白如來自穆汀斯克羅諾桿菌( Cronobacter muytjensii)的 MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、來自楊氏檸檬酸桿菌( Citrobacter youngae)的 MdfA(UniProt ID D4BC23)、來自大腸桿菌的MdfA (UniProt ID P0AEY8)、來自雷金斯堡預研菌( Yokenella regensburgei)的 MdfA(UniProt ID G9Z5F4)、來自大腸桿菌的iceT(Uniprot ID A0A024L207)或來自楊氏檸檬酸桿菌的iceT(UniProt ID D4B8A6)。

在唾液酸生產的一個實例中，突變株衍生自大腸桿菌K12 MG1655，其包含持續轉錄單位的基因體敲入，該持續轉錄單位含有一個或多個拷貝的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶如來自啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)，N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶如來自卵形類桿菌( Bacteroides ovatus)的AGE(UniProt ID A7LVG6)與如來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis) (UniProt ID E0NCD4)或空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)(UniProt ID Q93MP9)的N-乙醯神經胺酸合成酶。

或者及/或更甚者，唾液酸的產生可以透過基因體敲入含有UDP-N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶與N-乙醯神經胺酸合成酶的持續轉錄單位而達成，UDP-N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶如來自空腸彎曲桿菌的NeuC(UniProt ID Q93MP8)，且N-乙醯神經胺酸合成酶如來自腦膜炎雙球菌 (UniProt ID E0NCD4) 或空腸彎曲桿菌 (UniProt ID Q93MP9)。

或者及/或更甚者，唾液酸的產生可以透過基因體敲入含有磷酸葡萄糖胺變位酶(phosphoglucosamine mutase)、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸尿苷基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶、UDP-N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶與N-乙醯神經胺酸合成酶的持續轉錄單位而達成，磷酸葡萄糖胺變位酶如來自大腸桿菌的glmM (UniProt ID P31120)，N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸尿苷基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶如來自大腸桿菌的glmU(UniProt ID P0ACC7)，UDP-N-乙醯葡萄糖胺2表異構酶如來自空腸彎曲桿菌的NeuC(UniProt ID Q93MP8)，且N-乙醯神經胺酸合成酶如來自腦膜炎雙球菌 (UniProt ID E0NCD4)或空腸彎曲桿菌 (UniProt ID Q93MP9)。

或者及/或更甚者，唾液酸的產生可以透過基因體敲入持續轉錄單位而達成，持續轉錄單位含有雙功能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶(N-acylneuraminate-9-phosphate synthetase)與N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶，雙功能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶如來自小鼠( Mus musculus(C57BL/6J品系)(UniProt ID Q91WG8)，N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶如來自假單孢菌屬UW4 (UniProt ID K9NPH9)，且N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶如來自待定趨磁念珠菌種HK-1( Candidatus Magnetomorumsp. HK-1)(UniProt ID KPA15328.1)或多形擬桿菌( Bacteroides thetaiotaomicron)(UniProt ID Q8A712)。

或者及/或更甚者，唾液酸的產生可以透過基因體敲入含有磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸尿苷基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶、雙功能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶與N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶的持續轉錄單位而達成，磷酸葡萄糖胺變位酶如來自大腸桿菌的glmM (UniProt ID P31120)，N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸尿苷基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶如來自大腸桿菌的glmU(UniProt ID P0ACC7)，雙功能UDP-GlcNAc 2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶如來自小鼠( Mus musculus)(C57BL/6J品系)(UniProt ID Q91WG8)，N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶如來自假單孢菌屬UW4 (UniProt ID K9NPH9)，且N-醯基神經胺酸-9-磷酸酶如來自待定趨磁念珠菌種HK-1( Candidatus Magnetomorumsp. HK-1)(UniProt ID KPA15328.1)或多形擬桿菌( Bacteroides thetaiotaomicron)(UniProt ID Q8A712)。

唾液酸的產生可如WO18122225中所述在突變大腸桿菌菌株中基因體剔除大腸桿菌基因而進一步優化，大腸桿菌基因包括任一或多者的 nagA、nagB、 nagC、 nagD、 nagE、 nanA、 nanE、 nanK、 manX、 manY與 manZ，及/或可如Dang等人(Biochimie 88, 419-29 (2006))所述基因體剔除大腸桿菌基因及基因體敲入持續轉錄單位而進一步優化，大腸桿菌基因包括任一或多者的 nanT、 poxB、 ldhA、 adhE、 aldB、 pflA、 pflC、 ybiY、 ackA及/或 pta，且持續轉錄單位包括一或多個拷貝的L- 麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、較佳一磷酸酶及乙醯輔酶A合成酶，L- 麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶例如來自大腸桿菌的突變glms*54(與Uniprot ID P17169的野生型大腸桿菌glms不同在於A39T、R250C與G472S突變)， 磷酸酶如WO18122225中所述為任一或多者的大腸桿菌基因，其包括aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU，或來自戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草桿菌的BsAraL，且乙醯輔酶A合成酶如來自大腸桿菌的acs(UniProt ID P27550)。

對於唾液酸化寡醣的產生而言，所述產生唾液酸的菌株可進一步進行修飾以表現N-醯基神經胺酸胞苷轉移酶(例如，來自空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的NeuA酵素(UniProt ID Q93MP7)、來自流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)的NeuA酵素(GenBank No. AGV11798.1)或來自多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的NeuA酵素(GenBank No. AMK07891.1))，以及表現一或多個拷貝的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶(beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase)(例如，來自多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的PmultST3(UniProt ID Q9CLP3)，或由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的類PmultST3多肽，來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的NmeniST3(GenBank No. ARC07984.1)或來自多殺性巴氏桿菌亞種多殺性株Pm70( P. multocidasubsp. multocida str. Pm70)的PmultST2(GenBank No. AAK02592.1)，來自發光桿菌( Photobacterium damselae)pdST6(UniProt ID O66375)的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶、或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的類pdST6多肽、或來自發光菌屬JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6(UniProt ID A8QYL1)，或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514所組成的類P-JT-ISH-224-ST6多肽，及/或如來自小鼠( M. musculus)的α-2,8-唾液酸轉移酶(UniProt ID Q64689)。N-醯基神經胺酸胞苷轉移酶與唾液酸轉移酶可透過基因體敲入或透過表現質體而送入突變株中。若產生唾液酸與CMP-唾液酸的突變出是用以製造唾液酸化乳糖結構，則菌株以基因體剔除大腸桿菌 LacZ、 LacY與 LacA基因及基因體敲入乳糖通透酶的持續轉錄單位而額外進行修飾，乳糖通透酶如大腸桿菌的LacY(UniProt ID P02920)。產生唾液酸、CMP-唾液酸及/或唾液酸化寡醣的所有突變株可視需要地透過基因體敲入持續轉錄單位而適應蔗糖中的成長，持續轉錄單位包含蔗糖運輸蛋白(例如，來自大腸桿菌W的CscB(UniProt ID E0IXR1))、果糖激酶(例如，源自重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的Frk(UniProt ID Q03417))以及蔗糖磷酸化酶(例如，源自青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的BaSP(UniProt ID A0ZZH6)。

或者及/或更甚者，唾液酸及/或唾液酸化寡醣的產生可在突變大腸桿菌菌株中基因體敲入持續轉錄單位而進一步優化，持續轉錄單位包括如唾液酸運輸蛋白(例如，來自大腸桿菌K12 MG1655的nanT(UniProt ID P41036)、來自大腸桿菌O6:H1的nanT(UniProt ID Q8FD59)、來自大腸桿菌O157:H7的nanT(UniProt ID Q8X9G8)、來自艾伯特氏埃希氏菌( E. albertii)的nanT(UniProt ID B1EFH1))得膜運輸蛋白、 或如來自大腸桿菌的EntS(UniProt ID P24077)、來自抗壞血克呂沃爾氏菌( Kluyvera ascorbate)的EntS(UniProt ID A0A378GQ13)、來自腸道沙門氏菌 arizonae亞種( Salmonella enterica subsp. arizonae)的EntS(UniProt ID A0A6Y2K4E8)、來自穆汀斯克羅諾桿菌( Cronobacter muytjensii)的MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、來自楊氏檸檬酸桿菌( Citrobacter youngae)的MdfA(UniProt ID D4BC23)、來自大腸桿菌的MdfA (UniProt ID P0AEY8)、來自雷金斯堡預研菌( Yokenella regensburgei)的MdfA(UniProt ID G9Z5F4)、來自大腸桿菌的iceT(UniProt ID A0A024L207)、來自楊氏檸檬酸桿菌( Citrobacter youngae)的iceT(UniProt ID D4B8A6)、來自大腸桿菌的setA(UniProt ID P31675)、來自大腸桿菌的setB(UniProt ID P33026)、或來自大腸桿菌的setC(UniProt ID P31436))的運輸蛋白(porter)，或如來自來自大腸桿菌的oppF(UniProt ID P77737)、來自乳酸乳球菌亞種雙乙酸乳酸變種( Lactococcus lactis subsp. lactis bv. Diacetylactis)的ImrA(UniProt ID A0A1V0NEL4)與嬰兒長雙歧桿菌亞種( Bifidobacterium longum subsp. Infantis)的Blon_2475 (UniProt ID B7GPD4))的ABC運輸蛋白。

在增加UDP-半乳糖產生的一實施例中，大腸桿菌K12 MG1655菌株以基因體剔除任一或多者的大腸桿菌 ushA、 galT、 ldhA與 agp基因以及基因體敲入大腸桿菌UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)的持續表現構築體而進行修飾。

在增加UDP-GlcNAc產生的一實施例中，大腸桿菌K12 MG1655菌株以基因體敲入L- 麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的持續轉錄單位而進行修飾，例如如Dang等人(Biochimie 88, 419-29 (2006))所述來自大腸桿菌的突變glms*54(與Uniprot ID P17169的野生型大腸桿菌glmS蛋白不同在於A39T、R250C與G472S突變)。

在產生乳糖-N-丙糖(LN3，GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)的一實施例中，突變株是源自於大腸桿菌K12 MG1655且以剔除大腸桿菌 lacZ、 lacY、 lacA與 nagB基因及基因體敲入乳糖通透酶(例如，大腸桿菌LacY(UniProt ID P02920))與半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶(例如，腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的lgtA (UniProt ID Q9JXQ6))的持續轉錄單位而進行修飾。

在產生源自LN3寡醣(例如，乳糖-N-丁糖(LNT，Gal-β1,3-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc))的一實施例中，產生LN3的突變株透過基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的表現載體，將持續轉錄單位送至菌株中而進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶擇自包括下列的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。

在產生源自LN3寡醣(例如，乳糖-N-新丁糖(LNnT，Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc))的一實施例中，產生LN3的突變株透過基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的表現載體，將持續轉錄單位送至菌株中而進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶擇自包括下列的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。

在產生乳糖-N-乙糖(LNB，Gal-β1,3-GlcNAc)與源自LNB的寡醣的一實施例中，菌株以一或多個拷貝的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位的基因體敲入或表現質體而進行修飾，葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶如來自啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)，且N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶擇自包括下列的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。

在產生N-乙醯乳糖胺(LacNAc，Gal-β1,4-GlcNAc)與源自LacNAc的寡醣的一實施例中，菌株以一或多個拷貝的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位的基因體敲入或表現質體而進行修飾，葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶如來自啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)，且N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶擇自包括下列的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。

產生LNB、LacNAc、LN3、LNT與LNnT的大腸桿菌突變株也可視需要地透過基因體敲入持續轉錄單位而適應蔗糖中的成長，持續轉錄單位包含蔗糖運輸蛋白(例如，來自大腸桿菌W的CscB(UniProt ID E0IXR1))、果糖激酶(例如，源自重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的Frk(UniProt ID Q03417))以及蔗糖磷酸化酶(例如，源自青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的BaSP(UniProt ID A0ZZH6)。

或者及/或更甚者， LN3、LNT、LNnT、 LNB、LacNAc及其衍生寡醣可於大腸桿菌突變株中透過基因體敲入持續轉錄單位而進一步優化，持續轉錄單位包括模運輸蛋白如來自穆汀斯克羅諾桿菌( Cronobacter muytjensii)的MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、來自楊氏檸檬酸桿菌( Citrobacter youngae)的MdfA(UniProt ID D4BC23)、來自大腸桿菌的MdfA (UniProt ID P0AEY8)、來自雷金斯堡預研菌( Yokenella regensburgei)的MdfA (UniProt ID G9Z5F4)、來自大腸桿菌的iceT(UniProt ID A0A024L207)或來自楊氏檸檬酸桿菌( Citrobacter youngae)的iceT(UniProt ID D4B8A6)。

較佳但並非必要，任一或多種醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成的蛋白質及/或膜運輸蛋白在 N 端和/或 C 端融合到溶解度增強子標籤，例如SUMO 標籤、MBP 標籤、His、FLAG、Strep-II、Halo-tag、NusA、硫氧化還原蛋白(thioredoxin)、GST 及/或 Fh8 標籤以提高其溶解度(Costa et al., Front. Microbiol. 2014, https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063; Fox et al., Protein Sci. 2001, 10(3), 622-630; Jia and Jeaon, Open Biol. 2016, 6: 160196)。

視需要地，大腸桿菌突變株以基因體敲入編碼伴護蛋白(chaperone protein)的持續轉錄單位而進行修飾，伴護蛋白如DnaK、DnaJ、GrpE或GroEL/ES伴護蛋白系統(Baneyx F., Palumbo J.L. (2003) Improving Heterologous Protein Folding via Molecular Chaperone and Foldase Co-Expression. In: Vaillancourt P.E. (eds) E. coli Gene Expression Protocols. Methods in Molecular Biology™, vol 205. Humana Press)。

視需要地，大腸桿菌突變株係經修飾以產生醣最小化(glycominimized)大腸桿菌菌株，包括基因體剔除任一或多種非必要醣基轉移酶基因，其包括pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA與yaiP。

所有持續啟動子與UTR是源自De Mey等人(BMC Biotechnology, 2007)、Dunn(Nucleic Acids Res. 1980, 8(10), 2119-2132)、Kim與Lee(FEBS letters 1997, 407(3), 353-356)及Mutalik等人(Nat. Methods 2013, No. 10, 354-360)所述的分子庫(library)。

本發明中所述的SEQ ID NO概述於表1中。

所有基因皆於Twist Bioscience (twistbioscience.com)或IDT (eu.idtdna.com)合成下訂，且以供應商的工具調整密碼子使用(codon usage)。

所有菌株皆儲存於80℃下的冷凍樣品管中(隔夜LB培養物以1:1的比例與70%甘油混合)。

表1：本發明中所述的SEQ ID NO的概述

SEQ ID NO	生物	來源	數字序列訊息的來源國
01	不適用	合成的	人造序列
02	不適用	合成的	人造序列
03	麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)	合成的	日本
04	鰒發光桿菌( Photobacterium leiognathi)	合成的	美國
05	不適用	合成的	人造序列
06	阿拉伯芥( A. thaliana)	合成的	美國
07	布魯氏錐蟲 ( Trypanosoma brucei)	合成的	蘇格蘭
08	小鼠( Mus musculus)	合成的	美國
09	智人( Homo sapiens)	合成的	未知
10	不適用	合成的	人造序列
11	不適用	合成的	人造序列
12	不適用	合成的	人造序列
13	不適用	合成的	人造序列
14	不適用	合成的	人造序列
15	Basilea psittacipulmonis	合成的	瑞士
16	北極奈瑟菌( Neisseria arctica)	合成的	美國
17	副豬格萊瑟菌( Glaesserella parasuis)	合成的	美國
18	羊放線桿菌 ( Actinobacillus seminis)	合成的	澳洲
19	阿利西拉絲狀菌( Alysiella filiformis)	合成的	澳洲
20	Conchiformibius steedae	合成的	英國
21	溶血不動桿菌( Acinetobacter haemolyticus)	合成的	南韓
22	幽門彎曲桿菌( Campylobacter pylori)	合成的	瑞士
23	嗜睡嗜血桿菌( Histophilus somni)	合成的	加拿大
24	不適用	合成的	人造序列
25	不適用	合成的	人造序列
26	肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumoniae)	合成的	美國
27	蜂房哈夫尼菌( Hafnia alvei)	合成的	未知
28	不適用	合成的	人造序列
29	苦參分枝桿菌( Mycolicibacterium flavescens)	合成的	美國
30	鞘胺醇單胞菌屬( Sphingomonas sp.)	合成的	英國
31	帕拉米德氏菌科细菌HS-T3( Parachlamydiaceae bacteriumHS-T3)	合成的	日本
32	柯克斯氏體屬DG_40( Coxiella sp.DG_40)	合成的	美國
33	運動型珊瑚球菌( Corallococcus exercitus)	合成的	英國
34	阿達拉氏菌( Hypericibacter adhaerens)	合成的	德國
35	不適用	合成的	人造序列
36	不適用	合成的	人造序列
37	普通擬桿菌( Bacteroides vulgatus)	合成的	英國
38	人體普氏菌( Prevotella copri)	合成的	美國
39	螢光假單胞菌90F12-2 ( Pseudomonas fluorescens90F12-2 )	合成的	美國

培養條件

96孔微孔盤實驗的預培養始於冷凍養品管，150µL LB 中，並於 37℃下以 800 rpm 在迴轉式振盪器上培養隔夜。此培養物作為96孔方型微孔盤的接種物，以400µL MMsf培養基稀釋400x。接著，此最終96培養盤於 37℃下以 800 rpm 在迴轉式振盪器上培養72小時，或更短或更長的時間。為了測量培養實驗終點的糖濃度，將細胞離心之前於60℃下加熱培養液15分鐘，以從各個孔取出整個培養液樣品(=平均胞內與胞外糖濃度)。

生物反應器的預培養始於特定菌株的整個1mL冷凍樣品管， 在1L或2.5L搖瓶中以250mL或500mL的MMsf培養基進行接種，且於37℃下以200rpm在迴轉式振盪器上培養24小時。接著，接種5L的生物反應器(2L批量培養基中250mL的接種物)；以MFCS控制軟體(Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Germany)控制流程。培養條件設定為37℃，且攪拌速率為最大；壓力氣流速率取決於菌株與生物反應器。以0.5M H ₂SO ₄與20% NH ₄OH將pH控制在6.8。冷卻排氣。10%聚矽氧防沫劑(silicon antifoaming agent)溶液於發酵起泡時添加。

光學密度

透過測量600nm的光學密度而頻繁地監測培養物的細胞密度。(Implen Nanophotometer NP80, Westburg, Belgium或Spark 10M微盤讀取儀, Tecan, Switzerland)。

解析分析(Analytical analysis)

例如但不限於蔗糖、葡萄糖、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯乳糖胺、乳糖-N-二糖、岩藻糖化N-乙醯乳糖胺(2'FLAcNAc、3-FlacNAc)、岩藻糖化乳糖-N-二糖(2'FLNB、4-FLNB)、唾液酸化N -乙醯乳糖胺 (3'SLacNAc, 6'SLacNAc)的標準品是購自Carbosynth (UK)、Elicityl (France)與IsoSep (Sweden)。其他化合物以自製標準品進行分析。

在Dionex HPAEC系統以脈衝電流偵測(pulsed amperometric detection, PAD)分析N-乙醯葡萄糖胺與N -乙醯乳糖胺。將5µL體積的樣品注射至4x250mm的Dionex CarboPac PA1管柱與4x50mm的Dionex CarboPac PA1 guard管柱。管柱溫度為20℃。使用3種洗脫液進行分離步驟：A) 去離子水；B) 200mM氫氧化鈉；及C) 500mM醋酸鈉。洗脫曲線如下所述而進行：0-10分鐘50%A與50%B；10-18分鐘50-44%A與50%B；18-28分鐘44%A與50%B；28-32分鐘44-30.8%A與50%B；32-39分鐘30.8%A與50%B；39-40分鐘30.8-2%A與50%B；40-43分鐘2%A與50%B；43-44分鐘2-50%A與50%B；44-50分鐘50%A與50%B。流速為1.0mL/分。

在Waters Acquity H-class UPLC以蒸發光散射偵測(Evaporative Light Scattering Detector, ELSD)或折射率偵測分析N-乙醯葡萄糖胺、N -乙醯乳糖胺、乳糖-N-乙糖、岩藻糖化N-乙醯乳糖胺與岩藻糖化LNB。將0.7µL體積的樣品注射至Waters Acquity UPLC BEH 醯胺管柱(2.1 x 100mm; 130Å; 1.7µm)與130Å, 2.1x 5mm的Acquity UPLC BEH Amide VanGuard管柱。管柱溫度為50℃。流動相由1/4的水與3/4的乙腈溶液所組成並添加0.2%三乙胺。方法為等度的(isocratic)，流速為0.130mL/分。ELS偵測器的漂移管溫度為 50℃，且氮氣壓為50psi，gain值為200與數據速率為10pps。 RI偵測器的溫度設定為35℃。

於Waters Acquity H-Class UPLC以折射率偵測分析唾液酸化N-乙醯乳糖胺與唾液酸乳糖-N-乙糖。將0.5µL體積的樣品注射至Waters Acquity UPLC BEH 醯胺管柱(2.1 x 100mm; 1.7µm粒徑)，流動相包含70mL乙腈、26mL配在超純水中的150mM的醋酸銨，且添加4mL含有0.05% 吡咯啶的甲醇。方法為等度的，流速為0.150mL/分。管柱溫度設定為50℃。

在Dionex HPAEC系統以脈衝電流偵測分析低濃度的糖(低於50mg/L)。將5µL體積的樣品注射至4x250mm的Dionex CarboPac PA200管柱與4x50mm的Dionex CarboPac PA200 guard管柱。管柱溫度設定為30℃。使用梯度，其中洗脫液A為去離子水，其中洗脫液B為200mM氫氧化鈉，且其中洗脫液為500mM醋酸鈉。寡醣於60分鐘內分離並使用以下梯度維持25%洗脫液B的恆定比例：75%洗脫液A初始等度步驟維持10分鐘；於8分鐘內洗脫液C從0%初次增加至4%；71%洗脫液A與4%洗脫液C第二等度步驟維持6分鐘；於2.6分鐘內第二次洗脫液C從4%增加至12%；63%洗脫液A與12%洗脫液C第三等度步驟維持3.4分鐘；以及於5分鐘內洗脫液C從12%第三次增加至48%。作為清洗步驟，使用48%洗脫液C 3分鐘。為了平衡管柱，1分鐘內回復75%洗脫液A與0%洗脫液C的初始條件並維持11分鐘。所使用的流速為0.5mL/分。

數據標準化(normalization)

對於所有種類的培養條件，將從突變株獲得的數據對在相同培養條件的參考菌株獲得的數據進行標準化。

實施例2：修飾大腸桿菌宿主中GlcNAc的產生

此實施例中，剔除同源大腸桿菌N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶( nagA)基因與大腸桿菌葡萄糖胺-6-磷酸去胺酶( nagB)基因並接著轉形表現質體而修飾野生型大腸桿菌K-12 MG1655，表現質體包括來自啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1(UniProt ID P43577)的持續轉錄單位。因此，根據實施例1中的培養條件，所得大腸桿菌突變株在成長實驗中進行評估時於全培養液樣品中產生GlcNAc，其中培養基包含甘油。

實施例3：修飾大腸桿菌宿主中GlcNAc的產生

實施例2中所述進行修飾以產生GlcNAc的大腸桿菌突變株進一步以第二兼容表現質體轉形，第二兼容表現質體包括來自大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶(glmS*54)突變變體的持續轉錄單位，如Deng等人所述(Biochimie 2006: 88, 419-429)，大腸桿菌的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶(glmS*54)突變變體與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變。根據實施例1中的培養條件，新穎菌株在成長實驗中進行評估時於全培養液樣品中產生GlcNAc，其中培養基包含甘油。

實施例4：修飾大腸桿菌宿主中GlcNAc的產生

剔除 nagA基因與 nagB基因並基因體敲入來自啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)的持續轉錄單位而修飾野生型大腸桿菌K-12 MG1655。因此，根據實施例1中的培養條件，所得大腸桿菌突變株在成長實驗中進行評估時於全培養液樣品中產生GlcNAc，其中培養基包含甘油。

實施例5：修飾大腸桿菌宿主中GlcNAc的產生

實施例4中所述進行修飾以產生GlcNAc的大腸桿菌突變株進一步以表現質體轉形，表現質體包括來自大腸桿菌的glmS*54的持續轉錄單位，如Deng等人所述(Biochimie 2006: 88, 419-429)，glmS*54與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變。根據實施例1中的培養條件，新穎菌株在成長實驗中進行評估時於全培養液樣品中產生GlcNAc，其中培養基包含甘油。

實施例6：修飾大腸桿菌宿主中GlcNAc的產生

實施例4中所述進行修飾以產生GlcNAc的大腸桿菌突變株以基因體敲入來自大腸桿菌的glmS*54的持續轉錄單位而進一步轉形，如Deng等人所述(Biochimie 2006: 88, 419-429)，glmS*54與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變。根據實施例1中的培養條件，新穎菌株在成長實驗中進行評估時於全培養液樣品中產生GlcNAc，其中培養基包含甘油。

實施例7：修飾大腸桿菌宿主中GlcNAc的產生

實施例2中所述進行修飾以產生GlcNAc的大腸桿菌突變株以包括來自大腸桿菌的glmS*54的持續轉錄單位的基因體敲入而進行進一步修飾，如Deng等人所述(Biochimie 2006: 88, 419-429)，glmS*54與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變。根據實施例1中的培養條件，新穎菌株在成長實驗中進行評估時於全培養液樣品中產生GlcNAc，其中培養基包含甘油。

實施例8：修飾大腸桿菌宿主中LacNAc或LNB的產生

如實施例2與4至7中所述，具有 nagAB剔除、表現GNA1(UniProt ID P43577)，且額外表現或不表現突變glmS*54並產生GlcNAc的大腸桿菌K-12 MG1655突變株於下個實施例中以含有表現N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位的質體進行轉形，其中glmS*54與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括下列的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，且N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包括下列的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。

根據實施例1中的培養條件，對表現N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的每株新穎菌株評估GlcNAc與LacNAc在成長實驗中於全培養液樣品中的產生，其中培養基包含甘油。

根據實施例1中的培養條件，對表現N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的每株新穎菌株評估GlcNAc與LNB在成長實驗中於全培養液樣品中的產生，其中培養基包含甘油。

實施例9：修飾大腸桿菌宿主中GlcNAc或LacNAc的產生

如實施例1所述為了產生GDP-岩藻糖而優化的大腸桿菌K-12 MG1655突變株以剔除大腸桿菌 nagA與 nagB基因及基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體而進一步進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括下列的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。在下一步中，所述突變株細胞以包含來自大腸桿菌的突變glmS*54(與野生型glmS蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)與來自啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)的持續轉錄單位的表現載體進行轉形。根據實施例1中提供的培養條件，對新穎菌株評估GlcNAc與LacNAc在成長實驗中的產生，其中培養基含有蔗糖。菌株在96孔盤的多孔中成長72小時，之後收集培養液並以UPLC分析GlcNAc與LacNAc。

實施例10：修飾大腸桿菌宿主中GlcNAc或LacNAc的產生

下個實驗中，如實施例1所述，產生唾液酸、剔除大腸桿菌 nagA與 nagB基因及基因體敲入含有glmS*54(如Deng等人所述(Biochimie 2006: 88, 419-429)，與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、GNA1(UniProt ID P43577)，來自卵形類桿菌( Bacteroides ovatus)的N-乙醯葡萄糖胺 2-表異構酶(AGE)(UniProt ID A7LVG6)與來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的N-乙醯神經胺酸合成酶(UniProt ID E0NCD4)的持續表現構築體的大腸桿菌K-12 MG1655菌株，以剔除N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶而進一步進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括下列的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。

此外，如實施例1所述為了增加GDP-半乳糖的產生而優化的大腸桿菌K-12 MG1655菌株以基因體剔除大腸桿菌 ushA與 galT基因及基因體敲入大腸桿菌UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)的持續表現構築體，其額外以剔除大腸桿菌 nagB基因及基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體而進行突變，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括下列的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。根據實施例1中提供的培養條件，對新穎菌株評估GlcNAc與LacNAc在成長實驗中的產生，其中培養基含有蔗糖。各菌株在96孔盤的多孔中成長72小時，之後收集培養液並以UPLC分析GlcNAc與LacNAc。

實施例11：修飾大腸桿菌宿主中半乳糖化寡醣的產生

如實施例10所述為了增加GDP-半乳糖的產生且可產生GlcNAc與LacNAc而優化的大腸桿菌K-12 MG1655菌株可額外地以包含N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體的表現載體而進行轉形，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包括下列的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。根據實施例1中提供的培養條件，對新穎菌株評估除了成長實驗中評估的GlcNAc、LacNAc與LNB之外的Gal-β14-(Galβ13)-GlcNAc的產生，Gal-β14-(Galβ13)-GlcNAc包含以β-1,3與β-1,4連接至GlcNAc的兩種半乳糖部分，其中培養基含有蔗糖。

實施例12：大腸桿菌宿主中修飾LacNAc的產生

如實施例9所述為了GDP-岩藻糖的產生且可產生GlcNAc與LacNAc而優化的大腸桿菌K-12 MG1655菌株可額外地以包含來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的β-1,3-N-乙醯-己糖胺基轉移酶LgtA (UniProt ID Q9JXQ6) 的持續表現構築體的表現質體而進行轉形。藉由突變glmS*54(與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、同源EcGlmM與EcGlmU及異源LgtA(UniProt ID Q9JXQ6)的後續作用，所產生的菌株根據實施例1中提供的培養條件，可於胞內將果糖-6-磷酸轉變成UDP-GlcNAc，且可使用此UDP-GlcNAc於胞內修飾LacNAc以在成長實驗進行評估時於全培養液中產生GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-GlcNAc。新穎菌株也可產生聚-LacNAc結構，即(Gal-β1,4-GlcNAc)n，其由重複的N-乙醯乳糖胺所形成，重複的N-乙醯乳糖胺透過菌株中表現的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶與LgtA交替的活性而以β-1,3彼此連接在一起。

如實施例10所述為了GDP-半乳糖的產生且可產生GlcNAc與LacNAc而優化的大腸桿菌K-12 MG1655菌株係經修飾以持續表現來自綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)的UDP-GlcNAc表異構酶wbpP(UniProt ID Q8KN66)與來自流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)的醣基轉移酶IgtD(UniProt ID A0A2X4DBP3)。藉由突變glmS*54、同源大腸桿菌glmM與glmU及綠膿桿菌wbpP的後續作用，細胞可透過中間化合物葡萄糖胺-6-磷酸、葡萄糖胺-1-磷酸與UDP-GlcNAc於胞內將果糖-6-磷酸轉變成UDP-GalNAc。藉由新表現的LgtD酵素的後續作用，根據實施例1中提供的培養條件，新穎菌株可以GalNAc修飾胞內產生的LacNAc以在成長實驗中進行評估時於全培養液樣品中產生GalNAc-β1,3-Gal-β1,4-GlcNAc，其中培養基含有30g/L的蔗糖。

實施例13：修飾大腸桿菌宿主中LNB的產生

在下個實驗中，為了GDP-岩藻糖的產生而優化的大腸桿菌K-12 MG1655菌株以剔除glmS*54(與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)與來自啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)的持續表現構築體而進行修飾，以於胞內產生GlcNAc。在下個步驟中，突變株進一步以質體或基因體敲入的方式進行修飾以持續表現來自麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)具有SEQ ID NO: 03的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶。根據實施例1中提供的培養條件，於成長實驗中對新穎菌株進行評估。表2顯示各突變株在全培養液樣品中LNB的產生(g/L)，於含有30g/L蔗糖的基本培養基進行72小時培養之後取樣。數據顯示兩種新穎菌株於全培養液樣品中產生LNB，不論N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶是以何種方式送至菌株。

表2：於含有30g/L蔗糖的基本培養基進行72小時培養之後從大腸桿菌突變株取樣的全培養液樣品中LNB的產生(g/L)

具有 SEQ ID NO: 03 的 N- 乙醯葡萄糖胺 β-1,3- 半乳糖基轉移酶的轉錄單位的表現	LNB (g/L)( ±標準差 )
以基因體敲入	0.63 (± 0.12)
以表現質體	2.81 (± 0.11)

實施例14：修飾大腸桿菌宿主中半乳糖化LNB的產生

如實施例1所述為了增強UDP-半乳糖產生而優化的大腸桿菌K-12 MG1655菌株額外以剔除大腸桿菌 nagB基因進行突變，且以質體或基因體敲入的方式進一步修飾以持續表現來自麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)具有SEQ ID NO: 03的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶。根據實施例1中提供的培養條件，兩種新穎菌株在成長實驗中進行評估時皆於全培養液樣品中產生LNB，其中培養基含有蔗糖。當產生LNB的新穎菌株額外以半乳糖基轉移酶的表現構築體進行轉形時，根據實施例1中提供的培養條件，各新穎菌株在成長實驗中進行評估時於全培養液樣品中產生GlcNAc與LNB以及半乳糖化LNB的形式，其中培養基含有蔗糖。

實施例15：突變大腸桿菌宿主中LacNAc的發酵產生

如實施例1所述為了GDP-岩藻糖產生而優化且經修飾以產生GlcNAc與LacNAc的大腸桿菌K-12 MG1655突變株於5L生物反應器規模的饋料批量(fed-batch)發酵中進行評估，上述修飾是透過基因體敲入glmS*54(與野生型glmS蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)與GNA1(UniProt ID P43577)的持續轉錄單位而進行。在此實施例中，蔗糖作為碳源。如實施例1所述，定時取樣並測量LacNAc的產生。

實施例16：當成長於蔗糖之外的碳源時修飾大腸桿菌宿主中LacNAc或LNB的產生

根據實施例1中提供的培養條件，如實施例9與10所述為了產生GlcNAc與LacNAc而修飾的大腸桿菌突變株以及如實施例13與14所述為了產生GlcNAc與LNB而修飾的大腸桿菌突變株在成長實驗中進行評估時可分別產生GlcNAc與LacNAc或GlcNAc與LNB，其中培養基含有甘油。當以生物反應器規模的饋料批量發酵進行評估時，如實施例1所述，所述突變株也可利用以下任一或多種碳源而分別GlcNAc與LacNAc或GlcNAc與LNB，但不限於以下碳源：甘油、葡萄糖、果糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖和甘露糖。

實施例17：啤酒酵母菌( Saccharomyces cerevisiae)中的材料與方法

培養基

菌株培養於合成界定(synthetic defined)酵母菌培養基，其具有全補充混合物(complete supplement mixture)(SD CSM)或含有6.7 g/L不含胺基酸的酵母氮鹼(YNB w/o AA, Difco)、20 g/L瓊脂 (Difco)(固體培養物)、22 g/L葡萄糖單水合物或 20 g/L乳糖和 0.79 g/L CSM 或 0.77 g/L CSM-Ura (MP Biomedicals)的CSM drop-out (SD CSM-Ura) 。

菌株

使用Brachmann等人(Yeast (1998) 14:115-32)產生的啤酒酵母菌BY4742，於Euroscarf培養收藏(Euroscarf culture collection)可取得。所有突變株皆由同源重組或使用Gietz (Yeast 11:355-360, 1995)的方法進行的質體轉形而產生。

質體

使用酵母菌表現質體p2a_2µ (Chan 2013, Plasmid 70, 2-17)以表現啤酒酵母菌的外來基因。此質體含有胺苄青黴素抗性基因和細菌複製起點，以便在大腸桿菌中進行選擇和維持。此質體進一步包含用於在酵母中進行選擇和維持的 2μ 酵母 ori 和 Ura3 選擇標記。在一實施例中，如WO1812225中所述，酵母菌表現質體p2a_2µ可經修飾以獲得來自大腸桿菌的果糖-6-磷酸胺基轉移酶glmS*54(與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、來自啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1、磷酸酶如任一或多種包括下列的大腸桿菌基因：aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU，或來自戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草桿菌的BsAraL。所述修飾的質體可經進一步的修飾以獲得選自包括以下的名單的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，及/或獲得選自包括以下的名單的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。

在產生GDP-岩藻糖的一實施例中，如p2a_2µ_Fuc (Chan 2013, Plasmid 70, 2-17)的酵母菌表現質體以乳糖通透酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶與GDP-L-岩藻糖合成酶的持續轉錄單位進行修飾，乳糖通透酶如來自乳酸克魯維酵母( K. lactis)的LAC12(UniProt ID P07921)、GDP-甘露糖4,6-脫水酶如來自大腸桿菌的gmd(UniProt ID P0AC88)，且GDP-L-岩藻糖合成酶如來自大腸桿菌的fcl(UniProt ID P32055)。酵母菌表現質體p2a_2µ_Fuc2可作為p2a_2µ_Fuc質體的替代表現質體，其於胺苄青黴素抗性基因旁包括細菌ori、2µ酵母菌ori與Ura3選擇標記及乳糖通透酶、岩藻糖通透酶與具有岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶活性的雙功能酵素的持續轉錄單位，乳糖通透酶如來自乳酸克魯維酵母( K. lactis)的LAC12(UniProt ID P07921)，岩藻糖通透酶如來自大腸桿菌的fucP(UniProt ID P11551)，具有岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶活性的雙功能酵素如來自脆弱類桿菌( Bacteroides fragilis)的fkp(UniProt ID SUV40286.1)。為了進一步產生岩藻糖化寡醣，p2a_2µ_Fuc及其變體p2a_2µ_Fuc2額外地包含α-1,2-岩藻醣基轉移酶及/或α-1,3-岩藻醣基轉移酶的持續轉錄單位，α-1,2-岩藻醣基轉移酶如來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1)，且α-1,3-岩藻糖基轉移酶如來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511)。

在產生UDP-半乳糖的一實施例中，酵母菌表現質體可衍生自pRS420質體系列(Christianson et al., 1992, Gene 110: 119-122)，pRS420質體系列含有HIS3選擇標記及UDP-葡萄糖-4-表異構酶(例如，來自大腸桿菌的galE(UniProt ID P09147))的持續轉錄單位。此質體可以乳糖通透酶與半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺轉移酶的持續轉錄單位進行進一步修飾以產生LN3，乳糖通透酶如來自乳酸克魯維酵母( K. lactis)的LAC12(UniProt ID P07921)，且半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺轉移酶如來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的lgtA (UniProt ID Q9JXQ6)。為了進一步產生如LNT且衍生自LN3的寡醣，產生LN3的突變株以N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。為了進一步產生如LNnT且衍生自LN3的寡醣，產生LN3的突變株以以N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。

在產生唾液酸與CMP-唾液酸的一實施例中，酵母菌表現質體可衍生自pRS420質體系列(Christianson et al., 1992, Gene 110: 119-122)，pRS420質體系列含有TRP1選擇標記以及一或多個拷貝的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、一磷酸酶、N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯神經胺酸合成酶與N-醯基神經胺酸胞苷酸轉移酶的持續轉錄單位，L- 麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶如來自大腸桿菌的突變glmS*54(如Deng(Biochimie 88, 419-29 (2006)等人所述，與野生型glmS蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)，如WO18122225中所述，磷酸酶如任一或多種包括下列的大腸桿菌基因：aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU，或來自戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草桿菌的BsAraL，N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶如卵形類桿菌( Bacteroides ovatus)的AGE(UniProt ID A7LVG6)，N-乙醯神經胺酸合成酶如來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis) (UniProt ID E0NCD4)，且N-醯基神經胺酸胞苷酸轉移酶如來自空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的NeuA酵素(UniProt ID Q93MP7)或來自多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的NeuA酵素(GenBank No. AMK07891.1)。視需要地，也添加包括一或多個拷貝的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶(例如，來自啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577))的持續轉錄單位。為了產生唾液酸化寡醣，質體進一步包括乳糖通透酶與一或多個拷貝的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶、及/或β-半乳糖苷α-2,8-唾液酸轉移酶的持續轉錄單位，乳糖通透酶如來自乳酸克魯維酵母( K. lactis)的LAC12(UniProt ID P07921)，且β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶如來自多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的PmultST3(UniProt ID Q9CLP3)或類PmultST3多肽，類PmultST3多肽由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1-268所組成，β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶如來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的NmeniST3(GenBank No. ARC07984.1)或多殺性巴氏桿菌亞種多殺性株Pm70( P. multocidasubsp. multocida str. Pm70)的PmultST2(GenBank No. AAK02592.1)，β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶如來自發光桿菌( Photobacterium damselae)的pdST6(UniProt ID O66375)或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的類pdST6多肽，或來自發光菌屬JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6(UniProt ID A8QYL1)，或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514所組成的類P-JT-ISH-224-ST6多肽，且β-半乳糖苷α-2,8-唾液酸轉移酶如來自小鼠( M. musculus) (UniProt ID Q64689)。

較佳但非必要，醣基轉移酶蛋白及/或參與核苷酸活化糖合成的蛋白在 N 端融合到 SUMOstar 標籤(例如，從 pYSUMOstar，Life Sensors，Malvern，PA獲得)以提高它們的溶解度。

視需要地，酵母菌突變株以敲入編碼伴護蛋白(chaperone)的持續轉錄單位而進行修飾，伴護蛋白如Hsp31、Hsp32、Hsp33、Sno4、Kar2、Ssb1、Sse1、Sse2、Ssa1、Ssa2、Ssa3、Ssa4、Ssb2、Ecm10、Ssc1、Ssq1、Ssz1、Lhs1、Hsp82、Hsc82、Hsp78、Hsp104、Tcp1、Cct4、Cct8、Cct2、Cct3、Cct5、Cct6或Cct7 (Gong et al., 2009, Mol. Syst. Biol. 5: 275)。

質體於購自Invitrogen的大腸桿菌DH5alpha宿主(F ^-, phi80d lacZdeltaM15，delta( lacZYA- argF)U169， deoR， recA1， endA1，hsdR17(rk ^-，mk ⁺)， phoA， supE44，lambda ^-， thi-1， gyrA96， relA1)中維持。

異源與同源表現

需要表達的基因，無論是來自質體還是來自基因體，都由以下其中一間公司所合成：DNA2.0、Gen9、IDT或Twist Bioscience。

透過針對表現宿主的密碼子使用而進行密碼子使用的優化，可以進一步促進表現。使用供應商的工具對基因進行優化。

培養條件

一般而言，酵母菌株起初在 SD CSM 盤上生長以獲得單一菌落。這些盤在 30℃下生長 2-3 天。

從單一菌落開始，於30℃下以5mL成長預培養物隔夜，以200rpm的速度搖晃。接著，125mL搖瓶實驗於25mL培養基中接種2%的預培養物。這些搖瓶以200rpm的迴轉式震盪且於30℃下進行培養。

基因表現啟動子

如Blazeck所述，使用合成持續啟動子表現基因(Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, No. 11, 2012)。

實施例18：於啤酒酵母菌中產生GlcNAc及LacNAc或GlcNAc及LNB

另一實施例提供啤酒酵母形式的真核生物進行本發明的用途。使用如實施例17所述的菌株、質體與方法，製造出產生GlcNAc與LacNAc的啤酒酵母菌突變株。這些修飾包括加成大腸桿菌的突變果糖-6-磷酸胺基轉移酶glmS*54(與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1 (UniProt ID P43577)、選自包括下列任一或多種大腸桿菌基因的名單的一種磷酸酶：aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU，或如WO18122225中所述，來自戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草桿菌的BsAraL以及N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續表現單位，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。啤酒酵母菌突變株可以葡萄糖或甘油作為碳源而成長，將碳源轉變成果糖-6-磷酸，接著以新穎表現的果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶將果糖-6-磷酸轉變成GlcNAc，且接著轉變成LacNAc。

如實施例17所述，所述菌株的預培養物於含有22g/L葡萄糖的5mL合成定義培養基SD-CSM製作並於30℃之下成長。接著，此培養物接種於搖瓶中25mL的培養基，其含有10g/L葡萄糖作為僅有的碳源，並於30℃之下成長。如實施例1所述，定期取樣且測量GlcNAc與LacNAc的產生。

在相似的培養實驗中，包含N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶而非N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的相似酵母菌株可產生GlcNAc與LNB，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。

實施例19：半乳糖化雙醣或寡醣的酵素產生

另一實施例提供本發明的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶在合成半乳糖化雙醣或寡醣的用途。這些酵素於例如但不限於PURExpress系統(PURExpress system, NEB)的無細胞表現系統中或於例如但不限於大腸桿菌或啤酒酵母菌的宿主生物中產生，之後可分離上述所列酵素且視需要地進一步純化。

選自上述酵素萃取物或純化酵素的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶與UDP-半乳糖及如Tris-HCl或HEPES的緩衝成分及GlcNAc、GalNAc或含有非還原(端)GlcNAc或GalNAc作為接受者的雙醣或寡醣添加至反應混合物。接著，所述反應混合物於特定溫度下(例如，37℃)培養一段特定時間(例如，24小時)，期間接受者將半乳糖化至GlcNAc或GalNAc。接著，利用本領域習知的方法從反應混合物分離製得的半乳糖化雙醣或寡醣。較佳的是，可進行半乳糖化雙醣或寡醣進一步的純化步驟。在反應的終點或分離及/或純化步驟之後，如實施例1所述，測量半乳糖化雙醣或寡醣的產生。

實施例20：具有PFAM結構域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶基因的RegEx檢索

進行具有PFAM結構域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶基因的RegEx分析，以找出包括具有SEQ ID NO: 1的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD的成員，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17，或者，包括具有SEQ ID NO: 2的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]的成員，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17且m為100至115。為此，於Pfam 33.1版本的Pfam資料庫(於2020年6月11日釋出)中註解具有PFAM結構域PF00535的所有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶基因從UniProt資料庫(於2020年7月3日釋出)下載，並根據https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2(於2019年4月6日釋出)中的方法分析所述模體(motif)的存在。來自所述RegEx檢索的對應成員包括A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3。

實施例21：其他N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因的RegEx檢索

針對具有PFAM結構域IPR002659的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶基因，可進行與實施例20中例示相似的RegEX分析以找出包括具有SEQ ID NO: 5的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，非A、G、S)(X _p)(X，非F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至16、m為35至70且p為20至45。為此，於Pfam 33.1版本的Pfam資料庫(於2020年6月11日釋出)中註解具有PFAM結構域IPR002659的所有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶基因從UniProt資料庫(於2020年7月3日釋出)下載，並根據https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2(於2019年4月6日釋出)中的方法分析所述模體(motif)的存在。

同樣地，可針對具有PFAM結構域PF01755的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因進行RegEX分析，以找出包括具有SEQ ID NO: 10的序列EXXCXXSHX[AFILTY]LW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75，或包括具有SEQ ID NO: 11的序列EXXCXXSH[LR]VLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75，或包括具有SEQ ID NO: 12的序列EXXCXXSH[VHI]SLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75，或包括具有SEQ ID NO: 13的序列EXXCXXSHYMLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75，或包括具有SEQ ID NO: 14的序列EXXCXXSHXX(X，非V)Y(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75。為此，於Pfam 33.1版本的Pfam資料庫(於2020年6月11日釋出)中註解具有PFAM結構域PF01755的所有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因從UniProt資料庫(於2020年7月3日釋出)下載，並根據https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2 (於2019年4月6日釋出)中的方法分析所述模體(motif)的存在。

也可針對具有PFAM結構域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因進行RegEX分析，以找出包括具有SEQ ID NO: 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75且m為10至30，或包括具有SEQ ID NO: 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75、m為10至30且p為20至25。為此，於Pfam 33.1版本的Pfam資料庫(於2020年6月11日釋出)中註解具有PFAM結構域PF00535的所有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因從UniProt資料庫(於2020年7月3日釋出)下載，並根據https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2 (於2019年4月6日釋出)中的方法分析所述模體(motif)的存在。

也可針對具有PFAM結構域PF02709且非PFAM結構域PF00535的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因進行RegEX分析，以找出包括具有SEQ ID NO: 28的序列[FWY]XX[FWY](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D的成員，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是IP或NL的組合，且其中n為21至26。為此，於Pfam 33.1版本的Pfam資料庫(於2020年6月11日釋出)中註解具有PFAM結構域PF02709且非PFAM結構域PF00535的所有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因從UniProt資料庫(於2020年7月3日釋出)下載，並根據https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2 (於2019年4月6日釋出)中的方法分析所述模體(motif)的存在。

最後，可針對具有PFAM結構域PF03808的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因進行RegEX分析，以找出包括具有SEQ ID NO: 35的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25，或包括具有SEQ ID NO: 36的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]的成員，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25、m為40至50且p為22至30。為此，於Pfam 33.1版本的Pfam資料庫(於2020年6月11日釋出)中註解具有PFAM結構域PF03808的所有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因從UniProt資料庫(於2020年7月3日釋出)下載，並根據https://towardsdatascience.com/using-regular-expression-in-genetics-with-python-175e2b9395c2 (於2019年4月6日釋出)中的方法分析所述模體(motif)的存在。

實施例22：以修飾的大腸桿菌宿主產生包括6’-SL、LacNAc、唾液酸化LacNAc、LN3、唾液酸化LN3、LNnT與LSTc的寡醣混合物

如實施例1所述對大腸桿菌K12菌株MG1655進行修飾以產生唾液酸，包括剔除大腸桿菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、nanK、LacZ、LacY與LacA基因及基因體敲入持續轉錄單位，持續轉錄單位包括編碼以下的基因：大腸桿菌的乳糖通透酶(LacY)(UniProt ID P02920)、大腸桿菌的唾液酸運輸蛋白(nanT)(UniProt ID P41036)、大腸桿菌的突變L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶glmS*54(與野生型glms蛋白(Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶(GNA1)(UniProt ID P43577)、卵形類桿菌( Bacteroides ovatus)的N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶(AGE)(UniProt ID A7LVG6)、空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的N-乙醯神經胺酸合成酶(NeuB)(UniProt ID Q93MP9)、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶(Frk)(UniProt ID Q03417)、及青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)。所獲得產生唾液酸的大腸桿菌突變株以基因體敲入持續轉錄單位進行進一步修飾，以表現空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的N-醯基神經胺酸胞苷轉移酶酵素NeuA(UniProt ID Q93MP7)與發光桿菌( Photobacterium damselae)的α-2,6-唾液酸轉移酶PdbST (UniProt ID O66375)，進而產生6’-唾液酸乳糖。在下個步驟中，突變株以基因體敲入腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶lgtA(UniProt ID Q9JXQ6)及N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位而進行進一步修飾以產生包含6’-SL、LacNAc、唾液酸化LacNAc、LN3、唾液酸化LN3、LNnT與LSTc (Neu5Ac-α2,6-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)的寡醣混合物，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。新穎菌株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中進行評估，其中培養基含有蔗糖與乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培養72小時後，收集培養液，以UPLC分析糖類。

實施例23：以修飾的大腸桿菌宿主產生包括LN3、唾液酸化LN3、LNT、LNB、唾液酸化LNB、3’-SL與LSTa的寡醣混合物

如實施例22所述為了產生唾液酸(Neu5Ac)而修飾的大腸桿菌菌株以基因體敲入持續轉錄單位而進行進一步修飾，以表現空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的N-醯基神經胺酸胞苷轉移酶酵素NeuA(UniProt ID Q93MP7)與多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的α-2,3-唾液酸轉移酶PmultST3(UniProt ID Q9CLP3)，進而產生3’-唾液酸乳糖。在下個步驟中，突變株以基因體敲入腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶lgtA(UniProt ID Q9JXQ6)及N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位而進行進一步修飾以產生包含LN3、3’-唾液酸化LN3 (Neu5Ac-α2,3-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)、LNT、LNB、唾液酸化LNB、3’-SL與LSTa (Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)的寡醣混合物，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。新穎菌株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中進行評估，其中培養基含有蔗糖與乳糖。菌株在96孔盤中以四個生物學重複生長。培養72小時後，收集培養液，以UPLC分析糖類。

實施例24：修飾大腸桿菌宿主中岩藻糖化LNB形式的產生

如實施例1所述為了產生GDP-岩藻糖產生與於蔗糖中成長而優化的大腸桿菌K-12 MG1655突變株以剔除大腸桿菌 nagA與 nagB基因及基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體而進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。在下個步驟中，以表現載體對所述突變株細胞進行轉形，表現載體包括大腸桿菌突變glms*54(與Uniprot ID P17169的野生型大腸桿菌glms蛋白不同在於A39T、R250C與G472S突變)與啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)的持續轉錄單位。在下一個步驟中，新穎菌株以第二兼容表現載體進行轉形，第二兼容表現載體包括α-1,2-岩藻醣基轉移酶HpFutC(GenBank No. AAD29863.1)及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT(UniProt ID O30511)的持續轉錄單位。新穎菌株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中評估GlcNAc、LNB與岩藻糖化LNB形式(2’FLNB、4’FLNB及/或雙岩藻糖化LNB)的產生，其中培養基含有蔗糖。

實施例25：修飾大腸桿菌宿主中岩藻糖化LNB與乳糖形式的產生

如實施例24所述的大腸桿菌突變株可以基因體剔除大腸桿菌基因 galT 、 ushA 、 ldhA 、 LacZ 、 LacY與 LacA及基因體敲入大腸桿菌乳糖通透酶LacY(UniProt ID P02920)的持續轉錄單位而進行進一步修飾。

當所述新穎突變株在根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中培養，其中培養基含有蔗糖與乳糖，可對菌株評估GlcNAc、LNB與岩藻糖化LNB與乳糖形式的產生，岩藻糖化LNB與乳糖形式如2’-FLNB、4-FLNB、2’FL、3-FL及/或DiFL。

實施例26：修飾大腸桿菌宿主中包含岩藻糖化結構的中性寡醣混合物的產生

如實施例1所述為了產生GDP-岩藻糖產生與於蔗糖中成長而優化的大腸桿菌K-12 MG1655突變株以剔除大腸桿菌 nagA與 nagB基因及基因體敲入腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶lgtA (GenBank: AAM33849.1)與N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體而進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。在下個步驟中，以表現載體對所述突變株細胞進行轉形，表現載體包括大腸桿菌突變glms*54(與Uniprot ID P17169的野生型大腸桿菌glms蛋白不同在於A39T、R250C與G472S突變)與啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)的持續轉錄單位。在下一個步驟中，新穎菌株以第二兼容表現載體進行轉形，第二兼容表現載體包括α-1,2-岩藻醣基轉移酶HpFutC(GenBank No. AAD29863.1)的持續轉錄單位。

所述新穎突變株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中評估中性寡醣混合物的產生，其中培養基含有蔗糖與乳糖，中性寡醣混合物包括LNB、岩藻糖化LNB、2’FL、DiFL、LN3 (乳糖-N-丙糖)、LNT (乳糖-N-丁糖)與LNFP-I (乳糖-N-岩藻戊糖I，Fuc-α1,2-Gal-β1,3-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)。

實施例27：修飾大腸桿菌宿主中包含岩藻糖化結構的中性寡醣混合物的產生

如實施例1所述為了產生GDP-岩藻糖產生與於蔗糖中成長而優化的大腸桿菌K-12 MG1655突變株以剔除大腸桿菌 nagA與 nagB基因及基因體敲入腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶lgtA (GenBank: AAM33849.1)與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體而進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。在下個步驟中，以表現載體對所述突變株細胞進行轉形，表現載體包括大腸桿菌突變glms*54(與Uniprot ID P17169的野生型大腸桿菌glms蛋白不同在於A39T、R250C與G472S突變)與啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)的持續轉錄單位。在下一個步驟中，新穎菌株以第二兼容表現載體進行轉形，第二兼容表現載體包括α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT(UniProt ID O30511)的持續轉錄單位。

所述新穎突變株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中評估中性寡醣混合物的產生，其中培養基含有蔗糖與乳糖，中性寡醣混合物包括LacNAc、岩藻糖化LacNAc、3-FL、LN3 (乳糖-N-丙糖)、LNnT (乳糖-N-丁糖)與LNFP-III (乳糖-N-岩藻戊糖III，Gal-β1,4-(Fuc-α1,3)-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)。

實施例28：修飾大腸桿菌宿主中LacNAc與3-FLN的產生

如實施例1所述為了產生GDP-岩藻糖產生與於蔗糖中成長而於優化的大腸桿菌K-12 MG1655突變株以剔除大腸桿菌 nagA與 nagB基因及基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體而進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。在下個步驟中，以表現載體對所述突變株細胞進行轉形，表現載體包括大腸桿菌突變glms*54(與Uniprot ID P17169的野生型大腸桿菌glms蛋白不同在於A39T、R250C與G472S突變)與啤酒酵母菌的GNA1(UniProt ID P43577)的持續轉錄單位。在下一個步驟中，新穎菌株以第二兼容表現載體進行轉形，第二兼容表現載體包括α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT(UniProt ID O30511)的持續轉錄單位。所述新穎突變株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中評估GlcNAc、LacNAc與3-FLN(Gal-β1,4-(Fuc-α1,3)-GlcNAc)的產生，其中培養基含有蔗糖。

實施例29：修飾大腸桿菌宿主中T-雙醣(Gal-β1,3-GalNAc)的產生

如實施例1所述，為了增加UDP-半乳糖的產生，以基因體剔除大腸桿菌 ushA與 galT基因及基因體敲入大腸桿菌UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)的持續表現構築體對大腸桿菌K12 MG1655菌株進行優化。在下個步驟中，透過剔除大腸桿菌 nagB基因及基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體來額外突變菌株，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09。新穎突變株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中進行培養時評估T-雙醣(Gal-β1,3-GalNAc)的產生，其中培養基含有葡萄糖與GalNAc。

實施例30：修飾大腸桿菌宿主中Gal-β1,4-GalNAc的產生

如實施例1所述，為了增加UDP-半乳糖的產生，以基因體剔除大腸桿菌 ushA與 galT基因及基因體敲入大腸桿菌UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)的持續表現構築體對大腸桿菌K12 MG1655菌株進行優化。在下個步驟中，透過剔除大腸桿菌 nagB基因及基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體來額外突變菌株，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39。在最終步驟中，突變株透過基因體敲入持續轉錄單位而適應成長於蔗糖中，持續轉錄單位包含大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白CscB(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶Frk(UniProt ID Q03417)與青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶BaSP(UniProt ID A0ZZH6)。新穎菌株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中進行培養時評估Gal-β1,4-GalNAc的產生，其中培養基含有蔗糖與GalNAc。

實施例31：修飾大腸桿菌宿主中LN3與LNT的產生

如實施例1所述，修飾大腸桿菌K12 MG1655菌株，包括剔除大腸桿菌nagB、galT、ushA、agp、ldhA、LacZ、LacY與LacA基因及基因體敲入持續轉錄單位，持續轉錄單位包含編碼大腸桿菌的乳糖通透酶(LacY)(UniProt ID P02920)、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶(Frk)(UniProt ID Q03417)與青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)的基因。在下個步驟中，大腸桿菌突變株以基因體敲入腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶lgtA (GenBank: AAM33849.1)的持續轉錄單位來進行修飾以產生LN3。在下個步驟中，突變株大腸桿菌突變株以基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行修飾以產生LNT，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。新穎菌株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中評估LN3與LNT的產生，其中培養基含有30g/L的蔗糖與20g/L的乳糖。菌株於96孔盤中以四個生物重複成長。接種72小時之後，收集培養液，且以UPLC分析糖類。

實施例32：修飾大腸桿菌宿主中的LN3與LNnT的產生

如實施例1所述，修飾大腸桿菌K12 MG1655菌株，包括剔除大腸桿菌nagB、galT、ushA、agp、ldhA、LacZ、LacY與LacA基因及基因體敲入持續轉錄單位，持續轉錄單位包含編碼大腸桿菌的乳糖通透酶(LacY)(UniProt ID P02920)、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶(Frk)(UniProt ID Q03417)與青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)。在下個步驟中，大腸桿菌突變株以基因體敲入腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶lgtA (GenBank: AAM33849.1)的持續轉錄單位來進行修飾以產生LN3。在下個步驟中，突變株大腸桿菌突變株以基因體敲入N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行修飾以產生LNT，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。新穎菌株於根據實施例1提供的培養條件的成長實驗中評估包含LN3、LNnT、乳糖-N-新己糖(lacto-N-neohexaose, LNnH)與對-乳糖-N-新己糖(para-lacto-N-neohexaose, pLNH)的醣類產生，其中培養基含有30g/L的蔗糖與20g/L的乳糖。菌株於96孔盤中以四個生物重複成長。接種72小時之後，收集培養液，且以UPLC分析糖類。

實施例33：枯草桿菌的材料與方法

培養基

使用兩種不同的培養基，名為高營養Luria培養基(Luria Broth, LB)與搖瓶基本培養基(minimal medium for shake flask, MMsf)。基本培養基使用了微量元素混合物。

微量元素混合物由0.735 g/L CaCl ₂‧2H ₂O、0.1 g/L MnCl ₂‧2H ₂O、0.033 g/L CuCl ₂‧2H ₂O、0.06 g/L CoCl ₂‧6H ₂O、0.17 g/L ZnCl ₂、0.0311 g/L H ₃BO ₄、0.4 g/L Na ₂EDTA‧2H ₂O與0.06 g/L Na ₂MoO ₄所組成。檸檬酸鐵溶液包含0.135 g/L FeCl ₃‧6H ₂O與1 g/L 檸檬酸鈉(Hoch 1973 PMC1212887)。

Luria培養基由由1%胰蛋白腖(tryptone peptone)(Difco, Erembodegem, Belgium)、0.5%酵母萃取物(Difco)與0.5%氯化鈉(VWR. Leuven, Belgium)所組成。Luria培養基瓊脂盤(agar plate)由LB培養基所組成，且添加12g/L的瓊脂(Difco, Erembodegem, Belgium)。

搖瓶實驗的基本培養基含有2.00 g/L (NH ₄) ₂SO ₄、7.5 g/L KH ₂PO ₄、17.5 g/L K ₂HPO ₄、1.25 g/L檸檬酸鈉、0.25 g/L MgSO ₄‧7H ₂O、0.05 g/L 色胺酸、10至30 g/L 葡萄糖或另一碳源、10m/L微量元素混合物及10m/L檸檬酸鐵溶液，另一碳源包括但不限於實施例中所指明的果糖、麥芽糖、蔗糖、甘油與麥芽三糖。培養基的pH以1M KOH調整為7。取決於實驗，可添加唾液酸或乳糖作為前驅物。

如LB的複合培養基可透過高壓蒸氣滅菌法(autoclaving)(121℃，21’)來滅菌，且基本培養基可透過過濾(0.22μm，Satorious)來滅菌。若有需要，添加抗生素(例如，吉歐黴素(zeocin)(20mg/L))使培養基成為選擇性的。

菌株、質體及突變

枯草桿菌168(Bacillus subtilis 168)，可於桿菌遺傳儲存中心(Bacillus Genetic Stock Center (Ohio, USA))獲得。

透過Cre/lox的基因缺失質體如Yan等人(Appl. & Environm. Microbial., Sept 2008, p5556-5562)所述進行建構。基因破壞(gene disruption)如Xue等人(J. Microb. Meth. 34 (1999) 183-191)所述透過線性DNA的同源重組及電穿孔的轉形而完成。Liu等人(Metab. Engine. 24 (2014) 61-69)描述了基因剔除的方法。此方法使用了目標基因1000bp同源的上下游。

使用Popp等人(Sci. Rep., 2017, 7, 15158)所述的整合載體(integrative vector)作為表現載體，且若有需要可更用於基因體整合。表現合適的啟動子可衍生自局部儲存庫(part repository)(iGem)：序列id: Bba_K143012、Bba_K823000、Bba_K823002或Bba_K823003。可使用Gibson組裝法、Golden Gate組裝法、Cliva 組裝法、LCR或限制接合(restriction ligation)來進行選殖(cloning)。

在製造LNB的一實施例中，枯草桿菌突變株以基因體敲入大腸桿菌的突變glmS*54(如Deng等人(Biochimie 88, 419-29 (2006)所述，與野生型glms蛋白(具有Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1、磷酸酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行修飾，磷酸酶選自包含一或多種下列大腸桿菌基因的名單：aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU，或如WO1812225所述，來自戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、來自啤酒酵母菌的DOG1或來自枯草桿菌的AraL，且N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。

在產生LacNAc的一實施例中，枯草桿菌突變株以基因體敲入大腸桿菌的突變glmS*54(如Deng等人(Biochimie 88, 419-29 (2006)所述，與野生型glms蛋白(具有Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1、磷酸酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行修飾，磷酸酶選自包含一或多種下列大腸桿菌基因的名單：aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU，或如WO1812225所述，來自戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、來自啤酒酵母菌的DOG1或來自枯草桿菌的AraL，且N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。為了進一步岩藻糖化所述LNB或LacNAc，產生LNB或LacNAc的菌株以α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511))的持續轉錄單位而進行進一步修飾。

在產生乳糖基寡醣的實施例中，製造枯草桿菌突變株使其含有編碼乳糖輸入蛋白(例如，大腸桿菌lacY(UniProt ID P02920))的基因。α-1,2-岩藻糖基轉移酶及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶的表現構築體額外添加至菌株以產生2’FL、3FL與diFL。

在產生乳糖-N-丙糖(LNT-II, LN3, GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)的實施例中，枯草桿菌菌株以基因體敲入包含乳糖輸入蛋白(例如，大腸桿菌lacY(UniProt ID P02920))與半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶(例如，腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的LgtA (GenBank: AAM33849.1))的持續轉錄單位來進行修飾。對於產生LNT而言，產生LN3的菌株以N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽，可透過基因體敲入或從表現質體送入菌株。對於產生LNnT而言，產生LN3的菌株以N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。為了進一步岩藻糖化所述的LN3、LNT與LNnT，突變株以α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511))的持續轉錄單位而進行進一步修飾。

在產生唾液酸的實施例中，透過過度表現天然果糖-6-P-胺基轉移酶(UniProt ID P0CI73)來產生枯草桿菌突變株，以增加胞內葡萄糖胺-6-磷酸的含量。再者，透過基因剔除來破壞基因nagA、nagB與gamA的酵素活性，且啤酒酵母菌的葡萄糖胺-6-P-胺基轉移酶(UniProt ID P43577)、卵形類桿菌( Bacteroides ovatus)的N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶(UniProt ID A7LVG6)與空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的N-乙醯神經胺酸合成酶(UniProt ID Q93MP9)於基因體過度表現。為了能夠產生唾液酸化寡醣，產生唾液酸的菌株以表現構築體來進行進一步修飾，表現構築體包括N-醯基神經胺酸胞苷轉移酶(例如，來自空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的NeuA酵素(UniProt ID Q93MP7)、來自流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)的NeuA酵素(GenBank No. AGV11798.1)或來自多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的NeuA酵素(GenBank No. AMK07891.1))，以及一或多個拷貝的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶及/或α-2,8-唾液酸轉移酶，β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶如來自多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的PmultST3(UniProt ID Q9CLP3)，或由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的類PmultST3多肽、或來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的NmeniST3(GenBank No. ARC07984.1)或多殺性巴氏桿菌亞種多殺性株Pm70( P. multocidasubsp. multocida str. Pm70)的PmultST2(GenBank No. AAK02592.1)，β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶如來自發光桿菌( Photobacterium damselae)的pdST6(UniProt ID O66375)或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的類pdST6多肽，或來自發光菌屬JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6(UniProt ID A8QYL1)，或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514所組成的類P-JT-ISH-224-ST6多肽，且β-半乳糖苷α-2,8-唾液酸轉移酶如來自小鼠( M. musculus) (UniProt ID Q64689)。在產生乳糖基唾液酸化寡醣的實施例中，枯草桿菌突變株以乳糖輸入蛋白(例如，大腸桿菌lacY(UniProt ID P02920))的持續轉錄單位來進一步修飾。

為了於蔗糖中成長，突變株可以基因體敲入包含大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶(Frk)(UniProt ID Q03417)與青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)的持續轉錄單位進行額外修飾。

異源與同源表現

需要表達的基因，無論是來自質體還是來自基因體，都由以下其中一間公司所合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。

透過針對表現宿主的密碼子使用而進行密碼子使用的優化，可以進一步促進表現。使用供應商的工具對基因進行優化。

培養條件

96孔微孔盤實驗的預培養始於冷凍養品管或來自LB盤的單一菌落，150µL LB 中，並於 37℃下以 800 rpm 在迴轉式振盪器上培養隔夜。此培養物作為96孔方型微孔盤的接種物，以400µL MMsf培養基稀釋400x。每個菌株成長於96孔盤的多孔中作為生物重複。接著，此最終96培養盤於 37℃下以 800 rpm 在迴轉式振盪器上培養72小時，或更短或更長的時間。在培養實驗的終點，從各孔取樣以測量上清液濃度(胞外糖濃度，將細胞離心5分鐘後)，或將細胞離心之前於90℃下加熱培養液15分鐘或於60℃下加熱培養液60分鐘(=全培養液濃度，胞內與胞外糖濃度，如本文所定義)。

此外，製作培養物的稀釋品以於600nm測量光學密度。以寡醣濃度除以生物量來決定細胞性能指標(cell performance index, CPI)，並以與參考菌株相比的相對百分比呈現。生物量根據經驗是決定為600nm下所測量光學密度的約1/3。

實施例34：以修飾枯草桿菌菌株產生2’FLNB

枯草桿菌先透過基因體剔除nagB、glmS與gamA基因及基因體敲入持續轉錄單位而進行修飾以產生LNB且成長於蔗糖中，持續轉錄單位包括編碼天然果糖-6-P-胺基轉移酶(UniProt ID P0CI73)、大腸桿菌的突變glmS*54(如Deng等人(Biochimie 88, 419-29 (2006)所述，與野生型glms蛋白(具有Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1(UniProt ID P43577)、枯草桿菌的磷酸酶AraL(UniProt ID P94526)、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶(Frk)(UniProt ID Q03417)、以及青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)的基因，其中N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。在下個步驟中，產生LNB的菌株以包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))的持續轉錄單位的表現質體進行轉形。

新穎菌株於根據實施例33提供的培養條件的MMsf培養基成長實驗中評估2’FLNB的產生，其中MMsf培養基缺少前驅物。培養72小時之後，收集培養液，且以UPLC分析糖類。

實施例35：以修飾枯草桿菌菌株產生包括6’-SL、LacNAc、唾液酸化LacNAc、LN3、唾液酸化LN3、LNnT與LSTc的寡醣混合物

在第一步驟中，枯草桿菌菌株以基因剔除nagA、nagB與gamA基因及基因體敲入持續轉錄單位而進行修飾以產生唾液酸，持續轉錄單位包括編碼然果糖-6-P-胺基轉移酶(UniProt ID P0CI73)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1(UniProt ID P43577)、來自卵形類桿菌( Bacteroides ovatus)的N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶(UniProt ID A7LVG6)、以及來自腦膜炎雙球菌空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的N-乙醯神經胺酸合成酶(UniProt ID Q93MP9)的基因。在下個步驟中，突變株以基因體剔除包含編碼空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的N-醯基神經胺酸胞苷轉移酶酵素NeuA(UniProt ID Q93MP7)與發光桿菌( Photobacterium damselae)的α-2,6-唾液酸轉移酶pdbST(UniProt ID O66375)基因的持續轉錄單位而進行進一步修飾以產生6’-唾液酸乳糖。在下個步驟中，突變株以基因體敲入腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶lgtA(UniProt ID Q9JXQ6)及N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位而進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。新穎菌株於根據實施例33提供的培養條件的MMsf培養基成長實驗中評估包括6’-SL、LacNAc、唾液酸化LacNAc、LN3、唾液酸化LN3、LNnT與LSTc (Neu5Ac-α2,6-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)的寡醣混合物的產生，其中MMsf培養基含有乳糖作為前驅物。培養72小時之後，收集培養液，且以UPLC分析糖類。

實施例36：以修飾枯草桿菌產生Gal-β1,4-GalNAc

枯草桿菌菌株以基因體敲入大腸桿菌UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白CscB(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶Frk(UniProt ID Q03417)、以及青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶BaSP(UniProt ID A0ZZH6)的持續表現構築體而進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。新穎菌株於根據實施例33提供的培養條件的成長實驗中進行培養時評估Gal-β1,4-GalNAc的產生，其中培養基含有蔗糖與GalNAc。

實施例37：以修飾枯草桿菌產生Gal-β1,3-GalNAc

枯草桿菌菌株以基因體敲入UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白CscB(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶Frk(UniProt ID Q03417)、以及青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶BaSP(UniProt ID A0ZZH6)的持續表現構築體而進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。新穎菌株於根據實施例33提供的培養條件的成長實驗中進行培養時評估Gal-β1,3-GalNAc的產生，其中培養基含有蔗糖與GalNAc。

實施例38：麩胺酸棒狀桿菌( Corynebacterium glutamicum)的材料與方法

培養基

使用兩種不同的培養基，名為高營養Luria胰腖-酵母萃取物(tryptone-yeast extract, TY)培養基與搖瓶基本培養基(minimal medium for shake flask, MMsf)。基本培養基使用了1000x原液(stock)微量元素混合物。

微量元素混合物由10 g/L CaCl ₂、10 g/L FeSO ₄‧7H ₂O、10 g/L MnSO ₄‧H ₂O、1 g/L ZnSO ₄‧7H ₂O、0.2 g/L CuSO ₄、0.02 g/L NiCl ₂‧6H ₂O、0.2 g/L 生物素(biotin) (pH 7.0)與0.03 g/L 兒茶酸(protocatechuic acid)所組成。

搖瓶實驗的基本培養基含有20 g/L (NH ₄) ₂SO ₄、5 g/L 尿素、1 g/L KH ₂PO ₄、1 g/L K ₂HPO ₄、0.25 g/L MgSO ₄‧7H ₂O、42 g/L MOPS、10至30 g/L 葡萄糖或另一碳源、以及1m/L微量元素混合物，另一碳源包括但不限於實施例中所指明的果糖、麥芽糖、蔗糖、甘油與麥芽三糖。取決於實驗，可添加乳糖及/或唾液酸作為前驅物。

TY培養基由1.6%胰腖(Difco, Erembodegem, Belgium)、1%酵母萃取物(Difco)及0.5%氯化鈉(VWR. Leuven, Belgium)所組成。TY瓊脂(TY agar, TYA)由TY培養基所組成並添加12g/L的瓊脂(Difco, Erembodegem, Belgium)。

如TY的複合培養基可透過高壓蒸氣滅菌法(autoclaving)(121℃，21’)來滅菌，且基本培養基可透過過濾(0.22μm，Satorious)來滅菌。若有需要，添加抗生素(例如，康黴素(kanamycin)、胺苄青黴素(ampicillin))使培養基成為選擇性的。

菌株與突變

麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，可於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得。

建構如Suzuki等人(Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005 Apr, 67(2):225-33)所述基於Cre/loxP技術的整合質體載體以及如Okibe等人(Journal of Microbiological Methods 85, 2011, 155-163)所述的溫敏穿梭載體(temperature-sensitive shuttle vectors)以用於基因缺失、突變與插入。適用於(異源)基因表現啟動子可衍生自Yim等人(Biotechnol. Bioeng., 2013 Nov, 110(11):2959-69)。可使用Gibson組裝法、Golden Gate組裝法、Cliva 組裝法、LCR或限制接合(restriction ligation)來進行選殖(cloning)。

在製造LNB的一實施例中，麩胺酸棒狀桿菌菌株以基因體敲入包含大腸桿菌的突變glmS*54(如Deng等人(Biochimie 88, 419-29 (2006)所述，與野生型glms蛋白(具有Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1(UniProt ID P43577)、磷酸酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行修飾，磷酸酶選自包含任一或多種下列大腸桿菌基因的名單：aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU，或如WO1812225所述，來自戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草桿菌的BsAraL，且N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。

在產生LacNAc的一實施例中，麩胺酸棒狀桿菌菌株以基因體敲入包含大腸桿菌的突變glmS*54(如Deng等人(Biochimie 88, 419-29 (2006)所述，與野生型glms蛋白(具有Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1(UniProt ID P43577)、磷酸酶與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行修飾，磷酸酶選自包含一或多種下列大腸桿菌基因的名單：aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG與YbiU，或如WO1812225所述，來自戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的PsMupP、來自啤酒酵母菌的ScDOG1或來自枯草桿菌的BsAraL，且N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。為了進一步岩藻糖化所述LNB或LacNAc，產生LNB或LacNAc的菌株以α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511))的持續轉錄單位而進行進一步修飾。

在產生乳糖基寡醣的實施例中，製造麩胺酸棒狀桿菌突變株使其含有編碼乳糖輸入蛋白(例如，大腸桿菌lacY(UniProt ID P02920))的基因。α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511))額外添加至菌株以產生2’FL、3FL與diFL。

在產生乳糖-N-丙糖(LNT-II, LN3, GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc)的實施例中，麩胺酸棒狀桿菌菌株以基因體敲入包含乳糖輸入蛋白(例如，大腸桿菌lacY(UniProt ID P02920))與半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶(例如，腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的LgtA (GenBank: AAM33849.1))的持續轉錄單位來進行修飾。對於產生LNT而言，產生LN3的菌株以N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽，可透過基因體敲入或從表現質體送入菌株。對於產生LNnT而言，產生LN3的菌株以N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續轉錄單位來進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。為了進一步岩藻糖化所述的LN3、LNT或LNnT，突變株以α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511))的持續轉錄單位而進行進一步修飾。

在產生唾液酸的實施例中，透過過度表現天然果糖-6-P-胺基轉移酶(UniProt ID Q8NND3)來產生麩胺酸棒狀桿菌突變株，以增加胞內葡萄糖胺-6-磷酸的含量。再者，透過基因剔除來破壞麩胺酸棒狀桿菌基因ldh、cgl2645、nagB、 gamA與nagA的酵素活性，且啤酒酵母菌的葡萄糖胺-6-P-胺基轉移酶(UniProt ID P43577)、卵形類桿菌( Bacteroides ovatus)的N-乙醯葡萄糖胺-2-表異構酶(UniProt ID A7LVG6)與空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的N-乙醯神經胺酸合成酶(UniProt ID Q93MP9)於基因體過度表現。為了能夠產生唾液酸化寡醣，產生唾液酸的菌株以表現構築體來進行進一步修飾，表現構築體包括N-醯基神經胺酸胞苷轉移酶(例如，來自空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的NeuA酵素(UniProt ID Q93MP7)、來自流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)的NeuA酵素(GenBank No. AGV11798.1)或來自多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的NeuA酵素(GenBank No. AMK07891.1))，以及一或多個拷貝的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶及/或α-2,8-唾液酸轉移酶，β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶如來自多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)的PmultST3(UniProt ID Q9CLP3)，或由具有β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID Q9CLP3的胺基酸殘基1至268所組成的類PmultST3多肽、或來自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)的NmeniST3(GenBank No. ARC07984.1)或多殺性巴氏桿菌亞種多殺性株Pm70( P. multocidasubsp. multocida str. Pm70)的PmultST2(GenBank No. AAK02592.1)，β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶如來自發光桿菌( Photobacterium damselae)的pdST6(UniProt ID O66375)或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID O66375的胺基酸殘基108至497所組成的類pdST6多肽，或來自發光菌屬JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6(UniProt ID A8QYL1)，或由具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶活性的UniProt ID A8QYL1的胺基酸殘基18至514所組成的類P-JT-ISH-224-ST6多肽，及/或β-半乳糖苷α-2,8-唾液酸轉移酶如來自小鼠( M. musculus) (UniProt ID Q64689)。在產生乳糖基唾液酸化寡醣的實施例中，麩胺酸棒狀桿菌突變株以乳糖輸入蛋白(例如，大腸桿菌lacY(UniProt ID P02920))的持續轉錄單位來進一步修飾。

為了於蔗糖中成長，突變株可以基因體敲入包含大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶(Frk)(UniProt ID Q03417)與青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)的持續轉錄單位進行額外修飾。

異源與同源表現

需要表達的基因，無論是來自質體還是來自基因體，都由以下其中一間公司所合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。

透過針對表現宿主的密碼子使用而進行密碼子使用的優化，可以進一步促進表現。使用供應商的工具對基因進行優化。

培養條件

96孔微孔盤實驗的預培養始於冷凍養品管或來自TY盤的單一菌落，150µL TY中，並於 37℃下以 800 rpm 在迴轉式振盪器上培養隔夜。此培養物作為96孔方型微孔盤的接種物，以400µL MMsf培養基稀釋400x。每個菌株成長於96孔盤的多孔中作為生物重複。接著，此最終96培養盤於 37℃下以 800 rpm 在迴轉式振盪器上培養72小時，或更短或更長的時間。在培養實驗的終點，從各孔取樣以測量上清液濃度(胞外糖濃度，將細胞離心5分鐘後)，或將細胞離心之前於60℃下加熱培養液15分鐘(=全培養液濃度，胞內與胞外糖濃度，如本文所定義)。

此外，製作培養物的稀釋品以於600nm測量光學密度。以全培養液中測量到的寡醣濃度除以生物量來決定細胞性能指標(cell performance index, CPI)，並以與參考菌株相比的相對百分比呈現。生物量根據經驗是決定為600nm下所測量光學密度的約1/3。

實施例39：以修飾麩胺酸棒狀桿菌菌株產生2’FLNB

麩胺酸棒狀桿菌先透過基因體剔除ldh、cgl2645與nagB基因及基因體敲入持續轉錄單位而進行修飾以產生LNB且成長於蔗糖中，持續轉錄單位包括編碼大腸桿菌的突變glmS*54(如Deng等人(Biochimie 88, 419-29 (2006)所述，與野生型glms蛋白(具有Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1(UniProt ID P43577)、枯草桿菌的磷酸酶AraL(UniProt ID P94526)、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶(frk)(UniProt ID Q03417)、以及青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)的基因，其中N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。在下個步驟中，產生LNB的菌株以包含來自幽門螺旋桿菌的α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC(GenBank No. AAD29863.1)的持續轉錄單位的表現質體進行轉形。新穎菌株於根據實施例38提供的培養條件的MMsf培養基成長實驗中評估2’FLNB的產生，其中MMsf培養基缺少前驅物。培養72小時之後，收集培養液，且以UPLC分析糖類。

實施例40：以修飾麩胺酸棒狀桿菌菌株產生包括唾液酸化LacNAc的寡醣混合物

麩胺酸棒狀桿菌菌株先以基因剔除ldh、cgl2645、nagB、nagA與gamA基因及基因體敲入持續轉錄單位而進行修飾以產生LacNAc並於蔗糖中成長，持續轉錄單位包括編碼然果糖-6-P-胺基轉移酶(UniProt ID Q8NND3)、大腸桿菌的突變glmS*54(如Deng等人(Biochimie 88, 419-29 (2006)所述，與野生型glms蛋白(具有Uniprot ID P17169)不同在於A39T、R250C與G472S突變)、啤酒酵母菌的葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶GNA1(UniProt ID P43577)、來自枯草桿菌的磷酸酶AraL(UniProt ID P94526)、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白(CscB)(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶(Frk)(UniProt ID Q03417)、以及青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(UniProt ID A0ZZH6)的基因。在合成唾液酸的下個步驟中，突變株以基因體敲入包含編碼來自卵形類桿菌( Bacteroides ovatus)的N-乙醯葡萄糖胺2-表異構酶(UniProt ID A7LVG6)、以及來自腦膜炎雙球菌空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)的N-乙醯神經胺酸合成酶(UniProt ID Q93MP9)的基因的持續轉錄單位而進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。在下個步驟中，新穎菌株以包含持續轉錄單位的表現質體進行轉形，持續轉錄單位包含編碼腦膜炎雙球菌空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)NeuA酵素的基因，以及編碼多殺性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶PmultST3(UniProt ID Q9CLP3) 或發光桿菌( Photobacterium damselae)β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶pdST6(UniProt ID O66375)的基因。新穎菌株於根據實施例38提供的培養條件的MMsf培養基成長實驗中評估LacNAc、唾液酸與唾液酸化LacNAc的產生，其中MMsf培養基缺乏前驅物。當添加作為前驅物的乳糖至MMsf培養基時，取決於表現的α-唾液酸轉移酶，也可對突變株評估3’-SL或6’-SL額外的產生。培養72小時之後，收集培養液，且以UPLC分析糖類。

實施例41：以修飾麩胺酸棒狀桿菌產生Gal-β1,4-GalNAc

麩胺酸棒狀桿菌菌株以基因體敲入大腸桿菌UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白CscB(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶Frk(UniProt ID Q03417)、以及青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶BaSP(UniProt ID A0ZZH6)的持續表現構築體而進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。新穎菌株於根據實施例38提供的培養條件的成長實驗中進行培養時評估Gal-β1,4-GalNAc的產生，其中培養基含有蔗糖與GalNAc。

實施例42：以修飾麩胺酸棒狀桿菌產生Gal-β1,3-GalNAc

麩胺酸棒狀桿菌菌株以基因體敲入UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、大腸桿菌W的蔗糖運輸蛋白CscB(UniProt ID E0IXR1)、重組運動發酵單胞菌( Zymomonas mobilis)的果糖激酶Frk(UniProt ID Q03417)、以及青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)的蔗糖磷酸化酶BaSP(UniProt ID A0ZZH6)的持續表現構築體而進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。新穎菌株於根據實施例38提供的培養條件的成長實驗中進行培養時評估Gal-β1,3-GalNAc的產生，其中培養基含有蔗糖與GalNAc。

實施例43：萊茵衣藻( Chlamydomonas reinhardtii)的材料與方法

培養基

萊茵衣藻( C. reinhardtii)培養於Tris-醋酸鹽-磷酸鹽(Tris-acetate-phosphate, TAP)培養基(pH 7.0)中。TAP培養基使用1000x原液的Hutner微量元素混合物。Hutner微量元素混合物由50 g/L Na ₂EDTA‧H ₂O (Titriplex III)、22 g/L ZnSO ₄‧7H ₂O、11.4 g/L H ₃BO ₃、5 g/L MnCl ₂‧4H ₂O、5 g/L FeSO ₄‧7H ₂O、1.6 g/L CoCl ₂‧6H ₂O、1.6 g/L CuSO ₄‧5H ₂O與1.1 g/L (NH ₄) ₆MoO ₃所組成。

TAP培養基含有2.42g/L三羥甲基胺基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane, Tris)、25mg/L鹽類原液(salt stock solution)、0.108 g/L K ₂HPO ₄、0.054 g/L KH ₂PO ₄與1.0m/L冰醋酸。鹽類原液由15 g/L NH ₄Cl、4 g/L MgSO ₄‧7H ₂O與2 g/L CaCl ₂‧2H ₂O所組成。作為醣類合成的前驅物，可添加如半乳糖、葡萄糖、果糖及/或岩藻糖的前驅物。利用高壓蒸氣滅菌法(autoclaving)(121℃，21’)對培養基進行滅菌。對於瓊脂上的儲存培養原種(stock culture)，使用含有1%瓊脂(純化高強度，1000g/cm ²)的斜面(slant)TAP培養基。

菌株、質體與突變

萊茵衣藻野生株21gr(CC-1690, wild-type, mt+)、6145C (CC-1691, wild-type, mt−), CC-125 (137c, wild-type, mt+), CC-124 (137c, wild-type, mt−)於美國明尼蘇達大學的衣藻資源中心(https://www.chlamycollection.org)購得。

表現質體源自pSI103，於衣藻資源中心購得。可使用Gibson組裝法、Golden Gate組裝法、Cliva 組裝法、LCR或限制接合(restriction ligation)來進行選殖(cloning)。適用於(異源)基因表現的啟動子可源自如Scranton等人(Algal Res. 2016, 15: 135-142)。可使用如Jiang等人(Eukaryotic Cell 2014, 13(11): 1465-1469)所述的Crispr-Cas技術來進行目標基因的修飾。

如Wang等人(Biosci. Rep. 2019, 39: BSR2018210)所述，進行透過電穿孔的轉形。在持續充氣與持續照射8000Lx強度的光線之下，細胞於TAP液態培養基中成長直到細胞密度達到1.0-2.0x10 ⁷個細胞/mL。接著，將細胞以1.0x10 ⁶個細胞/mL的濃度接種至新鮮的液態TAP培養基中，並在持續光照下成長18-20小時，直到細胞密度達到4.0x10 ⁶個細胞/mL。接著，於室溫利用1250g的離心收集細胞，清洗細胞，並以預冷含有60mM山梨醇(Sigma, U.S.A.)的液態TAP培養基重新懸浮細胞，且冷卻10分鐘。接著，250μL的細胞懸浮物(對應至5.0x10 ⁷個細胞)置於預冷含有100ng質體DNA(400ng/mL)的0.4cm電穿孔光析管(cuvette)中。利用BTX ECM830電穿孔裝置(1575 Ω, 50 μFD)以6次500V脈衝進行電穿孔，每一次具有4ms的脈衝長度且脈衝間隔時間為100ms。電穿孔之後，光析管立即置於冰上10分鐘。最終，細胞懸浮物轉移至50ml圓錐形離心管，其含有10mL新鮮液態TAP培養基與60mM山梨醇，並在昏暗的燈光下緩慢搖晃隔夜進行恢復。隔夜恢復之後，重新收集細胞並以澱粉包埋法(starch embedding method)塗佈至選擇性1.5%(w/v)瓊脂TAP盤上，其含有胺苄青黴素(100mg/L)與氯黴素(100mg/L)。接著於23±0.5℃之下培養盤，並持續照射光強度為8000Lx的光線。細胞於5-7天後進行分析。

在產生UDP-半乳糖的實施例中，萊茵衣藻( Chlamydomonas reinhardtii)細胞以轉錄單位進行修飾，轉錄單位包含編碼阿拉伯芥( Arabidopsis thaliana)的半乳糖激酶(KIN，UniProt ID Q9SEE5)的基因以及編碼阿拉伯芥UDP-糖焦磷酸化酶(UDP-sugar pyrophosphorylase, USP) (UniProt ID Q9C5I1)的基因。

在產生LNB的實施例中，產生UDP-半乳糖的萊茵衣藻( Chlamydomonas reinhardtii)細胞以包含N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的轉錄單位的表現質體而進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。此外，萊茵衣藻突變細胞可以包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511))的轉錄單位的表現質體而進行進一步修飾。

在產生LacNAc的實施例中，產生UDP-半乳糖的萊茵衣藻( Chlamydomonas reinhardtii)細胞以包含N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的轉錄單位的表現質體而進行進一步修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。此外，萊茵衣藻突變細胞可以包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFutC(GenBank No. AAD29863.1))及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶(例如，來自幽門螺旋桿菌的HpFucT(UniProt ID O30511))的轉錄單位的表現質體而進行進一步修飾。

在合成CMP-唾液酸的實施例中，萊茵衣藻細胞以UDP-N-乙醯葡萄糖胺-2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶(例如，來自人類( Homo sapiens)的GNE(UniProt ID Q9Y223))或含有R263L突變的人類GNE多肽的突變形式、N-醯基神經胺酸-9-磷酸合成酶(例如，來自人類的NANS(UniProt ID Q9NR45))、以及N-醯基神經胺酸胞苷酸轉移酶(例如，來自人類的CMAS(UniProt ID Q8NFW8))的持續轉錄單位進行修飾。在產生唾液酸化寡醣的實施例中，萊茵衣藻細胞以CMP-唾液酸運輸蛋白(例如，來自小鼠( Mus musculus)的CST(UniProt ID Q61420))與選自人類、小鼠與褐鼠( Rattus norvegicus)的高基式體唾液酸轉移酶(Golgi-localised sialyltransferase)進行修飾。

異源與同源表現

需要表達的基因，無論是來自質體還是來自基因體，都由以下其中一間公司所合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。

透過針對表現宿主的密碼子使用而進行密碼子使用的優化，可以進一步促進表現。使用供應商的工具對基因進行優化。

培養條件

萊茵衣藻細胞在23±0.5℃及14/10小時光/暗週期之下培養於選擇性TAP瓊脂盤中，其中光強度為8000Lx。細胞於培養5至7天後進行分析。

以高密度培養物而言，細胞可培養於封閉式系統中，例如如Chen等人(Bioresour. Technol. 2011, 102: 71-81)及Johnson等人(Biotechnol. Prog. 2018, 34: 811-827)所述的水平管光生物反應器、攪拌槽光生物反應器或平板光生物反應器。

實施例44：修飾萊茵衣藻中LNB與2’FLNB的產生

如實施例43所述，以基因體敲入包含阿拉伯芥( Arabidopsis thaliana)的半乳糖激酶(KIN，UniProt ID Q9SEE5)以及阿拉伯芥UDP-糖焦磷酸化酶(USP)(UniProt ID Q9C5I1)來改造萊茵衣藻細胞以產生UDP-Gal。在下個步驟中，突變細胞以包含轉錄單位的表現質體而轉形，轉錄單位包括N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶與幽門螺旋桿菌的α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC(GenBank No. AAD29863.1)，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。新穎菌株於根據實施例43提供的培養條件的TAP瓊脂盤培養實驗中進行評估，其中TAP瓊脂盤含有作為前驅物的半乳糖。培養5天之後，收集細胞，且以UPLC分析評估LNB與2’FLNB的產生。

實施例45：修飾萊茵衣藻中LacNAc與3’-岩藻糖化LacNAc(3-FLN)的產生

如實施例43所述，以基因體敲入包含阿拉伯芥( Arabidopsis thaliana)的半乳糖激酶(KIN，UniProt ID Q9SEE5)以及阿拉伯芥UDP-糖焦磷酸化酶(USP)(UniProt ID Q9C5I1)來改造萊茵衣藻細胞以產生UDP-Gal。在下個步驟中，突變細胞以包含轉錄單位的表現質體而轉形，轉錄單位包括N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶與幽門螺旋桿菌的α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT(UniProt ID O30511)，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。新穎菌株於根據實施例43提供的培養條件的TAP瓊脂盤培養實驗中進行評估，其中TAP瓊脂盤含有作為前驅物的半乳糖。培養5天之後，收集細胞，且以UPLC分析評估LacNAc與3’-岩藻糖化LacNAc(3-FLN, Gal-β1,4-(Fuc-α1,3)-GlcNAc)的產生。

實施例46：以修飾萊茵衣藻產生Gal-β1,4-GalNAc

萊茵衣藻細胞以基因體敲入大腸桿菌UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體而進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。新穎菌株於根據實施例43提供的培養條件的TAP瓊脂盤培養實驗中進行培養時評估Gal-β1,4-GalNAc的產生，其中TAP瓊脂盤含有作為前驅物的GalNAc。培養5天之後，收集細胞，且以UPLC分析評估Gal-β1,4-GalNAc的產生。

實施例47：以修飾萊茵衣藻產生Gal-β1,3-GalNAc

萊茵衣藻細胞以基因體敲入UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)與N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的持續表現構築體而進行修飾，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。新穎菌株於根據實施例43提供的培養條件的TAP瓊脂盤培養實驗中進行培養時評估Gal-β1,3-GalNAc的產生，其中TAP瓊脂盤含有作為前驅物的GalNAc。培養5天之後，收集細胞，且以UPLC分析評估Gal-β1,3-GalNAc的產生。

實施例48：動物細胞的材料與方法

從不同哺乳動物的脂肪組織中分離間質(mesenchymal)幹細胞

新鮮脂肪組織來自屠宰場(例如，牛、豬、羊、雞、鴨、鯰魚、蛇、青蛙)或抽脂(例如，在人類的情況下，知情同意後進行)，並保存在添加有抗生素的磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffer saline)中。進行脂肪組織的酵素切割之後離心以分離間質幹細胞。分離的間質幹細胞轉移至細胞培養瓶，且於標準成長條件之下成長，例如，37℃、5%CO ₂。初始培養基包含DMEM-F12、RPMI與α-MEM培養基(添加15%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS))以及1%抗生素。第一次繼代(passage)後，接著將培養基以添加10%FBS的培養基取代。例如，Ahmad與Shakoori(2013, Stem Cell Regen. Med. 9(2): 29-36)描述了本文此實施例所述方法的某些變化，出於所有目的透過引用的方式將其全文併入本文。

從乳汁分離間質幹細胞

此實施例說明從乳汁分離間質幹細胞，而乳汁是在無菌條件下從如本所述的人類或任何其他哺乳動物所收集的。將等體積的磷酸鹽緩衝鹽水加入稀釋的乳汁中，然後離心20分鐘。以磷酸鹽緩衝鹽水清洗細胞沉澱物三次，並在標準培養條件下將細胞種於細胞培養瓶中，其中裝有添加10%胎牛血清與1%抗生素的DMEM-F12、RPMI與α-MEM培養基。例如，Hassiotou等人(2012, Stem Cells. 30(10): 2164-2174)描述了本文此實施例所述方法的某些變化，出於所有目的透過引用的方式將其全文併入本文。

使用2D與3D培養系統分化幹細胞

分離的間質幹細胞可於2D與3D培養系統中分化成類乳腺上皮細胞與內腔細胞(luminal cell)。例如，參照Huynh et al. 1991. Exp Cell Res. 197(2): 191 -199；Gibson et al.1991, In Vitro Cell Dev Biol Anim. 27(7): 585-594；Blatchford et al. 1999; Animal Cell Technology’: Basic & Applied Aspects, Springer, Dordrecht. 141-145；Williams et al. 2009, Breast Cancer Res 11(3): 26-43；以及Arevalo et al. 2015, Am J Physiol Cell Physiol. 310(5): C348 - C356，出於所有目的透過引用的方式將各篇全文併入本文。

以2D培養而言，分離的細胞一開始種於培養盤中，其中含有添加10ng/ml上皮成長因子與5pg/ml胰島素的成長培養基。在匯集時，細胞以添加2%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素(100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素)與5pg/ml胰島素的成長培養基培養48小時。為了誘發分化，細胞以含有5pg/ml胰島素、1pg/ml 氫化皮質酮(hydrocortisone)、0.65ng/ml三碘甲腺胺酸(triiodothyronine)、100nM地塞米松(dexamethasone)與1pg/ml泌乳素(prolactin)的完全成長培養基進行培養。24小時後，從完全誘導培養基移除血清。

以3D培養而言，分離的細胞以胰蛋白酶處理並培養於Matrigel、玻尿酸或超低附著表面培養盤中6天，且透過添加含有10ng/ml上皮成長因子與5 pg/ml胰島素的成長培養基以誘導分化及產生乳酸鹽。在匯集時，細胞以添加2%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素(100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素)與5pg/ml胰島素的成長培養基培養48小時。為了誘發分化，細胞以含有5pg/ml胰島素、1pg/ml 氫化皮質酮(hydrocortisone)、0.65ng/ml三碘甲腺胺酸(triiodothyronine)、100nM地塞米松(dexamethasone)與1pg/ml泌乳素(prolactin)的完全成長培養基進行培養。24小時後，從完全誘導培養基移除血清。

製作類乳腺細胞的方法

透過使用病毒載體重新編程使哺乳類細胞誘導具有多能性(pluripotency)，病毒載體編碼Oct4、Sox2、Klf4與c-Myc。接著，所得重新編程的細胞培養於Mammocult培養基(於Stem Cell Technologies可購得)或乳腺細胞富集培養基(enrichment media)(DMEM、3% FBS、雌激素、黃體酮、肝素、氫化皮質酮(hydrocortisone)、胰島素、EGF)中以使其成為類乳腺的，可從其中誘導選擇乳汁成分的表現。或者，使用重塑系統如CRISPR/Cas9來進行表觀遺傳重塑(epigenetic remodelling)，以使感興趣的選擇基因持續活化，例如酪蛋白、α-乳清蛋白，進而使其個別的蛋白能夠表現，及/或負向調控及/或剔除選擇的內源基因，如WO21067641所述，出於所有目的透過引用的方式將各篇全文併入本文。

培養

完全成長培養基(complete growth media)包含高葡萄糖DMEM/F12、10% FBS、1% NEAA、1% pen/strep、1% ITS-X、1% F-Glu、10ng/ml EGF、5pg/ml氫化皮質酮(hydrocortisone)與1pg/ml泌乳素(Hyunh 1991為5μg/ml)。細胞以20,000個細胞/cm ²的密度種於塗佈膠原蛋白的培養瓶與完全成長培養基中，使其於完全成長培養基中貼附及擴展48小時，之後將培養基換成完全泌乳培養基。一旦曝露至泌乳培養基，細胞開始分化且停止成長。約一周內，細胞開始分泌泌乳產物至培養基，例如乳脂、乳糖、酪蛋白和乳清。可透過超過濾進行濃縮或稀釋而達到所欲的泌乳培養基濃度。可透過透析以如從培養基移除不想要的代謝產物來達到泌乳培養基所欲的鹽平衡。可透過樹脂純化選擇性地萃取使用的荷爾蒙及其他成長因子，例如使用鎳樹脂移除His標籤的成長因子以進一步減少泌乳產物中汙染物的濃度。

實施例49：評估非乳腺成體幹細胞中2’FL、LNFP-I與2’FLNB的產生

如實施例48所述分離的間質細胞與重新編程為類乳腺的細胞透過CRISPR-CAS進行修飾，以過度表現密碼子優化的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、人類的GDP-岩藻糖合成酶GFUS(UniProt ID Q13630)與密碼子優化的幽門螺旋桿菌的α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC(GenBank No. AAD29863.1)，N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。細胞以20,000個細胞/cm ²的密度種於塗佈膠原蛋白的培養瓶與完全成長培養基中，使其於完全成長培養基中貼附及擴展48小時，之後將培養基換成完全泌乳培養基約7天。進行如實施例48所述的培養之後，使用UPLC分析細胞2’FL、LNFP-I與2’FLNB的產生。

實施例50：評估非乳腺成體幹細胞中LacNAc、唾液酸化LacNAc與唾液酸-路易斯x (sialyl-Lewis x)的產生

如實施例48所述分離的間質細胞與重新編程為類乳腺的細胞透過CRISPR-CAS進行修飾，以過度表現N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、人類的GDP-岩藻糖合成酶GFUS(UniProt ID Q13630)、人類的半乳糖苷α-1,3-岩藻糖基轉移酶FUT3(UniProt ID P21217)、小鼠的N-醯基神經胺酸胞苷轉移酶(UniProt ID Q99KK2)與人類的CMP-N-乙醯神經胺酸-β-1,4-半乳糖苷α-2,3-唾液酸轉移酶(CMP-N-acetylneuraminate-beta-1,4-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase)ST3GAL3(UniProt ID Q11203)，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。導入細胞的所有基因對於宿主皆為密碼子優化的。細胞以20,000個細胞/cm ²的密度種於塗佈膠原蛋白的培養瓶與完全成長培養基中，使其於完全成長培養基中貼附及擴展48小時，之後將培養基換成完全泌乳培養基約7天。進行如實施例48所述的培養之後，使用UPLC分析細胞LacNAc、唾液酸化LacNAc與唾液酸-路易斯x (sialyl-Lewis x)的產生。

實施例51：評估非乳腺成體幹細胞中Gal-β1,4-GalNAc的產生

如實施例48所述分離的間質細胞與重新編程為類乳腺的細胞透過CRISPR-CAS進行修飾，以過度表現大腸桿菌UDP-葡萄糖4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包括以下的名單：SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22、23、26、27、29、30、31、32、33、34、37、38與39，以及如實施例21所述鑑定出的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽。導入細胞的兩個基因對於宿主皆為密碼子優化的。細胞以20,000個細胞/cm ²的密度種於塗佈膠原蛋白的培養瓶與完全成長培養基中，使其於完全成長培養基中貼附及擴展48小時，之後將培養基換成完全泌乳培養基約7天。進行如實施例48所述的培養之後，使用UPLC分析細胞Gal-β1,4-GalNAc的產生。

實施例52：評估非乳腺成體幹細胞中Gal-β1,3-GalNAc的產生

如實施例48所述分離的間質細胞與重新編程為類乳腺的細胞透過CRISPR-CAS進行修飾，以過度表現UDP-葡萄糖-4-表異構酶(galE)(UniProt ID P09147)與N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶選自包含以下的名單：SEQ ID NO: 03、04、06、07、08與09，以及UniProt ID A0A354SD93、A0A108TBL4、A0A1G2TK10、A0A1G2UER6、A0A1G2UVR8、T1RPX3、U4SLB4、T1RNY4、T1RQ38、A0A377HVE3、A0A0M7B6J0、A0A0K1Q500、A0A3S0CAP8、A0A5C8BKY0、A0A0G0R169、A0A5C6Y259、A0A5C9C3N6、A0A1G7VWF9、A0A193KHC3、A0A5N1GML0,A0A3N2I9V8、A0A2I1RGW1、A0A5N1JGF2、A0A538SYW6、N8U0B3、A0A1G8DZV8、A0A538U133、A0A538SYT2、F3PEK1、B0NR63、A0A3D3JDC2、A0A5C5Y5M7、A0A1G9SAW9、E3HB28與A0A538TXM3的多肽。導入細胞的兩個基因對於宿主皆為密碼子優化的。細胞以20,000個細胞/cm ²的密度種於塗佈膠原蛋白的培養瓶與完全成長培養基中，使其於完全成長培養基中貼附及擴展48小時，之後將培養基換成完全成長培養基約7天。進行如實施例48所述的培養之後，使用UPLC分析細胞Gal-β1,3-GalNAc的產生。

無。

無 [定義]

本說明書中描述本發明及其各種實施例的用詞不可僅理解為其通常所定義的含意，且應透過本說明書中的特殊定義而包括通常所定義的含意範圍以外的結構、材料或動作。因此，若一要素在本說明書的背景下可被理解為包括一種以上的含意，則在申請專利範圍中使用此要素需理解為說明書與該用詞本身所支持的所有可能含意是通用的。

本文揭示的發明的各種實施例與態樣不僅在本說明書具體描述的順序與背景下進行解讀，且應包括任何順序及其任何組合。每當內文有需要，所有以單數形式的用詞應視為包含複數，反之亦然。除非另有定義，本文使用的所有技術與科學用詞一般具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般理解的相同含意。一般而言，本文使用的命名法及細胞培養、分子遺傳學、有機化學與核酸化學的實驗程序及本文所述的雜合(hybridization)步驟為本領域所週知且時常採用的。標準技術用於核酸與胜肽合成。一般而言，根據製造商說明書來進行純化步驟。

本說明書中揭示了本發明的實施例，且雖然使用了特定用詞，但用詞僅是以描述性質而使用，並非用以作為限定，本發明的範圍如下文申請專利範圍所述。應能理解的是，所述實施例僅是出於例示的目的而描述，不應將其視為限定本發明。對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是，其他實施例、改良、細節和用途與本發明的文字及精神為一致的且在本發明的範圍以內，僅以申請專利範圍來限定本發明的範圍，且以包括均等論的專利法來進行解讀。僅是為了便於描述起見，在下文申請專利範圍中，提供了用以表明申請專利範圍步驟的參考符號，而並非意圖隱含進行這些步驟的特定順序。

在此文件及其申請專利範圍中，動詞「包括(comprise)」及其詞型變化是以非限定的方式而使用，以意指在此用詞之後所包含的項目，但不排除未特別提及的項目。在整個申請中，可利用「由…所組成」或「實質上由…所組成」取代動詞「包括」，反之亦然。此外，可利用「實質上由…所組成」取代動詞「由…所組成」，「實質上由…所組成」指的是本文所定義的組成物可包括所特別指明之外的額外成分，所述額外成分不會改變本發明的獨特的特徵。此外，以不定冠詞「一(a或an)」提及成分不排除存在一個成分以上的可能性，除非內文明確指出僅有一成分或其中一成分。因此，不定冠詞「一(a或an)」一般指的是「至少一」。

在整個申請中，除非另有明確說明，否則冠詞「一(a或an)」較佳可利用「至少二」取代，更佳可利用「至少三」取代，更佳可利用「至少四」取代，更佳可利用「至少五」取代，更佳可利用「至少六」取代，最佳可利用「至少二」取代。

除非另有說明，本文所識別的每個實施例可以組合在一起。本說明書中提及的所有出版物、專利與專利申請案透過引用的方式併入本文，就如同明確且單獨指明各個單獨的出版物、專利或專利申請案透過引用的方式併入本文。優先權申請案，包括EP20190198、EP20190200及EP20190207，其全文亦透過引用的方式併入本文，就如同明確且單獨指明所述優先權申請案透過引用的方式併入本文。

根據本發明，「多核苷酸」一詞通常指的是任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或者修飾的RNA或DNA。 「多核苷酸」包括但不限於單鏈和雙鏈DNA，作為單鏈和雙鏈區域或單鏈、雙鏈和三鏈區域的混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA，以及作為單鏈和雙鏈區域的混合物的RNA，包含DNA和RNA(其可以是單鏈，或更典型的雙鏈或三鏈區域，或單鏈和雙鏈區域的混合物)的雜交分子。此外，本文所使用的「多核苷酸」指的是包含RNA或DNA或者RNA和DNA兩者的三鏈區域。這些區域中的鏈可以來自相同分子或來自不同的分子。這些區域可以包括所有的一個或多個分子，但更典型地只涉及一些分子的區域。三螺旋區域的分子之一通常是寡核苷酸。如本文所用，「多核苷酸」一詞還包括如上所述含有一個或多個修飾鹼基的DNA或RNA。因此，具有出於穩定性或其他原因而修飾的主鏈的DNA或RNA是根據本發明的「多核苷酸」。再者，包含不尋常鹼基(例如肌苷(inosine))或修飾的鹼基(例如三醯化(tritylated)鹼基)的DNA或RNA應理解為涵蓋在「多核苷酸」一詞中。應當理解，已經對DNA和RNA進行了多種修飾，其用於本領域技術人員已知的許多有用目的。本文中使用的「多核苷酸」一詞包括這種經化學、酵素或代謝修飾的多核苷酸形式，以及病毒和細胞(包括如簡單和復雜細胞)所特有的DNA和RNA的化學形式。「多核苷酸」一詞也包括通常稱為寡核苷酸的短多核苷酸。

「多肽」是指包含通過肽鍵或修飾的肽鍵彼此連接的兩個或更多個胺基酸的任何胜肽或蛋白質。 「多肽」指的是短鏈，通常稱為胜肽、寡肽和寡聚物，也指的是長鏈，通常稱為蛋白質。多肽可以含有20種基因編碼胺基酸以外的胺基酸。「多肽」包括通過自然過程修飾的多肽，例如經過處理和其他轉譯後修飾，也包括通過化學修飾技術修飾的多肽。這樣的修飾在基礎教科書和更詳細的專著中以及多卷研究文獻中充分描述，並且其對於本領域技術人員是周知的。相同類型的修飾可以以相同的程度或不同的程度存在於給定多肽中的數個位點上。此外，給定的多肽可以包含許多類型的修飾。修飾可以在多肽的任意位置發生，包括胜肽主鏈、胺基酸側鏈和胺基末端或羧基末端。修飾包括，例如，乙醯化(acetylation)、醯化(acylation)、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素(flavin)的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂質或脂質衍生物的共價連接、磷脂醯肌醇的共價連接、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化作用、共價交聯的形成、焦谷胺酸(pyroglutamate)的形成、甲醯化作用、γ-羧基化、醣基化、GPI錨定形成、羥基化、碘化、甲基化、荳蔻醯化(myristolyation)、氧化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊二烯化(prenylation)、外消旋化(racemization)、脂質連接、硫化、谷胺酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP-核糖基化、硒化(selenoylation)、向蛋白質添加轉移RNA介導的胺基酸，諸如精胺酸化和泛素化。多肽可以是分支的或有或無分支的環狀。環狀、分支的和分支環狀的多肽可以由轉譯後天然過程形成，並且也可以通過全合成法製得。

如本文所使用的，術語「編碼多肽的多核苷酸」包括包含編碼本發明多肽的序列的多核苷酸。此術語還包括多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼多肽的單一連續區域或不連續區域(例如，被整合的噬菌體或插入序列或透過編輯所間隔)以及也可包含編碼及/或非編碼序列的額外區域。

「分離的(isolated)」指的是「透過人工的方式」由其天然狀態改變，亦即，如果存在於自然界，則其已經改變或從其原始環境中移出，或者二者。例如，自然發生於生物體中的多核苷酸或多肽不是「分離的」，但是與其天然狀態的共存物質分開的相同的多核苷酸或多肽是「分離的」，如此術語在本文中所用的。同樣地，如本文所使用的術語「合成的」序列是指合成產生而不是從天然來源直接分離的任何序列。如本文所使用的術語「合成的」是指任何合成生成的序列，並且不是直接從天然來源分離出來的。

如本文提及細胞或宿主細胞而使用的「重組的(recombinant)」或「轉基因的(transgenic)」或「經代謝改造的(metabolically engineered)」或「經基因改造的(genetically modified)」一詞可交替使用，且指的是細胞複製異源核酸或表現異源核酸(亦即，對所述細胞而言是外來的序列，或對所述細胞中的所述位置或環境而言是外來的序列)編碼的胜肽或蛋白質。這類細胞被描述為用至少一種異源或外源基因進行轉形，或描述為透過導入至少一種異源或外源基因而進行轉形。代謝改造或重組或轉基因細胞可包含在細胞的天然(非重組)形式中不存在的基因。重組細胞也可包含在細胞的天然形式中存在的基因，其中這些基因係經過修飾且利用人工方式重新導入至細胞。這些用詞也包含含有對細胞而言為內源的核酸的細胞，所述核酸已經過修飾，或其表現或活性已在未從細胞移除核酸的情況下進行修飾，這些修飾包括透過基因取代而取得的修飾、啟動子(promoter)的取代、定點突變(site-specific mutation)及相關的技術。因此，「重組多肽」是由重組細胞所生產。如本文所使用的，「異源序列」或「異源核酸」是源自對特定細胞而言是外來的來源(例如，從不同的物種)，或者，若是源自相同來源，則是從其原始形式或基因體中的位置進行修飾。因此，與啟動子可操作連接的異源核酸來自與衍生啟動子的來源不同的來源，或者，若是自相同來源，則從其原始形式或基因體中的位置進行修飾。可穩定地導入異源序列，例如，透過轉染、轉形、接合或轉導(transduction)，到宿主微生物細胞的基因體中，其中可以應用取決於細胞和將導入序列的技術。各種技術對於本發明所屬技術領域具有通常知識者而言是習知的，且揭露於如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中。本發明內文中所使用的「突變」細胞或微生物指的是經基因改造的細胞或微生物。

本發明內文中所使用的術語「為了生產半乳糖化雙醣或寡醣而基因改造的細胞」指的是擇自包含下列的群組的一或多種酵素的表現或活性經基因改造的細胞：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶。

在本發明內文中的「內源的」一詞是指任何多核苷酸、多肽或蛋白質序列，其是細胞的天然部分並且存在於其在細胞染色體中的自然位置。「外源的」一詞是指任何多核苷酸、多肽或蛋白質序列，其源自於所研究的細胞外部，並且不是細胞的天然部分，或不存在於細胞染色體或質體中的其自然位置。

「異源的」一詞當用於提及多核苷酸、基因、核酸、多肽或酵素時，是指來自或衍生自宿主物種以外的來源的多核苷酸、基因、核酸、多肽或酵素。相反地，本文使用的「同源」多核苷酸、基因、核酸、多肽或酵素來表示衍生自宿主生物體物種的多核苷酸、基因、核酸、多肽或酵素。當提及用於維持或操縱基因序列的基因調控序列或輔助核酸序列時(例如，啟動子、5'未轉譯區、3'未轉譯區、poly A附加序列、內含子(intron)序列、剪接位點(splice site)、核醣體結合位點、內部核醣體進入序列、基因體同源區、重組位點等)，「異源的」是指調控序列或輔助序列與在構建體、基因體、染色體或游離基因體(episome)中與調控或輔助核酸序列並列的基因未有天然關聯。因此，可操作地連接至在其天然狀態下(亦即，在非基因改造生物體的基因體中)非可操作地連接至的基因的啟動子在本文中被稱為「異源啟動子」，即使該啟動子可衍生自與其所連接的基因相同的物種(或在某些情況下，相同的生物體)。

蛋白質或酵素「經修飾的活性」一詞是關於與所述蛋白質或酵素的野生型活性(即，天然活性)相比蛋白質或酵素活性的變化。所述經修飾的活性與蛋白質或酵素的野生型活性相比可以是所述蛋白質或酵素經破壞、削弱、減少或延遲的活性，但與蛋白質或酵素的野生型活性相比也可以是所述蛋白質或酵素加速或增強的活性。透過修飾所述蛋白質或酵素的表現或透過表現修飾型(即，突變型)蛋白質或酵素而達到蛋白質或酵素經修飾的活性。酵素經修飾的活性更關於酵素的表觀(apparent) Michaelis常數Km及/或表觀最大速率中的修飾。

基因「經修飾的表現」一詞是關於在編碼蛋白質生產過程的任何階段中，所述基因的表現量與野生型相比的變化。所述經修飾的表現與野生型相比為較低或較高的表現量，其中「較高的表現量」一詞也定義為以內源基因而言所述基因的「過度表現(overexpression)」，或以未存在於野生型品系的異源基因而言的表現。藉由技術人員通常習知技術來達到較低的表現量或減弱的表現量，例如使用SiRNA、CrispR、CrispRi、RNA開關(riboswitch)、重組介導的基因工程(recombination-mediated genetic engineering, recombineering)、同源重組、ssDNA誘發突變(mutagenesis)、RNAi、miRNA、asRNA、突變基因、基因剔除、轉位子(transposon)誘發突變等，這些技術以不太可能(亦即，與功能性野生型基因相比統計上顯著「不太可能」)或完全無法(例如，剔除基因)生產功能性最終產物的方式而改變基因。如本文所使用的，「RNA開關」一詞是定義為信使RNA(messenger RNA)的一部分，其摺疊為錯綜複雜的結構而透過干擾轉譯阻擋表現。與效應分子結合造成構型改變，進而得以調控轉錄後的表現。以降低表現量的方式改變感興趣的基因是透過如前文所述而獲得，也可透過改變轉錄單位(transcription unit)、啟動子、未轉譯區、核糖體結合位點、Shine Dalgarno序列或轉錄終止序列(terminator)來獲得較低的表現量。例如，可透過突變啟動子序列中一或多個鹼基對或將啟動子序列完全改變為比野生型具有更低表現強度的持續型啟動子或調控表現量的可誘導型啟動子或調控表現量的可抑制型啟動子。藉由技術人員通常習知技術來達到過度表現或表現，例如使用人造轉錄因子、從頭合成設計啟動子序列、改造RNA開關、在真染色質(euchromatin)導入或再導入表現模組或使用高複製數量的質體，其中所述基因是「轉錄單位」的一部份，其是關於其中存在有啟動子序列、未轉譯區序列、編碼序列以及視需要而定的轉錄終止序列的任何序列，並造成功能活性蛋白質的表現。所述表現是持續型的或受調控的。

「持續型表現」一詞定義為在特定成長條件下，不受RNA聚合酶的次單位(例如，細菌sigma因子)以外的轉錄因子調控的表現。這些轉錄因子的非限制性範例為E. coli中的CRP、LacI、ArcA、Cra與IclR。這些轉利因子結合至特定序列且在特定成長條件下可阻擋或增強表現。RNA聚合酶結合至特定序列以起始轉錄，例如透過原核宿主的sigma因子。

「調控的表現」一詞定義為在特定成長條件下，受到RNA聚合酶的次單位(例如，細菌sigma因子)以外的轉錄因子調控的表現。這些轉錄因子的範例如前文所述。透過誘導子(inducer)或抑制子(repressor)來達到通常表現調控，例如但不限於，IPTG、阿拉伯糖(arabinose)、鼠李糖(rhamnose)、岩藻糖(fucose)、異乳糖(allolactose)或調整pH、或調整溫度或碳耗竭，或透過受質、產物或化學抑制法。

術語「透過天然誘導子的表現」定義為僅在宿主的自然條件下(例如，分娩中的生物，或在泌乳期時)表現的基因的兼性或調控表現，對於環境變化(例如，包括荷爾蒙、熱、冷、pH改變、光線、氧化壓力或滲透壓力/訊號)有所反應，或取決於發育階段的位置或所述宿主細胞的細胞周期，但不限於細胞凋亡(apoptosis)或細胞自嗜(autophagy)。

術語「化學處理後可誘導的表現」定義為僅在用化學誘導子或抑制子處理後表現的基因的兼性或調控表現，其中所述誘導子與抑制子包括但不限於醇類(例如，乙醇、 甲醇)、碳水化合物(例如，葡萄糖、半乳糖、甘油、乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、異乳糖(allo-lactose))、金屬離子(例如，鋁、銅、鋅)、氮氣、磷酸鹽、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)、乙酸鹽、甲酸鹽或二甲苯。

「控制序列」一詞是指由宿主細胞轉錄和轉譯系統識別的序列，能夠使多核苷酸序列轉錄及轉譯成多肽。因此，這種DNA序列對於在特定宿主細胞或生物體中表達可操作連接的編碼序列是必需的。這種控制序列可以是但不限於啟動子序列、核醣體結合序列、ShineDalgarno序列、Kozak序列、轉錄終止子序列。例如，適用於原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱子序列和核醣體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺苷酸化信號和增強子。如果前序列或可分泌前導物(secretory leader)的DNA作為參與多肽分泌的前蛋白表達，則將前序列或可分泌前導物的DNA可操作地連接到多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則將啟動子或增強子可操作地連接到編碼序列；或者如果核醣體結合位點影響序列的轉錄，則將核醣體結合位點可操作地連接到編碼序列；或者如果核醣體結合位點的定位便於轉譯，則將核醣體結合位點可操作地連接到編碼序列。所述控制序列還可利用外部化學物質(例如，但不限於IPTG、阿拉伯糖、乳糖、異乳糖、鼠李糖或岩藻糖)經由可誘導啟動子或經由誘導或抑制所述多核苷酸轉錄或轉譯為多肽的遺傳迴路而得到另外控制。

一般而言，「可操作連接」是指被連接的DNA序列是連續的，且在可分泌前導物的情況下，是連續的並處於閱讀框架中。然而，增強子不必是連續的。

「野生型」一詞指的是通常習知發生於自然界的遺傳型或表現型情況。

如本文所使用，術語「蛋白質經修飾的表現」指的是與野生型(即，天然)蛋白質相比：i) 內源性蛋白質較高的表現或過度表現，ii) 異源性蛋白質的表現，或iii) 具有較高活性的變體蛋白質的表現及/或過度表現。

如本文所使用，「乳腺細胞」一詞一般是指乳腺上皮細胞、乳腺上皮腔細胞或哺乳動物上皮乳泡細胞(alveolar cell)或前述的任何組合。如本文所使用，「類乳腺細胞」一詞一般是指具有與自然乳腺細胞相似(或實質上相似)但源自於非乳腺細胞來源的表現型/基因型的細胞。這樣的類乳腺細胞可經過改造以移除至少一種不需要的遺傳成分，及/或包括至少一種典型的乳腺細胞的預定基因構築體(construct)。類乳腺細胞的非限制性範例可包括類乳腺上皮細胞、類乳腺上皮腔細胞、展現出乳腺細胞品系細胞的一或多種特徵的非乳腺細胞或前述的任何組合。類乳腺細胞更多的非限制性範例可包括具有與自然乳腺細胞相似(或實質上相似)的表現型的細胞。具有表現型或展現出與自然乳腺細胞或乳腺上皮細胞相似(或實質上相似)的至少一種特徵的細胞可包括展現出可自然表現至少一種乳汁成分或經改造為可表現至少一種乳汁成分的細胞(例如，源自乳腺細胞品系或非乳腺細胞品系)。

如本文所使用，「非乳腺細胞」一般可包括非乳腺細胞品系的任何細胞。在本發明的背景下，非乳腺細胞可以是可經改造而表現至少一種乳汁成分的任何哺乳類細胞。這樣的非乳腺細胞的非限制性範例包括肝細胞、血細胞、腎細胞、臍帶血細胞、上皮細胞、表皮細胞、肌細胞、纖維母細胞、間質細胞 或前述的任何組合。在一些範例中，分子生物學和基因體編輯技術可被設計為同時消除、沉默或減弱各式各樣的基因。

在本申請中，除非有明確說明，否則「可…＜動詞＞」的表示方式較佳為利用動詞的主動語態取代，且反之亦然。例如，「可表現」的表示方式較佳為利用「表現」取代，且反之亦然，亦即，「表現」較佳為利用「可表現」取代。

如本文所使用，「變體(variant)」是分別不同於參考多核苷酸或多肽但保留必要特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸或多肽典型的變體與另一參考多核苷酸的核苷酸序列不同。變體的核苷酸序列中的改變可能會或可能不會改變參考多核苷酸所編碼的多肽胺基酸序列。如下文所討論，核苷酸改變可能會造成參考序列所編碼的多肽中胺基酸取代(substitution)、加成(addition)、缺失(deletion)、融合(fusion)與截切(truncation)。多肽典型的變體與另一參考多肽的胺基酸序列不同。一般而言，差異有限導致參考多肽與變體的序列整體而言非常相似，且在許多區域中相同。變體與參考多肽的差異可在於一或多個取代、加成、缺失的任何組合。取代或插入的胺基酸殘基可能會或可能不會是遺傳密碼所編碼的胺基酸殘基。多核苷酸或多肽的變體可以是自然發生的(naturally occuring)，例如等位基因變體，或者可以是已知非自然發生的變體。多核苷酸或多肽非自然發生的變體可以利用突變技術、直接合成法及本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的其他重組方法而產生。

如本文所使用，多肽的「衍生物」一詞為在多肽的胺基酸序列中可能含有胺基酸殘基的缺失、加成或置換，但會導致沉默變化，從而產生功能性等效多肽的多肽。可以基於極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或所涉及殘基的雙性性質的相似性進行胺基酸取代。例如，非極性(疏水) 胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；平面中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；帶正電荷的(鹼性) 胺基酸包括精胺酸、離氨酸和組胺酸；帶負電荷的(酸性) 胺基酸包括天門冬胺酸和麩胺酸。在本發明的前後文中，如本文所用的衍生多肽是指能夠表現出與原始多肽實質上相似的體內活性的多肽，如通過許多標準中的任一個而進行判斷，包括但不限於酵素活性，且可以在轉譯期間或之後進行不同的修飾。再者，可以將非經典胺基酸或化學胺基酸類似物置換於或加成至原始多肽序列中。

在一些實施例中，本發明設想到透過修飾如本發明中使用的酵素結構來產生功能性變體。可透過胺基酸置換、缺失、加成或前述的組合來製造變體。例如，可合理預期用異白胺酸或纈胺酸單獨替換白胺酸、用麩胺酸單獨替換天門冬胺酸、用絲胺酸單獨替換蘇胺酸、或用結構上相關的胺基酸對胺基酸的相似取代(例如，保守型突變)不會對所得分子的生物活性產生重大影響。保守取代是發生在與其側鏈相關的胺基酸家族內進行的取代。通過評估變體多肽以類似於野生型多肽的方式在細胞中產生應答的能力，可以輕易地確定本發明的多肽的胺基酸序列中的改變是否會造成功能同源物。

本文所使用的「功能同源物」一詞描述的是具有序列相似性(換言之，同源性)並且還共享如生化活性的至少一個功能特徵的那些分子(Altenhoff et al., PLoS Comput. Biol. 8 (2012) e1002514)。功能同源物通常對於相同的特徵產生相似的，但不一定相同的程度。功能上同源的蛋白質具有相同的特徵，其中一個同源物產生的定量測量值為另一個的至少10%；更典型為至少為20%，在約30%和約40%之間；例如，在約50%和約60%之間；在約70%和約80%之間；或者在約90%和約95%之間；在約98%和約100%之間，或者超過原始分子所產生的定量測量值的100%。因此，當分子具有酵素活性時，功能同源物將具有與原始酵素相比的上述酵素活性百分比。如果分子是DNA結合分子(例如，多肽)，則同源物將具有上述結合親和力百分比，透過結合分子的重量與原始分子相比進行測量。

功能同源物和參考多肽可能是自然發生的多肽，並且序列相似性可能是由趨同或趨異演化事件所造成的。功能同源物有時被稱為異種同源物(orthologs)，其中「異種同源物」是指在另一物種中與參考基因或蛋白質功能等同的同源基因或蛋白質。異種同源蛋白質為不同物種中的同源基因，其起源於最後一個共同祖先的單一基因的垂直遺傳傳遞(vertical descent)，其中此基因及其主要功能是保守的。同源基因為遺傳自共同祖先的兩種物種的基因。

當「異種同源」一詞用於來自給定物種的胺基酸或核苷酸/核酸序列時，指的是來自不同物種的胺基酸或核苷酸/核酸序列。應能理解的是，當兩個序列源自於透過線性遺傳傳遞(linear descent)的共同祖先及/或在序列與生物功能方面密切相關時，這兩個序列彼此互為異種同源物。異種同源物通常具有高度的序列相似度，但可能不會(且一般不會)共有100%的序列相似度。

同種同源基因(paralogous gene)是源自基因複製現象的同源基因。同種同源基因通常屬於相同物種，但這並非必需條件。同種同源物可分為內旁系同種同源物(in-paralog，物種形成事件之後出現的同種同源對)與外旁系同種同源物(out-paralog，物種形成事件之前出現的同種同源對)。物種之間的外旁系同種同源物為物種形成之前因複製而存在於兩種生物之間成對的同種同源物。在物種之中，物種之中的外旁系同種同源物為存在於相同生物成對的同種同源物，但複製事件是發生於物種形成之後。同種同源物一般具有相同或相似的功能。

功能同源物可以通過核苷酸和多肽序列比對分析來鑑定。例如，對核苷酸或多肽序列的數據庫執行查詢可以鑑定的同源物，感興趣的多肽如生物量調節多肽、醣基轉移酶、涉及核苷酸活化糖合成的蛋白質或膜運輸蛋白。序列分析可以涉及分別使用生物量調節多肽、醣基轉移酶、涉及核苷酸活化糖合成的蛋白質或膜運輸蛋白的胺基酸序列作為參照序列的非冗餘資料庫的BLAST、交互BLAST(reciprocal BLAST)或PSI-BLAST分析。在某些情況下，胺基酸序列是從核苷酸序列推導出來的。通常，資料庫中序列相似度大於40%的多肽是進一步評估分別作為生物量調節多肽、醣基轉移酶、涉及核苷酸活化糖合成的蛋白質或膜運輸蛋白適合的候選物。胺基酸序列相似性允許保守的胺基酸取代，例如一個疏水性殘基取代另一個疏水性殘基，或一個極性殘基取代另一個極性殘基，或一個酸性殘基取代另一個酸性殘基，或一個鹼性殘基取代另一個鹼性殘基等。較佳的是，保守性取代是指諸如甘胺酸被丙胺酸取代的組合，反之亦然；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸被甲硫胺酸取代的組合，反之亦然；天門冬胺酸被麩胺酸取代的組合，反之亦然；天門冬醯胺被麩醯胺取代的組合，反之亦然；絲胺酸被蘇胺酸取代的組合，反之亦然；離胺酸被精胺酸取代的組合，反之亦然；半胱胺酸被甲硫胺酸取代的組合，反之亦然；苯丙胺酸與酪胺酸被色胺酸取代的組合，反之亦然。如有需要，可以對這類候選物進行手動檢查，以縮小待進一步評估的候選物的數量。可以透過選擇那些似乎具有在生產率調控多肽中存在的結構域(例如，保守的功能結構域)的候選物來執行手動檢查。

以多核苷酸而言，「 片段」是指克隆或多核苷酸分子的任何部分，特別是多核苷酸保留全長多核苷酸分子可用的功能特徵的部分。有用的片段包括寡核苷酸和多核苷酸，它們可用於雜交或擴增技術或者複製、轉錄或轉譯的調控。「多核苷酸片段」是指多核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的任何子序列，通常包括或由本文提供的任何多核苷酸序列的至少約9、10、11、12個連續核苷酸所組成，例如至少約30個核苷酸或至少約50個核苷酸。例示性片段可額外或備選地包括包含編碼多肽的保守家族結構域的區域、實質上由其組成或由其組成的片段。示例性片段可額外或備選地包括包含多肽的保守結構域的片段。因此，多核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段較佳指的是包括或由所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)所組成的核苷酸序列，其中不多於200、150、100、50或25個連續核苷酸缺失(missing)，較佳不多於50個連續核苷酸缺失，且上述核苷酸序列保留全長多核苷酸分子可用的功能特徵(例如，活性)，可利用通常知識者日常實驗方法來評估可用的功能特徵。或者，多核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段較佳指的是包括或由來自所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)的一些連續核苷酸所組成的核苷酸序列，其中所述的一些連續核苷酸為所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)的至少50.0%、60.0%、70.0%、80.0%、81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、95.5%、96.0%、96.5%、97.0%、97.5%、98.0%、98.5%、99.0%、99.5%、100.0%，較佳為至少80%，更佳為至少87%，更佳為至少90%，更佳為至少95%，更佳為至少97%，且保留全長多核苷酸分子可用的功能特徵(例如，活性)。因此，多核苷酸SEQ ID NO(或Genbank NO.)的片段較佳指的是包括或由所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)所組成的核苷酸序列，其中一些連續的核苷酸缺失，且其中缺失的含量不多於所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的50.0%、40.0%、30.0%，較佳為不多於所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的20.0%、15.0%、10.0%、9.0%、8.0%、7.0%、6.0%、5.0%、4.5%、4.0%、3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%，更佳為不多於所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的15%，更佳為不多於所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的10%，更佳為不多於所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的5%，最佳為不多於所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的2.5%，且其中所述片段留全長多核苷酸分子可用的功能特徵(例如，活性)，可利用通常知識者日常實驗方法來評估可用的功能特徵。

在本申請中，可以SEQ ID NO或者是GenBank NO.來表示多核苷酸的序列。因此，除非另有明確說明，否則用語「多核苷酸SEQ ID NO」與「多核苷酸GenBank NO.」可交替使用。

片段可額外或備選地包括多肽和蛋白質分子的子序列，或多肽的子序列。在某些情況下，片段或結構域是多肽的子序列，其以與完整多肽實質上相同的方式或較佳為類似程度執行完整多肽的至少一種生物功能。如本文所定義，「多肽的子序列」指的是源自多肽的連續胺基酸殘基的序列。例如，多肽片段可包含可識別的結構基序(motif)或功能結構域，例如DNA結合位點或結構域，其與DNA啟動子區、活化結構域或用於蛋白質-蛋白質相互作用的結構域結合，並且可啟動轉錄。片段的大小可以從少至3個胺基酸殘基到完整多肽的全長，例如長度至少約20個胺基酸殘基，例如長度至少約30個胺基酸殘基。因此，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)較佳指的是包括或由所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)所組成的多肽序列，其中不多於80、60、50、40、30、20或15個連續胺基酸殘基缺失，較佳為不多於40個胺基酸殘基缺失，且其以與完整多肽實質上相同的方式或較佳為類似程度執行完整多肽的至少一種生物功能，可利用通常知識者日常實驗方法來評估生物功能。或者，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的片段指的是包括或由來自所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的一些連續的胺基酸殘基所組成的多肽序列，且其中所述的一些連續的胺基酸殘基為所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)全長的至少50.0%、60.0%、70.0%、80.0%、81.0%、82.0%、83.0%、84.0%、85.0%、86.0%、87.0%、88.0%、89.0%、90.0%、91.0%、92.0%、93.0%、94.0%、95.0%、95.5%、96.0%、96.5%、97.0%、97.5%、98.0%、98.5%、99.0%、99.5%、100.0%，較佳為至少80%，更佳為至少87%，更佳為至少90%，更佳為至少95%，更佳為至少97%，且其以與完整多肽實質上相同的方式或較佳為類似程度執行完整多肽的至少一種生物功能，可利用通常知識者日常實驗方法來評估生物功能。因此，多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)的片段較佳指的是包括或由所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)所組成的多肽序列，其中一些連續的胺基酸殘基缺失，且其中缺失的含量不多於所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)全長的50.0%、40.0%、30.0%，較佳為不多於所述SEQ ID NO(或Genbank NO.)全長的20.0%、15.0%、10.0%、9.0%、8.0%、7.0%、6.0%、5.0%、4.5%、4.0%、3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%，更佳為不多於所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)全長的15%，更佳為不多於所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)全長的10%，更佳為不多於所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)全長的5%，最佳為不多於所述多肽SEQ ID NO(或UniProt ID或Genbank NO.)全長的2.5%，且其以與完整多肽實質上相同的方式或較佳為類似程度執行完整多肽的至少一種生物功能，可利用通常知識者日常實驗方法來評估生物功能。

在本申請中，可利用SEQ ID NO或者是UniProt ID或GenBank NO.來表示多肽的序列。因此，除非另有明確說明，否則用語「多肽SEQ ID NO」與「多肽UniProt ID」與「多肽GenBank NO.」可交替使用。

較佳的是，多肽的片段是以類似程度具有衍生片段的多肽的至少一種特性或活性的功能性片段，例如，功能性片段可以包括多肽的功能結構域或保守結構域。應能理解的是，多肽或其片段可具有保守型胺基酸取代，對於多肽的活性沒有實質上的影響。

保守性取代可以是一個疏水性胺基酸取代另一個疏水性胺基酸，或一個極性胺基酸取代另一個極性胺基酸，或一個酸性胺基酸取代另一個酸性胺基酸，或一個鹼性胺基酸取代另一個鹼性胺基酸等。較佳的是，保守性取代是指諸如甘胺酸被丙胺酸取代的組合，反之亦然；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸被甲硫胺酸取代的組合，反之亦然；天門冬胺酸被麩胺酸取代的組合，反之亦然；天門冬醯胺被麩醯胺取代的組合，反之亦然；絲胺酸被蘇胺酸取代的組合，反之亦然；離胺酸被精胺酸取代的組合，反之亦然；半胱胺酸被甲硫胺酸取代的組合，反之亦然；苯丙胺酸與酪胺酸被色胺酸取代的組合，反之亦然。例如，可以通過Pfam(El-Gebali et al., Nucleic Acids Res. 47 (2019) D427-D432)或保守結構域資料庫(conserved domain database, CDD) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd) (Lu et al., Nucleic Acids Res. 48 (2020) D265-D268)指定來表徵結構域。各個資料庫的內容在各個釋出版本為固定的而不會改變。當特定資料庫的內容改變時，此特定資料庫接收到具有新釋出日期的新釋出版本。各個資料庫的所有釋出版本與其對應的釋出日期以及所註釋的特定內容對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言是可得且習知的。本文所使用的PFAM資料庫(https://pfam.xfam.org/)為2020年6月11日釋出的Pfam版本33.1。蛋白質序列和註釋資料的綜合資源可以提供蛋白質序列資訊和功能資訊，例如通用蛋白質資源(Universal Protein Resource, UniProt)(www.uniprot.org)(Nucleic Acids Res. 2021, 49(D1), D480-D489)。UniProt包括專業且豐富的蛋白質資料庫，稱為UniProt知識庫(UniProt Knowledgebase, UniProtKB)以及UniProt參考群集(UniRef)與UniProt檔案(UniParc)。UniProt識別碼(UniProt ID)是資料庫中的每個蛋白質獨有的。本文所使用的UniProt ID為2021年5月5日UniProt資料庫版本中的UniProt ID。沒有UniProt ID的蛋白質於本文係利用2021年5月5日版本的NIH基因序列資料庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) (Nucleic Acids Res. 2013, 41(D1), D36-D42)中所呈現的個別GenBank登錄號碼(GenBank No.)來稱呼。

在本發明中，多肽序列段(stretch)用以指的是本發明中使用的半乳糖基轉移酶的片段，對於半乳糖基轉移酶是共通的。這樣的多肽序列段是以一個字母代碼的胺基酸序列形式而進行編寫。如果在這樣的多肽序列段中特定位置的胺基酸可以是數個胺基酸，則特定位置將具有胺基酸代碼X。

除非於本所另有提及，否則字母「X」指的是任何可能的胺基酸。用語(Xn)指的是一序列段由n個胺基酸殘基X所組成的蛋白質序列，其中所述X各為任何可能的胺基酸，且其中n為2、3、4和4個以上。用語(Xm)指的是一序列段由m個胺基酸殘基X所組成的蛋白質序列，其中所述X各為任何可能的胺基酸，且其中n為2、3、4和4個以上。用語(Xp)指的是一序列段由p個胺基酸殘基X所組成的蛋白質序列，其中所述X各為任何可能的胺基酸，且其中n為2、3、4和4個以上。

用語「[X，非A、G或S]」指的是胺基酸殘基丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或絲胺酸(S)以外的任何胺基酸。用語「[X，非F、H、W或Y]」指的是胺基酸殘基苯丙胺酸(F)、組胺酸(H)、色胺酸(W)與酪胺酸(Y)以外的任何胺基酸。用語「[X，非V]」指的是纈胺酸以外的任何胺基酸。

如本文所使用的， 「核苷酸糖」或「活化糖」一詞指的是單醣的活化形式。活化單醣的範例包括但不限於UDP-半乳糖(UDP-Gal)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿拉伯-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-arabino-4-hexulose)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-來蘇-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-lyxo-4-hexulose)、UDP-N-乙醯-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙醯-L-6-脫氧塔羅糖胺(UDP-L-PneNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖)、UDP-N-乙醯胞壁酸(UDP-N-acetylmuramic acid)、UDP-N-乙醯-L-異鼠李糖(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖)、GDP-L異鼠李糖(GDP-L-quinovose)、CMP-N-乙醯神經胺酸(N-acetylneuraminic acid，CMP-Neu5Ac)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、或GDP-木糖(UDP-xylose)。核苷酸糖在醣基化反應中作為醣基供給者。這些反應被稱為醣基轉移酶的一群酵素催化。

本發明中使用的「N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶」一詞指的是以β-1,3或β-1,4鍵結從UDP-半乳糖轉移半乳糖基殘基至接受者的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。

本發明中使用的用語「N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶」與「N-乙醯葡萄糖胺β 1,3-半乳糖基轉移酶」可交替使用且指的是催化以β-1,3醣苷鍵結從供給者受質UDP-半乳糖轉移半乳糖至接受者的半乳糖基轉移酶。編碼「N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶」或前文任何用語的多核苷酸指的是編碼催化以β-1,3醣苷鍵結從供給者受質UDP-半乳糖轉移半乳糖至接受者的這類半乳糖基轉移酶。

本發明中使用的用語「N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶」與「N-乙醯葡萄糖胺β 1,4-半乳糖基轉移酶」可交替使用且指的是催化以β-1,4醣苷鍵結從供給者受質UDP-半乳糖轉移半乳糖至接受者的半乳糖基轉移酶。編碼「N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶」或前文任何用語的多核苷酸指的是編碼催化以β-1,4醣苷鍵結從供給者受質UDP-半乳糖轉移半乳糖至接受者的這類半乳糖基轉移酶。

如本文所使用的，「接受者(acceptor)」一詞指的是作為雙醣及/或寡醣的一部分且位於所述雙醣及/或寡醣的非還原端的單醣N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、單醣N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)及/或N-乙醯葡萄糖胺殘基及/或N-乙醯半乳糖胺殘基，其利用本發明任一所述的N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶進行修飾。在非還原端包含N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣及/或寡醣的範例包括但不限於GlcNAc-β1,3-Glc、GlcNAc-β1,4-Glc、GalNAc-β1,3-Glc、GalNAc-β1,4-Glc、GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc (乳糖-N-丙糖, LN3)、GalNAc-α1,3-Gal-β1,4-Glc (3’-GalNAcL)、Gal-β1,4-GlcNAc-β1,6-(GlcNAc-β1,3)-Gal-β1,4-Glc、GalNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc (β3’-GalNAcL)、GalNAc-β1,4-GlcNAc (LacdiNAc)、GalNAc-α1,3-(Fuc-α1,2)-Gal-β1,4-Glc,GalNAc-β1,4-Glc、Neu5Ac-α2,6-(GlcNAc-β1,3)-Gal-β1,4-Glc (6’-唾液酸化LN3)、Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,6-(GlcNAc-β1,3)-Gal-β1,4-Glc、GalNAc-α1,3-(Fuc-α1,2)-Gal-β1,4-(Fuc-α1,3)-Glc、GalNAc-β1,4-(Neu5Ac-α2,3)-Gal-β1,4-Glc、GlcNAc-β1,6-(Gal-β1,3)-Gal-β1,4-Glc (新-LNT(novo-LNT))、乳糖-N-戊糖 (LNP)、乳糖-N-新戊糖(lacto-N-neopentaose)、旁乳糖-N-戊糖(para lacto-N-pentaose)、旁乳糖-N-新戊糖、乳糖-N-新戊糖I(lacto-N-novopentaose I)、乳糖-N-庚糖、乳糖-N-新庚糖、旁乳糖-N-新庚糖(para lacto-N-neoheptaose)、旁乳糖-N-庚糖、異乳糖-N-壬糖(iso lacto-N-nonaose)、新乳糖-N-壬糖(novo lacto-N-nonaose)、乳糖-N-壬糖。

如本文所使用的，「雙醣」一詞指的是由兩個單醣單元所形成的醣類。雙醣的範例包括乳醣(Gal-β1,4-Glc)、乳糖-N-二糖(Gal-β1,3-GlcNAc)、N-乙醯乳糖胺(Gal-β1,4-GlcNAc)、LacDiNAc(GalNAc-β1,4-GlcNAc)、N-乙醯半乳糖胺基葡萄糖(GalNAc-β1,4-Glc)、Neu5Ac-α2,3-Gal、Neu5Ac-α2,6-Gal與哌喃岩藻糖基-(1-4)-N-乙醇醯神經胺酸 (fucopyranosyl- (1-4)-N-glycolylneuraminic acid, Fuc-(1-4)-Neu5Gc)。

本文所使用且在現有技術中一般所能理解的「寡醣」一詞指的是含有少量，通常為三至二十個單醣，即單醣的醣聚合物。本文使用的單醣是還原糖。 雙醣和寡醣可以是還原糖或非還原糖，並具有還原和非還原端。 還原糖是能夠還原另一種化合物並且自身被氧化的任何糖，亦即，糖的羰基碳被氧化成羧基。 本發明中使用的 「醣的還原端」一詞是指醣中可用於還原另一種化合物的游離變旋異構碳(free anomeric carbon)。

本文所使用的「單醣」一詞指的是無法透過水解而分解成較簡單糖類的糖，其被歸類為醛糖(aldose)或酮糖(ketose)，且每個分子包含一或多個羥基。單醣為僅包含一個簡單糖的醣類。單醣的範例包括己糖、D-葡萄呱喃糖(D-glucopyranose)、D-半乳呋喃糖(D-galactofuranose)、D-半乳呱喃糖、L-半乳呱喃糖、D-甘露呱喃糖、D-異呱喃糖(D-allopyranose)、L-阿卓呱喃糖(L-altropyranose)、D-古洛呱喃糖(D-gulopyranose)、L-艾杜呱喃糖(L-idopyranose)、D-塔羅呱喃糖(D-talopyranose)、D-核呋喃糖、D-核呱喃糖、D-阿拉伯呋喃糖、D-阿拉伯呱喃糖、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯呱喃糖、D-木呱喃糖(D-xylopyranose)、D-來蘇呱喃糖(D-lyxopyranose)、D-赤藻呋喃糖(D-erythrofuranose)、D-蘇呋喃糖(D-threofuranose)、庚糖、L-甘油-D-甘露呱喃庚糖(LDmanHep) , D-甘油-D-甘露呱喃庚糖 (DDmanHep)、6-去氧-L-阿卓呱喃糖、6-去氧-D-古洛呱喃糖、6-去氧-D-塔羅呱喃糖、6-去氧-D-半乳呱喃糖、6-去氧-L-半乳呱喃糖、6-去氧-D-甘露呱喃糖、6-去氧-L-甘露呱喃糖、6-去氧-D-古洛呱喃糖、2-去氧-D-阿拉伯己糖、2-去氧-D-赤藻戊糖、2,6-雙去氧-D-阿拉伯呱喃己糖、3,6-雙去氧-D-阿拉伯呱喃己糖、3,6-雙去氧-L-阿拉伯呱喃己糖、3,6-雙去氧-D-木呱喃己糖(3,6-dideoxy-D-xylopyranose)、3,6-雙去氧-D-核呱喃己糖、2,6-雙去氧-D-核呱喃己糖、3,6-雙去氧-L-木呱喃己糖、2-胺基-2-去氧-D-葡萄呱喃糖、2-胺基-2-去氧-D-半乳呱喃糖、2-胺基-2-去氧-D-甘露呱喃糖、2-胺基-2-去氧-D-異呱喃糖、2-胺基-2-去氧-L-阿卓呱喃糖、2-胺基-2-去氧-D-古洛呱喃糖、2-胺基-2-去氧-L-艾杜呱喃糖、2-胺基-2-去氧-D-塔羅呱喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-葡萄呱喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-半乳呱喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-甘露呱喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-異呱喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-阿卓呱喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-古洛呱喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-艾杜呱喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-塔羅呱喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-半乳呱喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳呱喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露呱喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-葡萄呱喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿卓呱喃糖、2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-D-塔羅呱喃糖、D-葡萄呱喃糖醛酸(D-glucopyanuronic acid)、D-半乳呋喃糖醛酸、D-甘露呱喃糖醛酸、D-異呱喃糖醛酸、L-阿卓呱喃糖醛酸、D-古洛呱喃糖醛酸、L-古洛呱喃糖醛酸、L-艾杜呱喃糖醛酸、D-塔羅呱喃糖醛酸、唾液酸(sialic acid)、5-胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-非-2-酮醣酸(5-Amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulosonic acid)、5-乙醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-非-2-酮醣酸、5-乙醇醯胺基-3,5-雙去氧-D-甘油-D-半乳-非-2-酮醣酸(5-Glycolylamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulosonic acid)、赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、D-核-己-2-呱喃酮糖(D-ribo-Hex-2-ulopyranose)、D-阿拉伯-己-2-呋喃酮糖(D-果呋喃糖)、D-阿拉伯-己-2-呱喃酮糖、D-木-己-2-呱喃酮糖、L-來蘇-己-2-呱喃酮糖、D-來蘇-己-2-呱喃酮糖、D-蘇-戊-2-呱喃酮糖(D-threo-pent-2-ulopyranose)、D-阿卓-庚-2呱喃酮糖、3-C-(羥甲基)-D-赤藻呋喃糖、2,4,6-三去氧-2,4-二胺基-D-葡萄呱喃糖、6-去氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖(3-O-mehtyl-rhamnose)、2,6-雙去氧-3甲基-D-核己糖、2-胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄呱喃糖(2-Amino-3-O-[(R)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucopyranose)、2-乙醯胺基-3-O-[(R)-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄呱喃糖、2-乙醇醯胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄呱喃糖(2-Glycolylamido-3-O-[(R)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucopyranose)、3-去氧-D-來蘇-庚-2-呱喃酮糖酸(3-Deoxy-D-lyxo-hept-2-ulopyranosaric acid)、3-去氧-D-甘露-辛-2-呱喃酮糖酸、3-去氧-D-甘油-D-半乳-非-2-呱喃酮糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-L-甘油-L-甘露-非-2-呱喃酮糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-L-甘油-L-阿卓-非-2-呱喃酮糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-D-甘油-D-半乳-非-2-呱喃酮糖酸、5,7-二胺基-3,5,7,9-四去氧-D-甘油-D-塔羅-非-2-呱喃酮糖酸、葡萄糖、半乳糖、N-乙醯胺基葡萄糖、胺基葡萄糖、甘露糖、木糖、N-乙醯甘露糖胺、N-乙醯神經胺酸、N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid)、唾液酸、N-乙醯半乳糖胺、半乳糖胺、岩藻糖、鼠李糖、葡萄醣醛酸(glucuronic acid)、葡萄糖酸(gluconic acid)、果糖和多元醇(polyols)。

「多元醇」一詞是指含有多個羥基的醇類。例如，甘油、山梨醇或甘露糖醇。

本發明中所使用的「半乳糖化雙醣」一詞包括Gal-β1,3-GlcNAc、Gal-β1,4-GlcNAc、Gal-β1,3-GalNAc與Gal-β1,4-GalNAc，其中半乳糖分別以β-1,3鍵結或β-1,4鍵結分別連接至N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)或N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)，且其中N-乙醯葡萄糖胺或N-乙醯半乳糖胺位於雙醣的還原端且半乳糖位於雙醣的非還原端。術語「Gal-β1,3-GlcNAc」、「Galβ1,3GlcNAc」、「乳糖-N-雙糖(lacto-N-biose)」、「LNB」、「I型LacNAc」、「LacNAc(I)」可交替使用，且指的是半乳糖以β-1,3鍵結連接至N-乙醯葡萄糖胺的雙醣，且其中N-乙醯葡萄糖胺位於雙醣的還原端。術語「「Gal-β1,4-GlcNAc」、「Galβ1,4GlcNAc」、「N-乙醯乳糖胺」、「LacNAc」、「II型LacNAc」、「LacNAc(II)」可交替使用，且指的是半乳糖以β-1,4鍵結連接至N-乙醯葡萄糖胺的雙醣，且其中N-乙醯葡萄糖胺位於雙醣的還原端。

術語「Gal-β1,3-GalNAc」、「Galβ1,3GalNAc」、「T-雙醣」可交替使用，且指的是半乳糖以β-1,3鍵結連接至N-乙醯半乳糖胺的雙醣，且其中N-乙醯半乳糖胺位於雙醣的還原端。

術語「Gal-β1,4-GalNAc」、「Galβ1,4GalNAc」可交替使用，且指的是半乳糖以β-1,4鍵結連接至N-乙醯半乳糖胺的雙醣，且其中N-乙醯半乳糖胺位於雙醣的還原端。

本發明中所使用的「半乳糖化寡醣」一詞指的是由三至二十的單醣單元所構成的寡醣，其中末端非還原半乳糖以β-1,3鍵結或β-1,4鍵結連接至N-乙醯葡萄糖胺或N-乙醯半乳糖胺。本發明中所使用的寡醣可以是線性結構或可包括分枝(branch)。兩個糖單元間的鍵結(例如，醣苷鍵、半乳糖苷鍵(galactosidic linkage)、葡萄糖苷鍵等)可以以如1,4、1-＞4或(1-4)表示，於本文可交替使用。例如，術語「Gal-β1,4-Glc」、「β-Gal-(1-＞4)-Glc」、「Galβ1-4-Glc」與「Gal-β(1-4)-Glc」具有相同的意思，亦即，β醣苷鍵連接半乳糖(Gal)的1號碳與葡萄糖的4號碳。每個單醣可以是環狀的形式(例如，呱喃或呋喃形式)。個別單醣單元之間的鍵結可包括α1-＞2、α1-＞3、α1-＞4、α1-＞6、α2-＞1、α2-＞3、α2-＞4、α2-＞6、β1-＞2、β1-＞2、β1-＞3、β1-＞4、β1-＞6、β2-＞1、β2-＞3、β2-＞4與β2-＞6。寡醣可包含α與β醣苷鍵或可僅包含β醣苷鍵。

本發明中所使用的術語「葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶」、「葡萄糖胺-磷酸N-乙醯轉移酶」、「GNA」、「GNA1」、「葡萄糖胺6P N-乙醯轉移酶」、「GlcN6P N-乙醯轉移酶」可交替使用，且指的是催化轉移乙醯輔酶A的乙醯基團至葡萄糖胺-6-磷酸中的初級胺以產生N-乙醯-D-葡萄糖胺-6-磷酸的酵素，後者也稱為GlcNAc-6P。編碼「葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶」或以上任何術語的的多核苷酸指的是，編碼催化轉移乙醯輔酶A的乙醯基團至葡萄糖胺-6-磷酸中的初級胺以產生N-乙醯-D-葡萄糖胺-6-磷酸的酵素的多核苷酸。

本發明中所使用的術語「果糖-6-磷酸胺基轉移酶」、「麩醯胺酸-D-果糖-6磷酸-胺基轉移酶」、「麩醯胺酸-D-果糖-6磷酸胺基轉移酶」、「L-麩醯胺酸-D-果糖-6磷酸-胺基轉移酶」、「glmS」、「glms」、「glmS*54」可交替使用，且指的是以麩醯胺酸作為氮源催化將果糖-6-磷酸轉變為葡萄糖胺6鄰酸的酵素。編碼「果糖-6-磷酸胺基轉移酶」或以上任何術語的的多核苷酸指的是，編碼以麩醯胺酸作為氮源催化將果糖-6-磷酸轉變為葡萄糖胺6鄰酸的酵素的多核苷酸。

「純化的」一詞指的是實質上不含干擾生物分子活性的成分的材料。對於細胞、醣類、核酸與多肽而言，「純化的」一詞指的是不含在天然狀態下通常伴隨材料的成分的材料。一般而言，本發明純化的醣類、寡醣、蛋白質或核酸的純度至少約為50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %或85 %，通常至少約為90 %、91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %，利用銀染凝膠上的條帶強度或其他決定純度的方法進行測量。可利用本領域習知的許多方法來表明純度或均質度，例如，蛋白質或核酸樣品的聚丙烯醯胺凝膠電泳，並接著進行染色而顯像。出於某些目的，需要高解析度並使用 HPLC 或類似的純化方法。對於寡醣而言，可利用以下方法，但不限於薄層色層分析、氣相色層分析、NMR、HPLC、毛細管電泳或質譜法來決定純度。

術語「相同」或「相似度百分比」或「%相似度」在兩個或兩個以上的核酸或多肽序列的情形中，是指兩個或兩個以上的序列或子序列，當用序列比較演算法或目測法測量就最大對應性進行比較和比對時，其是相同的或具有特定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸。對於序列比較，一個序列作為參照序列，將測試序列與之進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列和參照序列輸入電腦，必要時指定子序列坐標，並指定序列演算法程式參數。然後，序列比較演算法根據指定的程式參數，計算測試序列相對於參照序列的序列百分比相似度。可以在參考序列的全長序列上整體計算百分比相似度，從而得到整體百分比相似度分數。或者，可以在參考序列的部分序列上計算百分比相似度，從而得到局部百分比相似度分數。在局部序列比對中使用參考序列的全長可產生測試和參考序列之間的整體百分比相似度分數。可利用不同演算法決定百分比相似度，例如BLAST與PSI-BLAST(Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:3, 403- 410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25: 17, 3389-402)、Clustal Omega方法(Sievers et al., 2011, Mol. Syst. Biol. 7:539), MatGAT方法(Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics, 4:29)或EMBOSS Needle。

比對的BLAST(局部比對檢索基本工具)方法是由美國國家生物技術資訊中心所提供的演算法，利用預設參數來比較序列。程式將核苷酸或蛋白質序列與序列資料庫進行比較並計算統計上的顯著性。PSI-BLAST(位置特定疊代局部比對檢索基本工具)從使用蛋白質-蛋白質BLAST(BLASTp)檢測到的高於給定分數閾值的序列的多序列比對中得出位置特定計分矩陣(position-specific scoring matrix, PSSM)或概述。BLAST方法可用於成對或多序列比對。成對序列比對用以識別可能表明兩個生物序列(蛋白質或核酸)之間的功能、結構和/或進化關係的相似區域。BLAST的網頁介面位於：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

Clustal Omega (Clustal W) 是一個多序列比對程式，其使用種子引導樹(seeded guided tree)和 HMM profile-profile技術來產生三個或三個以上的序列之間的比對結果。它產生不同序列的具有生物學意義的多序列比對。Clustal W的網頁介面位於：https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/。使用Clustal W方法進行多序列比對與蛋白質序列的百分比相似度的預設參數為：啟用輸入序列的去比對：FALSE；啟用類mbed群集引導樹(mbed-like clustering guide-tree)：TRUE；啟用類mbed群集疊代(mbed-like clustering iteration)：TRUE；(結合引導樹/HMM)疊代數量：預設(0)；最大引導樹疊代：預設[-1]；最大HMM疊代[-1]；順序：對齊的(aligned)。

矩陣整體比對工具(Matrix Global Alignment Tool, MatGAT) 是一種電腦應用程式，可生成 DNA 或蛋白質序列的相似性(similarity)/相似度(identity)矩陣，而無需對數據進行預比對。程式使用 Myers 和 Miller 整體比對算法執行一系列成對比對，計算相似性和相似度，然後將結果放入距離矩陣中。使用者可以指定哪種類型的比對矩陣(例如，BLOSUM50、BLOSUM62 和 PAM250)用於檢視蛋白質序列。

EMBOSS Needle (https://galaxy-iuc.github.io/emboss-5.0-docs/needle.html)使用 Needleman-Wunsch 整體比對演算法在考慮兩個序列的全長時找到它們的最佳比對(包括間隙)。動態程序法通過探索所有可能的比對結果並選擇最佳比對結果來確保最佳比對結果。Needleman-Wunsch演算法是可以按 mn 步驟的順序(其中m與n為兩序列的長度)計算最佳分數和比對結果的一類演算法的成員之一。間隙開放懲罰(gap open penalty)(預設10.0)為產生間隙時的分數。預設數值假設你對蛋白質序列使用EBLOSUM62矩陣。間隙延伸(預設0.5)懲罰被添加至間隙中每個鹼基或殘基的標準間隙懲罰。這便是長間隙如何被懲罰的。

如本文所使用的，具有相對於參考多肽序列的全長序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽可被理解為此序列對於參考多肽序列的胺基酸序列具有80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、91 %、91.50 %、92.00 %、92.50 %、93.00 %、93.50 %、94.00 %、94.50 %、95.00 %、95,50 %、96.00 %、96,50 %、97.00 %、97,50 %、98.00 %、98,50 %、99.00 %、99,50 %、99,60 %、99,70 %、99,80 %、99,90 %、100 %的序列相似度。在本申請中，除非另有明確指明，否則多肽(或DNA序列)包括/具有/由相對於參考多肽序列(或核苷酸序列)的全長胺基酸序列(或核苷酸序列)，通常以SEQ ID NO或UniProt ID或Genbank NO.所指明，具有至少80%序列相似度的胺基酸序列(或核苷酸序列)所組成，較佳為相對於全長參考序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相似度，更佳具有至少85%的序列相似度，更佳具有至少90%的序列相似度，最佳具有至少95%的序列相似度。

為了達到本發明的目的，使用MatGAT2.01(Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4:29)來決定百分比相似度。採用以下蛋白質的預設參數：(1)間隙成本 存在：12以及延長：2；(2) 使用的矩陣為BLOSUM65。在較佳實施例中，根據給定SEQ ID NO(即，參考序列)的全長序列或其部分來計算序列相似度。其部分較佳是指完整參考序列的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。

「培養」一詞是指培養或發酵細胞的培養基、細胞本身，以及本發明的細胞在全培養基(whole broth)中產生的半乳糖化雙及/或寡醣，即在細胞內部(細胞內)和外部(細胞外)。

「哺乳動物乳汁寡醣(mammalian milk oligosaccharides, MMOs)」包括哺乳期任何階段的乳汁中存在的寡醣，包括人類的初乳(即，人乳寡醣或HMOs)和哺乳動物的初乳，哺乳動物包括但不限於牛( Bos Taurus)、羊( Ovis aries)、山羊( Capra aegagrus hircus)、雙峰駝( Camelus bactrianus)、馬( Equest ferus caballus)、豬( Sus scropha)、狗( Canis lupus familiaris)、埃佐棕熊( Ursus arctos yesoensis)、北極熊( Ursus maritimus)、日本黑熊( Ursus thibetanus japonicus)、條紋臭鼬( Mephitis mephitis)、海豹( Cystophora cristata)、亞洲象( Elephas maximus)、非洲象( Loxodonta africana)、巨型食蟻獸( Myrmecophaga tridactyla)、普通瓶鼻海豚( Tursiops truncates)、北方小鯨( Balaenoptera acutorostrata)、塔馬小袋鼠( Macropus eugenii)、紅袋鼠( Macropus rufus)。普通刷尾負鼠( Trichosurus Vulpecula)、考拉( Phascolarctos cinereus)、東方崑崙( Dasyurus viverrinus)、鴨嘴獸( Ornithorhynchus anatinus)。人乳寡醣(HMOs)也被稱為相同人乳寡醣，其化學成分與人乳中的人乳寡醣相同，但是是透過生物技術生產的(例如，使用無細胞系統或包括細菌、真菌、酵母、植物、動物或原生動物細胞和生物體，較佳為基因改造細胞和生物體）。相同人乳寡醣在市場上的名稱為HiMO。

本文所用的「膜運輸蛋白」是指作為細胞膜的一部分或與之相互作用並控制分子和資訊在細胞內外流動的蛋白質。因此，膜蛋白參與運輸作用，無論是輸入至細胞中或輸出至細胞外。

這樣的膜運輸蛋白可以是運輸蛋白(porter)、P-P鍵結水解驅動運輸蛋白、β桶孔蛋白(β-barrel porin)、輔助運輸蛋白(auxiliary transport protein)、推定運輸蛋白(putative transport protein)及磷酸轉移驅動基團轉位蛋白(phosphotransfer-driven group translocator) 由Saier實驗室生物資訊學組操作和策劃位於www.tcdb.org的運輸蛋白分類資料庫而定義，運輸蛋白分類資料庫提供膜運輸蛋白的功能和系統發育分類。運輸蛋白分類資料庫詳細介紹了IUBMB批准的膜運輸蛋白的綜合分類系統，稱為膜運輸蛋白分類(transporter classification, TC)系統。如本文所述的TCDB分類檢索是根據TCDB.org於2019年6月17日釋出的版本而定義。

運輸蛋白(porter)是單向運輸蛋白(uniporter)、同向運輸蛋白(symporter)、反向運輸蛋白(antiporter)的共同名稱，其利用載體所介導的過程(Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379)。它們屬於電化學電位驅動的運輸蛋白，也被稱為二級載體型促進子(facilitator)。當膜運輸蛋白利用載體介導的過程來催化二級載體的單向運輸或單一物質透過促進擴散或在膜電位依賴性的過程中(如果溶質是帶電的)進行運輸時；當兩個或更多種的物質在一個緊密耦合的過程中二級載體向相反的方向運輸時，不與化學能以外的直接能量形式相耦合；和/或當兩個或更多的物種在一個緊密耦合的過程中二級載體一起向同一方向運輸時，不與化能以外的直接能量形式相耦合，由(Forrest et al. , Biochim. Biophys. Acta 1807 (2011) 167-188)，則包括在這一分類之中。這些系統通常具有立體特異性。溶質：溶質反運輸是二級載體的一個特點。運輸蛋白與酵素的動態締合產生了功能性膜運輸代謝物(metabolon)，將通常從細胞外獲得的通道受質直接輸送到其細胞代謝中(Moraes andReithmeier, Biochim. Biophys. Acta 1818 (2012), 2687-2706)。藉由此運輸蛋白系統運輸的溶質包括但不限於陽離子、有機陰離子、無機陰離子、核苷、胺基酸、多元醇、磷酸化的醣解中間產物(phosphorylated glycolytic intermediates)、滲透物、螯鐵蛋白(siderophores)。

如果膜運輸蛋白水解無機焦磷酸鹽、ATP 或另一種三磷酸核苷的二磷酸鍵以驅動溶質的主動攝入(uptake)及/或排出(extrusion)，膜運輸蛋白則包含於P-P鍵結水解驅動運輸蛋白類別(Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379)。膜運述蛋白可能會或可能不會暫時被磷酸化，但受質不會被磷酸化。透過P-P鍵結水解驅動運輸蛋白類別所運輸的受質包括但不限於陽離子、重金屬、β-葡聚醣、UDP-葡萄糖、脂多醣、磷壁酸(teichoic acid)。

β桶孔蛋白膜運輸蛋白形成穿膜孔洞，通常使溶質得以不需能量便橫跨穿越膜。這些蛋白的穿膜部分完全由形成β桶的β股(β-strand)所組成(Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379)。這些孔蛋白型蛋白質存在於革蘭氏陰性菌、粒線體、色素體(plastid)的外膜中，且可能存在於抗酸性的(acid-fast)革蘭氏陽性菌的外膜中。藉由這些β桶孔蛋白所運輸的溶質包括但不限於核苷、棉子糖(raffinose)、葡萄糖、β-葡萄糖苷、寡醣。

輔助運輸蛋白(auxiliary transport protein)定義為促進橫跨一或更多的生物膜的運輸的蛋白質，但其本身不會直接參與運輸的過程。這些膜運輸蛋白總是與一或多個已建立的運輸系統一起作用，例如但不限於外膜因子(outer membrane factors, OMFs)、多醣運輸蛋白(polysaccharide porters, PST porters)、ATP-結合匣 (ATP-binding cassette, ABC)運輸蛋白。它們可提供與能量耦合運輸相關的功能、在複合物形成的過程中扮演結構性的角色、發揮生物或穩定性功能或調節功能(Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379)。輔助運輸蛋白的範例包括但不限於參與多醣運輸的多醣共聚酶家族，參與細菌素(bacteriocin)和化學毒素運輸的膜融合蛋白家族。

推定運輸蛋白(putative transport protein) 包含的家族在成員的運輸功能建立時歸類到別處，或者是在提議的運輸功能被否定時從運輸蛋白分類系統中刪除。這些家族包括一個或多個成員，已建議其具有運輸功能，但這種功能的證據尚不完整(Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379)。如2019年6月17日所釋出，在TCDB系統之下分類為此群組的推定運輸蛋白範例包括但不限於銅運輸蛋白。

磷酸轉移驅動基團轉位蛋白(phosphotransfer-driven group translocator)也稱為細菌磷酸烯醇丙酮酸鹽：糖磷酸轉移酶系統(PTS)的PEP依賴性磷醯基轉移驅動轉位蛋白。衍生自胞外糖的反應產物為細胞質糖磷酸(cytoplasmic sugar-phosphate)。催化糖磷酸化的酵素成分在緊密耦合的過程中疊加在運輸過程中。PTS系統涉及許多不同的方面，包括調節和趨化性、生物膜形成和發病機制(Lengeler, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 25 (2015) 79-93; Saier, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 25 (2015) 73-78)。如2019年6月17日所釋出，在TCDB系統之下分類在磷酸轉移驅動基團轉位蛋白之中的膜運輸蛋白家族包括與葡萄糖-葡萄糖苷、果糖-甘露糖醇、乳糖-N,N'-二乙醯幾丁二糖-β-葡萄糖苷(lactose-N,N’-diacetylchitobiose-beta-glucoside)、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖-果糖-山梨糖和抗壞血酸的轉運相關的 PTS 系統。

主要促進子超家族(main facilitator superfamily, MFS)是一個膜運輸蛋白超家族，催化單向運輸、溶質：陽離子(H ⁺，但少數是Na ⁺)同向運輸及/或溶質：H ⁺或溶質：溶質反向運輸。根據Saier實驗室生物資訊學組(www.tcdb.org)運作的運輸蛋白體分類資料庫的定義，大多數運輸蛋白的長度為400-600個胺基酸殘基，具有12、14或偶爾24個穿膜α螺旋形扳手(transmembrane α-helical spanners, TMS)。

本文所使用的「糖流出運輸蛋白(sugar efflux transporter, SET)」指的是SET家族的膜蛋白，SET家族的膜蛋白為具有InterPRO結構域IPR004750的蛋白質及/或屬於eggNOGv4.5家族ENOG410XTE9的蛋白質。可使用https://www.ebi.ac.uk/interpro/的線上工具或以預設數值使用InterProScan(https://www.ebi.ac.uk/interpro/download.html)的獨立版本來識別interPRO結構域。可使用eggNOG-mapperv1 (http://eggnogdb.embl.de/#/app/home) 的獨立版本來識別eggNOGv4.5中的異種同源家族。

本文所使用的「螯鐵蛋白(siderophore)」指的是各種微生物主要為鐵離子特異性螯合劑的次級代謝物。這些分子被分類為兒茶酚酸鹽(catecholater)、異羥肟酸鹽(hydroxamate)、羧酸鹽和混合類型。 螯鐵蛋白通常由非核醣體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)依賴性途徑或 NRPS 非依賴性途徑 (NRPS independent pathway, NIS) 合成。NRPS依賴性螯鐵蛋白生物合成途徑中最重要的前驅物為分支酸(chorismate)。可由分支酸利用異分支酸合成酶、異分支酸酶與2, 3-二羥基苯甲酸-2, 3-脫氫酶催化的三步反應形成2,3-DHBA。當使用鳥胺酸(ornithine)作為螯鐵蛋白的前驅物時，生物合成取決於L-鳥胺酸N5-單加氧酶(L-ornithine N5-monooxygenase)催化的鳥胺酸羥基化。在NIS途徑中，螯鐵蛋白生物合成的重要步驟為N(6)-羥基離胺酸合成酶(N(6)-hydroxylysine synthase)。

將螯鐵蛋白輸出至細胞外所需的運輸蛋白。至今為止，在過程中鑑定出了四個膜蛋白超家族：主要促進子超家族(MFS)、多藥/寡醣脂/多醣翻轉酶超家族(Multidrug/Oligosaccharidyl-lipid/Polysaccharide Flippase Superfamily, MOP)、抗性、結瘤與細胞分裂超家族(the resistance, nodulation and cell division superfamily, RND)與ABC超家族。一般而言，參與螯鐵蛋白輸出的基因會與螯鐵蛋白基因群集在一起。本文所使用的「螯鐵蛋白輸出蛋白」一詞指的是將螯鐵蛋白輸出至細胞外所需的運輸蛋白。

ATP結合匣(ATP-binding cassette, ABC)超家族包含攝入與流出運輸系統，且這兩群組的成員一般會鬆散地群集在一起。沒有蛋白質磷酸化的 ATP 水解為運輸提供能量。ABC 超家族中有幾十個家族，家族通常與受質特異性相關。成員根據由 Saier實驗室生物資訊學組運作的運輸蛋白分類資料庫定義的 3.A.1 類進行分類，其位於www.tcdb.org，並提供膜運輸蛋白的功能和系統親源分類。

「允許流出(enabled efflux)」一詞指的是導入溶質在細胞膜及/或細胞壁的運輸活性。所述的運輸可以透過導入及/或增加本發明中所述的運輸蛋白的表現量而實現。「增強的流出」一詞指的是改善溶質在細胞膜及/或細胞壁的運輸活性。可透過導入及/或增加本發明中所述的膜運輸蛋白的表現量來增強溶質在細胞膜及/或細胞壁的運輸。膜運輸蛋白的「表現」定義為編碼所述膜運輸蛋白的基因在所述基因是內源基因的情況下的「過度表現」，或在編碼所述膜運輸蛋白的基因是異源基因的情況下的「表現」，而異源基因不存在於野生型菌株或細胞中。

如本文所使用的，「前驅物」一詞是指被細胞吸收及/或合成用於生產特定寡醣的物質。就此意義而言，前驅物可以是如本文所定義的接受者(acceptor)，但也可以是另一物質-代謝物，在細胞內作為寡醣的生化合成路徑的一部分而先進行修飾。這類前驅物的範例包括本文所定義的接受者，及/或葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、二羥基丙酮、胺基葡萄糖、N-乙醯葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙醯甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙醯半乳糖胺、磷酸化糖例如但不限於葡萄糖-1-磷酸、半乳糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、甘露糖-6-磷酸、甘露糖-1-磷酸、甘油-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸、二羥基丙酮-磷酸、葡糖胺-6-磷酸、N-乙醯-葡糖胺-6-磷酸、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸、N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸、N-乙醯-神經胺酸-9-磷酸及/或如本文所定義的核苷酸活化糖，例如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙醯葡萄糖胺、CMP-唾液酸、GDP-甘露糖、GDP-4-脫氫-6-去氧-α-D-甘露糖、GDP-岩藻糖。

在本申請中，除非另有明確說明，否則「合成(synthesize或synthesis)」與「合成的(synthesized)」的表現方式可分別與「產生(produce或production)」及「產生的(produced)」的表現方式交替使用。

Claims (79)

1. 一種N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶在合成半乳糖化雙醣或寡醣的用途，其中所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶： -半乳糖化作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺；及/或 -半乳糖化作為雙醣及/或寡醣的一部分且位於所述雙醣及/或寡醣的非還原端的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺； 其特徵在於，所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶為： A. N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶，其具有： a. PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 1的序列[AGPS]XXLN(X _n)RXDXD，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 2的序列PXXLN(X _n)RXDXD(X _m)[FWY]XX[HKR]XX[NQST]，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是FA、FS、YC或YS的組合，且其中n為12至17且m為100至115；或 iii) 包括SEQ ID NO: 3或4任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 3或4任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 3或4的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 3或4任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 為SEQ ID NO: 3或4任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 3或4任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 3或4任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 b. PFAM結構域IPR002659，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 5的序列KT(X _n)[FY]XXKXDXD(X _m)[FHY]XXG(X，非A、G、S)(X _p)(X，非F、H、W、Y)[DE]D[ILV]XX[AG]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至16、m為35至70且p為20至45；或 ii) 包括SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者所示的多肽序列；或 iii) 為SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 6、7、8或9的N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 iv) 包括來自SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 為SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 包括包含相對於SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 6、7、8或9任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶的活性； 或 B. N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶，其具有： a. PFAM結構域PF01755，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 10的序列EXXCXXSHX[AFILTY]LW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 11的序列EXXCXXSH[LR]VLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 iii) 包括具有SEQ ID NO: 12的序列EXXCXXSH[VHI]SLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV]，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 iv) 包括具有SEQ ID NO: 13的序列EXXCXXSHYMLW(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 v) 包括具有SEQ ID NO: 14的序列EXXCXXSHXX(X，非V)Y(X _n)EDD(X _m)[ACGST]XXY[ILMV] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為13至15且m為50至75；或 vi) 包括SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者所示的多肽序列；或 vii) 為SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 viii) 包括來自SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 ix) 為SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 x) 包括包含相對於SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 15、16、17、18、19、20、21、22或23任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 b. PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 24的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE]，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75且m為10至30；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 25的序列R[KN]XXXXXXXGXXXX[FL](X，非V)DXD(X _n)[FHW]XXX[FHNY](X _m)E[DE](X _p)[FWY]XX[HKR]XX[NQST] ，其中X為任何胺基酸，且其中n為50至75、m為10至30且p為20至25；或 iii) 包括SEQ ID NO: 26或27任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 26或27任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 26或27的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 26或27任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 為SEQ ID NO: 26或27任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 26或27任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 26或27任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 c. PFAM結構域PF02709且非PFAM結構域PF00535，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 28的序列[FWY]XX[FWY](X _n)[FWY][GQ]X[DE]D，其中X為任何胺基酸，但第2、3位XX的組合不會是IP或NL的組合，且其中n為21至26；或 ii) 包括SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者所示的多肽序列；或 iii) 為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 iv) 包括來自SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 為SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 包括包含相對於SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 29、30、31、32、33或34任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 d. PFAM結構域PF03808，且 i) 包括具有SEQ ID NO: 35的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25；或 ii) 包括具有SEQ ID NO: 36的序列[ST][FHY]XN(X _n)DGXXXXXXXXXXXXXXXX[HKR]X[ST]FDXX[ST]XA(X _m)[HR]XG[FWY](X _p)GXGXXXQ[DE]，其中X為任何胺基酸，且其中n為20至25、m為40至50且p為22至30；或 iii) 包括SEQ ID NO: 37、38或39任一者所示的多肽序列；或 iv) 為SEQ ID NO: 37、38或39任一者的功能性同源物、變體或衍生物，其相對於具有SEQ ID NO: 37、38或39的N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶多肽任一者的全長，具有至少80%全體序列相似度，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 v) 包括來自SEQ ID NO: 37、38或39任一者至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個連續胺基酸殘基的寡肽序列，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vi) 為SEQ ID NO: 37、38或39任一者的功能性片段，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性；或 vii) 包括包含相對於SEQ ID NO: 37、38或39任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列的多肽，或包括由相對於SEQ ID NO: 37、38或39任一者的全長胺基酸序列具有至少80%序列相似度的胺基酸序列所組成的多肽，且具有N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的活性。
2. 一種使用如請求項1所述之N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途來合成半乳糖化雙醣或寡醣的方法。
3. 如請求項2所述之方法，其中所述合成步驟包括以下步驟： a. 提供UDP-半乳糖與任一所述半乳糖基轉移酶，其中所述半乳糖基轉移酶可從所述UDP-半乳糖的供給者將半乳糖殘基轉移至一或多個接受者；且 b. 在半乳糖基轉移酶催化從所述UDP-半乳糖將半乳糖殘基轉移至所述接受者的條件下，使任一所述半乳糖基轉移酶及UDP-半乳糖與一或多個接受者接觸； c. 較佳的是，分離所述半乳糖化雙醣或寡醣。
4. 如請求項3所述之方法，其中所述接受者為作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺，及/或在其非還原端具有N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣或寡醣。
5. 如請求項2至4中任一項所述之方法，其中所述半乳糖化雙醣或寡醣係於無細胞系統中所產生。
6. 如請求項2至4中任一項所述之方法，其中所述半乳糖化雙醣或寡醣係由細胞所產生。
7. 如請求項6所述之方法，其中所述細胞： -可合成一或多個所述接受者；且 -表現所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的任一者；且 -可為所述半乳糖基轉移酶合成作為供給者的UDP-半乳糖(UDP-Gal)。
8. 如請求項6或7所述之方法，其中所述細胞更可合成擇自包含以下所列的名單的一或多種核苷酸-糖供給者：GDP-Fuc、CMP-Neu5Ac、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿拉伯-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-arabino-4-hexulose)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-來蘇-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-lyxo-4-hexulose)、UDP-N-乙醯-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙醯-L-6-脫氧塔羅糖胺(UDP-L-PneNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖)、UDP-N-乙醯胞壁酸(UDP-N-acetylmuramic acid)、UDP-N-乙醯-L-異鼠李糖(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖)、GDP-L異鼠李糖(GDP-L-quinovose)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4,5Ac2、CMP-Neu5,7Ac2、CMP-Neu5,9Ac2、CMP-Neu5,7(8,9)Ac2、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、GDP-木糖(UDP-xylose)。
9. 如請求項6至8中任一項所述之方法，其中所述細胞更可表現擇自包含以下所列的名單的一或多種醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸基轉移酶、半乳醣醛酸基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醇醯神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醇鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯-β-L-阿卓糖胺轉胺酶(UDP-4-amino-4,6-dideoxy-N-acetyl-β-L-altrosamine transaminase)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶(UDP-N-acetylglucosamine enopyruvyl transferase)及岩藻糖胺基轉移酶； -較佳的是，所述岩藻糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶； -較佳的是，所述唾液酸轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶； -較佳的是，所述半乳糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶； -較佳的是，所述葡萄糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶； -較佳的是，所述甘露糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶； -較佳的是，所述N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶；且 -較佳的是，所述N-乙醯半乳糖胺基轉移酶為α-1,3-N-乙醯半乳糖胺基轉移酶。
10. 如請求項6至9中任一項所述之方法，其中所述細胞為代謝改造細胞。
11. 如請求項10所述之方法，其中利用一或多種基因表現模組(gene expression module)來改造所述細胞，其特徵在於，源自任何所述基因表現模組的表現為持續性的(constitutive)或係透過自然誘導物(natural inducer)而產生。
12. 如請求項10或11中任一項所述之方法，其中所述細胞包括編碼一個蛋白質的相同編碼DNA序列的多個拷貝。
13. 如請求項6至12中任一項所述之方法，其中所述細胞係經修飾酵素的表現或活性，所述酵素係擇自包含以下所列的群組：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶。
14. 如請求項6至13中任一項所述之方法，其中所述細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉換成葡萄糖胺-6-磷酸，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸轉換成果糖-6-磷酸。
15. 如請求項6至14中任一項所述之方法，其中所述細胞係經修飾以增加UDP-半乳糖的產生，且其中所述修飾係擇自包含以下所列的群組：剔除編碼5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶的基因或剔除編碼半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)的基因。
16. 如請求項6至15中任一項所述之方法，其中所述細胞使用一或多種前驅物以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣，所述前驅物是由培養基提供給所述細胞。
17. 如請求項6至16中任一項所述之方法，其中所述細胞產生一或多種前驅物以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣。
18. 如請求項16或17所述之方法，其中用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的所述前驅物完全轉變為所述半乳糖化雙醣或寡醣。
19. 如請求項6至18中任一項所述之方法，其中所述細胞於胞內產生所述半乳糖化雙醣或寡醣，且其中一部分或實質上所有所述產生的半乳糖化雙醣或寡醣保留於胞內，及/或透過被動或主動運輸分泌至所述細胞之外。
20. 如請求項6至19中任一項所述之方法，其中所述細胞表現膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽，藉此將化合物運輸穿越細胞壁的外膜，較佳的是，所述細胞係經修飾所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽的表現或活性。
21. 如請求項20所述之方法，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽係擇自於包含以下所列的名單：運輸蛋白(porter)、P-P鍵結水解驅動運輸蛋白、β桶孔蛋白(β-barrel porin)、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白(putative transport protein)及磷酸轉移驅動基團轉位蛋白(phosphotransfer-driven group translocator)，較佳的是，所述運輸蛋白(porter)包括MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵體輸出蛋白(siderophore exporter)，較佳的是，所述P-P鍵結水解驅動運輸蛋白包括ABC運輸蛋白與螯鐵體輸出蛋白。
22. 如請求項20或21所述之方法，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制所述半乳糖化雙醣或寡醣及/或用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的一或多種前驅物及/或接受者於細胞壁外膜的流動。
23. 如請求項20至22中任一項所述之方法，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽改良所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生，及/或使所述半乳糖化雙醣或寡醣得以流出，及/或增強所述半乳糖化雙醣或寡醣的流出。
24. 如請求項6至23中任一項所述之方法，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞(progenitor)相比包括減少乙酸鹽(acetate)產生的修飾。
25. 如請求項24所述之方法，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞相比包括以下任一或多種蛋白質降低或減少的表現及/或經破壞、削弱、減少或延遲的活性，所述一或多種蛋白質包括：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷 O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白(N-acetylglucosamine repressor)、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖1-磷酸轉移酶(UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase)、L-岩藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶(L-fucose isomerase)、N-乙醯神經胺酸裂解酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1(ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1)、ATP 依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶 2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(glucose-specific translocating phosphotransferase)酵素IIBC組成ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(phosphotransferase, PTS)酵素IIBC組成malX、酵素IIAGlc、β-葡萄糖苷特異性PTS酵素II、果糖特異性PTS多磷醯基轉移蛋白FruA與FruB、乙醇脫氫酶、醛脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)、乙酸激酶、磷酸醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶及丙酮酸脫羧酶。
26. 如請求項6至25中任一項所述之方法，其中所述細胞可產生磷酸烯醇丙酮酸鹽(phosphoenolpyruvate, PEP)。
27. 如請求項6至26中任一項所述之方法，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞相比係經修飾以增加磷酸烯醇丙酮酸鹽的產生及/或供應。
28. 如請求項6至27中任一項所述之方法，其中所述細胞包括選擇的單醣、雙醣或寡醣至少部分失活的分解途徑，所述單醣、雙醣或寡醣涉及所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生及/或是產生所述半乳糖化雙醣或寡醣所需的。
29. 如請求項6至28中任一項所述之方法，其中所述細胞生長於乳糖結合一或多種其他的碳源的環境時抵抗乳糖殺傷(lactose killing)的現象。
30. 如請求項6至29中任一項所述之方法，其中所述細胞於全培養液(whole broth)及/或上清液中產生90g/L或90g/L以上的所述半乳糖化雙醣或寡醣，及/或其中以全培養液及/或上清液中的所述半乳糖化雙醣或寡醣及其前驅物的總量進行測量，全培養液及/或上清液中的所述半乳糖化雙醣或寡醣具有至少80%的純度。
31. 如請求項6至30中任一項所述之方法，其中所述細胞穩定培養於培養基中。
32. 如請求項6至31中任一項所述之方法，其中所述條件包括： -使用包括至少一前驅物及/或接受者的培養基，以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣；及/或 -於培養基添加至少一前驅物及/或接受者饋料(feed)，以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣。
33. 如請求項6至32中任一項所述之方法，所述方法包括至少其中一下述步驟： i) 使用包括至少一前驅物及/或接受者的培養基； ii) 將至少一前驅物饋料及/或接受者饋料添加至反應器中的培養基，其中總反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述前驅物及/或接受者饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍； iii) 將至少一前驅物饋料及/或接受者饋料添加至反應器中的培養基，其中總反應器體積介於250mL至10.000m ³，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述前驅物及/或接受者饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍，且其中較佳的是，所述前驅物及/或接受者饋料的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述前驅物及/或接受者饋料的溫度維持在20℃與80℃之間； iv) 以進料溶液的形式將至少一前驅物及/或接受者饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基； v) 以進料溶液的形式將至少一前驅物及/或接受者饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基，且其中較佳的是，所述進料溶液的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述進料溶液的溫度維持在20℃與80℃之間； 所述方法產生出最終培養濃度為至少為50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，且更佳為至少200g/L的所述半乳糖化雙醣或寡醣。
34. 如請求項3至32中任一項所述之方法，其中所述方法包括至少其中一下述步驟： i) 使用包括每公升初始反應器體積至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，且更佳為至少150克的乳糖的培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)； ii) 將包括每公升初始反應器體積至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，且更佳為至少150克乳糖的乳糖饋料添加至培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述乳糖饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍； iii) 將包括每公升初始反應器體積至少50克，更佳為至少75克，更佳為至少100克，更佳為至少120克，且更佳為至少150克乳糖的乳糖饋料添加至培養基，其中反應器體積介於250mL至10.000m ³(立方公尺)，較佳的是以連續的方式添加，且較佳的是，培養基的最終體積不超過在添加所述乳糖饋料之前培養基體積的三倍，較佳為不超過兩倍，且更佳為小於兩倍，且其中較佳的是，所述乳糖饋料的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述乳糖饋料的溫度維持在20℃與80℃之間； iv) 以進料溶液的形式將乳糖饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基； v) 以進料溶液的形式將乳糖饋料在1天、2天、3天、4天或5天內連續添加至培養基，且其中所述乳糖進料溶液的濃度為50g/L，較佳為75g/L，更佳為100g/L，更佳為125g/L，更佳為150g/L，更佳為175g/L，更佳為200g/L，更佳為225g/L，更佳為250g/L，更佳為275g/L，更佳為300g/L，更佳為325g/L，更佳為350g/L，更佳為375g/L，更佳為400g/L，更佳為450g/L，更佳為500g/L，更佳為550g/L，且最佳為600g/L，且其中較佳的是，所述進料溶液的pH值設定介於3至7，且其中較佳的是，所述進料溶液的溫度維持在20℃與80℃之間； 所述方法產生出最終培養濃度為至少為50g/L，較佳為至少75g/L，更佳為至少90g/L，更佳為至少100g/L，更佳為至少125g/L，更佳為至少150g/L，更佳為至少175g/L，且更佳為至少200g/L的所述半乳糖化雙醣或寡醣。
35. 如請求項34所述之方法，其中所述乳糖進料是透過於培養開始添加濃度至少5mM的乳糖而完成，乳糖的濃度較佳為30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM，且更佳為大於300mM。
36. 如請求項34或35所述之方法，其中所述乳糖進料是透過將乳糖以一定濃度添加至培養基而完成，使得在培養的整個生產階段乳糖濃度至少為5mM，且較佳為10mM或30mM。
37. 如請求項6至36中任一項所述之方法，其中所述細胞培養至少約60小時、約80小時、約100小時或約120小時，或以連續的方式進行培養。
38. 如請求項6至37中任一項所述之方法，其中所述培養基包含擇自包含下述的群組的至少一前驅物：乳糖、半乳糖、岩藻糖與唾液酸。
39. 如請求項6至38中任一項所述之方法，其中將碳基受質(carbon-based substrate)，較佳為葡萄糖或蔗糖，添加至包括前驅物的培養基而提供指數型細胞成長的第一階段，接著進行第二階段，其中僅將碳基受質，較佳為葡萄糖或蔗糖，添加至培養基。
40. 如請求項6至38中任一項所述之方法，其中將碳基受質(carbon-based substrate)，較佳為葡萄糖或蔗糖，添加至包括前驅物的培養基而提供指數型細胞成長的第一階段，接著進行第二階段，其中將碳基受質，較佳為葡萄糖或蔗糖，及前驅物添加至培養基。
41. 如請求項6至38中任一項所述之方法，其中所述細胞可分解代謝擇自包含以下所列的名單的碳源：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽寡醣、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液(corn-steep liquor)、糖蜜(molasses)、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。
42. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中所述方法產生帶電及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。
43. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中所述方法產生帶電及/或中性寡醣的混合物，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。
44. 如請求項6至41中任一項所述之方法，其中所述細胞產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。
45. 如請求項6至41中任一項所述之方法，其中所述細胞產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。
46. 如請求項3至45中任一項所述之方法，其中所述分離的步驟包括至少一下述步驟：澄清(clarification)、超過濾(ultrafiltration)、奈米過濾(nanofiltration)、二相分配(two-phase partitioning)、逆滲透、微過濾(microfiltration)、活性碳或碳處理、以非離子型界面活性劑處理、酵素切割、切向流高效能過濾(tangential flow high-performance filtration)、切向流超過濾、親和性色層分析、離子交換色層分析、疏水性作用色層分析及/或凝膠過濾、配位基交換色層分析。
47. 如請求項3至46中任一項所述之方法，更包括純化所述半乳糖化雙醣或寡醣。
48. 如請求項47所述之方法，其中所述純化的步驟包括至少一下述步驟：使用活性碳或碳、使用木炭、奈米過濾、超過濾、電泳、酵素處理或離子交換、使用醇類、使用醇類水混合物、結晶、蒸發、沉澱、乾燥、噴霧乾燥、冷凍乾燥(lyophilization)、噴霧冷凍乾燥(spray freeze drying)、帶式乾燥(band drying或belt drying)、真空帶式乾燥(vacuum band drying或vacuum belt drying)、滾筒式乾燥(drum drying或roller drying)或真空滾筒式乾燥(vacuum drum drying或vacuum roller drying)。
49. 一種細胞，其係經代謝改造成以如實施例1所述之N-乙醯葡萄糖胺β-1,X-半乳糖基轉移酶的用途來合成半乳糖化雙醣或寡醣。
50. 如請求項49所述之細胞，其中所述細胞： -表現所述N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶的任一者；且 -可為所述半乳糖基轉移酶合成作為供給者的UDP-半乳糖(UDP-Gal)；且 -可合成一或多種所述半乳糖基轉移酶，其中所述接受者為作為單醣的N-乙醯葡萄糖胺，及/或在其非還原端具有N-乙醯葡萄糖胺及/或N-乙醯半乳糖胺的雙醣或寡醣。
51. 如請求項49或50所述之細胞，其中利用一或多種基因表現模組來改造所述細胞，其特徵在於，源自任何所述基因表現模組的表現為持續性的或係透過自然誘導物而產生。
52. 如請求項49至51中任一項所述之細胞，其中所述細胞包括編碼一個蛋白質的相同編碼DNA序列的多個拷貝。
53. 如請求項49至52中任一項所述之細胞，其中所述細胞更可合成擇自包含以下所列的名單的一或多種核苷酸-糖供給者：GDP-Fuc、CMP-Neu5Ac、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙醯半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙醯甘露糖胺(UDP-ManNAc)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-阿拉伯-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-arabino-4-hexulose)、UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-來蘇-4-己酮糖(UDP-2-acetamido-2,6-dideoxy-L-lyxo-4-hexulose)、UDP-N-乙醯-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙醯岩藻糖胺、UDP-N-乙醯岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙醯-L-6-脫氧塔羅糖胺(UDP-L-PneNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-塔羅糖)、UDP-N-乙醯胞壁酸(UDP-N-acetylmuramic acid)、UDP-N-乙醯-L-異鼠李糖(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-雙去氧-L-葡萄糖)、GDP-L異鼠李糖(GDP-L-quinovose)、CMP-N-乙醇醯神經胺酸(N-glycolylneuraminic acid，CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N ₃、CMP-Neu4,5Ac ₂、CMP-Neu5,7Ac ₂、CMP-Neu5,9Ac ₂、CMP-Neu5,7(8,9)Ac ₂、UDP-葡萄糖醛酸鹽(UDP-glucuronate)、UDP-半乳糖醛酸鹽(UDP-galacturonate)、GDP-鼠李糖(GDP-rhamnose)、GDP-木糖(UDP-xylose)。
54. 如請求項49至53中任一項所述之細胞，其中所述細胞更可表現擇自包含以下所列的名單的一或多種醣基轉移酶：岩藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖醛酸基轉移酶、半乳醣醛酸基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醇醯神經胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醇鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-雙去氧-N-乙醯-β-L-阿卓糖胺轉胺酶(UDP-4-amino-4,6-dideoxy-N-acetyl-β-L-altrosamine transaminase)、UDP-N-乙醯葡萄糖胺烯醇丙酮基轉移酶(UDP-N-acetylglucosamine enopyruvyl transferase)及岩藻糖胺基轉移酶； -較佳的是，所述岩藻糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶； -較佳的是，所述唾液酸轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-2,3-唾液酸轉移酶、α-2,6-唾液酸轉移酶及α-2,8-唾液酸轉移酶； -較佳的是，所述半乳糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶； -較佳的是，所述葡萄糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶； -較佳的是，所述甘露糖基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶； -較佳的是，所述N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶係擇自包含以下所列的名單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶； -較佳的是，所述N-乙醯半乳糖胺基轉移酶為α-1,3-N-乙醯半乳糖胺基轉移酶；且 -較佳的是，所述細胞係經修飾所述更多的醣基轉移酶的表現或活性。
55. 如請求項49至54中任一項所述之細胞，其中所述細胞係經修飾酵素的表現或活性，所述酵素係擇自包含以下所列的群組：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖-4-表異構酶。
56. 如請求項49至55中任一項所述之細胞，其中所述細胞無法將N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸轉換成葡萄糖胺-6-磷酸，及/或無法將葡萄糖胺-6-磷酸轉換成果糖-6-磷酸。
57. 如請求項49至56中任一項所述之細胞，其中所述細胞係經修飾以增加UDP-半乳糖的產生，且其中所述修飾係擇自包含以下所列的群組：剔除編碼5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶的基因或剔除編碼半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)的基因。
58. 如請求項49至57中任一項所述之細胞，其中所述細胞使用一或多種前驅物以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣，所述前驅物是由培養基提供給所述細胞。
59. 如請求項49至58中任一項所述之細胞，其中所述細胞產生一或多種前驅物以產生所述半乳糖化雙醣或寡醣。
60. 如請求項49至59所述之細胞，其中用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的所述前驅物完全轉變為所述半乳糖化雙醣或寡醣。
61. 如請求項49至60中任一項所述之細胞，其中所述細胞於胞內產生所述半乳糖化雙醣或寡醣，且其中一部分或實質上所有所述產生的半乳糖化雙醣或寡醣保留於胞內，及/或透過被動或主動運輸分泌至所述細胞之外。
62. 如請求項49至61中任一項所述之細胞，其中所述細胞表現膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽，藉此將化合物運輸穿越細胞壁的外膜，較佳的是，所述細胞係經修飾所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽的表現或活性。
63. 如請求項62所述之細胞，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽係擇自於包含以下所列的名單：運輸蛋白(porter)、P-P鍵結水解驅動運輸蛋白、β桶孔蛋白(β-barrel porin)、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白(putative transport protein)及磷酸轉移驅動基團轉位蛋白(phosphotransfer-driven group translocator)，較佳的是，所述運輸蛋白(porter)包括MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵體輸出蛋白(siderophore exporter)，較佳的是，所述P-P鍵結水解驅動運輸蛋白包括ABC運輸蛋白與螯鐵體輸出蛋白。
64. 如請求項62或63所述之細胞，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽控制所述半乳糖化雙醣或寡醣及/或用於產生所述半乳糖化雙醣或寡醣的一或多種前驅物及/或接受者於細胞壁外膜的流動。
65. 如請求項62至64中任一項所述之細胞，其中所述膜運輸蛋白或具有運輸活性的多肽改良所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生，及/或使所述半乳糖化雙醣或寡醣得以流出，及/或增強所述半乳糖化雙醣或寡醣的流出。
66. 如請求項49至65中任一項所述之細胞，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞(progenitor)相比包括減少乙酸鹽(acetate)產生的修飾。
67. 如請求項66所述之細胞，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞相比包括以下任一或多種蛋白質降低或減少的表現及/或經破壞、削弱、減少或延遲的活性，所述一或多種蛋白質包括：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷 O-乙醯轉移酶、N-乙醯葡萄糖胺-6-磷酸脫乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯葡萄糖胺抑制蛋白(N-acetylglucosamine repressor)、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖1-磷酸轉移酶(UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase)、L-岩藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶(L-fucose isomerase)、N-乙醯神經胺酸裂解酶、N-乙醯甘露糖胺激酶、N-乙醯甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶1(ATP-dependent 6-phosphofructokinase isozyme 1)、ATP 依賴性6-磷酸果糖激酶同功酶 2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(glucose-specific translocating phosphotransferase)酵素IIBC組成ptsG、葡萄糖特異性轉位磷酸轉移酶(phosphotransferase, PTS)酵素IIBC組成malX、酵素IIAGlc、β-葡萄糖苷特異性PTS酵素II、果糖特異性PTS多磷醯基轉移蛋白FruA與FruB、乙醇脫氫酶、醛脫氫酶、丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)、乙酸激酶、磷酸醯基轉移酶、磷酸乙醯轉移酶及丙酮酸脫羧酶。
68. 如請求項49至67中任一項所述之細胞，其中所述細胞可產生磷酸烯醇丙酮酸鹽(phosphoenolpyruvate, PEP)。
69. 如請求項49至68中任一項所述之細胞，其中所述細胞與未經修飾的前驅細胞相比係經修飾以增加磷酸烯醇丙酮酸鹽的產生及/或供應。
70. 如請求項49至69中任一項所述之細胞，其中所述細胞包括選擇的單醣、雙醣或寡醣至少部分失活的分解途徑，所述單醣、雙醣或寡醣涉及所述半乳糖化雙醣或寡醣的產生及/或是產生所述半乳糖化雙醣或寡醣所需的。
71. 如請求項49至70中任一項所述之細胞，其中所述細胞生長於乳糖結合一或多種其他的碳源的環境時抵抗乳糖殺傷(lactose killing)的現象。
72. 如請求項49至71中任一項所述之細胞，其中所述細胞可分解代謝擇自包含以下所列的名單的碳源：葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽寡醣、海藻糖、澱粉、纖維素、半纖維素、玉米浸液(corn-steep liquor)、糖蜜(molasses)、高果糖漿、甘油、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽和丙酮酸鹽。
73. 如請求項49至72中任一項所述之細胞或如請求項6至48中任一項所述之方法，其中所述細胞為細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、動物細胞或原生動物細胞(protozoan cell)， -較佳的是，所述細菌為大腸桿菌( Escherichia coli)菌株，更佳為K-12菌株的大腸桿菌菌株，更佳的是大腸桿菌K-12菌株為 E. coliMG1655； -較佳的是，所述真菌屬於擇自包含以下所列的群組的屬：黑黴菌屬( Rhizopus)、網柱黏菌屬( Dictyostelium)、青黴菌屬( Penicillium)、白黴菌屬( Mucor)或麴菌屬( Aspergillus)； -較佳的是，所述酵母菌屬於擇自包含以下所列的群組的屬：酵母菌屬( Saccharomyces)、接合酵母菌屬( Zygosaccharomyces)、畢赤酵母菌屬( Pichia)、克馬格特勒酵母菌屬( Komagataella)、漢遜氏酵母菌屬( Hansenula)、子囊菌酵母屬( Yarrowia)、擬球酵母菌屬( Starmerella)、克魯維酵母菌屬( Kluyveromyces)或德巴利酵母菌屬( Debaromyces)； -較佳的是，所述植物細胞為藻細胞，或衍生自煙草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、油菜籽、大豆、玉米(maize)或玉米植物(corn plant)； -較佳的是，所述動物細胞是衍生自非人類哺乳動物、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬蟲類、兩棲類或昆蟲，或是衍生自胚胎幹細胞以外的人類哺乳類細胞的基因改造細胞株，更佳的是，所述人類與非人類哺乳類細胞為上皮細胞、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中華倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster ovary cell, CHO cell)、鼠類骨髓瘤細胞、NIH-3T3細胞、非哺乳類成人幹細胞或其衍生細胞，更佳的是，所述昆蟲細胞是衍生自秋行軍蟲( Spodoptera frugiperda)、蠶( Bombyx mori)、甘藍夜蛾( Mamestra brassicae)、粉紋夜蛾( Trichoplusia ni)或黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)；且 -較佳的是，所述原生動物細胞為狼蛛利什曼原蟲( Leishmania tarentolae)細胞。
74. 如請求項73所述之細胞或如請求項73所述之方法，其中所述細胞為活革蘭氏陰性菌，所述活革蘭氏陰性菌與未經修飾的前驅細胞相比包括聚N-乙醯葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG)、腸細菌共同抗原(Enterobacterial Common Antigen, ECA)、纖維素、可拉酸(colonic acid)、核心寡醣、滲透調節間質葡聚醣(osmoregulated perplasmic glucan, OPG)、葡萄糖苷甘油(glucosylglycerol)、聚醣(glycan)及/或海藻糖減弱或經破壞的合成。
75. 如請求項49至74中任一項所述之細胞，其中所述細胞產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。
76. 如請求項49至74中任一項所述之細胞，其中所述細胞產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。
77. 一種如請求項49至74中任一項所述之細胞或如請求項1至42、73至74中任一項所述的方法的用途，其係用於產生半乳糖化雙醣或寡醣。
78. 一種如請求項49至75中任一項所述之細胞或如請求項1至42、73至74中任一項所述的方法的用途，其係用於產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性雙醣及/或寡醣的混合物，所述帶電及/或中性雙醣及/或寡醣包含至少一半乳糖化雙醣或寡醣。
79. 一種如請求項49至76中任一項所述之細胞或如請求項1至42、73至74中任一項所述的方法的用途，產生帶電，較佳為唾液酸化，及/或中性寡醣的混合物，所述帶電及/或中性寡醣包含至少一半乳糖化寡醣。