TW202212572A

TW202212572A - 藉由細胞製造中性岩藻糖基化寡醣之混合物

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Publication number: TW202212572A
Application number: TW110129390A
Authority: TW
Inventors: 蘇菲艾薩爾特; 喬立畢普瑞茲; 彼得卡斯曼; 湯馬士狄康; 諾希卡蘭諾; 葛特彼得斯; 克里斯多夫凡德沃; 安妮里斯法克特潤
Original assignee: 比利時商因比奧斯公司
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2021-08-10
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本發明處於合成生物學及代謝工程改造之技術領域中。更特定言之，本發明處於經代謝工程改造之細胞之培養或醱酵的技術領域中。本發明描述一種經代謝工程改造以用於製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物的細胞。此外，本發明提供一種用於藉由細胞製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物以及自培養純化該等中性寡醣中之至少一者的方法。

Description

藉由細胞製造中性岩藻糖基化寡醣之混合物

常常以與蛋白質及脂質之糖結合形式存在的寡醣參與許多生命現象，諸如與受精、胚胎發生、發炎、癌轉移及宿主病原體黏附之發生及進展相關的分化、發育及生物識別過程。寡醣亦可以非結合聚醣形式存在於體液及人乳中，其中寡醣亦調節重要的發育及免疫過程（Bode, Early Hum. Dev. 1-4 (2015)；Reily等人, Nat. Rev. Nephrol. 15, 346-366 (2019)；Varki, Glycobiology 27, 3-49 (2017)）。由於寡醣之廣泛功能譜，對寡醣混合物存在巨大科學及商業關注。然而，寡醣混合物之可用性受到限制，因為製造依賴於化學或化學酶合成或依賴於自天然來源，諸如動物乳之純化。化學合成方法為費力且耗時的，且由於所涉及之大量步驟，該等方法難以擴大規模。使用醣基轉移酶之酶促路徑提供優於化學合成之許多優勢。醣基轉移酶催化糖部分自活化核苷酸-糖供體轉移至醣或非醣受體上（Coutinho等人, J. Mol. Biol. 328 (2003) 307-317）。此等醣基轉移酶為生物技術人員合成寡醣之來源且用於（化學）酶促路徑以及基於細胞之製造系統中。然而，醣基轉移酶之立體特異性及區位選擇性仍為難對付的挑戰。另外，化學酶促路徑需要原位再生核苷酸-糖供體。寡醣之細胞製造需要嚴格控制足夠水準之核苷酸-糖供體在互補醣基轉移酶附近之時空可用性。由於此等困難，當前方法通常使得合成單一寡醣而非寡醣混合物。

本發明之一目標為提供一種工具及方法，藉助於該等工具及方法，包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性寡醣混合物可藉由細胞，較佳地單一細胞，以高效、有時間效益及成本效益之方式，且視需要以連續製程製造。

根據本發明，此目標及其他目標係藉由提供一種用於製造包含至少四種不同中性及岩藻糖基化寡醣之中性岩藻糖基化寡醣混合物的細胞及方法來實現，其中該細胞經遺傳修飾以用於製造該等中性岩藻糖基化寡醣。

出人意料地，現已發現，有可能藉由單一細胞製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性岩藻糖基化寡醣混合物。本發明提供一種經代謝工程改造之細胞及用於製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性岩藻糖基化寡醣混合物的方法。該方法包含以下步驟：提供一種表現為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶及至少一種額外醣基轉移酶且能夠合成GDP-岩藻糖及至少一種或多種作為該(等)額外醣基轉移酶之供體的核苷酸-糖的細胞，及在容許製造該中性岩藻糖基化寡醣混合物之條件下培養該細胞。本發明亦提供自中性岩藻糖基化寡醣混合物分離該等中性寡醣中之至少一者，較佳全部的方法。此外，本發明提供一種經代謝工程改造以用於製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性岩藻糖基化寡醣混合物的細胞。定義

用於本說明書中以描述本發明之字組及其各種實施方式應不僅以其通常所定義含義之意義來理解，而且應包括在通常所定義含義之範圍以外之在本說明書中特定定義的結構、物質或作用。因此，若元件在本說明書之上下文中可理解為包括超過一個含義，則其在申請專利範圍中之使用必須理解為由本說明書及字組自身支援之一般至所有可能含義。

本文所揭示之本發明之各種實施方式及實施方式之態樣應不僅以本說明書中特定描述之次序及情形來理解，而且包括任何次序及其任何組合。每當情形需要時，將認為以單數形式使用之所有字組包括複數形式，且反之亦然。除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語一般具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解相同之含義。一般而言，本文所使用之命名法及本文所描述的細胞培養中之實驗步驟、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜合為所屬領域中熟知且常用之命名法、細胞培養中之實驗步驟、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜合。使用標準技術進行核酸及肽合成。一般而言，純化步驟係根據製造商說明書進行。

在本說明書中，已揭示本發明之實施方式，且儘管採用特定術語，但該等術語僅以描述性意義使用且並非出於限制本發明之範圍之目的，本發明之範圍闡述於以下申請專利範圍中。必須理解，已僅出於示例之目的闡述所說明之實施方式，且不應視為限制本發明。所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見，改變、其他實施方式、改良、細節及用途可根據本文中本發明之文字及精神且在本發明之範圍內進行，本發明之範圍僅由申請專利範圍限制，根據包括等同原則之專利法予以解釋。在以下申請專利範圍中，僅為便於描述，提供用以指明申請專利範圍步驟之參考字元，且該等參考字元並不意欲暗示用於執行該等步驟之任何特定次序。

在此文件及其申請專利範圍中，動詞「包含（to comprise）」及其詞形變化形式以其非限制性意義使用，意謂包括該字組之後的項目，但不排除未具體提及之項目。在整個申請案中，動詞「包含（to comprise）」可由「由……組成（to consist）」或「基本上由……組成（to consist essentially of）」替換，且反之亦然。另外，動詞「由……組成」可由「基本上由……組成」替換，意謂如本文所定義之組成物可包含除具體鑑別之組分外的（多種）額外組分，該（等）額外組分不改變本發明之獨特特徵。另外，除非上下文明確要求存在一個元件且僅存在一個元件，否則藉由不定冠詞「一（a/an）」提及一元件並不排除存在超過一個元件的可能性。因此不定冠詞「一」通常意謂「至少一個（at least one）」。在整個申請案中，除非另外明確陳述，否則冠詞「一（a及an）」較佳由「至少兩個（at least two）」置換，更佳由「至少三個（at least three）」置換，甚至更佳由「至少四個（at least four）」置換，甚至更佳由「至少五個（at least five）」置換，甚至更佳由「至少六個（at least six）」置換，最佳由「至少七個（at least seven）」置換。

除非另外指示，否則如本文中鑑別之各實施方式可組合在一起。本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用程度如同特定及個別地指示將各個別公開案、專利或專利申請案以引用之方式併入一般。優先權申請案，包括EP20190198、EP20190200、EP20190201、EP20190204及EP20190205之全部內容，亦以引用之方式併入本文中，其引用程度如同特定及個別地指示將該等優先權申請案以引用之方式併入一般。

根據本發明，術語「聚核苷酸（polynucleotide）」一般係指可為未修飾RNA或DNA或經修飾RNA或DNA之任何聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸。「聚核苷酸」包括但不限於單股及雙股DNA；為單股及雙股區或單股、雙股及三股區之混合物的DNA；單股及雙股RNA；及為單股及雙股區之混合物的RNA；包含可為單股或更典型地雙股或三股區、或單股及雙股區之混合物的DNA及RNA的雜合分子。另外，如本文所用，術語「聚核苷酸」係指包含RNA或DNA或RNA及DNA兩者的三股區。此類區中之股可來自相同分子或來自不同分子。該等區可包括該等分子中之一或多者之全部，但更典型地僅涉及具有該等分子中之一些之區。三螺旋區之分子中之一者常為寡核苷酸。如本文所用，術語「聚核苷酸」亦包括含有一或多個經修飾鹼基之如上文所描述之DNA或RNA。因此，具有出於穩定性或出於其他原因進行修飾之主鏈的DNA或RNA為根據本發明之「聚核苷酸」。此外，包含不常見鹼基（諸如肌苷）或經修飾鹼基（諸如三苯甲基化鹼基）的DNA或RNA應理解為由術語「聚核苷酸」覆蓋。應瞭解，已對DNA及RNA進行多種修飾，此用於所屬技術領域中具有通常知識者已知之許多適用目的。術語「聚核苷酸」在本文使用時涵蓋此類經化學、酶促或代謝修飾之形式之聚核苷酸，以及病毒及細胞（包括（例如）簡單及複雜細胞）所特有之DNA及RNA之化學形式。術語「聚核苷酸」亦涵蓋通常稱為寡核苷酸之短聚核苷酸。

「多肽（polypeptide）」係指包含兩個或更多個藉由肽鍵或經修飾肽鍵彼此接合之胺基酸的任何肽或蛋白質。「多肽」係指短鏈（通常稱為肽、寡肽及寡聚物）及長鏈（通常稱為蛋白質）。多肽可含有除20種基因編碼之胺基酸以外之胺基酸。「多肽」包括藉由自然過程（諸如加工及其他轉譯後修飾）以及藉由化學修飾技術修飾之多肽。此類修飾充分描述於基本文本及更詳細的專論中以及大量研究文獻中，且其為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。相同類型之修飾可在既定多肽中若干位點處以相同或不同程度存在。此外，既定多肽可含有多種類型之修飾。修飾可出現在多肽中之任何地方，包括肽主鏈、胺基酸側鏈及胺基端或羧基端。修飾包括例如：乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素之共價連接、血基質部分之共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物之共價連接、脂質或脂質衍生物之共價連接、磷脂酸肌醇之共價連接、交聯、環化、雙硫鍵形成、去甲基化、共價交聯之形成、焦麩胺酸之形成、甲醯化、γ-羧化、醣基化、GPI錨定形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、脂質連接、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧化、羥基化及ADP-核糖基化、硒化、轉移RNA介導之向蛋白質添加胺基酸（諸如精胺醯化）及泛素化。多肽可為分支鏈的或在存在或不存在分支情況下為環狀的。環狀、分支鏈及分支鏈環狀多肽可由轉譯後自然過程產生，且亦可藉由完全合成方法製備。

如本文所用，術語「編碼多肽之聚核苷酸（polynucleotide encoding a polypeptide）」涵蓋包括編碼本發明多肽之序列的聚核苷酸。術語亦涵蓋如下聚核苷酸，其包括編碼多肽之單個連續區或非連續區（例如間雜有整合噬菌體或插入序列或編輯）以及亦可含有編碼序列及/或非編碼序列之其他區。

「經分離（isolated）」意謂自天然狀態「人工（by the hand of man）」改變，亦即若其存在於自然界中，則其自其原始環境改變或移除或兩者。舉例而言，天然存在於活生物體中之聚核苷酸或多肽未「經分離」，但與其天然狀態之共存物質分離的相同聚核苷酸或多肽「經分離」，如該術語在本文中所用。類似地，如本文所用之術語「合成（synthetic）」序列意謂已以合成方式產生且不直接自天然來源分離之任何序列。如本文所用之術語「合成」意謂任何合成產生之序列且不直接自天然來源分離。

如本文中提及細胞或宿主細胞所用，術語「重組（recombinant）」或「轉殖基因（transgenic）」或「經代謝工程改造（metabolically engineered）」或「經遺傳修飾（genetically modified）」可互換使用，且指示細胞複製異源核酸，或表現由異源核酸（亦即，「對該細胞外來（foreign to said cell）」之序列或「對該細胞中之該位置或環境外來（foreign to said location or environment in said cell）」之序列）編碼之肽或蛋白質。此類細胞描述為經至少一種異源或外源基因轉型，或描述為藉由引入至少一種異源或外源基因轉型。經代謝工程改造或重組或轉殖基因細胞可含有在天然（非重組）形式之細胞內未發現之基因。重組細胞亦可含有天然形式之細胞中所發現之基因，其中基因藉由人工手段修飾且再引入至細胞中。該等術語亦涵蓋含有對於細胞而言內源之核酸的細胞，該核酸已經修飾或其表現或活性已經修飾而無需自該細胞移除該核酸；此類修飾包括藉由基因置換、啟動子置換；位點特異性突變；及相關技術獲得之修飾。相應地，「重組多肽（recombinant polypeptide）」係藉由重組細胞產生之多肽。如本文所用，「異源序列（heterologous sequence）」或「異源核酸（heterologous nucleic acid）」係源自對特定細胞而言外來的來源（例如來自不同物種），或若來自相同來源則自其原始形式或基因體中之位置進行修飾之序列或核酸。因此，與啟動子可操作地連接之異源核酸係來自與衍生啟動子之來源不同的來源，或若來自相同來源，則自其原始形式或基因體中之位置進行修飾。異源序列可例如藉由轉染、轉型、結合或轉導穩定引入至宿主微生物細胞之基因體中，其中可視細胞及待引入之序列而定來應用技術。各種技術為所屬領域中具有通常知識者所已知且例如揭示於Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中。如在本發明之上下文中所用之術語「突變（mutant）」細胞或微生物係指經遺傳修飾之細胞或微生物。

在本發明之上下文內，術語「內源（endogenous）」係指任何作為細胞之天然部分且存在於其在細胞染色體中之天然位置處且與作用於其表現之天然控制機制相比，表現之控制尚未改變的聚核苷酸、多肽或蛋白質序列。術語「外源（exogenous）」係指任何來源於研究下之細胞的外部且不來源於細胞之天然部分或不存在於其在細胞染色體或質體中之天然位置處的聚核苷酸、多肽或蛋白質序列。

當提及聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶使用時，術語「異源」係指來自宿主生物體物種之外的源或源自宿主生物體物種之外的源的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相比之下，本文使用「同源」聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶指示源自宿主生物體物種之聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。當提及用於維持或操縱基因序列之基因調節序列或輔助核酸序列（例如，啟動子、5'非轉譯區、3'非轉譯區、聚A添加序列、內含子序列、剪接位點、核糖體結合位點、內部核糖體進入序列、基因體同源區、重組位點等）時，「異源」意謂調節序列或輔助序列不與該調節或輔助核酸序列在構築體、基因體、染色體或游離基因體中與其並置之基因天然相關。因此，可操作地連接於在自然狀態下（亦即以非基因工程改造生物體之基因體形式）不可與啟動子操作連接之基因的啟動子在本文中稱為「異源啟動子（heterologous promoter）」，即使該啟動子可源自與其連接之基因相同的物種（或在一些情況下，源自相同的生物體）。

術語蛋白質或酶之「經修飾活性（modified activity）」與蛋白質或酶之活性相比於該蛋白質或酶之野生型（亦即天然）活性的變化有關。該經修飾活性可為與蛋白質或酶之野生型活性相比，該蛋白質或酶之消除、減弱、降低或延遲之活性，但亦可為與蛋白質或酶之野生型活性相比，該蛋白質或酶之加速或增強之活性。蛋白質或酶之經修飾活性藉由該蛋白質或酶之經修飾表現獲得或藉由蛋白質或酶之經修飾（亦即突變）形式之表現獲得。酶之經修飾活性進一步關於酶之表觀米氏常數（apparent Michaelis constant）Km及/或表觀最大速度（Vmax）之修飾。

術語基因之「經修飾表現（modified expression）」係關於與在經編碼蛋白質之製造過程之任何階段中該基因之野生型表現相比的表現之變化。該經修飾表現相比於野生型為較低或較高表現，其中在內源基因之情況下，術語「較高表現（higher expression）」亦定義為該基因之「過度表現（overexpression）」，或在野生型菌株中不存在之異源基因的情況下，定義為「表現（expression）」。較低表現或減少之表現係藉助於所屬技術領域中具有通常知識者之常見熟知技術獲得（諸如使用siRNA、CrispR、CrispRi、核糖開關、重組工程、同源重組、ssDNA突變誘發、RNAi、miRNA、asRNA、突變基因、剔除基因、轉位子突變誘發、……），該等技術用於以使得基因不太能夠（亦即與功能性野生型基因相比統計上顯著『不太能夠』）或完全不能（諸如剔除基因）產生功能性最終產物之方式改變基因。如本文所用之術語「核糖開關（riboswitch）」定義為信使RNA之一部分，該信使RNA摺疊成藉由干擾轉譯而阻斷表現之錯綜結構。效應分子之結合誘導構形變化，允許轉錄後之調節表現。隨後以使得如上文所描述獲得較低表現之方式改變相關之基因，亦可藉由改變轉錄單元、啟動子、非轉譯區、核糖體結合位點、夏因達爾加諾（Shine Dalgarno）序列或轉錄終止子獲得較低表現。較低表現或減少之表現可例如藉由使啟動子序列中之一或多個鹼基對突變或將啟動子序列完全改為具有與野生型相比更低之表現強度的持續型啟動子或引起經調節之表現的可誘導型啟動子或引起經調節之表現的可抑制型啟動子來獲得。過度表現或表現係藉助於所屬技術領域中具有通常知識者之常見熟知技術獲得（諸如使用人工轉錄因子、重新設計啟動子序列、核糖體工程改造、在真染色質處引入或再引入表現模組、使用高複本數之質體），其中該基因為「表現卡匣（expression cassette）」之一部分，該表現卡匣係關於其中存在啟動子序列、非轉譯區序列（含有核糖體結合序列、夏因達爾加諾或科紮克（Kozak）序列）、編碼序列及視情況選用之轉譯終止子且引起功能性活性蛋白質之表現的任何序列。該表現為持續型或調節性的。

術語「持續型表現（constitutive expression）」定義為在某些生長條件下不受除RNA聚合酶之次單元以外之轉錄因子（例如，如σ ⁷⁰、σ ⁵⁴之細菌δ因子或相關σ因子；及與RNA聚合酶核心酶共締合之酵母粒線體RNA聚合酶特異性因子MTF1）調節的表現。此類轉錄因子之非限制性實例為大腸桿菌中之CRP、LacI、ArcA、Cra、IclR，或釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）中之Aft2p、Crz1p、Skn7，或枯草桿菌（ B. subtilis）中之DeoR、GntR、Fur。此等轉錄因子結合於特異性序列上且可阻斷或增強在某些生長條件下之表現。RNA聚合酶為用於自DNA模板合成RNA之催化機構。RNA聚合酶結合特異性序列以例如經由原核宿主中之δ因子或經由酵母中之MTF1使轉錄起始。持續型表現在不需要誘導或抑制之情況下提供恆定表現量。

術語「藉由天然誘導物之表現（expression by a natural inducer）」定義為僅在宿主之某一天然條件（例如生物體在分娩中或在泌乳期間）下表現之基因的兼性或調節表現，作為對環境變化（例如包括但不限於激素、熱、冷、光、氧化或滲透應激/信號傳導）之反應，或取決於發育階段之位置或該宿主細胞之細胞週期，包括但不限於細胞凋亡及自體吞噬。

術語「控制序列（control sequence）」係指藉由細胞轉錄及轉譯系統識別之序列，允許聚核苷酸序列轉錄及轉譯成多肽。此類DNA序列因此為在特定細胞或生物體中表現可操作地連接之編碼序列所必需的。此類控制序列可為（但不限於）啟動子序列、核糖體結合序列、夏因達爾加諾序列、科紮克序列、轉錄終止子序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及強化子。若前序列或分泌性前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其可與該多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經定位以便有助於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。該等控制序列可另外經外部化學物質，諸如（但不限於）IPTG、阿拉伯糖、乳糖、別位乳糖（allo-lactose）、鼠李糖或岩藻糖經由誘導型啟動子或經由誘導或抑制該聚核苷酸轉錄或轉譯成多肽之基因迴路控制。

一般而言，「可操作地連接（operably linked）」意謂所連接之DNA序列為連續的且在分泌性前導序列之情況下，為連續的且處於閱讀階段（reading phase）。然而，強化子不必為連續的。

術語「野生型（wild type）」係指其在自然界中存在時通常已知的遺傳或表型情況。

如本文所用之術語「蛋白質之經修飾表現（modified expression of a protein）」係指與野生型（亦即天然）蛋白質相比，i）內源蛋白之較高表現或過度表現，ii）異源蛋白之表現或iii）具有較高活性之變異蛋白的表現及/或過度表現。

如本文所用，術語「乳腺細胞（mammary cell）」大體上係指乳腺上皮細胞、乳腺上皮管腔細胞或哺乳動物上皮肺泡細胞或其任何組合。如本文所用，術語「乳腺樣細胞（mammary-like cell）」大體上係指具有類似於（或實質上類似於）天然乳腺細胞但衍生自非乳腺細胞來源之表型/基因型的細胞。此類乳腺樣細胞可經工程改造以移除至少一個非所需遺傳組件及/或包括乳腺細胞所特有之至少一個預定遺傳構築體。乳腺樣細胞之非限制性實例可包括乳腺上皮樣細胞、乳腺上皮管腔樣細胞、呈現乳腺細胞譜系之細胞之一或多個特徵的非乳腺細胞或其任何組合。乳腺樣細胞之其他非限制性實例可包括具有與天然乳腺細胞類似（或實質上類似）之表型，或更特定言之與天然乳腺上皮細胞類似（或實質上類似）之表型的細胞。具有表型或展現至少一種與天然乳腺細胞或乳腺上皮細胞類似（或實質上與其類似）之特徵的細胞可包含展現天然或已經工程改造以能夠表現至少一種乳汁組分之細胞（例如衍生於乳腺細胞譜系或非乳腺細胞譜系）。

如本文所用，術語「非乳腺細胞（non-mammary cell）」一般可包括任何非乳腺譜系之細胞。在本發明之上下文中，非乳腺細胞可為能夠經工程改造以表現至少一種乳汁組分之任何哺乳動物細胞。此類非乳腺細胞之非限制性實例包括肝細胞、血球、腎細胞、臍帶血細胞、上皮細胞、表皮細胞、肌細胞、纖維母細胞、間葉細胞或其任何組合。在一些情況下，分子生物學及基因體編輯技術可經工程改造以同時消除、沉默或減弱無數基因。

在整個本申請案中，除非另外明確地陳述，否則表述「能夠……＜動詞＞（capable of…＜verb＞）」及「能夠……＜動詞＞（capable to…＜verb＞）」較佳地用該動詞之主動語態替換，且反之亦然。舉例而言，表述「能夠表現（capable of expressing）」較佳地用「表現（express）」替換，且反之亦然，亦即「表現」較佳地用「能夠表現」替換。

如本文所用，術語「變異體（variant）」為分別與參考聚核苷酸或多肽不同但保持基本特性之聚核苷酸或多肽。聚核苷酸之典型變異體與另一參考聚核苷酸在核苷酸序列方面不同。變異體之核苷酸序列之變化可能會或可能不會改變由參考聚核苷酸編碼之多肽之胺基酸序列。如下文所論述，核苷酸變化可能在參考序列編碼之多肽中引起胺基酸取代、添加、缺失、融合及截斷。多肽之典型變異體與另一參考多肽在胺基酸序列方面不同。通常，差異係有限的，以致參考多肽之序列與變異體之序列總體上十分相似且在許多區中一致。藉由呈任何組合之一或多個取代、添加、缺失，變異體與參考多肽可在胺基酸序列方面不同。取代或插入之胺基酸殘基可為或可不為由遺傳密碼編碼之殘基。聚核苷酸或多肽之變異體可為天然產生的，諸如對偶基因變異體，或其可為未已知為天然產生的變異體。聚核苷酸及多肽之非天然產生變異體可藉由突變誘發技術、藉由直接合成及藉由所屬領域中具有通常知識者已知之其他重組方法製得。

如本文所用，術語多肽之「衍生物（derivative）」係可在多肽之胺基酸序列內含有胺基酸殘基之缺失、添加或取代，但引起沉默變化，由此產生功能上等效之多肽的多肽。胺基酸取代可基於所涉及殘基之極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性及/或兩親媒性性質之類似性進行。舉例而言，非極性（疏水性）胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；平面中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；帶正電（鹼性）胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶負電（酸性）胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。在本發明之上下文內，如本文所用之衍生物多肽係指能夠展現與原始多肽在試管內及/或活體內活性方面實質上類似的多肽，如藉由多種標準（包括但不限於酶活性）中之任一者所判定，且其可在轉譯期間或轉譯之後差異修飾。此外，可將非經典胺基酸或化學胺基酸類似物以取代或添加形式引入至原始多肽序列中。

在一些實施方式中，本發明涵蓋藉由修飾如本發明中所用之酶之結構來製備功能變異體。變異體可藉由胺基酸取代、缺失、添加或其等之組合產生。舉例而言，可合理地預期，白胺酸用異白胺酸或纈胺酸之獨立置換、天冬胺酸用麩胺酸之獨立置換、蘇胺酸用絲胺酸之獨立置換或胺基酸用結構上相關之胺基酸之類似置換（例如保守突變）不會對所得分子之生物活性產生重大影響。保守置換為在側鏈相關之胺基酸家族內發生的置換。本發明多肽之胺基酸序列變化是否產生功能同源物可容易地藉由評定變異體多肽以類似於野生型多肽之方式在細胞中產生反應的能力來測定。

如本文所用之術語「功能同源物（functional homolog）」描述具有序列相似性（換言之，同源性）且亦共有至少一種功能性特徵（諸如生物化學活性）的彼等分子（Altenhoff等人 ,PLoS Comput. Biol. 8 (2012) e1002514）。功能同源物典型地將產生類似但未必相同程度之相同特徵。功能上同源之蛋白質產生相同特徵，其中藉由一種同源物產生之定量量測值為另一者之至少10%；更典型地，為由原始分子產生之定量量測值的至少20%，在約30%與約40%之間；例如在約50%與約60%之間；在約70%與約80%之間；或在約90%與約95%之間；在約98%與約100%之間，或大於100%。因此，在分子具有酶活性的情況下，功能同源物將具有與原始酶相比以上所列舉之酶活性百分比。在分子為DNA結合分子（例如多肽）的情況下，與原始分子相比，如藉由結合分子之重量所量測，同源物將具有結合親和力之以上所列舉百分比。

功能同源物及參考多肽可為天然存在之多肽，且序列相似性可歸因於趨同或趨異進化事件。功能同源物有時被稱為異種同源物，其中「異種同源物（ortholog）」係指作為另一物種中所參考之基因或蛋白質之功能等效物的同源基因或蛋白質。

異種同源基因為藉由最後共同祖先之單一基因之垂直傳遞產生的不同物種中之同源基因，其中基因及其主要功能為保守性的。同源基因為由共同祖先在兩個物種中遺傳之基因。

當參考來自給定物種之胺基酸或核苷酸/核酸序列使用時，術語「異種同源物」係指來自不同物種之相同胺基酸或核苷酸/核酸序列。應理解，兩個序列在其經由線性傳遞衍生自共同祖先序列時為彼此之異種同源物，及/或就其序列及其生物功能兩者而言在其他方面為緊密相關的。異種同源物通常將具有高度序列一致性但可能不（且通常將不）共有100%序列一致性。

同種同源基因為藉由基因複製事件產生之同源基因。同種同源基因通常屬於相同物種，但此並非必需的。同種同源物可分裂成同種內同源物（in-paralog）（在物種形成事件之後出現的同種同源對）及同種外同源物（out-paralog）（在物種形成事件之前出現的同種同源對）。在物種之間，同種外同源物為由於在物種形成之前複製而存在於兩個生物體之間的同種同源物對。在物種內，同種外同源物為存在於同一生物體中但其複製事件發生在物種形成之後的同種同源物對。同種同源物典型地具有相同或類似功能。

可藉由分析核苷酸及多肽序列比對來鑑別功能同源物。舉例而言，對核苷酸或多肽序列之資料庫執行查詢可鑑別相關多肽之同源物，如生物質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質或膜蛋白。序列分析可涉及分別使用生物質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質或膜蛋白之胺基酸序列作為參考序列對非冗餘資料庫之BLAST、Reciprocal BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情況下，胺基酸序列係自核苷酸序列推導出。典型地，資料庫中具有超過40%序列一致性之彼等多肽為進一步評估是否適合分別作為生物質調節多肽、醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質或膜運輸蛋白的候選物。胺基酸序列相似性允許保守胺基酸取代，諸如一個疏水性殘基經另一疏水性殘基取代或一個極性殘基經另一極性殘基取代或一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸取代或一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸取代等。較佳地，藉由保守取代，意指以下組合，諸如甘胺酸藉由丙胺酸取代，且反之亦然；纈胺酸、異白胺酸及白胺酸藉由甲硫胺酸取代，且反之亦然；天冬胺酸藉由麩胺酸取代，且反之亦然；天冬醯胺藉由麩醯胺酸取代，且反之亦然；絲胺酸藉由蘇胺酸取代，且反之亦然；離胺酸藉由精胺酸取代，且反之亦然；半胱胺酸藉由甲硫胺酸取代，且反之亦然；及苯丙胺酸及酪胺酸藉由色胺酸取代，且反之亦然。視需要，可進行此類候選物之人工檢驗以便限制待進一步評估之候選物之數目。人工檢驗可藉由選擇似乎具有存在於製造力調節多肽中之域（例如保守功能域）之彼等候選物來進行。

就聚核苷酸而言，「片段（Fragment）」係指純系或聚核苷酸分子之任何部分，尤其保留全長聚核苷酸分子之可用功能特徵之聚核苷酸的一部分。有用片段包括可用於雜合或擴增技術或用於調節複製、轉錄或轉譯之寡核苷酸及聚核苷酸。「聚核苷酸片段（polynucleotide fragment）」係指聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）之任何子序列，其典型地包含本文所提供之聚核苷酸序列中之任一者的至少約9、10、11、12個連續核苷酸或由其組成，例如至少約30個核苷酸或至少約50個核苷酸。例示性片段可另外或替代地包括包含編碼多肽之保守性家族域之區、基本上由其組成或由其組成的片段。例示性片段可另外或替代地包括包含多肽之保守域的片段。因此，聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）之片段較佳意謂包含該聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）或由其組成之核苷酸序列，其中不超過200、150、100、50或25個連續核苷酸缺失，較佳不超過50個連續核苷酸缺失，且該核苷酸序列保留可藉由所屬技術領域中具有通常知識者經由常規實驗評定之全長聚核苷酸分子之可用功能特徵（例如活性）。替代地，聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）之片段較佳意謂一種核苷酸序列，其包含來自該聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）之一定量之連續核苷酸或由其組成，且其中該一定量之連續核苷酸為該聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）之全長的至少50.0 %、60.0 %、70.0 %、80.0 %、81.0 %、82.0 %、83.0 %、84.0 %、85.0 %、86.0 %、87.0 %、88.0 %、89.0 %、90.0 %、91.0 %、92.0 %、93.0 %、94.0 %、95.0 %、95.5%、96.0 %、96.5 %、97.0 %、97.5 %、98.0 %、98.5 %、99.0 %、99.5 %、100 %，較佳至少80%，更佳至少87%，甚至更佳至少90%，甚至更佳至少95%，最佳至少97%且保留全長聚核苷酸分子之可用功能特徵（例如活性）。因此，聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）之片段較佳意謂包含該聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）或由其組成之核苷酸序列，其中一定量之連續核苷酸缺失且其中該量不超過該聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）之全長的50.0%、40.0%、30.0%，較佳不超過該聚核苷酸SEQ ID NO（或Genbank NO.）之全長的20.0 %、15.0 %、10.0 %、9.0 %、8.0 %、7.0 %、6.0 %、5.0 %、4.5 %、4.0 %、3.5 %、3.0 %、2.5 %、2.0 %、1.5 %、1.0 %、0.5 %，更佳不超過15%，甚至更佳不超過10%，甚至更佳不超過5%，最佳不超過2.5%，且其中該片段保留可藉由所屬技術領域中具有通常知識者常規評定之全長聚核苷酸分子之可用功能特徵（例如活性）。

在整個申請案中，聚核苷酸序列可由SEQ ID NO或可替代地由GenBank NO表示。因此，除非另外明確陳述，否則術語「聚核苷酸SEQ ID NO（polynucleotide SEQ ID NO）」及「聚核苷酸GenBank NO.（polynucleotide GenBank NO.）」可互換使用。

片段可另外或可替代地包括多肽及蛋白質分子之子序列，或多肽之子序列。在一些情況下，片段或域為多肽之子序列，其按與完整多肽實質上相同之方式，較佳以類似程度執行完整多肽之至少一種生物功能。如本文所定義之「多肽之子序列（subsequence of the polypeptide）」係指衍生自多肽之連續胺基酸殘基的序列。舉例而言，多肽片段可包含可識別的結構模體或功能域，諸如結合於DNA啟動子區、活化域或蛋白質-蛋白質相互作用域之DNA結合位點或域，且可引發轉錄。片段之尺寸可自少至3個胺基酸殘基至完整多肽之全長變化，例如長度為至少約20個胺基酸殘基，例如長度為至少約30個胺基酸殘基。因此，多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）之片段較佳意謂一種多肽序列，其包含該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）或由其組成，其中不超過80、60、50、40、30、20或15個連續胺基酸殘基缺失，較佳不超過40個連續胺基酸殘基缺失，且其按與可藉由所屬技術領域中具有通常知識者常規評定之完整多肽實質上相同之方式，較佳以類似或更大程度執行完整多肽之至少一種生物功能。替代地，多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）之片段較佳意謂一種多肽序列，其包含來自該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）之一定量之連續胺基酸殘基或由其組成，且其中該一定量之連續胺基酸殘基為該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）之全長的至少50.0 %、60.0 %、70.0 %、80.0 %、81.0 %、82.0 %、83.0 %、84.0 %、85.0 %、86.0 %、87.0 %、88.0 %、89.0 %、90.0 %、91.0 %、92.0 %、93.0 %、94.0 %、95.0 %、95.5%、96.0 %、96.5 %、97.0 %、97.5 %、98.0 %、98.5 %、99.0 %、99.5 %、100 %，較佳至少80%，更佳至少87%，甚至更佳至少90%，甚至更佳至少95%，最佳至少97%，且其按與可藉由所屬技術領域中具有通常知識者常規評定之完整多肽實質上相同之方式，較佳以類似或更大程度執行完整多肽之至少一種生物功能。因此，多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）之片段較佳意謂一種多肽序列，其包含該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）或由其組成，其中一定量之連續胺基酸殘基缺失且其中該量不超過該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）之全長的50.0%、40.0%、30.0%，較佳不超過該多肽SEQ ID NO（或UniProt ID或Genbank NO.）之全長的20.0%、15.0%、10.0%、9.0%、8.0%、7.0%、6.0%、5.0%、4.5%、4.0%、3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%，更佳不超過15%，甚至更佳不超過10%，甚至更佳不超過5%，最佳不超過2.5%，且其按與可藉由所屬技術領域中具有通常知識者常規評定之完整多肽實質上相同之方式，較佳以類似或更大程度執行完整多肽之至少一種生物功能。

在整個申請案中，多肽序列可由SEQ ID NO或可替代地由UniProt ID或GenBank NO表示。因此，除非另外明確陳述，否則術語「多肽SEQ ID NO（polypeptide SEQ ID NO）」及「多肽UniProt ID（polypeptide UniProt ID）」及「多肽GenBank NO.（polypeptide GenBank NO.）」可互換使用。

較佳地，多肽之片段為衍生自多肽之較佳以類似或更大程度具有多肽之至少一種特性或活性的功能片段。功能片段可例如包括多肽之功能域或保守域。應理解，多肽或其片段可具有對多肽之活性實質上無作用之保守胺基酸取代。藉由保守取代，意指一種疏水性胺基酸經另一種疏水性胺基酸取代或一種極性胺基酸經另一種極性胺基酸取代或一種酸性胺基酸經另一種酸性胺基酸取代或一種鹼性胺基酸經另一種鹼性胺基酸取代等。較佳地，藉由保守取代，意指以下組合，諸如甘胺酸藉由丙胺酸取代，且反之亦然；纈胺酸、異白胺酸及白胺酸藉由甲硫胺酸取代，且反之亦然；天冬胺酸藉由麩胺酸取代，且反之亦然；天冬醯胺藉由麩醯胺酸取代，且反之亦然；絲胺酸藉由蘇胺酸取代，且反之亦然；離胺酸藉由精胺酸取代，且反之亦然；半胱胺酸藉由甲硫胺酸取代，且反之亦然；及苯丙胺酸及酪胺酸藉由色胺酸取代，且反之亦然。域可例如藉由Pfam（El-Gebali等人, Nucleic Acids Res. 47 (2019) D427-D432）或保守域資料庫（Conserved Domain Database；CDD）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）（Lu等人, Nucleic Acids Res. 48 (2020) D265-D268）名稱表徵。各資料庫之內容在每次發佈時為固定的且不改變。當特定資料庫之內容改變時，此特定資料庫接收具有新發佈日期之新發佈版本。各資料庫之所有發佈版本及其對應發佈日期及如在此等特定發佈日期標註之特定內容均為可獲得的且為本領域中所屬技術領域中具有通常知識者已知。本文所用之PFAM資料庫（https://pfam.xfam.org/）為在2020年6月11日發佈的Pfam版本33.1。蛋白質序列資訊及功能資訊可由蛋白質序列及標註資料之全面資源提供，如例如通用蛋白質資源（UniProt）（www.uniprot.org）（Nucleic Acids Res. 2021, 49(D1), D480-D489）。UniProt包含稱為UniProt知識庫（UniProtKB）之專門及充分管理的蛋白質資料庫，以及UniProt參考序列集（UniRef）及UniProt檔案（UniParc）。UniProt標識符（UniProt ID）對於存在於資料庫中之各蛋白質為特有的。如本文所用之UniProt ID為2021年5月05日之UniProt資料庫版本中之UniProt ID。在本文中使用如存在於2021年5月05日之NIH基因序列資料庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）（Nucleic Acids Res. 2013, 41(D1), D36-D42）版本中之各別Genbank寄存編號（GenBank NO.）提及不具有UniProt ID之蛋白質。

如本文所用之術語「醣基轉移酶（glycosyltransferase）」係指能夠催化糖部分自活化供體分子轉移至特異性受體分子，從而形成糖苷鍵之酶。由此合成之寡醣可具有直鏈類型或分支鏈類型且可含有多個單醣建構嵌段。已描述使用核苷酸二磷酸-糖、核苷酸單磷酸-糖及磷酸糖及相關蛋白將醣基轉移酶分類成不同的基於序列之家族（Campbell等人, Biochem. J. 326, 929-939 (1997)）且可在CAZy（碳水化合物活性酶）網站（ www.cazy.org）上獲得。

如本文所用，醣基轉移酶可選自包含（但不限於）以下者之清單：岩藻糖基轉移酶（例如α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3/1,4-岩藻糖基轉移酶、α-1,6-岩藻糖基轉移酶）、半乳糖基轉移酶（例如β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶、α-1,4-半乳糖基轉移酶）、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（例如β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶）、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶（例如α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶）、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺（altrosamine）轉胺酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶。

岩藻糖基轉移酶為將岩藻糖殘基（Fuc）自GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。岩藻糖基轉移酶包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶，其催化經由α-糖苷鍵使Fuc殘基自GDP-Fuc轉移至聚醣受體上。岩藻糖基轉移酶可發現但不限於為GT10、GT11、GT23、GT65及GT68 CAZy家族。半乳糖基轉移酶為將半乳糖苷基（Gal）自UDP-半乳糖（UDP-Gal）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。半乳糖基轉移酶包含β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶，其經由α-或β-糖苷鍵將Gal殘基自UDP-Gal轉移至聚醣受體上。半乳糖基轉移酶可發現但不限於為GT2、GT6、GT8、GT25及GT92 CAZy家族。葡萄糖基轉移酶為將葡萄糖基（Glc）自UDP-葡萄糖（UDP-Glc）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。葡萄糖基轉移酶包含α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶，其經由α-或β-糖苷鍵將Glc殘基自UDP-Glc轉移至聚醣受體上。葡萄糖基轉移酶可發現但不限於為GT1、GT4及GT25 CAZy家族。甘露糖基轉移酶為將甘露糖基（Man）自GDP-甘露糖（GDP-Man）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。甘露糖基轉移酶包含α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶，其經由α-糖苷鍵將Man殘基自GDP-Man轉移至聚醣受體上。甘露糖基轉移酶可發現但不限於為GT22、GT39、GT62及GT69 CAZy家族。N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶為將N-乙醯基葡萄糖胺基（GlcNAc）自UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）供體轉移至聚醣受體上之醣基轉移酶。N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶可發現但不限於為GT2及GT4 CAZy家族。

N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶為將N-乙醯基半乳糖胺基（GalNAc）自UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶可發現但不限於為GT7、GT12及GT27 CAZy家族。N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶為將N-乙醯基甘露糖胺基（ManNAc）自UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。木糖基轉移酶為將木糖殘基（Xyl）自UDP-木糖（UDP-Xyl）供體轉移至聚醣受體上之醣基轉移酶。木糖基轉移酶可發現但不限於為GT61及GT77 CAZy家族。鼠李糖基轉移酶為將鼠李糖殘基自GDP-鼠李糖供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。鼠李糖基轉移酶可發現但不限於為GT1、GT2及GT102 CAZy家族。N-乙醯基鼠李糖基轉移酶為將N-乙醯基鼠李糖胺殘基自UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺供體轉移至聚醣受體上之醣基轉移酶。UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶為使用UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖（arabino）-4-己酮糖用於偽胺酸（pseudaminic acid）之生物合成的醣基轉移酶，該偽胺酸為用於修飾鞭毛蛋白之唾液酸類糖。UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶（murA）為將烯醇丙酮醯基自磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）轉移至UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDPAG）以形成UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮酸鹽的醣基轉移酶。岩藻糖胺基轉移酶為將N-乙醯基岩藻糖胺殘基自dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺或UDP-N-乙醯基岩藻糖胺供體轉移至聚醣受體上的醣基轉移酶。

術語「核苷酸-糖（nucleotide-sugar）」、「核苷酸活化糖（nucleotide-activated sugar）」或「活化糖（activated sugar）」在本文中可互換使用且係指單醣之活化形式。活化單醣之實例包括但不限於UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-來蘇糖（lyxo）-4-己酮糖、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（pneumosamine）（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖、GDP-鼠李糖或UDP-木糖。核苷酸-糖在醣基化反應中充當醣基供體。醣基化反應為藉由醣基轉移酶催化之反應。

如本文所用之術語且如目前先進技術中通常所理解，「寡醣（Oligosaccharide）」係指含有少量、典型地三至二十個簡單糖（亦即單醣）的醣聚合物。如本文所用之單醣為還原糖。寡醣可為還原或非還原糖且具有還原及非還原端。還原糖為能夠還原另一種化合物且本身經氧化的任何糖，亦即糖之羰基碳經氧化成羧基。如本發明中所用之寡醣可為直鏈結構或可包括分支。兩個糖單元之間的鍵（例如糖苷鍵、半乳糖苷鍵、葡萄糖苷鍵等）可表示為例如1,4、1-＞4或(1-4)，在本文中可互換使用。舉例而言，術語「Gal-b1,4-Glc」、「β-Gal-(1-＞4)-Glc」、「Galβ1-4-Glc」及「Gal-b(1-4)-Glc」具有相同含義，亦即半乳糖（Gal）之碳-1與葡萄糖（Glc）之碳-4的β-糖苷鍵鍵聯。各單醣可呈環狀形式（例如呋喃醣形式之哌喃醣）。個別單醣單元之間的鍵聯可包括α 1-＞2、α 1-＞3、α 1-＞4、α 1-＞6、α 2-＞1、α 2-＞3、α 2-＞4、α 2-＞6、β 1-＞2、β 1-＞3、β 1-＞4、β 1-＞6、β 2-＞1、β 2-＞3、β 2-＞4及β 2-＞6。寡醣可含有α-糖苷鍵及β-糖苷鍵或可僅含有β-糖苷鍵。較佳地，如本文所描述之寡醣含有選自如本文下文所用之清單的單醣。寡醣之實例包括但不限於路易斯型（Lewis-type）抗原寡醣、哺乳動物乳寡醣及人乳寡醣。如本文所用，「基於乳-N-二糖（LNB）之寡醣（LNB (lacto-N-biose)-based oligosaccharide）」係指如本文所定義之寡醣，其在其還原端處含有LNB。如本文所用，「基於N-乙醯基乳糖胺（LacNAc）之寡醣（LacNAc (N-acetyllactosamine)-based oligosaccharide）」係指如本文所定義之寡醣，其在其還原端處含有LacNAc。

如本文所用之術語「單醣（monosaccharide）」係指藉由水解不可分解為更簡單的糖，經醛醣或酮醣分類，且每分子含有一或多個羥基的糖。單醣為含有僅一個簡單糖的醣。單醣之實例包含己糖、D-葡萄哌喃糖、D-半乳呋喃糖、D-半乳哌喃糖、L-半乳哌喃糖、D-哌喃甘露糖、D-別哌喃糖（Allopyranose）、L-阿卓哌喃糖、D-古洛哌喃糖（Gulopyranose）、L-艾杜哌喃糖（Idopyranose）、D-塔羅哌喃糖（Talopyranose）、D-呋喃核糖、D-哌喃核糖、D-阿拉伯呋喃糖（Arabinofuranose）、D-阿拉伯哌喃糖、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯哌喃糖、D-木哌喃糖、D-來蘇哌喃糖、D-赤呋喃糖（Erythrofuranose）、D-蘇糖呋喃糖（Threofuranose）、庚醣、L-甘油-D-甘露-庚糖哌喃糖（LDmanHep）、D-甘油-D-甘露-庚糖哌喃糖、（DDmanHep）、6-去氧-L-阿卓哌喃糖、6-去氧-D-古洛哌喃糖、6-去氧-D-塔羅哌喃糖、6-去氧-D-半乳哌喃糖、6-去氧-L-半乳哌喃糖、6-去氧-D-甘露哌喃糖、6-去氧-甘露哌喃糖、6-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-去氧-D-阿拉伯糖-己糖、2-去氧-D-赤-戊糖、2,6-二去氧-D-阿拉伯糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-D-阿拉伯糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-L-阿拉伯糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-D-木糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-D-核糖-己哌喃糖、2,6-二去氧-D-核糖-己哌喃糖、3,6-二去氧-L-木糖-己哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-別哌喃糖、2-胺基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-胺基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-胺基-2-去氧-D-塔羅哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-別哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-乙醯胺基-2-去氧-D-塔羅哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-半乳哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-甘露哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙醯胺基-2,6-二去氧-D-塔羅哌喃糖、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、D-核糖-己-2-酮哌喃糖、D-阿拉伯糖-己-2-酮呋喃糖（D-呋喃果糖）、D-阿拉伯糖-己-2-酮哌喃糖、L-木糖-己-2-酮哌喃糖、D-來蘇糖-己-2-酮哌喃糖、D-蘇糖-戊-2-酮哌喃糖、D-阿卓-庚-2-酮哌喃糖、3-C-(羥甲基)-D-赤呋喃糖、2,4,6-三去氧-2,4-二胺基-D-葡萄哌喃糖、6-去氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖、2,6-二去氧-3-甲基-D-核糖-己糖、2-胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙醯胺基-3-O-[(R)-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-羥乙醯基醯胺基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙醯基葡萄糖胺、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、N-乙醯基甘露糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖胺、岩藻糖、鼠李糖、果糖及多元醇。

術語多元醇意指含有多個羥基之醇。舉例而言，甘油、山梨糖醇或甘露糖醇。如本文所用，術語「雙醣（disaccharide）」係指由兩個單醣單元構成之醣。雙醣之實例包含乳糖（Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二糖（Gal-b1,3-GlcNAc）、N-乙醯基乳糖胺（Gal-b1,4-GlcNAc）、LacDiNAc（GalNAc-b1,4-GlcNAc）、N-乙醯基半乳糖胺基葡萄糖（GalNAc-b1,4-Glc）。

如本文所用，「哺乳動物乳寡醣（mammalian milk oligosaccharide）」（MMO）係指諸如但不限於以下者之寡醣：3-岩藻糖基乳糖、2'-岩藻糖基乳糖、6-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、2',2-二岩藻糖基乳糖、3,4-二岩藻糖基乳糖、乳糖二岩藻四糖、乳-N-三糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、對-乳-N-六糖、單岩藻糖基對-乳-N-六糖、單岩藻糖基乳-N-六糖III、異構岩藻糖基化乳-N-六糖III、異構岩藻糖基化乳-N-六糖I、二岩藻糖基-對-乳-N-六糖、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基乳-N-六糖a、二岩藻糖基乳-N-六糖c、半乳糖基化聚葡萄胺糖、中性岩藻糖基化寡醣。哺乳動物乳寡醣（MMO）包含在泌乳期間之任何階段中發現的乳汁中所存在之寡醣，該乳汁包括來自人類（亦即人乳寡醣或HMO）及哺乳動物之初乳，該等哺乳動物包括但不限於牛（歐洲牛（ Bos Taurus））、綿羊（綿羊（ Ovis aries））、山羊（家畜山羊（ Capra aegagrus hircus））、雙峰駱駝（雙峰駝（ Camelus bactrianus））、馬（歐洲野馬（ Equus ferus caballus））、豬（野豬（ Sus scropha））、犬（家犬亞種（ Canis lupus familiaris））、蝦夷棕熊（ezo brown bear）（日本棕熊（ Ursus arctos yesoensis））、北極熊（海熊（ Ursus maritimus））、日本黑熊（亞洲黑熊（ Ursus thibetanus japonicus））、條紋臭鼬（條紋臭鼬（ Mephitis mephitis））、冠海豹（冠海豹（ Cystophora cristata））、亞洲大象（亞洲象（ Elephas maximus））、非洲大象（非洲象（ Loxodonta africana））、巨食蟻獸（大食蟻獸（ Myrmecophaga tridactyla））、真瓶鼻海豚（瓶鼻海豚（ Tursiops truncates））、北極小鬚鯨（小鬚鯨（ Balaenoptera acutorostrata））、尤金袋鼠（尤金袋鼠（ Macropus eugenii））、紅袋鼠（紅袋鼠（ Macropus rufus））、普通袋狐（帚尾袋貂（ Trichosurus Vulpecula））、無尾熊（考拉（ Phascolarctos cinereus））、東袋鼬（細腳袋鼩（ Dasyurus viverrinus））、鴨嘴獸（鴨嘴獸（ Ornithorhynchus anatinus））。人乳寡醣（human milk oligosaccharide；HMO）亦稱為人類一致乳寡醣，其在化學上與人類母乳中發現之人乳寡醣一致，但為生物技術產生的（例如使用不含細胞之系統或細胞及包含細菌、真菌、酵母菌、植物、動物或原蟲細胞之生物體，較佳經基因工程改造之細胞及生物體）。人類一致乳寡醣以名稱HiMO出售。

如本文所用，「基於乳糖之哺乳動物乳寡醣（lactose-based mammalian milk oligosaccharide）（MMO）」係指如本文中所定義之MMO，其在其還原端含有乳糖。

如本文中所使用，術語「路易斯型抗原（Lewis-type antigen）」包含以下寡醣：H1抗原，其為Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc，或簡言之2'FLNB；Lewisa（或Lea），其為三醣Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或簡言之4-FLNB；Lewisb（或Leb），其為四醣Fucα1-2Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或簡言之DiF-LNB；H2抗原，其為Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc，或另外稱作2'岩藻糖基-N-乙醯基乳糖胺，簡言之2'FLacNAc；Lewisx（或Lex），其為三醣Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc，或另外稱為3-岩藻糖基-N-乙醯基乳糖胺，簡言之3-FLacNAc；及Lewisy（或Ley），其為四醣Fucα1-2Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc。

術語「LNB」及「乳-N-二糖（Lacto-N-biose）」可互換使用且係指雙醣Gal-b1,3-GlcNAc。

術語「LacNAc」及「N-乙醯基乳糖胺（N-acetyllactosamine）」可互換使用且係指雙醣Gal-b1,4-GlcNAc。

如本文所用且如目前先進技術中一般所理解，『中性岩藻糖基化寡醣（neutral fucosylated oligosaccharide）』為攜有岩藻糖-殘基之非帶電中性寡醣。如本文所用，且如目前先進技術中一般所瞭解，中性寡醣為不具有源自羧酸基之負電荷的寡醣。此類中性岩藻糖基化寡醣為包含經由糖苷鍵彼此連接之至少三個單醣次單元的醣結構，其中該單醣次單元中之至少一者為岩藻糖。中性岩藻糖基化寡醣可含有超過一個岩藻糖殘基，例如兩個、三個或更多個。岩藻糖可經由α-糖苷鍵連接至包含葡萄糖、半乳糖、GlcNAc之其他單醣次單元，該α-糖苷鍵包含α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6鍵。

實例包含2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、6-岩藻糖基乳糖（6FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL）、乳糖二岩藻四糖（LDFT）、乳-N-岩藻五糖I（LNFP I）、乳-N-岩藻五糖II（LNFP II）、乳-N-岩藻五糖III（LNFP III）、乳-N-岩藻五糖V（LNFP V）、乳-N-岩藻五糖VI（LNFP VI）、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-二岩藻六糖I（LDFH I）、乳-N-二岩藻六糖II（LDFH II）、單岩藻糖基乳-N-六糖III（MFLNH III）、二岩藻糖基乳-N-六糖（DFLNHa）、二岩藻糖基-乳-N-新六糖。如本發明中所用之術語「α-1,2-岩藻糖基轉移酶（alpha-1,2-fucosyltransferase）」、「α 1,2岩藻糖基轉移酶（alpha 1,2 fucosyltransferase）」、「2-岩藻糖基轉移酶（2-fucosyltransferase）」、「α-1,2-岩藻糖基轉移酶（α-1,2-fucosyltransferase）」、「α 1,2岩藻糖基轉移酶（α 1,2 fucosyltransferase）」、「2岩藻糖基轉移酶（2 fucosyltransferase）」、「2-FT」或「2FT」可互換使用且係指催化岩藻糖自供體GDP-L-岩藻糖轉移至α-1,2-鍵中之受體分子的醣基轉移酶。如本發明中所用之術語「2'岩藻基乳糖（2' fucosyllactose）」、「2'-岩藻基乳糖（2'-fucosyllactose）」、「α-1,2-岩藻基乳糖（α-1,2-fucosyllactose）」、「α 1,2岩藻基乳糖（α 1,2 fucosyllactose）」、「α-1,2-岩藻基乳糖（α-1,2-fucosyllactose）」、「α 1,2岩藻基乳糖（α 1,2 fucosyllactose）」、「Galβ-4(Fucα1-2)Glc」、「2FL」或「2'FL」可互換使用且係指藉由催化α-1,2-岩藻糖基轉移酶將岩藻糖殘基自GDP-L-岩藻糖移轉至α-1,2-鍵中之乳糖獲得的產物。如本發明中所用之術語「二岩藻基乳糖（difucosyllactose）」、「二-岩藻基乳糖（di-fucosyllactose）」、「乳糖二岩藻四糖（lactodifucotetraose）」、「2',3-二岩藻基乳糖（2',3-difucosyllactose）」、「2',3二岩藻基乳糖（2',3 difucosyllactose）」、「α-2',3-岩藻基乳糖（α-2',3-fucosyllactose）」、「α 2',3岩藻基乳糖（fucosyllactose）」、「Fucα1-2Galβ 1-4(Fucα1-3)Glc」、「DFLac」、「2',3 diFL」、「DFL」、「DiFL」或「diFL」可互換使用。

如本發明中所用之術語「α-1,3-岩藻糖基轉移酶（alpha-1,3-fucosyltransferase）」、「α 1,3岩藻糖基轉移酶（alpha 1,3 fucosyltransferase）」、「3-岩藻糖基轉移酶（3-fucosyltransferase）」、「α-1,3-岩藻糖基轉移酶（α-1,3-fucosyltransferase）」、「α 1,3岩藻糖基轉移酶（α 1,3 fucosyltransferase）」、「3岩藻糖基轉移酶（3 fucosyltransferase）」、「3-FT」或「3FT」可互換使用且係指催化岩藻糖自供體GDP-L-岩藻糖轉移至α-1,3-鍵中之受體分子的醣基轉移酶。如本發明中所用之術語「3-岩藻基乳糖（3-fucosyllactose）」、「α-1,3-岩藻基乳糖（alpha-1,3-fucosyllactose）」、「α 1,3岩藻基乳糖（alpha 1,3 fucosyllactose）」、「α-1,3-岩藻基乳糖（α-1,3-fucosyllactose）」、「α 1,3岩藻基乳糖（α 1,3 fucosyllactose）」、「Galβ-4(Fucα1-3)Glc」、「3FL」或「3-FL」可互換使用且係指藉由催化α-1,3-岩藻糖基轉移酶將岩藻糖殘基自GDP-L-岩藻糖移轉至α-1,3-鍵中之乳糖獲得的產物。

『中性寡醣（neutral oligosaccharide）』包含在其聚醣結構中含有一或多個岩藻糖次單元的非帶電岩藻糖基化寡醣以及缺乏任何岩藻糖次單元的非帶電非岩藻糖基化寡醣。如本文所用之『中性寡醣』之實例包含2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3FL）、2',3-二岩藻糖基乳糖（diFL）、乳-N-三糖II（LN3）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、對-乳-N-六糖、對-乳-N-新六糖、二岩藻糖基-乳-N-六糖及二岩藻糖基-乳-N-新六糖。

如本文所用，人類ABO血型系統之抗原為寡醣。人類ABO血型系統之此類抗原不限於人類結構。該等結構涉及存在於包含Gal-β1,3-GlcNAc、Gal-β1,4-GlcNAc、Gal-β1,3-GalNAc及Gal-β1,4-Glc之雙醣核心結構上的A決定子GalNAc-α1,3(Fuc-α1,2)-Gal-、B決定子Gal-α1,3(Fuc-α1,2)-Gal-及H決定子Fuc-α1,2-Gal-。

如本發明中所用之術語「LNT II」、「LNT-II」、「LN3」、「乳-N-丙糖II（lacto-N-triose II）」、「乳- N-丙糖II（lacto- N-triose II）」、「乳-N-丙糖（lacto-N-triose）」、「乳- N-丙糖（lacto- N-triose）」或「GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。

如本發明中所用之術語「LNT」、「乳-N-四糖（lacto-N-tetraose）」、「乳- N-四糖（lacto- N-tetraose）」或「Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。

如本發明中所用之術語「LNnT」、「乳-N-新四糖（lacto-N- neotetraose）」、「乳- N-新四糖（lacto- N-neotetraose）」、「新-LNT（neo-LNT）」或「Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互換使用。

術語「GalNAc-LNFP-I」及「A血型抗原六糖I型（blood group A antigen hexaose type I）」可互換使用且係指GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。

術語「LNFP-II」及「乳-N-岩藻五糖II（lacto-N-fucopentaose II）」可互換使用且係指Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。

術語「LNFP-III」及「乳-N-岩藻五糖III（lacto-N-fucopentaose III）」可互換使用且係指Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。

術語「LNFP-V」及「乳-N-岩藻五糖V（lacto-N-fucopentaose V）」可互換使用且係指Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。

術語「LNFP-VI」、「LNnFP V」及「乳-N-新岩藻五糖V（lacto-N-neofucopentaose V）」可互換使用且係指Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。

術語「LNnFP I」及「乳-N-新岩藻五糖I（Lacto-N-neofucopentaose I）」可互換使用且係指Fuc-a1,2-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。

術語「LNDFH I」、「乳-N-二岩藻六糖（Lacto-N-difucohexaose I）」、「LNDFH-I」、「LDFH I」、「Le ^b-乳糖」及「路易斯-b六醣（Lewis-b hexasaccharide）」可互換使用且係指Fuc-a1,2-Gal-b1,3-[Fuc-a1,4]-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc。

術語「LNDFH II」、「乳-N-二岩藻六糖II（Lacto-N-difucohexaose II）」、「路易斯a-路易斯x（Lewis a-Lewis x）」及「LDFH II」可互換使用且係指Fuc-a1,4-(Gal-b1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。

術語「LNnDFH」、「乳-N-新二岩藻六糖（Lacto-N-neoDiFucohexaose）」及「路易斯x六糖（Lewis x hexaose）」可互換使用且係指Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc。

術語「α-四醣（alpha-tetrasaccharide）」及「A-四醣（A-tetrasaccharide）」可互換使用且係指GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,4-Glc。

如本文所用之『岩藻糖基化路徑（fucosylation pathway）』係由以下者組成之生化路徑：酶及其各別基因，甘露糖-6-磷酸鹽異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶及/或再利用路徑L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶，以及產生α 1,2、α 1,3、α 1,4及/或α 1,6岩藻糖基化寡醣之岩藻糖基轉移酶。

如本文所用之『半乳糖基化路徑（galactosylation pathway）』為由以下者組成之生化路徑：酶及其各別基因，半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶及/或葡萄糖磷酸變位酶，以及產生寡醣之2、3、4及/或6羥基上之α或β結合半乳糖的半乳糖基轉移酶。

如本文所用之『N-乙醯基葡萄糖胺碳水化合物路徑（N-acetylglucosamine carbohydrate pathway）』為由以下者組成之生化路徑：酶及其各別基因，L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶及/或葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶，以及產生寡醣之3、4及/或6羥基上之α或β結合N-乙醯基葡萄糖胺的醣基轉移酶。

如本文所用之『N-乙醯基半乳糖胺基化路徑（N-acetylgalactosaminylation pathway）』為包含酶及其各別基因中之至少一者的生化路徑，該等酶及其各別基因選自包含以下者之清單：L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、 N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、 UDP- N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、 UDP-葡萄糖 4-表異構酶、 N-乙醯基半乳糖胺激酶及/或 UDP- N-乙醯基半乳糖胺焦磷酸化酶，以及產生GalNAc修飾之化合物的醣基轉移酶，該化合物包含在單-、二-或寡醣上具有α或β結合N-乙醯基半乳糖胺之該單-、二-或寡醣。

如本文所用之『甘露糖基化路徑（mannosylation pathway）』為包含酶及其各別基因中之至少一者的生化路徑，該等酶及其各別基因選自包含以下者之清單：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶及/或甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶，以及產生甘露糖基化化合物之醣基轉移酶，該化合物包含在單-、二-或寡醣上具有α或β結合甘露糖之該單-、二-或寡醣。

如本文所用之『N-乙醯基甘露糖胺基化路徑（N-acetylmannosaminylation pathway）』為包含酶及其各別基因中之至少一者的生化路徑，該等酶及其各別基因選自包含以下者之清單：L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、UDP-GlcNAc 2-表異構酶及/或ManNAc激酶，以及產生ManNAc修飾之化合物的醣基轉移酶，該化合物包含在單-、二-或寡醣上具有α或β結合N-乙醯基甘露糖胺之該單-、二-或寡醣。

術語「甘露糖-6-磷酸異構酶（mannose-6-phosphate isomerase）」、「磷酸甘露糖異構酶（phosphomannose isomerase）」、「甘露糖磷酸異構酶（mannose phosphate isomerase）」、「磷酸已糖異構酶（phosphohexoisomerase）」、「磷酸甘露糖異構酶（phosphomannoisomerase）」、「磷酸甘露糖-異構酶（phosphomannose-isomerase）」、「磷酸已糖變位酶（phosphohexomutase）」、「D-甘露糖-6-磷酸鹽酮醇-異構酶（D-mannose-6-phosphate ketol-isomerase）」及「manA」可互換使用且係指催化D-果糖6-磷酸鹽可逆地轉化為D-甘露糖6-磷酸鹽之酶。

術語「磷酸甘露糖變位酶（phosphomannomutase）」、「甘露糖磷酸變位酶（mannose phosphomutase）」、「磷酸甘露糖變位酶（phosphomannose mutase）」、「D-甘露糖1,6-磷酸變位酶（D-mannose 1,6-phosphomutase）」及「manB」可互換使用且係指催化D-甘露糖6-磷酸鹽可逆地轉化為D-甘露糖1-磷酸鹽之酶。

術語「甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（mannose-1-phosphate guanylyltransferase）」、「GTP-甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase）」、「磷酸甘露糖異構酶-鳥苷5'-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶（phosphomannose isomerase-guanosine 5'-diphospho-D-mannose pyrophosphorylase；PIM-GMP）」、「GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GDP-mannose pyrophosphorylase）」、「鳥苷5'-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶（guanosine 5'-diphospho-D-mannose pyrophosphorylase）」、「鳥苷二磷酸甘露糖焦磷酸化酶（guanosine diphosphomannose pyrophosphorylase）」、「鳥苷三磷酸-甘露糖1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（guanosine triphosphate-mannose 1-phosphate guanylyltransferase）」、「甘露糖1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（三磷酸鳥苷）（mannose 1-phosphate guanylyltransferase (guanosine triphosphate)）」及「manC」可互換使用且係指使用GTP將D-甘露糖-1-磷酸鹽轉化為GDP-甘露糖及二磷酸鹽之酶。

術語「GDP-甘露糖4,6-脫水酶（GDP-mannose 4,6-dehydratase）」、「鳥苷5'-二磷酸鹽-D-甘露糖氧化還原酶（guanosine 5'-diphosphate-D-mannose oxidoreductase）」、「鳥苷二磷酸甘露糖氧化還原酶（guanosine diphosphomannose oxidoreductase）」、「鳥苷二磷酸甘露糖4,6-脫水酶（guanosine diphosphomannose 4,6-dehydratase）」、「GDP-D-甘露糖脫水酶（GDP-D-mannose dehydratase）」、「GDP-D-甘露糖4,6-脫水酶（GDP-D-mannose 4,6-dehydratase）」、「GDP-甘露糖4,6-氫-解離酶（GDP-mannose 4,6-hydro-lyase）」、「GDP-甘露糖4,6-氫-解離酶（形成GDP-4-脫氫-6-去氧-D-甘露糖）（GDP-mannose 4,6-hydro-lyase (GDP-4-dehydro-6-deoxy-D-mannose-forming)）」及「gmd」可互換使用且係指在GDP-鼠李糖及GDP-岩藻糖之生物合成中形成第一步驟之酶。

術語「GDP-L-岩藻糖合酶（GDP-L-fucose synthase）」、「GDP-4-酮-6-去氧-D-甘露糖-3,5-表異構酶-4-還原酶（GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reductase）」、「GDP-L-岩藻糖:NADP+4-氧化還原酶（3,5-表異構化）（GDP-L-fucose:NADP+ 4-oxidoreductase (3,5-epimerizing)）」及「fcl」可互換使用且係指在GDP-岩藻糖之生物合成中形成第二步驟之酶。

術語「L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶（L-fucokinase/GDP-fucose pyrophosphorylase）」、「L-岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-P鳥苷醯基轉移酶（L-fucokinase/L-fucose-1-P guanylyltransferase）」、「GDP-岩藻糖焦磷酸化酶（GDP-fucose pyrophosphorylase）」、「GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶（GDP-L-fucose pyrophosphorylase）」及「fkp」可互換使用且係指催化使用GTP將L-岩藻糖-1-磷酸鹽轉化為GDP-岩藻糖之酶。

術語「L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（L-glutamine-D-fructose-6-phosphate aminotransferase）」、「麩醯胺酸---果糖-6-磷酸轉胺酶（異構化）（glutamine---fructose-6-phosphate transaminase (isomerizing)）」、「磷酸己糖胺基轉移酶（hexosephosphate aminotransferase）」、「葡萄糖胺-6-磷酸異構酶（形成麩醯胺酸）（glucosamine-6-phosphate isomerase (glutamine-forming）」、「麩醯胺酸-果糖-6-磷酸轉胺酶（異構化）（glutamine-fructose-6-phosphate transaminase (isomerizing)）」、「D-果糖-6-磷酸醯胺轉移酶（D-fructose-6-phosphate amidotransferase）」、「果糖-6-磷酸胺基轉移酶（fructose-6-phosphate aminotransferase）」、「磷酸葡萄糖胺異構酶（glucosaminephosphate isomerase）」、「葡萄糖胺6-磷酸合酶（glucosamine 6-phosphate synthase）」、「GlcN6P合酶（GlcN6P synthase）」、「GFA」、「glms」、「glmS」及「glmS*54」可互換使用且係指催化使用L-麩醯胺酸將D-果糖-6-磷酸鹽轉化為D-葡萄糖胺-6-磷酸鹽之酶。

術語「葡萄糖胺-6-P脫胺酶（glucosamine-6-P deaminase）」、「葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶（glucosamine-6-phosphate deaminase）」、「GlcN6P脫胺酶（GlcN6P deaminase）」、「葡萄糖胺-6-磷酸異構酶（glucosamine-6-phosphate isomerase）」、「glmD」及「nagB」可互換使用且係指催化葡萄糖胺-6-磷酸鹽（GlcN6P）之可逆異構化-脫胺作用以形成果糖-6-磷酸鹽及銨離子之酶。

術語「磷酸葡萄糖胺變位酶（phosphoglucosamine mutase）」及「glmM」可互換使用且係指催化葡萄糖胺-6-磷酸鹽轉化成葡萄糖胺-1-磷酸鹽之酶。磷酸葡萄糖胺變位酶亦可催化自葡萄糖-1-P形成葡萄糖-6-P，儘管速率要低1400倍。

術語「N-乙醯基葡萄糖胺-6-P去乙醯酶（N-acetylglucosamine-6-P deacetylase）」、「N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶（N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase）」及「nagA」可互換使用且係指催化N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸鹽（GlcNAc-6-P）之N-乙醯基的水解以產生葡萄糖胺-6-磷酸鹽（GlcN6P）及乙酸鹽的酶。

N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶為催化反應N-醯基-D-葡萄糖胺=N-醯基-D-甘露糖胺之酶。此酶之替代名稱包含N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶、GlcNAc 2-表異構酶、N-醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶及N-乙醯基葡萄糖胺表異構酶。

UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶為催化反應N-乙醯基-D-葡萄糖胺=N-乙醯基甘露糖胺之酶。此酶之替代名稱包含UDP-N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-GlcNAc-2-表異構酶及UDP-N-乙醯基-D-葡萄糖胺2-表異構酶。

N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶為催化反應N-乙醯基-D-葡萄糖胺6-磷酸鹽=N-乙醯基-D-甘露糖胺6-磷酸鹽之酶。

雙功能性UDP-GlcNAc 2-表異構酶/激酶為催化反應UDP-N-乙醯基-D-葡萄糖胺=N-乙醯基-D-甘露糖胺及反應N-乙醯基-D-甘露糖胺+ATP=ADP+N-乙醯基-D-甘露糖胺6-磷酸鹽之雙功能性酶。

葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶為催化乙醯基自乙醯基-CoA轉移至D-葡萄糖胺-6-磷酸鹽從而產生游離CoA及N-乙醯基-D-葡萄糖胺6-磷酸鹽之酶。替代名稱包含胺基去氧葡萄糖磷酸乙醯基轉移酶、D-葡萄糖胺-6-P N-乙醯基轉移酶、葡萄糖胺6-磷酸乙醯基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、葡萄糖胺-磷酸N-乙醯基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸乙醯基酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡萄糖胺乙醯基酶、磷酸葡萄糖胺N-乙醯基酶磷酸葡萄糖胺N-乙醯基酶、磷酸葡萄糖胺轉乙醯基酶、GNA及GNA1。

術語「N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶（N-acetylglucosamine-6-phosphate phosphatase）」係指使N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸鹽（GlcNAc-6-P）去磷酸化由此合成N-乙醯基葡萄糖胺（GlcNAc）之酶。

術語「N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶（N-acetylmannosamine-6-phosphate phosphatase）」係指使N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸鹽（ManNAc-6P）去磷酸化成N-乙醯基甘露糖胺（ManNAc）之酶。

術語「N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶（N-acetylmannosamine-6-phosphate 2-epimerase）」、「ManNAc-6-P異構酶（ManNAc-6-P isomerase）」、「ManNAc-6-P 2-表異構酶（ManNAc-6-P 2-epimerase）」、「N-乙醯基葡萄糖胺-6P 2-表異構酶（N-acetylglucosamine-6P 2-epimerase）」及「nanE」可互換使用且係指將ManNAc-6-P轉化為N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸鹽（GlcNAc-6-P）之酶。

術語「磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶（phosphoacetylglucosamine mutase）」、「乙醯基葡萄糖胺磷酸變位酶（acetylglucosamine phosphomutase）」、「乙醯基胺基去氧葡萄糖磷酸變位酶（acetylaminodeoxyglucose phosphomutase）」、「二氧磷基-N-乙醯基葡萄糖胺變位酶（phospho-N-acetylglucosamine mutase）」及「N-乙醯基-D-葡萄糖胺1,6-磷酸變位酶（N-acetyl-D-glucosamine 1,6-phosphomutase）」可互換使用且係指催化將N-乙醯基-葡萄糖胺1-磷酸鹽轉化成N-乙醯基葡萄糖胺6-磷酸鹽之酶。

術語「N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶（N-acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase）」、「N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase）」、「UDP-N-乙醯基葡萄糖胺二磷酸酶（UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase）」、「UDP-N-乙醯基葡萄糖胺焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase）」、「尿苷二磷酸乙醯基葡萄糖胺焦磷酸化酶（uridine diphosphoacetylglucosamine pyrophosphorylase）」、「UTP:2-乙醯胺基-2-去氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（UTP:2-acetamido-2-deoxy-alpha-D-glucose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「UDP-GlcNAc焦磷酸化酶（UDP-GlcNAc pyrophosphorylase）」、「GlmU尿苷醯基轉移酶（GlmU uridylyltransferase）」、「乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶（Acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase）」、「UDP-乙醯基葡萄糖胺焦磷酸化酶（UDP-acetylglucosamine pyrophosphorylase）」、「二磷酸尿苷-N-乙醯基葡萄糖胺焦磷酸化酶（uridine diphosphate-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase）」、「尿苷二磷酸乙醯基葡萄糖胺磷酸化酶（uridine diphosphoacetylglucosamine phosphorylase）」及「乙醯基葡萄糖胺1-磷酸尿苷醯基轉移酶（acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase）」可互換使用且係指催化藉由轉移尿苷5-單磷酸鹽（自尿苷5-三磷酸鹽（uridine 5-triphosphate；UTP）轉移）將N-乙醯基葡萄糖胺1-磷酸鹽（GlcNAc-1-P）轉化為UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）之酶。

術語葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶係指催化乙醯基自乙醯基輔酶A轉移至葡萄糖胺-1-磷酸鹽（GlcN-1-P）以產生N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸鹽（GlcNAc-1-P）之酶。

術語「glmU」係指具有N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶及葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶活性兩者且催化UDP-GlcNAc之從頭生物合成路徑中之兩個依序反應的雙功能性酶。C端域催化乙醯基自乙醯基輔酶A轉移至GlcN-1-P以產生GlcNAc-1-P，其藉由尿苷5-單磷酸鹽之轉移而轉化成UDP-GlcNAc，此係由N端域催化之反應。

術語「半乳糖-1-表異構酶（galactose-1-epimerase）」、「醛糖1-表異構酶（aldose 1-epimerase）」、「變旋酶（mutarotase）」、「醛醣變旋酶（aldose mutarotase）」、「半乳糖變旋酶（galactose mutarotase）」、「半乳糖1-表異構酶（galactose 1-epimerase）」及「D-半乳糖1-表異構酶（D-galactose 1-epimerase）」可互換使用且係指催化β-D-半乳糖轉化為α-D-半乳糖之酶。

術語「半乳糖激酶（galactokinase）」、「半乳糖激酶（磷酸化）（galactokinase(phosphorylating)）」及「ATP:D-半乳糖-1-磷酸轉移酶（ATP:D-galactose-1-phosphotransferase）」可互換使用且係指催化使用ATP將α-D-半乳糖轉化成α-D-半乳糖1-磷酸鹽之酶。

術語葡萄糖激酶及「葡萄糖激酶（磷酸化）（glucokinase (phosphorylating)）」可互換使用且係指催化使用ATP將D-葡萄糖轉化成D-葡萄糖6-磷酸鹽之酶。

術語「半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（galactose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「Gal-1-P尿苷醯基轉移酶（Gal-1-P uridylyltransferase）」、「UDP-葡萄糖---己糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（UDP-glucose---hexose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「尿苷醯基轉移酶（uridyl transferas）」、「己糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（hexose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「尿苷醯基轉移酶（uridyltransferase）」、「己糖1-磷酸尿苷醯基轉移酶（hexose 1-phosphate uridyltransferase）」、「UDP-葡萄糖:α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（UDP-glucose:alpha-D-galactose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「galB」及「galT」可互換使用且係指催化反應D-半乳糖1-磷酸鹽+UDP-D-葡萄糖=D-葡萄糖1-磷酸鹽+UDP-D-半乳糖之酶。

術語「UDP-葡萄糖4-表異構酶（UDP-glucose 4-epimerase）」、「UDP-半乳糖4-表異構酶（UDP-galactose 4-epimerase）」、「尿苷二磷酸葡萄糖表異構酶（uridine diphosphoglucose epimerase）」、「半乳糖瓦爾登轉化酶（galactowaldenase）」、「UDPG-4-表異構酶（UDPG-4-epimerase）」、「尿苷二磷酸半乳糖4-表異構酶（uridine diphosphate galactose 4-epimerase）」、「尿苷二磷酸-半乳糖-4-表異構酶（uridine diphospho-galactose-4-epimerase）」、「UDP-葡萄糖表異構酶（UDP-glucose epimerase）」、「4-表異構酶（4-epimerase）」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表異構酶（uridine diphosphoglucose 4-epimerase）」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表異構酶（uridine diphosphate glucose 4-epimerase）」及「UDP-D-半乳糖4-表異構酶（UDP-D-galactose 4-epimerase）」可互換使用且係指催化UDP-D-葡萄糖轉化為UDP-半乳糖之酶。

術語「葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（glucose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「UTP---葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶（UTP---glucose-1-phosphate uridylyltransferase）」、「UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UDP glucose pyrophosphorylase）」、「UDPG磷酸化酶（UDPG phosphorylase）」、「UDPG焦磷酸化酶（UDPG pyrophosphorylase）」、「尿苷5'-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine 5'-diphosphoglucose pyrophosphorylase）」、「尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase）」、「尿苷二磷酸-D-葡萄糖焦磷酸化酶（uridine diphosphate-D-glucose pyrophosphorylase）」、「尿苷-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine-diphosphate glucose pyrophosphorylase）」及「galU」可互換使用且係指催化使用UTP將D-葡萄糖-1-磷酸鹽轉化為UDP-葡萄糖之酶。

術語「磷酸葡萄糖變位酶（α-D-葡萄糖-1,6-二磷酸依賴型）（phosphoglucomutase (alpha-D-glucose-1,6-bisphosphate-dependent)）」、「葡萄糖磷酸變位酶（不明確）（glucose phosphomutase (ambiguous)）」及「磷酸葡萄糖變位酶（不明確）（phosphoglucose mutase (ambiguous)）」可互換使用且係指催化D-葡萄糖1-磷酸鹽轉化為D-葡萄糖6-磷酸鹽之酶。

術語「UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶（UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase）」、「UDP乙醯基葡萄糖胺表異構酶（UDP acetylglucosamine epimerase）」、「尿苷二磷酸乙醯基葡萄糖胺表異構酶（uridine diphosphoacetylglucosamine epimerase）」、「尿苷二磷酸N-乙醯基葡萄糖胺-4-表異構酶（uridine diphosphate N-acetylglucosamine-4-epimerase）」、「尿苷5'-二磷酸-N-乙醯基葡萄糖胺-4-表異構酶（uridine 5'-diphospho-N-acetylglucosamine-4-epimerase）」及「UDP-N-乙醯基-D-葡萄糖胺4-表異構酶（UDP-N-acetyl-D-glucosamine 4-epimerase）」可互換使用且係指催化UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）差向異構化為UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）之酶。

術語「N-乙醯基半乳糖胺激酶（N-acetylgalactosamine kinase）」、「GALK2」、「GK2」、「GalNAc激酶（GalNAc kinase）」、「N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)-1-磷酸激酶（N-acetylgalactosamine (GalNAc)-1-phosphate kinase）」及「ATP:N-乙醯基-D-半乳糖胺1-磷酸轉移酶（ATP:N-acetyl-D-galactosamine 1-phosphotransferase）」可互換使用且係指催化使用ATP自N-乙醯基半乳糖胺（GalNAc）合成N-乙醯基半乳糖胺1-磷酸鹽（GalNAc-1-P）之酶。

術語「UDP-N-乙醯基半乳糖胺焦磷酸化酶（UDP-N-acetylgalactosamine pyrophosphorylase）」及「UDP-GalNAc焦磷酸化酶（UDP-GalNAc pyrophosphorylase）」可互換使用且係指使用UTP催化N-乙醯基半乳糖胺1-磷酸鹽（GalNAc-1-P）轉化為UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）之酶。

術語「N-乙醯基神經胺酸激酶（N-acetylneuraminate kinase）」、「ManNAc激酶（ManNAc kinase）」、「N-乙醯基-D-甘露糖胺激酶（N-acetyl-D-mannosamine kinase）」及「nanK」可互換使用且係指使ManNAc磷酸化以合成N-乙醯基甘露糖胺-磷酸鹽（ManNAc-6-P）之酶。

術語「乙醯基-輔酶A合成酶（acetyl-coenzyme A synthetase）」、「acs」、「乙醯基-CoA合成酶（acetyl-CoA synthetase）」、「AcCoA合成酶（AcCoA synthetase）」、「乙酸鹽--CoA接合酶（acetate--CoA ligase）」、「醯基活化酶（acyl-activating enzyme）」及「yfaC」可互換使用且係指在ATP依賴性反應中催化乙酸鹽轉化為乙醯基-輔酶A（AcCoA）之酶。

術語「丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase）」、「丙酮酸氧化酶（pyruvate oxidase）」、「POX」、「poxB」及「丙酮酸鹽:泛醌-8氧化還原酶（pyruvate:ubiquinone-8 oxidoreductase）」可互換使用且係指催化丙酮酸鹽之氧化去羧以產生乙酸鹽及CO2之酶。

術語「乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）、「D-乳酸脫氫酶（D-lactate dehydrogenase）」、「ldhA」、「hslI」、「htpH」、「D-LDH」、「醱酵性乳酸脫氫酶（fermentative lactate dehydrogenase）」及「D-特異性2-羥基酸脫氫酶（D-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase）」可互換使用且係指催化乳酸鹽轉化成丙酮酸鹽由此生成NADH之酶。

如本文所用，術語「細胞製造力指數（cell productivity index；CPI）」係指藉由細胞產生之產物的質量除以培養物中產生之細胞的質量。

術語「純化（purified）」係指實質上或基本上不含干擾生物分子活性之組分的物質。對於細胞、醣類、核酸及多肽，術語「純化」係指實質上或基本上不含通常伴隨如天然狀態下所發現之物質的組分的物質。典型地，本發明之經純化醣、寡醣、蛋白質或核酸為至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%純，通常至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%純，如藉由基於銀染凝膠之條帶強度或用於測定純度之其他方法所量測。純度或均質性可藉由所屬技術領域中熟知之多種方式指示，該等方式諸如蛋白質或核酸樣品之聚丙烯醯胺凝膠電泳，之後在染色後進行觀測。出於某些目的，將需要高解析度及採用HPLC或用於純化之類似方式。對於寡醣，純度可使用諸如（但不限於）薄層層析、氣相層析、NMR、HPLC、毛細管電泳或質譜分析之方法測定。

如使用序列比較演算法或藉由目視檢查所量測，在針對最大對應性比較且比對時，在兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中，術語「一致（identical）」或「一致性百分比（percent identity）」或「一致性%（% identity）」係指兩個或更多個相同或具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸的序列或子序列。對於序列比較，一個序列充當參考序列，將測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。接著，序列比較演算法根據所指定之程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。可在參考序列之全長序列內全局計算一致性百分比，產生整體一致性百分比評分。替代地，可在參考序列之部分序列內計算一致性百分比，產生局部一致性百分比評分。在局部序列比對中使用參考序列之全長產生測試與參考序列之間的整體一致性百分比評分。一致性百分比可使用不同演算法如例如BLAST及PSI-BLAST（Altschul等人, 1990, J Mol Biol 215:3, 403- 410；Altschul等人, 1997, Nucleic Acids Res 25: 17, 3389-402）、Clustal Omega方法（Sievers等人, 2011, Mol. Syst. Biol. 7:539）、MatGAT方法（Campanella等人, 2003, BMC Bioinformatics, 4:29）或EMBOSS Needle測定。

比對之基本局部比對搜尋工具（Basic Local Alignment Search Tool；BLAST）方法為由國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information；NCBI）提供以使用預設參數比較序列之演算法。該程式比較核苷酸或蛋白質序列與序列資料庫且計算統計顯著性。位置特異性迭代基本局部比對搜尋工具（Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool；PSI-BLAST）使用蛋白質-蛋白質BLAST（BLASTp）自超過給定分數臨限值偵測之序列之多個序列比對導出位置特異性評分矩陣（position-specific scoring matrix；PSSM）或分佈概況。BLAST方法可用於成對或多序列比對。成對序列比對用於鑑別具有相似性之區，其可以指示兩個生物序列（蛋白質或核酸）之間的功能、結構及/或進化關係。BLAST之網頁界面可在以下者獲得：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

Clustal Omega（Clustal W）為使用接種之引導樹及HMM分佈-分佈技術（HMM profile-profile technique）以在三個或更多個序列之間產生比對的多序列比對程式。其產生發散序列之生物學上有意義的多序列比對。Clustal W之網頁介面可在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/下獲得。使用Clustal W方法進行多序列比對及蛋白質序列一致性百分比計算之預設參數為：啟用輸入序列之去比對：FALSE；啟用mbed類集群引導樹：TRUE；啟用mbed類集群迭代：TRUE；（組合引導樹/HMM）迭代之數目：預設(0)；最大引導樹迭代：預設[-1]；最大HMM迭代：預設[-1]；命令：比對。

矩陣全局比對工具（MatGAT）係在不需要資料之預比對之情況下產生DNA或蛋白質序列之相似性/一致性矩陣的電腦應用。程式使用Myers及Miller全局比對演算法進行一系列成對比對，計算相似性及一致性，且接著將結果置於距離矩陣中。使用者可以指定採用何種類型之比對矩陣（例如BLOSUM50、BLOSUM62及PAM250）進行其蛋白質序列檢查。

當考慮到其整個長度時，EMBOSS Needle（https://galaxy-iuc.github.io/emboss-5.0-docs/needle.html）使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch）全局比對演算法尋找兩個序列之最佳比對（包括空位）。藉由動態程式化方法藉由探究所有可能的比對且選擇最佳比對來確保最佳比對。尼德曼-翁施演算法為一類演算法之成員，其可按mn步驟之次序計算最佳評分及比對（其中『n』及『m』為兩個序列之長度）。空位開放罰分（預設10.0）為當產生空位時所扣除之分數。預設值假設您將EBLOSUM62矩陣用於蛋白質序列。空位延伸（預設0.5）罰分被添加至空位中之每一鹼基或殘基之標準空位罰分。此為懲罰長空位之方式。

如本文所用，具有與參考多肽序列之全長序列至少80%序列一致性之胺基酸序列的多肽應理解為與參考多肽序列之胺基酸序列全長具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、91.50%、92.00%、92.50%、93.00%、93.50%、94.00%、94.50%、95.00%、95.50%、96.00%、96.50%、97.00%、97.50%、98.00%、98.50%、99.00%、99.50%、99.60%、99.70%、99.80%、99.90%、100%序列一致性的序列。在整個申請案中，除非另外明確指定，否則包含/組成/具有與參考多肽（或核苷酸序列）之全長胺基酸序列（或核苷酸序列）具有至少80%序列一致性的胺基酸序列（或核苷酸序列）的多肽（或DNA序列），通常用SEQ ID NO或UniProt ID或Genbank NO.指示，與全長參考序列較佳具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，更佳具有至少85%，甚至更佳具有至少90%，最佳具有至少95%的序列一致性。

出於本發明之目的，一致性百分比係使用MatGAT2.01（Campanella等人, 2003, BMC Bioinformatics 4:29）來測定。採用針對蛋白質之以下預設參數：（1）空位成本存在：12及延伸：2；（2）所用矩陣為BLOSUM65。在較佳實施方式中，序列一致性係基於指定SEQ ID NO或UniProt ID或GenBank NO.，亦即參考序列之全長序列或其一部分計算。其部分較佳意謂完整參考序列之至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。

術語「培養（cultivation）」係指培養或醱酵細胞之培養基、細胞本身及由細胞在全培養液中產生之寡醣，亦即在細胞之內部（胞內）以及外部（胞外）產生。

術語「膜蛋白（membrane protein）」及「膜運輸蛋白（membrane transporter protein）」可互換使用且係指作為細胞膜之一部分或與細胞膜相互作用且控制分子流動及跨越細胞之資訊的蛋白質。因此，膜蛋白參與轉運，不論其輸入至細胞中或自細胞輸出。

此類膜運輸蛋白可為如由運輸蛋白分類資料庫（Transporter Classification Database）所定義之搬運蛋白（porter）、P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白、β-桶狀孔蛋白（β-Barrel Porin）、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白及磷酸轉移驅動之基團移位蛋白，該資料庫經由www.tcdb.org獲得由Saier Lab Bioinformatics Group運作及管理且提供膜運輸蛋白之功能性及系統發生分類。此運輸蛋白分類資料庫詳述膜運輸蛋白之IUBMB核准之綜合分類系統，稱為運輸蛋白分類（Transporter Classification；TC）系統如此處所描述之TCDB分類搜尋係基於如2019年6月17日發佈之TCDB. org而定義。

搬運蛋白為利用載體介導之過程的單向搬運蛋白、同向搬運蛋白及反向搬運蛋白的集合名稱（Saier等人, Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。其屬於電化學電位驅動運輸蛋白且亦稱為次級載體型促進劑。膜運輸蛋白在利用載體介導之過程時包括於此類別中，以當單個物種藉由易化擴散或在膜電位依賴型過程（若溶質帶電）中進行轉運時，則催化單向搬運；當兩個或更多個物種在緊耦合過程中以相反方向轉運時，不耦合至除化學滲透能量之外的直接能量形式，則催化反向搬運；及/或當兩個或更多個物種在緊耦合過程中以相同方向一起轉運時，不耦合至除化學滲透能量之外的直接能量形式，則催化同向搬運，該等蛋白均屬於次級載體（Forrest等人, Biochim. Biophys. Acta 1807 (2011) 167-188）。此等系統通常具有立體特異性。溶質:溶質反向運輸為次級載體之典型特徵。搬運蛋白及酶之動態締合產生功能性膜轉運代謝群組，其將典型地獲自胞外隔室之基質直接地導入至其細胞代謝中（Moraes及Reithmeier, Biochim. Biophys. Acta 1818 (2012), 2687-2706）。經由此搬運蛋白系統轉運之溶質包括但不限於陽離子、有機陰離子、無機陰離子、核苷、胺基酸、多元醇、磷酸化糖分解中間物、滲透劑、螯鐵蛋白。

若膜運輸蛋白水解無機焦磷酸、ATP或另一核苷三磷酸之二磷酸鍵以驅動一種溶質或多種溶質之主動吸收及/或擠出，則膜運輸蛋白包括於P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白之類別中（Saier等人, Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。膜運輸蛋白可或可不暫時磷酸化，但基質未磷酸化。經由P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白之類別轉運之基質包括但不限於陽離子、重金屬、β-葡聚糖、UDP-葡萄糖、脂多醣、磷壁酸。

β-桶狀孔蛋白膜運輸蛋白形成跨膜孔隙，其通常允許溶質以能量無關之方式穿過膜。此等蛋白質之跨膜部分僅僅由β股組成，形成β-桶狀（Saier等人, Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。此等孔蛋白型蛋白質發現於革蘭氏陰性細菌（Gram-negative bacteria）、粒線體、質體及可能抗酸性（acid-fast）革蘭氏陽性細菌之外膜中。經由此等β-桶狀孔蛋白轉運之溶質包括但不限於核苷、棉子糖、葡萄糖、β-葡萄糖苷、寡醣。

輔助運輸蛋白定義為促進跨越一或多個生物膜轉運但本身不直接參與轉運之蛋白質。此等膜運輸蛋白始終結合一或多種現有轉運系統起作用，該等系統諸如（但不限於）外膜因子（outer membrane factor；OMF）、多醣（PST）搬運蛋白、ATP結合卡匣（ATP-binding cassette；ABC）型運輸蛋白。其可提供與能量耦合相關以進行轉運之功能，在複合物形成中起結構作用，提供生源或穩定性功能或調節功能（Saier等人, Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。輔助運輸蛋白之實例包括但不限於參與多醣轉運之多醣共聚合酶家族、參與細菌素及化學毒素轉運之膜融合蛋白家族。

推定運輸蛋白包含以下者之家族，當成員之轉運功能確認時，該等家族將被分類為別處，或若所提出之轉運功能被證明無效，則將自運輸蛋白分類系統中消除。此等家族包括一或多個已針對其提出轉運功能之成員，但此類功能之證據尚未令人信服（Saier等人, Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。如在2019年6月17日發佈之TCDB系統下歸入此組之推定運輸蛋白的實例包括但不限於銅運輸蛋白。

磷酸轉移驅動之基團移位蛋白亦稱為細菌磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system；PTS）之PEP依賴型磷氧基轉移驅動之基團移位蛋白。衍生自胞外糖之反應產物為細胞質磷酸糖類。催化糖磷酸化之酶促成分在緊耦合過程中疊加於轉運過程上。PTS系統涉及許多不同態樣，包含調節及趨化性、生物膜形成及發病機制（Lengeler, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 25 (2015) 79-93；Saier, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 25 (2015) 73-78）。如在2019年6月17日發佈之TCDB系統下歸於磷酸轉移驅動之基團移位蛋白內的膜運輸蛋白家族包括與葡萄糖-葡萄糖苷、果糖-甘露糖醇、乳糖-N,N'-二乙醯基殼二糖-β-葡萄糖苷、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖-果糖-山梨糖及抗壞血酸鹽之轉運有關聯的PTS系統。

主要易化子超家族（major facilitator superfamily；MFS）為膜運輸蛋白之超家族，其催化單向搬運、溶質:陽離子（H+，但幾乎不為Na+）同向搬運及/或溶質:H+或溶質:溶質反向搬運。大多數長度為400-600個胺基醯基殘基且具有12、14或偶爾24個跨膜α-螺旋扳手（TMS），如藉由Saier Lab Bioinformatics Group（www.tcdb.org）運作之運輸蛋白分類資料庫所定義。

如本文所用之「SET」或「糖流出運輸蛋白（Sugar Efflux Transporter）」係指SET家族之膜蛋白，其為具有InterPRO域IPR004750之蛋白質及/或為屬於eggNOGv4.5家族ENOG410XTE9之蛋白質。InterPro域之鑑別可藉由使用https://www.ebi.ac.uk/interpro/上之線上工具或InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/download.html）之獨立版本使用預設值進行。在eggNOGv4.5中鑑別直系同源家族可使用eggNOG-mapperv1（http://eggnogdb.embl.de/#/app/home）之在線版本或獨立版本進行。

如本文所用之術語「螯鐵蛋白（Siderophore）」係指各種微生物之次級代謝物，其主要為鐵離子特異性螯合劑。此等分子已分類為兒茶酚鹽（catecholate）、氧肟酸鹽（hydroxamate）、羧酸鹽及混合類型。螯鐵蛋白一般藉由非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase；NRPS）依賴性路徑或NRPS非依賴性路徑（NRPS independent pathway；NIS）合成。NRPS依賴性螯鐵蛋白生物合成路徑中最重要之前驅物為分支酸鹽（chorismate）。2,3-DHBA可藉由異分支酸合酶、異分支酸酶及2,3-二羥基苯甲酸酯-2,3-脫氫酶催化之三步驟反應自分支酸鹽形成。螯鐵蛋白亦可由水楊酸鹽形成，該水楊酸鹽藉由異分支酸丙酮酸酯解離酶自異分支酸鹽形成。當鳥胺酸用作螯鐵蛋白之前驅物時，生物合成取決於由L-鳥胺酸N5-單加氧酶催化之鳥胺酸的羥基化。在NIS路徑中，螯鐵蛋白生物合成中之重要步驟係N(6)-羥基離胺酸合酶。

需要運輸蛋白以將螯鐵蛋白輸出至細胞外。至此在此過程中鑑別出膜蛋白之四個超家族：主要易化子超家族（MFS）；多藥/寡醣基脂質/多醣翻轉酶超家族（Multidrug/Oligosaccharidyl-lipid/Polysaccharide Flippase Superfamily；MOP）；抗性、結節性及細胞分裂超家族（resistance, nodulation and cell division superfamily；RND）；及ABC超家族。一般而言，參與螯鐵蛋白輸出之基因與螯鐵蛋白生物合成基因簇聚在一起。如本文所用之術語「螯鐵蛋白輸出蛋白（siderophore exporter）」係指將螯鐵蛋白輸出至細胞外所需的此類運輸蛋白。

ATP結合卡匣（ABC）超家族含有吸收及流出轉運系統，且此等兩組中之成員通常鬆散地簇聚在一起。無蛋白質磷酸化之ATP水解為轉運供以能量。ABC超家族內存在數十個家族，且家族一般與基質特異性相關。成員根據如藉由運輸蛋白分類資料庫所定義的類別3.A.1分類，該資料庫藉由經由www.tcdb.org可獲得之Saier Lab Bioinformatics Group運作且提供膜運輸蛋白之功能性及系統發生分類。

術語「致能流出（enabled efflux）」意謂在細胞質膜及/或細胞壁上引入溶質之轉運活性。該轉運可藉由引入及/或增加如本發明中所描述之運輸蛋白之表現來實現。術語「增強之流出（enhanced efflux）」意謂改善溶質在細胞質膜及/或細胞壁上之轉運活性。溶質在細胞質膜及/或細胞壁上之轉運可藉由引入及/或增加如本發明所描述之膜運輸蛋白之表現來增強。膜運輸蛋白之「表現（Expression）」在基因為內源基因之情況下，被定義為編碼該膜運輸蛋白之該基因的「過度表現（overexpression）」；或在編碼該膜運輸蛋白之基因為不存在於野生型菌株或細胞中之異源基因的情況下，被定義為「表現（expression）」。

如本文所用之術語「前驅物（precursor）」係指藉由細胞吸收或合成以特異性製造根據本發明之寡醣的物質。在此意義上，前驅物可為如本文所定義之受體，但亦可為另一物質、代謝物，其首先在細胞內經修飾作為寡醣之生物化學合成路徑之一部分。此類前驅物之實例包含如本文所定義之受體及/或葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、岩藻糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、二羥基丙酮、葡萄糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙醯基-甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺；磷酸化糖，如例如但不限於葡萄糖-1-磷酸鹽、半乳糖-1-磷酸鹽、葡萄糖-6-磷酸鹽、果糖-6-磷酸鹽、果糖-1,6-二磷酸鹽、甘油-3-磷酸鹽、甘油醛-3-磷酸鹽、二羥基丙酮-磷酸鹽、葡萄糖胺-6-磷酸鹽、N-乙醯基-葡萄糖胺-6-磷酸鹽、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸鹽、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸鹽、甘露糖-6-磷酸鹽、甘露糖-1-磷酸；及/或如本文所定義之核苷酸活化糖，如例如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺、GDP-甘露糖、GDP-4-脫氫-6-去氧-α-D-甘露糖及/或GDP-岩藻糖。

視情況，細胞經轉型以包含至少一種編碼選自由以下者組成之群之蛋白質的核酸序列：乳糖運輸蛋白；岩藻糖運輸蛋白；用於核苷酸活化糖之運輸蛋白，其中該運輸蛋白將a內化至添加前驅物以用於寡醣合成之培養基中。

如本文所用之術語「受體（acceptor）」係指可藉由醣基轉移酶修飾之雙醣或寡醣。此類受體之實例包含乳糖，乳-N-二糖（LNB）、乳-N-丙糖、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-新四糖（LNnT）、N-乙醯基-乳糖胺（LacNAc）、乳-N-五糖（LNP）、乳-N-新五糖、對乳-N-五糖、對乳-N-新五糖、乳-N-新生五糖I（lacto-N-novopentaose I）、乳-N-六糖（lacto-N-hexaose；LNH）、乳-N-新六糖（lacto-N-neohexaose；LNnH）、對乳-N-新六糖（para lacto-N-neohexaose；pLNnH）、對乳-N-六糖（para lacto-N-hexaose；pLNH）、乳-N-七糖、乳-N-新七糖、對乳-N-新七糖、對乳-N-七糖、乳-N-八糖（lacto-N-octaose；LNO）、乳-N-新八糖、異乳-N-八糖、對乳-N-八糖、異乳-N-新八糖、新生乳-N-新八糖、對乳-N-新八糖、異乳-N-九糖、新生乳-N-九糖、乳-N-九糖、乳-N-十糖、異乳-N-十糖、新生乳-N-十糖、乳-N-新十糖；半乳糖基乳糖，經延伸具有1、2、3、4、5或多個N-乙醯基乳糖胺單位及/或1、2、3、4、5或多個乳-N-二糖單位之乳糖及含有1或多個N-乙醯基乳糖胺單位及或1或多個乳-N-二糖單位之寡醣，或其轉為寡醣及岩藻糖基化形式之中間物。

在整個本申請案中，除非另外明確陳述，否則特徵「合成（synthesize）」、「合成（synthesized）」及「合成（synthesis）」可分別與特徵「製造（produce）」、「製造（produced）」及「製造（production）」互換地使用。

根據第一態樣，本發明提供一種用於製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物的經代謝工程改造之細胞，亦即，經代謝工程改造以用於製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物的細胞。本文中，提供單個經代謝工程改造之細胞，其能夠表現，較佳表現至少一種岩藻糖基轉移酶及一種額外醣基轉移酶，且能夠合成GDP-岩藻糖及一或多種作為該額外醣基轉移酶之供體的糖-核苷酸。在整個申請案中，除非另外明確說明，否則「經遺傳修飾之細胞（genetically modified cell）」或「經代謝工程改造之細胞」較佳意謂分別經遺傳修飾或經代謝工程改造以用於製造包含根據本發明之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之該混合物的細胞。在本發明之上下文中，如本文所揭示之該混合物的至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣較佳地不出現在該經代謝工程改造之細胞的野生型先驅細胞中。

根據第二態樣，本發明提供一種用於製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物的方法。該方法包含以下步驟： i）提供一種細胞，較佳單一細胞，其能夠表現，較佳表現為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶及至少一種額外醣基轉移酶，且能夠合成GDP-岩藻糖及一或多種核苷酸-糖，其中該一或多種核苷酸-糖為用於該額外醣基轉移酶之供體，及 ii）在容許表現該等醣基轉移酶及合成該（等）核苷酸-糖之條件下培養該細胞，使得該細胞製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之該中性混合物， iii）較佳地，自培養分離該等中性寡醣中之至少一者，更佳地，自該培養分離所有該等中性寡醣。

本發明中所用之岩藻糖基轉移酶可為如本文所定義之岩藻糖基轉移酶中之任一者。

在本發明之範圍內，容許條件應理解為與物理或化學參數相關之條件，該等參數包括但不限於溫度、pH、壓力、滲透壓及產物/前驅物/受體濃度。

在一特定實施方式中，容許條件可包括30 +/- 20攝氏度之溫度範圍、7 +/- 3之pH範圍。

在本發明之上下文中，應理解，該細胞胞內製造根據本發明之不同寡醣之該混合物。所屬技術領域中具有通常知識者應進一步理解，一部分或實質上所有該等所製造之寡醣保留在胞內及/或經由被動或主動運輸排出到細胞外。

根據本發明，用於製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物的該方法可利用非代謝經工程改造之細胞或可利用經代謝工程改造之細胞，亦即，經代謝工程改造以用於製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之該混合物的細胞。

根據本發明之方法及細胞之一較佳實施方式，經代謝工程改造之細胞經基因表現模組修飾，其中來自該等表現模組中之任一者之表現為持續型的或藉由天然誘導物產生。

該等表現模組亦稱為轉錄單元且包含用於表現重組基因之聚核苷酸，該等基因包括編碼基因序列及可操作地連接於編碼基因之適當轉錄及/或轉譯控制信號。該等控制信號包含啟動子序列、非轉譯區、核糖體結合位點、終止子序列。該等表現模組可含有用於表現一個單一重組基因之元件，但亦可含有用於表現更多重組基因之元件或可組織於操縱子結構中以用於整合表現兩個或更多個重組基因。該等聚核苷酸可藉由重組DNA技術，使用所屬技術領域中熟知之技術來產生。所屬技術領域中具有通常知識者熟知的構築表現模組之方法包括例如試管內重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。參見例如描述於以下者中之技術：Sambrook等人(2001) Molecular Cloning: a laboratory manual,第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York或Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y. (1989及每年更新)。

根據本發明之一較佳實施方式，細胞經一或多個表現模組修飾。表現模組可整合於該細胞之基因體中或可在載體上呈遞至該細胞。該載體可以穩定轉型/轉染至該經代謝工程改造之細胞中的質體、黏質體、噬菌體、脂質體或病毒形式存在。其中，此類載體包括染色體、游離型及病毒衍生之載體，例如，來源於細菌質體、噬菌體、轉位子、酵母游離基因體、插入元件、酵母染色體元件、病毒之載體及來源於其等之組合之載體，諸如來源於質體及噬菌體遺傳元件（諸如黏質體及噬質體）之載體。此等載體可含有選擇標記，諸如（但不限於）抗生素標記、營養缺陷型標記、毒素-抗毒素標記、RNA有義/反義標記。表現系統構築體可含有調節以及產生表現之控制區。通常，就此而言，適合於在宿主中維持、擴增或表現聚核苷酸及/或表現多肽之任何系統或載體可用於表現。適當DNA序列可藉由各種熟知及慣例技術、諸如（例如）闡述於Sambrook等人（參見上文）文獻中之彼等技術中之任一者插入至表現系統中。對於重組製造，細胞可經基因工程改造以併入本發明之表現系統或其部分或聚核苷酸。向細胞中引入聚核苷酸可藉由許多標準實驗室手冊，諸如Davis等人, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)及Sambrook等人, 1989,前述文獻中所描述之方法來實現。

如本文所用，表現模組包含用於表現至少一種重組基因之聚核苷酸。該重組基因參與在合成該寡醣混合物中起作用之多肽的表現；或該重組基因與該宿主細胞中之其他路徑相關聯，該等路徑不參與三種或更多種寡醣之該混合物的合成。該等重組基因編碼具有經修飾之表現或活性之內源蛋白，較佳該等內源蛋白過度表現；或該等重組基因編碼異質引入且表現於該經修飾之細胞中，較佳過度表現之異源蛋白。內源蛋白可在亦表現異源蛋白之細胞中具有經修飾之表現。

根據本發明之一較佳實施方式，該等表現模組中之每一者之表現為持續型的或藉由天然誘導物產生。如本文所用，持續型表現應理解為在生物體中連續轉錄之基因的表現。藉由天然誘導物產生之表現應理解為僅在宿主之某一天然條件（例如生物體在分娩中或在泌乳期間）下表現之基因的兼性或調節表現，作為對環境變化（例如包括但不限於激素、熱、冷、光、氧化或滲透應激/信號傳導）之反應，或取決於發育階段之位置或該宿主細胞之細胞週期，包括但不限於細胞凋亡及自體吞噬。

本發明提供不同類型的細胞以用於中性寡醣混合物之該製造，該寡醣混合物包含具有單個經代謝工程改造之細胞的四種或超過四種中性岩藻糖基化寡醣。舉例而言，本發明提供一種細胞，其中該細胞表現一種岩藻糖基轉移酶及一種額外不為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶，且該細胞合成GDP-岩藻糖及另一種不同於GDP-岩藻糖但為用於該額外醣基轉移酶之供體的額外核苷酸-糖。本發明亦提供一種細胞，其中該細胞表現兩種或更多種岩藻糖基轉移酶及作為該等岩藻糖基轉移酶之核苷酸-糖供體的GDP-岩藻糖。本發明亦提供一種細胞，其中該細胞表現兩種不同岩藻糖基轉移酶及一種不為岩藻糖基轉移酶之額外醣基轉移酶，且該細胞合成GDP-岩藻糖及另一種不同於GDP-岩藻糖但為用於該額外醣基轉移酶之供體的額外核苷酸-糖。本發明亦提供一種細胞，其中該細胞表現一種岩藻糖基轉移酶及不為岩藻糖基轉移酶之兩種額外醣基轉移酶，且該細胞合成GDP-岩藻糖及另一種不同於GDP-岩藻糖但為用於該等額外醣基轉移酶之供體的額外核苷酸-糖。本發明亦提供一種細胞，其中該細胞表現一種岩藻糖基轉移酶及不為岩藻糖基轉移酶之兩種額外醣基轉移酶，且該等細胞合成GDP-岩藻糖及不同於GDP-岩藻糖的兩種額外核苷酸-糖，且其中第一種核苷酸-糖為用於第一種額外醣基轉移酶之供體且第二種核苷酸-糖為用於第二種額外醣基轉移酶之供體。本發明亦提供一種細胞，其中該細胞表現兩種或更多種岩藻糖基轉移酶及不為岩藻糖基轉移酶之一或多種額外醣基轉移酶，且該細胞合成GDP-岩藻糖及不同於GDP-岩藻糖但為用於該等額外醣基轉移酶中之任一者的供體的一或多種額外核苷酸-糖。

在本文所描述之方法及細胞中，細胞較佳包含編碼一種蛋白質之同一編碼DNA序列的多個複本。在本發明之上下文中，該蛋白可為醣基轉移酶、膜蛋白或如本文所揭示之任何其他蛋白。在整個本申請案中，特徵「多個（multiple）」意謂至少2個，較佳至少3個，更佳至少4個，甚至更佳至少5個。

在根據本發明之方法及/或細胞之一實施方式中，該混合物包含至少四種，較佳至少五種，更佳至少六種，甚至更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種不同中性岩藻糖基化寡醣。在整個申請案中，除非另外說明，否則特徵「寡醣（oligosaccharide）」及「寡醣（oligosaccharides）」較佳分別經「一種MMO」及「多種MMO」替換，更佳地分別經「基於乳糖之MMO（lactose-based MMO）」及「多種基於乳糖之MMO（lactose-based MMOs）」替換，甚至更佳地分別經「一種HMO」及「多種HMO」替換。

在根據本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，該中性混合物中之中性岩藻糖基化寡醣中之至少一者為哺乳動物乳寡醣（MMO），較佳乳糖類哺乳動物乳寡醣，更佳人乳寡醣（HMO）。在一實施方式中，細胞在該所製造之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物中產生一種哺乳動物乳寡醣。在一較佳實施方式中，細胞在該所製造之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物中產生超過一種哺乳動物乳寡醣。在一更佳實施方式中，所製造之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物中的所有該等寡醣皆為哺乳動物乳寡醣。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之該等中性混合物中之寡醣中的至少一者為人類ABO血型系統之抗原。在一實施方式中，細胞在該所製造之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物中產生人類ABO血型系統之一種抗原。在一較佳實施方式中，細胞在該所製造之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物中產生人類ABO血型系統之超過一種抗原。在一更佳實施方式中，細胞在該所製造之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物中產生人類ABO血型系統之三種抗原。

在本發明之上下文中，根據本發明之至少三種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物可包含其他寡醣，諸如如本文中所描述之中性非岩藻糖基化寡醣。此類寡醣可例如為如本文所述基於乳糖之寡醣、基於LNB之寡醣及/或基於LacNAc之寡醣。

在根據本發明之方法及/或細胞的一個更佳實施方式中，該混合物包含人類ABO血型系統之至少三種不同抗原。

在根據本發明之方法及/或細胞之另一更佳實施方式中，該中性混合物包含至少四種，較佳至少五種，更佳至少六種，甚至更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種中性岩藻糖基化哺乳動物乳寡醣（MMO），較佳基於乳糖之哺乳動物乳寡醣，更佳人乳寡醣（HMO）。在整個申請案中，除非另外明確說明，否則特徵「包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物（mixture comprising at least four different neutral fucosylated oligosaccharides）」較佳用「包含至少四種不同中性岩藻糖基化MMO，較佳基於乳糖之MMO，更佳基於HMO之混合物（mixture comprising at least four different neutral fucosylated MMOs, preferably lactose-based MMOs, more preferably HMOs）」替換，同樣，「包含至少五種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物（mixture comprising at least five different neutral fucosylated oligosaccharides）」較佳用「包含至少五種不同中性岩藻糖基化MMO，較佳基於乳糖之MMO，更佳HMO之混合物（mixture comprising at least five different neutral fucosylated MMOs, preferably lactose-based MMOs, more preferably HMOs）」替換，等等。在本發明之上下文中，根據本發明之一較佳實施方式之至少四種不同中性岩藻糖基化哺乳動物乳寡醣之中性混合物可包含其他寡醣，諸如哺乳動物乳寡醣及/或非哺乳動物乳寡醣。此類寡醣可例如為如本文所述基於乳糖之寡醣、基於LNB之寡醣及/或基於LacNAc之寡醣。在根據本發明之方法及/或細胞的一個較佳實施方式中，該中性混合物包含至少四種如本文所揭示之不同中性岩藻糖基化MMO及視情況人類ABO血型系統之至少一種，較佳至少兩種，更佳至少三種抗原。在根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳實施方式中，該中性混合物包含至少四種如本文所揭示之不同中性岩藻糖基化MMO及視情況至少一種，較佳至少兩種，更佳至少三種，甚至更佳至少四種不同的基於LNB之寡醣及視情況至少一種，較佳至少兩種，更佳至少三種，甚至更佳至少四種不同的基於LacNAc之寡醣。在根據本發明之方法及/或細胞之替代及/或額外較佳實施方式中，哺乳動物乳寡醣構成根據本發明之寡醣混合物之至少50%，較佳至少60%，更佳至少70%，甚至更佳至少80%，甚至更佳至少90%。在根據本發明之方法及/或細胞之一更佳實施方式中，該混合物中之所有寡醣為MMO，較佳基於乳糖之MMO，更佳HMO。如本文中已陳述，如本文所揭示之混合物較佳為如本文所描述對細胞進行代謝工程改造之直接結果。

在整個本申請案中，除非另外明確陳述，否則特徵「至少一種（at least one）」較佳用「一種（one）」替換，同樣地，特徵「至少兩種（at least two）」較佳用「兩種（two）」替換，等等。

在根據本發明之方法及/或細胞的一視情況選用之實施方式中，根據本發明之混合物進一步包含LacdiNAc（亦即GalNAc-b1,4-GlCNAc）及/或GalNAc-b1,4-葡萄糖。

在根據本發明之方法及/或細胞之額外及/或替代實施方式中，中性岩藻糖基化寡醣混合物包含至少三種在聚合度（degree of polymerization，DP）方面不同的不同中性岩藻糖基化寡醣。寡醣之聚合度係指寡醣結構中存在之單醣單元之數目。如本文所用，寡醣之聚合度為三（DP3）或更高，後者包含4（DP4）、5（DP5）、6（DP6）或更長中之任一者。如本文所描述之中性岩藻糖基化寡醣混合物較佳地包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣，其中存在於該混合物中之至少三種，較佳全部寡醣彼此具有不同的聚合度。舉例而言，該中性岩藻糖基化寡醣混合物由四種寡醣組成，其中兩種寡醣係聚合度為3（DP3）之三醣，第三種寡醣係聚合度為4（DP4）之四醣，且第四種寡醣為聚合度為5（DP5）之五醣。在另一實例中，該中性岩藻糖基化寡醣混合物由四種寡醣組成，其中第一種寡醣為聚合度為3（DP3）之三醣，第二種寡醣及第三種寡醣為聚合度為4（DP4）之四醣，且第四種寡醣為聚合度為5（DP5）之五醣。在另一實例中，該中性岩藻糖基化寡醣混合物由四種寡醣組成，其中第一種寡醣為聚合度為3（DP3）之三糖，第二種寡醣為聚合度為4（DP4）之四糖，且第三種及第四種寡醣為聚合度為5（DP5）之五醣。在另一實例中，該中性岩藻糖基化寡醣混合物由四種寡醣組成，其中所有該等四種寡醣具有不同聚合度，其中該第一種寡醣為聚合度為3（DP3）之三醣，其中該第二種寡醣為聚合度為4（DP4）之四醣，其中該第三種寡醣為聚合度為5（DP5）之五醣，且其中該第四種寡醣為具有聚合度6（DP6）之六醣。根據本發明之方法及/或細胞之一個實施方式，細胞製造包含五種不同中性岩藻糖基化寡醣或超過五種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物。在一個實施方式中，此類混合物包含至少五種不同中性岩藻糖基化寡醣，其中寡醣中之三者具有不同聚合度。在一個實施方式中，混合物中之所有該等寡醣具有如本文所描述之不同聚合度。

根據本發明之方法及/或細胞之額外及/或替代實施方式，該混合物之該等岩藻糖基化寡醣中之至少一者經半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖、及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。

較佳地，中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物包含至少一種經由糖苷鍵彼此連接之3個或更多個單醣次單元的中性寡醣，其中該等單醣殘基中之至少一者為N-乙醯基葡萄糖胺（GlcNAc）殘基。該寡醣可含有超過一個GlcNAc殘基，例如兩個、三個或超過三個。GlcNAc可存在於寡醣之還原端處。該GlcNAc亦可存在於該寡醣之非還原端處。該GlcNAc亦可存在於寡醣結構內。GlcNAc可連接至包含半乳糖、岩藻糖之其他單醣次單元。

替代地或另外，中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物包含至少一種中性半乳糖基化寡醣且含有至少一個半乳糖單醣次單元。該半乳糖基化寡醣為包含至少三個經由糖苷鍵彼此連接之單醣次單元的醣結構，其中該單醣次單元中之至少一者為半乳糖。該中性半乳糖基化寡醣可含有超過一個半乳糖殘基，例如兩個、三個或超過三個。半乳糖可連接至包含葡萄糖、GlcNAc、岩藻糖之其他單醣次單元。

在根據本發明之方法及/或細胞的額外及/或替代較佳實施方式中，根據本發明之中性寡醣混合物包含在該混合物中相對豐度為至少50%，較佳至少60%，更佳至少70%，甚至更佳至少80%，甚至更佳至少90%，甚至更佳至少95%之岩藻糖基化寡醣，最佳地，在本發明之該中性寡醣混合物中之所有寡醣經岩藻糖基化。所屬技術領域中具有通常知識者將進一步理解，若定義中性混合物中之岩藻糖基化寡醣的相對豐度，則混合物中之寡醣的剩餘部分不可避免地為中性非岩藻糖基化寡醣。

在根據本發明之方法及/或細胞的一較佳實施方式中，該中性寡醣混合物不包含非岩藻糖基化寡醣。在根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳實施方式中，該中性寡醣混合物包含至少四種岩藻糖基化寡醣及一或多種非岩藻糖基化寡醣。

在根據本發明之方法及/或細胞之額外及/或替代實施方式中，如本文所描述之混合物中各寡醣之相對豐度為至少5%，較佳至少10%。

在本發明之上下文中，如本文所揭示之該寡醣混合物較佳為如本文所描述之對細胞進行代謝工程改造的直接結果。此意謂，根據本發明之混合物中之寡醣中之較佳至少一種，更佳至少兩種，甚至更佳至少三種，最佳全部不藉由該經代謝工程改造之細胞之野生型先驅細胞產生。

如本文所描述之寡醣之名稱係根據如藉由Urashima等人（Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 2018, 第30卷, 編號72, 第SE51-SE65頁）及其中之參考文獻所公開且如「Prebiotics and Probiotics in human milk. Origins and Functions of Milk-Borne Oligosaccharides and Bacteria」, 第2及3章, 編M. McGuire, M. McGuire, L. Bode, Elsevier, Academic Press, 第506頁）中所公開之寡醣名稱及式。

在根據本發明之方法及/或細胞之一更佳實施方式中，混合物包含以下者、基本上由以下者組成或由以下者組成：至少四種，較佳至少五種，甚至更佳至少六種，甚至更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種不同中性岩藻糖基化寡醣，較佳選自以下各者： - 基於乳糖之中性岩藻糖基化寡醣，較佳以下者中之任一者：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、6-岩藻糖基乳糖（6FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-[Fuc-a1,3-[Gal-b1,4]-GlcNAc-b1,6]-Gal-b1,4-Glc、乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、GalNAc-LNFP-I（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II；Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖III（LNFP III；Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V；Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI；Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-新岩藻五糖I（LNnFP I；Fuc-a1,2-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二岩藻六糖I（LNDFH I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-[Fuc-a1,4]- GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二岩藻六糖II（LNDFH II；Fuc-a1,4-(Gal-b1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、單岩藻糖基乳-N-六糖III、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基-乳-N-新六糖、LNnDFH（Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、A-四醣（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,4-Glc）、Gal-LNFP-III、LNDFH III、F-LNH I、F-LNH II、F-LNH III、F-LNnH II、F-LNnH I、F-對-LNH I、F-對-LNH II、F-對-LNnH、DF-LNH II、DF-LNH I、DF-LNnH、DF-對-LNH、DF-對-LNH II、DF-對 LNH III、DF-對-LNnH、TF-LNH I、TF-LNH II、TF-對-LNH I、TF-對-LNH II、TF-對-LNnH、F-LNO I、F-LNO II、F-LNO III、F-LNnO、F-LNnO II、F-異-LNO、F-異-LNnO I、F-新生-LNnO、F-對-LNO、DF-異-LNnO、DF-LNO I、DF-LNO II、DF-LNO III、DF-LNnO I、DF-LNnO II、DF-LNnO III、DF-異-LNO I、DF-異-LNO II、DF-異-LNO III、DF-異-LNO IV、DF-異-LNO V、DF-異-LNO VI、DF-異-LNO VII、DF-對-LNnO、TF-LNO I、TF-LNO II、TF-LNnO、TF-異-LNO I、TF-異-LNO II、TF-異-LNO III、TF-異-LNO IV、TF-異-LNnO、四-F-異-LNO、四-F-對-LNO、五-F-異-LNO、F-LND I、F-LND II、DF-LND I、DF-LND II、DF-LND III、DF-LND IV、DF-LND V、DF-LND VI、TriF-LND I、TriF-LND II、TriF-LND III、TriF-LND IV、TriF-LND V、TriF-LND VI、TriF-LND VII、TetraF-LND I、TetraF-LND II、TetraF-LND III、F-LNnD I、F-LNnD II、DF-LNnD、DF-新生-LND、DF D Gal-LNnH（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-a1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、3-F-異球三糖、B-四醣、B-五醣、B-六醣、B-七醣、DF DGal-LNnT（Gal-a1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-Glc）、TF DGal-LNnH a、TF DGal-LNnH b、DFGal-對-LNnH，更佳以下者中之任一者：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、6-岩藻糖基乳糖（6FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-[Fuc-a1,3-[Gal-b1,4]-GlcNAc-b1,6]-Gal-b1,4-Glc、乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、GalNAc-LNFP-I（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II；Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖III（LNFP III；Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V；Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI；Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc），最佳以下者中之任一者：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、6-岩藻糖基乳糖（6FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT)；及/或 - 基於LNB之中性岩藻糖基化寡醣，較佳以下者中之任一者：2'FLNB、4-FLNB、Leb（Fuc-a1,2-Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc)；及/或 - 基於LacNAc之中性岩藻糖基化寡醣，較佳以下者中之任一者：2'FLacNAc、3-FLacNAc、Ley（Fuc-a1,2-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc)。

在本發明之此上下文中之較佳混合物包含至少四種中性岩藻糖基化寡醣之混合物，其中該等混合物包含以下者、基本上由以下者組成或由以下者組成：至少四種，較佳至少五種，甚至更佳至少六種，甚至更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種選自包含以下者之清單的不同中性岩藻糖基化寡醣：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、6-岩藻糖基乳糖（6FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-[Fuc-a1,3-[Gal-b1,4]-GlcNAc-b1,6]-Gal-b1,4-Glc、乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、GalNAc-LNFP-I（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II；Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖III（LNFP III；Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V；Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI；Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-新岩藻五糖I（LNnFP I；Fuc-a1,2-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二岩藻六糖I（LNDFH I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-[Fuc-a1,4]- GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二岩藻六糖II（LNDFH II；Fuc-a1,4-(Gal-b1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、單岩藻糖基乳-N-六糖III、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基-乳-N-新六糖、LNnDFH（Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、A-四醣（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,4-Glc）、2'FLNB、4-FLNB、Leb（Fuc-a1,2-Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc）、2'FLacNAc、3-FLacNAc、Ley（Fuc-a1,2-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc）、Gal-LNFP-III、LNDFH III、F-LNH I、F-LNH II、F-LNH III、F-LNnH II、F-LNnH I、F-對-LNH I、F-對-LNH II、F-對-LNnH、DF-LNH II、DF-LNH I、DF-LNnH、DF-對-LNH、DF-對-LNH II、DF-對 LNH III、DF-對-LNnH、TF-LNH I、TF-LNH II、TF-對-LNH I、TF-對-LNH II、TF-對-LNnH、F-LNO I、F-LNO II、F-LNO III、F-LNnO、F-LNnO II、F-異-LNO、F-異-LNnO I、F-新生-LNnO、F-對-LNO、DF-異-LNnO、DF-LNO I、DF-LNO II、DF-LNO III、DF-LNnO I、DF-LNnO II、DF-LNnO III、DF-異-LNO I、DF-異-LNO II、DF-異-LNO III、DF-異-LNO IV、DF-異-LNO V、DF-異-LNO VI、DF-異-LNO VII、DF-對-LNnO、TF-LNO I、TF-LNO II、TF-LNnO、TF-異-LNO I、TF-異-LNO II、TF-異-LNO III、TF-異-LNO IV、TF-異-LNnO、四-F-異-LNO、四-F-對-LNO、五-F-異-LNO、F-LND I、F-LND II、DF-LND I、DF-LND II、DF-LND III、DF-LND IV、DF-LND V、DF-LND VI、TriF-LND I、TriF-LND II、TriF-LND III、TriF-LND IV、TriF-LND V、TriF-LND VI、TriF-LND VII、TetraF-LND I、TetraF-LND II、TetraF-LND III、F-LNnD I、F-LNnD II、DF-LNnD、DF-新生-LND、DF D Gal-LNnH（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-a1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、3-F-異球三糖、B-四醣、B-五醣、B-六醣、B-七醣、DF DGal-LNnT（Gal-a1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-Glc）、TF DGal-LNnH a、TF DGal-LNnH b、DFGal-對-LNnH。

在本發明之此上下文中之更佳混合物包含至少四種中性岩藻糖基化寡醣之混合物，其中該等混合物包含以下者、基本上由以下者組成或由以下者組成：至少四種，較佳至少五種，甚至更佳至少六種，甚至更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種選自包含以下者之清單的不同中性岩藻糖基化寡醣：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、6-岩藻糖基乳糖（6FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-[Fuc-a1,3-[Gal-b1,4]-GlcNAc-b1,6]-Gal-b1,4-Glc、乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、GalNAc-LNFP-I（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II；Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖III（LNFP III；Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V；Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI；Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc)。

該等較佳混合物之實例包含有包含以下者、由以下者組成或基本上由以下者組成之混合物：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）及乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)。該等較佳混合物之另一實例包含一種混合物，該混合物包含至少四種選自包含以下者之清單的寡醣、由其組成或基本上由其組成：3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、乳-N-岩藻五糖III（LNFP III；Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI；Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-二岩藻六糖I（LNDFH I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-[Fuc-a1,4]-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二岩藻六糖II（LNDFH II；Fuc-a1,4-(Gal-b1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc)。該等較佳混合物之另一實例包含一種混合物，該混合物包含至少四種選自包含以下者之清單的寡醣、由其組成或基本上由其組成：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、2'FLNB、4-FLNB、Leb（Fuc-a1,2-Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc）、乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II；Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V；Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc)。

例示性混合物在本發明之此上下文中描述於實施例部分中。

視情況，至少一種，較佳至少兩種，更佳至少三種，甚至更佳至少四種，甚至更佳至少五種，甚至更佳至少六種，最佳至少七種不同中性非岩藻糖基化寡醣存在於根據本發明之混合物中。較佳地，該等中性非岩藻糖基化寡醣較佳選自： - 基於乳糖之中性非岩藻糖基化寡醣，較佳以下者中之任一者：乳-N-三糖II（LN3）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-四糖（LNT）、對-乳-N-新五糖、對-乳-N-五糖、對-乳-N-新六糖、對-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖基-對-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖基-對-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc（Gal-a1,4-乳糖）、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1, 3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc（GalNAc-b1,3-乳糖）、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc（球-N-四糖）、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、新生-LNT（GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP I（Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3-Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP II（Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP III（Gal-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、新生-LNO、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、LNH、LNnH、異-LNO、新生-LNO、新生-LNnO、LND、異-LND、GalNAc-a1,3-Gal-b1,4-Glc、新生-LNP I、異-LNT、DGalLNnH、galili五醣，更佳以下者中之任一者：乳-N-三糖II（LN3）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-四糖（LNT）、對-乳-N-新五糖、對-乳-N-五糖、對-乳-N-新六糖、對-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖基-對-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖基-對-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc（Gal-a1,4-乳糖）、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、GalNAc-b1,3-乳糖、球-N-四糖，最佳以下者中之任一者：乳-N-三糖II（LN3）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-四糖（LNT）、對-乳-N-新五糖、對-乳-N-五糖、對-乳-N-新六糖、對-乳-N-六糖；及/或 - 基於LNB之中性非岩藻糖基化寡醣、及/或 - 基於LacNAc之中性非岩藻糖基化寡醣，如例如LacDiNAc及poly-LacNAc。

在本發明之此上下文中之較佳混合物包含至少四種中性岩藻糖基化寡醣與至少一種，較佳至少兩種，更佳至少三種，甚至更佳至少四種，甚至更佳至少五種，甚至更佳至少六種，最佳至少七種選自包含以下者之清單的不同中性非岩藻糖基化寡醣之混合物：乳-N-三糖II（LN3）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-四糖（LNT）、對-乳-N-新五糖、對-乳-N-五糖、對-乳-N-新六糖、對-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖基-對-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖基-對-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc（Gal-a1,4-乳糖）、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1, 3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc（GalNAc-b1,3-乳糖）、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc（球-N-四糖）、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、新生-LNT（GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP I（Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3-Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP II（Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP III（Gal-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、新生-LNO、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、LacDiNAc、poly-LacNAc、LNH、LNnH、異-LNO、新生-LNO、新生-LNnO、LND、異-LND、GalNAc-a1,3-Gal-b1,4-Glc、新生-LNP I、異-LNT、DGalLNnH、galili五醣。

在本發明之此上下文中之更佳混合物包含至少四種中性岩藻糖基化寡醣與至少一種，較佳至少兩種，更佳至少三種，甚至更佳至少四種，甚至更佳至少五種，甚至更佳至少六種，最佳至少七種選自包含以下者之清單的不同中性非岩藻糖基化寡醣之混合物：乳-N-三糖II（LN3）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-四糖（LNT）、對-乳-N-新五糖、對-乳-N-五糖、對-乳-N-新六糖、對-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖基-對-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖基-對-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc（Gal-a1,4-乳糖）、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、GalNAc-b1,3-乳糖及球-N-四糖。例示性混合物在本發明之此上下文中描述於實施例部分中。

在根據本發明之方法及/或細胞之甚至更佳實施方式中，根據本發明之混合物包含以下者、基本上由以下者組成或由以下者組成：至少四種，較佳至少五種，甚至更佳至少六種，甚至更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種選自包含以下者之清單的不同中性岩藻糖基化寡醣：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、6-岩藻糖基乳糖（6FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-[Fuc-a1,3-[Gal-b1,4]-GlcNAc-b1,6]-Gal-b1,4-Glc、乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、GalNAc-LNFP-I（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II；Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖III（LNFP III；Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V；Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI；Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-新岩藻五糖I（LNnFP I；Fuc-a1,2-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二岩藻六糖I（LNDFH I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-[Fuc-a1,4]- GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二岩藻六糖II（LNDFH II；Fuc-a1,4-(Gal-b1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、單岩藻糖基乳-N-六糖III、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基-乳-N-新六糖、LNnDFH（Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、A-四醣（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,4-Glc）、2'FLNB、4-FLNB、Leb（Fuc-a1,2-Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc）、2'FLacNAc、3-FLacNAc、Ley（Fuc-a1,2-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc）、Gal-LNFP-III、LNDFH III、F-LNH I、F-LNH II、F-LNH III、F-LNnH II、F-LNnH I、F-對-LNH I、F-對-LNH II、F-對-LNnH、DF-LNH II、DF-LNH I、DF-LNnH、DF-對-LNH、DF-對-LNH II、DF-對 LNH III、DF-對-LNnH、TF-LNH I、TF-LNH II、TF-對-LNH I、TF-對-LNH II、TF-對-LNnH、F-LNO I、F-LNO II、F-LNO III、F-LNnO、F-LNnO II、F-異-LNO、F-異-LNnO I、F-新生-LNnO、F-對-LNO、DF-異-LNnO、DF-LNO I、DF-LNO II、DF-LNO III、DF-LNnO I、DF-LNnO II、DF-LNnO III、DF-異-LNO I、DF-異-LNO II、DF-異-LNO III、DF-異-LNO IV、DF-異-LNO V、DF-異-LNO VI、DF-異-LNO VII、DF-對-LNnO、TF-LNO I、TF-LNO II、TF-LNnO、TF-異-LNO I、TF-異-LNO II、TF-異-LNO III、TF-異-LNO IV、TF-異-LNnO、四-F-異-LNO、四-F-對-LNO、五-F-異-LNO、F-LND I、F-LND II、DF-LND I、DF-LND II、DF-LND III、DF-LND IV、DF-LND V、DF-LND VI、TriF-LND I、TriF-LND II、TriF-LND III、TriF-LND IV、TriF-LND V、TriF-LND VI、TriF-LND VII、TetraF-LND I、TetraF-LND II、TetraF-LND III、F-LNnD I、F-LNnD II、DF-LNnD、DF-新生-LND、DF D Gal-LNnH（Gal-a1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-a1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-GlcNAc-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、3-F-異球三糖、B-四醣、B-五醣、B-六醣、B-七醣、DF DGal-LNnT（Gal-a1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-[Fuc-a1,3]-Glc）、TF DGal-LNnH a、TF DGal-LNnH b、DFGal-對-LNnH，及至少一種，較佳至少兩種，更佳至少三種，甚至更佳至少四種，甚至更佳至少五種，甚至更佳至少六種，最佳至少七種選自包含以下者之清單的不同中性非岩藻糖基化寡醣：乳-N-三糖II（LN3）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-四糖（LNT）、對-乳-N-新五糖、對-乳-N-五糖、對-乳-N-新六糖、對-乳-N-六糖、β-(1,3)半乳糖基-對-乳-N-新五糖、β-(1,4)半乳糖基-對-乳-N-五糖、Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc（Gal-a1,4-乳糖）、β3'-半乳糖基乳糖、β6'-半乳糖基乳糖、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1, 3-Gal-b1,4-Glc、Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Gal-b1,3-Galb1,3-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc（GalNAc-b1,3-乳糖）、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-乳糖、GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc（球-N-四糖）、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-Gal-a1,4-Gal-b1,4-Glc、GalNAc-b1,3-LNT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNT、新生-LNT（GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP I（Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3-Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP II（Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、Gal-新生 -LNP III（Gal-b1,3-Gal-b1,4-GlcNAc-b1,6-[Gal-b1,3]-Gal-b1,4-Glc）、新生-LNO、GalNAc-b1,3-LNnT、Gal-b1,3-GalNAc-b1,3-LNnT、LacDiNAc、poly-LacNAc、LNH、LNnH、異-LNO、新生-LNO、新生-LNnO、LND、異-LND、GalNAc-a1,3-Gal-b1,4-Glc、新生-LNP I、異-LNT、DGalLNnH、galili五醣。

該等更佳混合物之實例包含有包含以下者、由以下者組成或基本上由以下者組成之混合物：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、LN3、LNT及乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc)。

該等更佳混合物之另一實例包含一種混合物，該混合物包含至少四種選自包含以下者之清單的寡醣、由其組成或基本上由其組成：3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、4-岩藻糖基乳糖（4FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、LN3、LNnT、乳-N-岩藻五糖III（LNFP III；Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI；Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）、乳-N-二岩藻六糖I（LNDFH I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-[Fuc-a1,4]- GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-二岩藻六糖II（LNDFH II；Fuc-a1,4-(Gal-b1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc），其中該混合物之至少四種寡醣經岩藻糖基化。

該等更佳混合物之另一實例包含一種混合物，該混合物包含至少四種選自包含以下者之清單的寡醣、由其組成或基本上由其組成：2'-岩藻糖基乳糖（2'FL）、二岩藻糖基乳糖（diFL或LDFT）、2'FLNB、4-FLNB、Leb（Fuc-a1,2-Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc）、LN3、LNT、乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I；Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）、乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II；Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V；Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）其中該混合物之至少四種寡醣經岩藻糖基化。

例示性混合物在本發明之此上下文中描述於實施例部分中。

為了製造如本文及在根據本發明之方法及/或細胞之一實施方式中所描述之基於乳糖之寡醣，可添加乳糖至培養中使得該細胞可經由被動或主動運輸將其吸收；或可藉由細胞製造乳糖（例如在如所屬技術領域中具有通常知識者已知用於此目的而對細胞進行代謝工程改造後），較佳地胞內製造。乳糖可因此在合成哺乳動物乳寡醣或人乳寡醣（較佳所有基於乳糖之MMO或HMO）中用作受體，該乳糖較佳包含於如本文所描述之根據本發明之寡醣混合物中。產生乳糖之細胞可藉由表現N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶獲得。更佳地，細胞經修飾以用於增強乳糖產生。該修飾可為選自包含以下者之群的任一者或多者：N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶之過度表現、UDP-葡萄糖4-表異構酶之過度表現。替代地，在醣基化反應中使用乳糖作為受體之細胞較佳具有用於自培養中吸收乳糖之運輸蛋白。更佳地，將細胞最佳化以用於乳糖吸收。該最佳化可為乳糖運輸蛋白之過度表現，該乳糖運輸蛋白如來自例如大腸桿菌或乳酸克魯維酵母菌（ Kluyveromyces lactis）之乳糖透過酶。較佳持續型地表現乳糖透過酶。乳糖可在培養開始時添加，或其可在培養之生長階段期間已形成足夠生物質時添加，亦即，MMO產生階段（藉由將乳糖添加至培養中開始）與生長階段分離。在一較佳實施方式中，乳糖在培養開始時及/或期間添加，亦即生長階段及產生階段不分離。

在根據本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，當細胞在乳糖與一或多種其他碳源合併之環境中生長時抵抗乳糖殺滅現象。在術語「乳糖殺滅（lactose killing）」之情況下，意指其中存在乳糖以及另一碳源之培養基中之細胞生長受阻。在一較佳實施方式中，細胞經遺傳修飾以使得其保持至少50%之乳糖流入而不經受乳糖殺滅，甚至在高乳糖濃度下，如WO 2016/075243中所描述。該遺傳修飾包含藉由不產生乳糖殺滅表型之異源啟動子表現及/或過度表現外源性及/或內源性乳糖運輸蛋白基因，及/或修飾不產生乳糖殺滅表型之乳糖運輸蛋白的密碼子使用以產生該乳糖運輸蛋白之改變的表現。在此方面WO 2016/075243之內容以引用之方式併入。

為產生如本文及根據本發明之方法及/或細胞之額外及/或替代實施方式中所描述之基於LNB的寡醣，可向培養中添加LNB（亦即乳-N-二糖，Gal-b1,3-GlcNAc）以使得該細胞可被動地或經由主動運輸吸收；或LNB可藉由細胞產生（例如出於如所屬技術領域中具有通常知識者已知之此目的對細胞進行代謝工程改造後），較佳在胞內產生。LNB可因此在合成基於LNB之寡醣（較佳所有基於LNB之寡醣）中用作受體，該LNB較佳包含於如本文所描述之根據本發明之寡醣混合物中。產生LNB之細胞可藉由表現可修飾GlcNAc（在細胞中產生及/或被動地或經由主動運輸吸收）以形成LNB之N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶獲得。較佳地，產生LNB之細胞能夠表現，較佳表現用於合成GlcNAc所需的酶，諸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、磷酸酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶，較佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶及磷酸酶（較佳地，HAD類磷酸酶）。較佳地，細胞經代謝工程改造以用於產生LNB。更佳地，細胞經代謝工程改造以用於增強產生LNB。細胞較佳經修飾以表現及/或過度表現包含以下者之多肽中之任一者或多者：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、磷酸酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶。

在醣基化反應中使用LNB作為受體之細胞較佳地具有用於自培養中吸收LNB之運輸蛋白。更佳地，將細胞最佳化以用於LNB吸收。該最佳化可為LNB運輸蛋白之過度表現，該LNB運輸蛋白如來自例如大腸桿菌、乳酸克魯維酵母菌或酪蛋白乳酸桿菌BL23之乳糖透過酶。較佳持續型地表現乳糖透過酶。LNB可在培養開始時添加，或其可在培養之生長階段期間已形成足夠生物質時添加，亦即，寡醣產生階段（藉由將LNB添加至培養中開始）與生長階段分離。在一較佳實施方式中，LNB在培養開始時及/或期間添加，亦即生長階段及產生階段不分離。

為產生如本文及根據本發明之方法及/或細胞之額外及/或替代實施方式中所描述之基於LacNAc的寡醣，可向培養中添加LacNAc（亦即N-乙醯基乳糖胺，Gal-b1,4-GlcNAc）以使得該細胞可被動地或經由主動運輸吸收；或LacNAc可藉由細胞產生（例如出於如所屬技術領域中具有通常知識者已知之此目的對細胞進行代謝工程改造後），較佳在胞內產生。LacNac可因此在合成基於LacNAc之寡醣（較佳所有基於LacNAc之寡醣）中用作受體，該LacNAc較佳包含於如本文所描述之根據本發明之寡醣混合物中。產生LacNAc之細胞可藉由表現可修飾GlcNAc（在細胞中產生及/或被動地或經由主動運輸吸收）以形成LacNAc之N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶獲得。較佳地，產生LacNAc之細胞能夠表現，較佳表現用於合成GlcNAc所需的酶，諸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、磷酸酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶，較佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶及磷酸酶（較佳地，HAD類磷酸酶）。較佳地，細胞經代謝工程改造以用於產生LacNAc。更佳地，細胞經代謝工程改造以用於增強產生LacNAc。細胞較佳經修飾以表現及/或過度表現包含以下者之多肽中之任一者或多者：葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、磷酸酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶。

在醣基化反應中使用LacNAc作為受體之細胞較佳具有用於自培養中吸收LacNAc之運輸蛋白。更佳地，將細胞最佳化以用於LacNAc吸收。該最佳化可為LNB運輸蛋白之過度表現，該LNB運輸蛋白如來自例如大腸桿菌、乳酸克魯維酵母菌或酪蛋白乳酸桿菌BL23之乳糖透過酶。較佳持續型地表現乳糖透過酶。LacNAc可在培養開始時添加，或其可在培養之生長階段期間已形成足夠生物質時添加，亦即，寡醣產生階段（藉由將LacNAc添加至培養中開始）與生長階段分離。在一較佳實施方式中，LacNAc在培養開始時及/或期間添加，亦即生長階段及產生階段不分離。

在根據本發明之方法及/或細胞之一實施方式中，該細胞（i）能夠表現，較佳表現岩藻糖基轉移酶，較佳選自α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3/1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶，及（ii）能夠表現，較佳表現至少一種，較佳至少兩種，較佳至少三種，更佳至少四種，甚至更佳至少五種，甚至更佳至少六種，最佳至少七種額外醣基轉移酶，較佳選自包含以下者之清單：如本文描述之岩藻糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP- N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶。

在一較佳實施方式中，該岩藻糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶。在另一較佳實施方式中，該半乳糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶。在另一較佳實施方式中，該葡萄糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶。在另一較佳實施方式中，該甘露糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶。在另一較佳實施方式中，該N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶。在另一較佳實施方式中，該N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶及β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者，較佳至少兩者，更佳所有之表現或活性方面經修飾。在一較佳實施方式中，該醣基轉移酶為經修飾表現或活性之細胞的內源蛋白，較佳該內源性醣基轉移酶過度表現；替代地該醣基轉移酶為異質引入且表現於該細胞中，較佳過度表現之異源蛋白。該內源性醣基轉移酶可在亦表現異源性醣基轉移酶之細胞中具有經修飾之表現。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，該等醣基轉移酶中之至少一者，較佳至少兩者為岩藻糖基轉移酶且該細胞能夠合成GDP-Fuc。GDP-岩藻糖可由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。產生GDP-岩藻糖之此類細胞可表現將例如添加至細胞中之岩藻糖轉化為GDP-岩藻糖之酶。此酶可為例如雙功能性岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶，如來自脆弱類桿菌（ Bacteroides fragilis）之Fkp，或一種各別岩藻糖激酶連同一種各別岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶之組合，如已知其來自若干物種，包括智人、野豬（ Sus scrofa）及褐鼠（ Rattus norvegicus）。在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，該細胞能夠表現選自以下者中之至少一種，較佳至少兩種岩藻糖基轉移酶：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3/1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶。較佳地，該等岩藻糖基轉移酶係選自以下者之生物體：如例如螺旋桿菌屬（Helicobacter）物種，如例如幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）、鼬鼠螺旋桿菌（Helicobacter mustelae）；阿克曼氏菌屬（Akkermansia）物種，如例如嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）；類桿菌屬（Bacteroides）物種，如例如脆弱類桿菌、普通類桿菌（Bacteroides vulgatus）、卵形類桿菌（Bacteroides ovatus）；大腸桿菌物種，如例如大腸桿菌O126、大腸桿菌O55:H7；毛螺菌科（Lachnospiraceae）物種；坦納菌屬（Tannerella）物種；梭菌屬（Clostridium）物種；沙門氏菌屬（Salmonella）物種，如例如腸沙門氏菌（Salmonella enterica）、黑蒿產甲烷微菌（Methanosphaerula palustries）；丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）物種；普氏菌屬（Prevotella）物種；吡咯單胞菌屬（Porphyromonas）物種，如例如卡托氏吡咯單胞菌（Porphyromonas catoniae）；阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）；智人；小家鼠（Mus musculus）。在本發明之方法及/或細胞之一更佳實施方式中，該等岩藻糖基轉移酶係選自包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶及α-1,3/1,4-岩藻糖基轉移酶之清單。

較佳地，細胞經修飾以產生GDP-岩藻糖。更佳地，細胞經修飾以用於增強GDP-岩藻糖產生。該修飾可為選自包含以下者之群的任一者或多者：UDP-葡萄糖:十一異戊烯基（undecaprenyl）-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶編碼基因之基因剔除、GDP-L-岩藻糖合酶編碼基因之過度表現、GDP-甘露糖4,6-脫水酶編碼基因之過度表現、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶編碼基因之過度表現、磷酸甘露糖變位酶編碼基因之過度表現及甘露糖-6-磷酸異構酶編碼基因之過度表現。在整個本申請案中，除非另外明確陳述，否則特徵「經增強（enhanced）」及/或「經最佳化（optimized）」製造較佳意謂如本文所描述引入細胞中的修飾及/或代謝工程改造與該經修飾細胞或經代謝工程改造之細胞的野生型先驅細胞相比產生更高的產量。舉例而言，「經增強之GDP-岩藻糖製造」較佳意謂與不含有此等特定修飾之野生型先驅細胞相比，經修飾細胞中之GDP-岩藻糖之胞內製造較高。

較佳地，細胞在此上下文中包含如本文所描述之岩藻糖基化路徑。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，該等額外醣基轉移酶中之至少一者，較佳至少兩者為N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶且該細胞能夠合成UDP-GlcNAc。UDP-GlcNAc可由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。產生UDP-GlcNAc之此類細胞可表現將例如添加至細胞中之GlcNAc轉化為UDP-GlcNAc之酶。此等酶可為來自包括智人、大腸桿菌之若干物種之N-乙醯基-D-葡萄糖胺激酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、磷酸葡萄糖胺變位酶及N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶。替代地，細胞可（較佳經代謝工程改造以）表現用於合成GlcNAc所需的酶，諸如葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、磷酸酶、醣基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶及UDP-葡萄糖4-表異構酶，較佳葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶及磷酸酶（較佳地，HAD類磷酸酶）。在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，該細胞能夠表現選自β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶之至少一種，較佳至少兩種N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶。較佳地，該等N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶係選自以下者之生物體：如例如奈瑟氏菌屬（Neisseria）物種，如例如腦膜炎奈瑟氏菌（ Neisseria meningitidis）、乳酸奈瑟氏菌（Neisseria lactamica）、多醣奈瑟氏菌（Neisseria polysaccharea）、長奈瑟氏菌（Neisseria elongata）、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、微黃奈瑟氏菌（Neisseria subflava）；巴氏桿菌物種，如例如達可馬巴氏桿菌；新根瘤菌屬（Neorhizobium）物種，如例如山羊豆根瘤菌（Neorhizobium galegae）；嗜血桿菌屬物種，如例如副流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfluenzae）、杜克雷嗜血桿菌；智人；小家鼠。

較佳地，細胞經修飾以產生UDP-GlcNAc。更佳地，細胞經修飾以用於增強UDP-GlcNAc產生。該修飾可為選自包含以下者之群的任一者或多者：N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶之基因剔除、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶之過度表現、磷酸葡萄糖胺變位酶之過度表現以及N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶之過度表現。

較佳地，細胞在此上下文中包含如本文所描述之N-乙醯基葡萄糖胺碳水化合物路徑。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，該等額外醣基轉移酶中之至少一者，較佳至少兩者為半乳糖基轉移酶且該細胞能夠合成UDP-Gal。UDP-Gal可由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。產生UDP-Gal之此類細胞可表現將例如UDP-葡萄糖轉化為UDP-Gal之酶。此酶可例如為如自包括智人、大腸桿菌及褐鼠之若干物種已知之UDP-葡萄糖-4-表異構酶GalE。在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，該細胞能夠表現選自β-1,3-半乳糖基轉移酶及β-1,4-半乳糖基轉移酶之至少一種，較佳至少兩種半乳糖基轉移酶，及/或該細胞能夠表現選自α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶之至少一種，較佳至少兩種半乳糖基轉移酶。較佳地，該等半乳糖基轉移酶系選自以下者之生物體，如例如大腸桿菌物種，如例如大腸桿菌O55:H7、大腸桿菌DEC1B、大腸桿菌DEC1D；奈瑟氏菌屬物種，如例如腦膜炎奈瑟氏菌、乳酸奈瑟氏菌、多醣奈瑟氏菌、長奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、微黃奈瑟氏菌；金氏菌屬物種，如例如脫氮金氏菌（Kingella denitrificans）；布氏桿菌屬（Brucella）物種，如例如犬布氏桿菌（Brucella canis）、豬布氏桿菌（Brucella suis）；沙門氏菌屬物種，如例如腸沙門氏菌、氧化亞鐵假高炳根氏菌（Pseudogulbenkiana ferrooxidan）、麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）；鏈球菌屬物種；阿拉伯芥；智人；小家鼠。

較佳地，細胞經修飾以產生UDP-Gal。更佳地，細胞經修飾以用於增強UDP-Gal產生。該修飾可為選自包含以下者之群的任一者或多者：雙功能性5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因之基因剔除、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶編碼基因之基因剔除及UDP-葡萄糖-4-表異構酶編碼基因之過度表現。

較佳地，細胞在此上下文中包含如本文所描述之半乳糖基化路徑。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，該等醣基轉移酶中之至少一者，較佳至少兩者為N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶且該細胞能夠合成UDP-GalNAc。UDP-GalNAc可由細胞中表現之酶提供或藉由細胞代謝提供。產生UDP-GalNAc之此類細胞可表現將例如UDP-葡萄糖轉化為UDP-Gal之酶。此酶可例如為如自包括智人、大腸桿菌及褐鼠之若干物種已知之UDP-葡萄糖-4-表異構酶GalE。在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，該細胞能夠表現選自α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶及β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶之至少一種，較佳至少兩種N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶。較佳地，該等N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶係選自以下者之生物體，如例如螺旋桿菌屬物種，如例如鼬鼠螺旋桿菌；嗜血桿菌屬物種，如例如流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）；奈瑟氏菌屬物種，如例如腦膜炎奈瑟氏菌、乳糖奈瑟氏菌、多醣奈瑟氏菌、長奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、微黃奈瑟氏菌；立克次體屬（Rickettsia）物種，如例如貝氏立克次體（Rickettsia bellii）、普氏立克次體（Rickettsia prowazekii）、日本立克次體（Rickettsia japonica）、康氏立克次體（Rickettsia conorii）、貓立克次體（Rickettsia felis）、馬賽立克次體（Rickettsia massiliae）；智人；小家鼠。

較佳地，細胞經修飾以產生UDP-GalNAc。更佳地，細胞經修飾以用於增強UDP-GalNAc產生。該修飾可為選自包含以下者之群的任一者或多者：雙功能性5'-核苷酸酶/UDP-糖水解酶編碼基因之基因剔除、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶編碼基因之基因剔除及UDP-葡萄糖-4-表異構酶編碼基因之過度表現。

較佳地，細胞在此上下文中包含如本文所描述之N-乙醯基半乳糖胺基化路徑。

在整個本申請案中，每當例如藉由提及SEQ ID NO亦即獨特資料庫編號（例如UNIPROT編號）或藉由提及來源之特定生物體揭示蛋白質時，該蛋白質實施方式可較佳經以下實施方式中之任一者，較佳全部置換（且因此認為該蛋白質根據所有以下實施方式揭示）： -蛋白質（例如藉由提及SEQ ID NO亦即獨特資料庫編號（例如UNIPROT編號）或藉由提及來源之特定生物體）， -與該蛋白質之全長具有至少80%整體序列一致性之該蛋白質的功能同源物、變異體或衍生物， -該蛋白質之功能片段且具有相同活性，或 -包含多肽，該多肽包含與該蛋白質之全長胺基酸序列具有至少80%序列一致性且具有相同活性之胺基酸序列或由其組成。

舉例而言，當揭示「具有SEQ ID NO: 05之幽門螺旋桿菌（ H. pylori）α-1,3-岩藻糖基轉移酶（ H. pylorialpha-1,3-fucosyltransferase with SEQ ID NO: 05）」時，該實施方式較佳經以下實施方式中之任一者，較佳全部置換： -具有SEQ ID NO: 05之幽門螺旋桿菌α-1,3-岩藻糖基轉移酶， -包含根據SEQ ID NO: 05之多肽序列的α-1,3-岩藻糖基轉移酶， -與SEQ ID NO: 05之全長具有至少80%整體序列一致性且具有α-1,3-岩藻糖基轉移酶活性之SEQ ID NO: 05之功能同源物、變異體或衍生物， - SEQ ID NO: 05之功能片段且具有α-1,3-岩藻糖基轉移酶活性，或 -包含多肽，該多肽包含與該SEQ ID NO: 05之全長胺基酸序列具有至少80%序列一致性且具有α-1,3-岩藻糖基轉移酶活性之胺基酸序列或由其組成。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，細胞能夠合成選自包含以下者之清單的該等核苷酸-糖中之任一者：GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-來蘇糖-4-己酮糖、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖。在一較佳實施方式中，細胞能夠合成兩種核苷酸-糖。在一更佳實施方式中，細胞能夠合成至少三種核苷酸活化糖。在一甚至更佳實施方式中，細胞能夠合成至少四種核苷酸活化糖。在一最佳實施方式中，細胞能夠合成至少五種核苷酸活化糖。在另一較佳實施方式中，該細胞經代謝工程改造以用於產生核苷酸-糖。在另一較佳實施方式中，細胞經修飾及/或經工程改造以用於核苷酸-糖之最佳化產生，亦即如本文所描述之核苷酸-糖之增強產生。在一更佳實施方式中，該細胞經代謝工程改造以用於產生兩種核苷酸-糖。在一甚至更佳實施方式中，該細胞經代謝工程改造以用於產生三個或更多種核苷酸活化糖。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，細胞表現一或多種多肽，該一或多種多肽選自包含以下者之清單：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透過酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙醯基半乳糖胺焦磷酸化酶。

在根據本發明之方法及/或細胞的一較佳實施方式中，根據本發明之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣的中性混合物可藉由提供一種用於製造基於乳糖之中性岩藻糖基化寡醣的細胞來產生，該細胞1）能夠如本文所描述自培養吸收乳糖或能夠在藉由如本文所描述之b-1,4-半乳糖基轉移酶之作用吸收葡萄糖之後產生乳糖；及2）能夠表現至少一種，較佳至少兩種選自包含以下者之清單的如本文所描述之岩藻糖基轉移酶：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶；3）視情況能夠表現如本文所描述之N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶，較佳半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶；4）視情況能夠表現至少一種，較佳至少兩種選自包含以下者之清單的如本文所描述之半乳糖基轉移酶：N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶、α-1,4-半乳糖基轉移酶；5）視情況能夠表現選自包含以下者之清單的至少一種，較佳至少兩種如本文所描述之N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶：α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶及β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶；6）能夠合成GDP-岩藻糖，較佳該細胞具有如本文所定義之岩藻糖基化路徑，及7）能夠合成該醣基轉移酶（若存在）中之每一者之核苷酸-糖。

在根據本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外較佳實施方式中，根據本發明之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物可藉由提供一種用於製造基於乳糖之中性非岩藻糖基化寡醣的細胞來產生，該細胞1）能夠自如本文所描述之培養中吸收乳糖或能夠在藉由如本文所描述之b-1,4-半乳糖基轉移酶之作用吸收葡萄糖之後產生乳糖；及2）能夠表現如本文所描述之N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶，較佳半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶；3）視情況能夠表現至少一種，較佳至少兩種如本文所描述之半乳糖基轉移酶，該（等）半乳糖基轉移酶選自包含以下者之清單：N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶、α-1,4-半乳糖基轉移酶；及4）視情況能夠表現至少一種，較佳至少兩種如本文所描述之N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶，該（等）N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶選自包含α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶及β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶之清單及5）能夠合成該等醣基轉移酶（若存在）中之每一者的核苷酸-糖。

在根據本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外較佳實施方式中，根據本發明之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物可藉由提供一種用於製造基於LNB之中性岩藻糖基化寡醣的細胞來產生，該細胞1）能夠自如本文所描述之培養中吸收LNB或能夠產生如本文所描述之LNB；及2）能夠表現至少一種，較佳至少兩種如本文所描述之岩藻糖基轉移酶，該（等）岩藻糖基轉移酶選自包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶之清單；3）能夠合成GDP-岩藻糖，較佳該細胞具有如本文所定義之岩藻糖基化路徑，及4）視情況能夠產生UDP-半乳糖。

在根據本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外較佳實施方式中，根據本發明之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物可藉由提供一種用於製造基於LNB之中性非岩藻糖基化寡醣的細胞來產生，該細胞能夠如本文所描述產生LNB或能夠如本文所描述自培養吸收LNB；且能夠合成UDP-Gal。

在根據本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外較佳實施方式中，根據本發明之至少三種不同寡醣之混合物可藉由提供一種用於產生基於LacNAc之中性岩藻糖基化寡醣的細胞來產生，該細胞1）能夠自如本文所描述之培養中吸收LacNAc或能夠產生如本文所描述之LacNAc；及2）能夠表現至少一種，較佳至少兩種如本文所描述之岩藻糖基轉移酶，該（等）岩藻糖基轉移酶選自包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶之清單；3）能夠合成GDP-岩藻糖，較佳該細胞具有如本文所定義之岩藻糖基化路徑，及4）視情況能夠產生UDP-半乳糖。

在根據本發明之方法及/或細胞之另一及/或額外較佳實施方式中，根據本發明之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物可藉由提供一種用於製造基於LacNAc之中性非岩藻糖基化寡醣的細胞來產生，該細胞能夠如本文所描述產生LacNAc或能夠如本文所描述自培養吸收LacNAc；且能夠合成UDP-Gal。

在根據本發明之方法及/或細胞之一更佳實施方式中，包含中性岩藻糖基化基於乳糖之寡醣（如例如岩藻基乳糖及岩藻糖基化LNT及/或LNnT結構，如例如LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V）之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣的中性混合物可藉由提供一種細胞來產生，該細胞：1）能夠如本文所描述自培養吸收乳糖或能夠在藉由如本文所描述之b-1,4-半乳糖基轉移酶之作用吸收葡萄糖之後產生乳糖；及2）能夠表現至少一種，較佳至少兩種選自包含以下者之清單的如本文所描述之岩藻糖基轉移酶：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶；3）能夠合成GDP-岩藻糖，較佳地，該細胞具有如本文所定義之岩藻糖基化路徑；4）能夠表現如本文所描述之N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶，較佳半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶；5）能夠表現至少一種，較佳至少兩種選自包含以下者之清單的如本文所描述之半乳糖基轉移酶：N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶、α-1,4-半乳糖基轉移酶；6）能夠合成UDP-GlcNAc，較佳該細胞具有如本文所定義之N-乙醯基葡萄糖胺基化路徑；7）能夠合成UDP-Gal，較佳該細胞具有如本文所定義之半乳糖基化路徑。

根據本發明之例示性方法及細胞描述於實施例部分中。強調此等實施例顯示產生特定混合物之至少一種方式。所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，若所表現酶中之任一者具有相同催化活性，較佳在類似程度上，該活性可經由常規實驗容易地評定，則該等所表現酶中之任一者可經另一種酶置換，其中酶之活性與如本文所揭示之參考酶（例如基質之試管內轉化）之活性相比。

較佳地，除四種中性岩藻糖基化寡醣以外，寡醣混合物亦包含至少一種如本文所定義之中性非岩藻糖基化寡醣。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，該等中性寡醣中之任一者，更佳該等寡醣中之全部，藉由被動運輸亦即無需藉助於主動運輸系統消耗來自該細胞之能量而移位至細胞外。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，細胞使用至少一種前驅物用於製造該等寡醣中之任一者或多者。如本文所揭示之定義中所解釋，應瞭解術語「前驅物（precursor）」。在一更佳實施方式中，細胞使用兩種或更多種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物。

在本發明方法之一較佳實施方式中，向培養中饋入前驅物及/或受體以用於合成該混合物中之該等寡醣中之任一者。如本文所揭示之定義中所解釋，應瞭解術語「受體（acceptor）」。在該方法之另一較佳實施方式中，向培養中饋入至少兩種前驅物及/或受體以用於合成混合物中之該等寡醣中之任一者或多者，較佳全部。若使用同一分類之兩個或更多個醣基轉移酶（例如2-岩藻糖基轉移酶），其具有不同親和力（例如一個對乳糖具有親和力之岩藻糖基轉移酶及另一個對乳果糖具有親和力之岩藻糖基轉移酶）用於產生根據本發明之寡醣的混合物，則此可為適用的。

在如本文所描述之方法及/或細胞之另一實施方式中，細胞產生用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物。在一較佳實施方式中，該細胞產生一或多種用於合成該寡醣混合物之前驅物。在一更佳實施方式中，該細胞經修飾以用於該等前驅物中之任一者之最佳化產生，以用於合成該等寡醣中之任一者。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物完全轉化為該等寡醣中之任一者。在一更佳實施方式中，細胞將該等前驅物中之任一者完全轉化為該等寡醣中之任一者。

在本發明之方法及/或細胞之另一較佳實施方式中，細胞經進一步代謝工程改造以用於 i）內源膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與該細胞外之該等中性寡醣中之任一者之分泌。該細胞可表現參與該等中性寡醣中之任一者自該細胞至該細胞外之分泌的該等膜蛋白中之一者。該細胞亦可表現該等膜蛋白中之超過一者。該等膜蛋白中之任一者可使該等中性寡醣中之一或多者移位至該細胞外。該細胞可使該等中性寡醣中之任一者移位，該等寡醣包含被動擴散體（passive diffusion）、通道膜蛋白、膜運輸蛋白、膜載體蛋白。

在本發明之方法及/或細胞之另一較佳實施方式中，細胞經進一步代謝工程改造以用於 i）內源膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與吸收用於合成該等中性寡醣中之任一者的前驅物及/或受體。在一實施方式中，細胞可表現參與用於合成該等中性寡醣中之任一者的任何類型前驅物及/或受體之吸收的該等膜蛋白中之一者。在另一及/或額外實施方式中，細胞亦可表現該等膜蛋白之超過一者，該等膜蛋白參與吸收該等前驅物及/或受體中之至少一者。在另一及/或額外實施方式中，細胞可經修飾以用於吸收超過一種用於合成該等中性寡醣中之任一者的前驅物及/或受體。在一較佳實施方式中，細胞經修飾以用於吸收所有所需前驅物。在另一較佳實施方式中，細胞經修飾以用於吸收所有受體。

在本發明之方法及/或細胞之一更佳實施方式中，膜蛋白係選自包含以下者之清單：搬運蛋白、P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白、β-桶狀孔蛋白、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白及磷酸轉移驅動之基團移位蛋白。在本發明之方法及/或細胞之甚至更佳實施方式中，搬運蛋白包含MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白。在本發明之方法及/或細胞之另一更佳實施方式中，P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白包含ABC運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白。

在本發明之方法及/或細胞之另一較佳實施方式中，膜蛋白提供該等寡醣中之任一者，較佳該等寡醣中之全部之經改善製造。在本發明之方法及/或細胞之替代及/或額外較佳實施方式中，膜蛋白使該等寡醣中之任一者，較佳該等寡醣中之全部能夠流出。在本發明之方法及/或細胞之替代及/或額外較佳實施方式中，膜蛋白提供該等寡醣中之任一者，較佳該等寡醣中之全部之經增強流出。

在本發明之方法及/或細胞之一更佳實施方式中，細胞表現屬於MFS運輸蛋白家族之膜蛋白，該等運輸蛋白如例如來自包含大腸桿菌（UniProt ID P0AEY8）、莫金斯克羅諾桿菌（Cronobacter muytjensii）（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、楊氏檸檬酸桿菌（Citrobacter youngae）（UniProt ID D4BC23）及雷金斯堡約克氏菌（Yokenella regensburgei）（UniProt ID G9Z5F4）之物種的多藥運輸蛋白MdfA家族之MdfA多肽。在本發明之方法及/或細胞之另一更佳實施方式中，細胞表現屬於糖流出運輸蛋白家族之膜蛋白，該等運輸蛋白如例如來自包含大腸桿菌（UniProt ID P31675）、克氏檸檬酸桿菌（Citrobacter koseri）（UniProt ID A0A078LM16）及肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）（UniProt ID A0A0C4MGS7）之物種的SetA家族之SetA多肽。在本發明之方法及/或細胞之另一更佳實施方式中，細胞表現屬於螯鐵蛋白輸出蛋白家族之膜蛋白，該等輸出蛋白如例如大腸桿菌entS（UniProt ID P24077）及大腸桿菌iceT（UniProt ID A0A024L207）。在本發明之方法及/或細胞之另一更佳實施方式中，細胞表現屬於ABC運輸蛋白家族之膜蛋白，該等運輸蛋白如例如來自大腸桿菌之oppF（UniProt ID P77737）、來自乳酸乳球菌乳酸亞種二乙醯基乳酸變種（Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis）之lmrA（UniProt ID A0A1V0NEL4）及來自長雙歧桿菌嬰兒亞種（Bifidobacterium longum subsp. infantis）之Blon_2475（UniProt ID B7GPD4）。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，細胞賦予增強之噬菌體抗性。噬菌體抗性之該增強可源自內源膜蛋白之降低的表現及/或內源膜蛋白編碼基因之突變。術語「噬菌體不敏感性（phage insensitive）」或「抗噬菌體（phage resistant）」或「噬菌體抗性（phage resistance）」或「抗噬菌體概況（phage resistant profile）」應理解為意指對藉由噬菌體及/或生長抑制之感染及/或殺滅較不敏感且較佳不敏感的細菌菌株。如本文所用，術語「抗噬菌體活性（anti-phage activity）」或「對藉由至少一種噬菌體之感染具抗性（resistant to infection by at least one phage）」係指表現功能性噬菌體抗性系統之細菌細胞相比於不表現功能性噬菌體抗性系統之相同發育階段（例如培養狀態）下之相同物種之細菌細胞對藉由至少一種噬菌體家族之感染的抗性增加，如可藉由例如細菌活力、噬菌體溶原性、噬菌體基因體複製及噬菌體基因體降解所確定。噬菌體可為裂解噬菌體或溫和（溶原性）噬菌體。涉及細胞之噬菌體抗性之膜蛋白包含OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、BtuB、TolC、LamB、FhuA、TonB、FadL、Tsx、FepA、YncD、PhoE及NfrA及其同源物。

在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，細胞賦予降低之黏度。細胞黏度降低可藉由經修飾之細胞壁生物合成獲得。細胞壁生物合成可經修飾，包含例如聚-N-乙醯基-葡萄糖胺、腸內菌共同抗原、纖維素、可拉酸（colanic acid）、核寡醣、滲透調節周質葡聚糖及甘油葡萄糖苷、聚醣及繭蜜糖之合成減少或消除。

根據本發明之方法及/或細胞之另一實施方式，細胞能夠製造磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）。在本發明之方法及/或細胞之一較佳實施方式中，與未經修飾之先驅細胞相比，細胞經修飾以用於PEP之經增強產生及/或供應。

在一較佳實施方式中且作為用於PEP之經增強產生及/或供應的手段，一或多種PEP依賴型、糖運輸磷酸轉移酶系統被破壞，諸如（但不限於）：1）N-乙醯基-D-葡萄糖胺Npi-磷酸轉移酶（EC 2.7.1.193），其舉例而言由大腸桿菌或芽孢桿菌物種中之nagE基因（或簇nagABCD）編碼，2）ManXYZ，其編碼輸入外源性己糖（甘露糖、葡萄糖、葡萄糖胺、果糖、2-去氧葡萄糖、甘露糖胺、N-乙醯基葡萄糖胺等）及釋放磷酸至細胞細胞質中之酶ll Man複合物（甘露糖PTS透過酶、蛋白質-Npi-磷酸組胺酸-D-甘露糖磷酸轉移酶），3）葡萄糖特異性PTS運輸蛋白（舉例而言由PtsG/Crr編碼），其在細胞質中吸收葡萄糖且形成葡萄糖-6-磷酸鹽，4）蔗糖特異性PTS運輸蛋白，其在細胞質中吸收蔗糖且形成蔗糖-6-磷酸鹽，5）果糖特異性PTS運輸蛋白（舉例而言由基因fruA及fruB編碼及激酶fruK編碼，該激酶fruK在第一步驟中吸收果糖且形成果糖-1-磷酸鹽且在第二步驟中形成果糖1,6二磷酸鹽，6）乳糖PTS運輸蛋白（舉例而言由乾酪乳球菌（Lactococcus casei）中之lacE編碼），其吸收乳糖且形成乳糖-6-磷酸鹽，7）半乳糖醇特異性PTS酶，其吸收半乳糖醇及/或山梨醇且分別形成半乳糖醇-1-磷酸鹽或山梨醇-6-磷酸鹽，8）甘露糖醇特異性PTS酶，其吸收甘露糖醇及/或山梨醇且分別形成甘露糖醇-1-磷酸鹽或山梨醇-6-磷酸鹽，及9）繭蜜糖特異性PTS酶，其吸收繭蜜糖且形成繭蜜糖-6-磷酸鹽。

在另一及/或額外較佳實施方式中且作為用於PEP之經增強產生及/或供應的手段，完整PTS系統藉由破壞PtsIH/Crr基因簇而破壞。PtsI（酶I）為充當大腸桿菌K-12之磷酸烯醇丙酮酸:糖磷酸轉移酶系統（PTS糖）之閘道的細胞質蛋白。PtsI為PTS糖之兩個（PtsI及PtsH）糖非特異性蛋白成分中之一者，其與糖特異性內膜透過酶一起影響引起多種碳水化合物基質之耦合磷酸化及運輸的磷酸轉移級聯。HPr（含有組胺酸之蛋白質）為PTS糖之兩種糖非特異性蛋白質成分中之一者。其接受來自磷酸化酶I（PtsI-P）之磷氧基且接著將其轉移至PTS糖之許多糖特異性酶（統稱為酶II）中之任一者的EIIA域。在需要PtsH及PtsI之反應中，Crr或EIIAGlc由PEP磷酸化。

在另一及/或額外較佳實施方式中，細胞經進一步修飾以藉由對應的透過酶之引入及/或過度表現來補償碳源之PTS系統之缺失。此等為例如透過酶或ABC運輸蛋白，其包含但不限於特異性地輸入乳糖之運輸蛋白，諸如由來自大腸桿菌之LacY基因編碼之運輸蛋白；輸入蔗糖之運輸蛋白，諸如由來自大腸桿菌之cscB基因編碼之運輸蛋白；輸入葡萄糖之運輸蛋白，諸如由來自大腸桿菌之galP基因編碼之運輸蛋白；輸入果糖之運輸蛋白，諸如由來自變形鏈球菌（Streptococcus mutans）之fruI基因編碼之運輸蛋白；或為山梨醇/甘露糖醇ABC運輸蛋白，諸如由類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）之簇SmoEFGK編碼之運輸蛋白；繭蜜糖/蔗糖/麥芽糖運輸蛋白，諸如由苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）之基因簇ThuEFGK編碼之運輸蛋白；及N-乙醯基葡萄糖胺/半乳糖/葡萄糖運輸蛋白，諸如由奧奈達希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）之NagP編碼之運輸蛋白。PTS缺失與替代運輸蛋白之過度表現的組合之實例為：1）葡萄糖PTS系統（例如ptsG基因）之缺失與葡萄糖透過酶（例如glcP之galP）之引入及/或過度表現組合，2）果糖PTS系統（例如fruB、fruA、fruK基因中之一或多者）之缺失與果糖透過酶（例如fruI）之引入及/或過度表現組合，3）乳糖PTS系統之缺失與乳糖透過酶（例如LacY）之引入及/或過度表現組合，及/或4）蔗糖PTS系統之缺失與蔗糖透過酶（例如cscB）之引入及/或過度表現組合。

在另一較佳實施方式中，細胞經修飾以藉由引入碳水化合物激酶，諸如葡萄糖激酶（EC 2.7.1.1、EC 2.7.1.2、EC 2.7.1.63）、半乳糖激酶（EC 2.7.1.6）及/或果糖激酶（EC 2.7.1.3、EC 2.7.1.4）來補償碳源之PTS系統缺失。PTS缺失與替代運輸蛋白及激酶之過度表現的組合之實例為：1）葡萄糖PTS系統（例如ptsG基因）之缺失，與葡萄糖透過酶（例如glcP之galP）之引入及/或過度表現組合，與葡萄糖激酶（例如glk）之引入及/或過度表現組合，及/或2）果糖PTS系統（例如fruB、fruA、fruK基因中之一或多者）之缺失，與果糖透過酶（例如fruI）之引入及/或過度表現組合，與果糖激酶（例如frk或mak）之引入及/或過度表現組合。

在另一及/或額外較佳實施方式中且作為用於PEP之經增強產生及/或供應的手段，細胞藉由引入包含以下者之清單中之任一者或多者或在包含以下者之清單中之任一者或多者方面進行修飾來修飾：磷酸烯醇丙酮酸合酶活性（EC: 2.7.9.2，舉例而言在大腸桿菌中藉由ppsA編碼）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性（EC 4.1.1.32或EC 4.1.1.49，舉例而言分別在麩胺酸棒狀桿菌中藉由PCK編碼或在大腸桿菌中藉由pckA編碼）；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性（EC 4.1.1.31，舉例而言在大腸桿菌中藉由ppc編碼）；草醯乙酸脫羧酶活性（EC 4.1.1.112，舉例而言在大腸桿菌中藉由eda編碼）；丙酮酸激酶活性（EC 2.7.1.40，舉例而言在大腸桿菌中藉由pykA及pykF編碼）；丙酮酸羧化酶活性（EC 6.4.1.1，舉例而言在枯草芽孢桿菌中藉由pyc編碼）；及蘋果酸脫氫酶活性（EC 1.1.1.38或EC 1.1.1.40，舉例而言在大腸桿菌中分別藉由maeA或maeB編碼）。

在一更佳實施方式中，細胞經修飾以過度表現該等多肽中之任一者或多者，該等多肽包含來自大腸桿菌之ppsA（UniProt ID P23538）、來自麩胺酸棒狀桿菌之PCK（UniProt ID Q6F5A5）、來自大腸桿菌之pcka（UniProt ID P22259）、來自大腸桿菌之eda（UniProt ID P0A955）、來自大腸桿菌之maeA（UniProt ID P26616）及來自大腸桿菌之maeB（UniProt ID P76558）。

在另一及/或額外較佳實施方式中，細胞經修飾以表現具有磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、草醯乙酸脫羧酶活性或蘋果酸脫氫酶活性之任一或多種多肽。

在另一及/或額外較佳實施方式中且作為用於PEP之經增強產生及/或供應的手段，細胞藉由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶活性之降低活性，較佳缺失編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶之基因加以修飾。

在一例示性實施方式中，細胞藉由不同調適經遺傳修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與丙酮酸激酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、蘋果酸脫氫酶之過度表現與丙酮酸激酶基因之缺失組合、蘋果酸脫氫酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合及/或蘋果酸脫氫酶之過度表現與丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

在另一例示性實施方式中，細胞藉由不同調適經遺傳修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現組合，磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現組合及/或磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現組合。

在另一例示性實施方式中，細胞藉由不同調適經遺傳修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因之缺失組合。

在另一例示性實施方式中，細胞藉由不同調適經遺傳修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

在另一例示性實施方式中，細胞藉由不同調適經遺傳修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

在另一例示性實施方式中，細胞藉由不同調適經遺傳修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

在另一例示性實施方式中，細胞藉由不同調適經遺傳修飾，該等不同調適諸如磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、草醯乙酸脫羧酶之過度表現與蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現及草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合、磷酸烯醇丙酮酸合酶之過度表現與草醯乙酸脫羧酶之過度表現及蘋果酸脫氫酶之過度表現以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因之缺失組合。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳實施方式，與未經修飾之先驅細胞相比，細胞包含用於減少乙酸鹽之產生的修飾。該修飾可為選自包含以下者之群的任一者或多者：乙醯基-輔酶A合成酶之過度表現、完全或部分基因剔除或顯現較少功能性丙酮酸脫氫酶及完全或部分基因剔除或顯現較少功能性乳酸脫氫酶。

在本發明之方法及/或細胞之另一實施方式中，細胞在至少一種乙醯基-輔酶A合成酶之表現或活性方面經修飾，該等合成酶如例如來自大腸桿菌、釀酒酵母、智人、小家鼠之acs。在一較佳實施方式中，該乙醯基-輔酶A合成酶為具有修飾之表現或活性之細胞之內源蛋白，較佳該內源性乙醯基-輔酶A合成酶經過度表現；替代地，該乙醯基-輔酶A合成酶係異質引入且表現於該細胞中，較佳過度表現之異源蛋白。該內源性乙醯基-輔酶A合成酶可在亦表現異源性乙醯基-輔酶A合成酶之細胞中具有經修飾之表現。在一更佳實施方式中，細胞在來自大腸桿菌之乙醯基-輔酶A合成酶acs（UniProt ID P27550）之表現或活性方面經修飾。在另一及/或額外較佳實施方式中，細胞在來自大腸桿菌之acs（UniProt ID P27550）之功能同源物、變異體或衍生物的表現或活性方面經修飾，該功能同源物、變異體或衍生物與來自大腸桿菌之該多肽（UniProt ID P27550）的全長具有至少80%整體序列一致性且具有乙醯基-輔酶A合成酶活性。

在本發明之方法及/或細胞之替代性及/或額外其他實施方式中，細胞在至少一種如例如來自大腸桿菌、釀酒酵母、智人及褐鼠之丙酮酸脫氫酶的表現或活性方面經修飾。在一較佳實施方式中，細胞已經修飾以藉由所屬領域中具有通常知識者通常已知之方式具有至少一種部分或完全基因剔除或突變之丙酮酸脫氫酶編碼基因，從而產生至少一種功能較小或丙酮酸脫氫酶活性失能之蛋白質。在一更佳實施方式中，細胞在poxB編碼基因方面具有完全基因剔除，從而導致細胞缺乏丙酮酸脫氫酶活性。

在本發明之方法及/或細胞之替代性及/或額外其他實施方式中，細胞在至少一種如例如來自大腸桿菌、釀酒酵母、智人及褐鼠之乳酸脫氫酶的表現或活性方面經修飾。在一較佳實施方式中，細胞已經修飾以藉由所屬領域中具有通常知識者通常已知之方式具有至少一種部分或完全基因剔除或突變之乳酸脫氫酶編碼基因，從而產生至少一種功能較小或乳酸脫氫酶活性失能之蛋白質。在一更佳實施方式中，細胞在ldhA編碼基因方面具有完全基因剔除，從而導致細胞缺乏乳酸脫氫酶活性。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳實施方式，與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含降低或減少表現及/或消除、減弱、降低或延遲活性之包含以下者之蛋白質中之任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-墨角藻糖激酶（fuculokinase）、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶IIBC組分ptsG、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶（PTS）IIBC組分malX、酶IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷氧基轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶　醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸解離酶、乙酸激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯基轉移酶、丙酮酸脫羧酶。

根據本發明之方法及/或細胞之另一較佳實施方式，細胞包含用於所選單醣、雙醣或寡醣之分解代謝路徑，該分解代謝路徑至少部分不活化，該等單醣、雙醣或寡醣參與來自該混合物之該等寡醣中之任一者之製造及/或為該製造所需的。

本發明之另一實施方式提供一種方法及一種細胞，其中包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物係在如本文所描述之真菌、酵母菌、細菌、昆蟲、動物、植物及原蟲細胞中及/或藉由其產生。細胞係選自包含細菌、酵母菌、原蟲或真菌之清單，或係指植物或動物細胞。後一細菌較佳屬於變形菌（Proteobacteria）門或厚壁菌（Firmicutes）門或藍菌（Cyanobacteria）門或異常球菌-棲熱菌（Deinococcus-Thermus）門。屬於變形菌門之後一細菌較佳屬於腸細菌科，較佳屬於大腸桿菌種。後一細菌較佳係關於屬於大腸桿菌種之任何菌株，諸如（但不限於）大腸桿菌B、大腸桿菌C、大腸桿菌W、大腸桿菌K12、大腸桿菌尼塞爾（Nissle）。更特定言之，後一術語係關於指定為大腸桿菌K12菌株之經培養大腸桿菌菌株-其良好適應於實驗室環境，且不同於野生型菌株，該等經培養大腸桿菌菌株已喪失其在腸中生長之能力。大腸桿菌K12菌株之熟知實例為K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111及AA200。因此，本發明特定地係關於如上文所指示之經突變及/或經轉型之大腸桿菌細胞或菌株，其中該大腸桿菌菌株為K12菌株。大腸桿菌K12菌株更佳為大腸桿菌MG1655。屬於厚壁菌門之後一細菌較佳屬於桿菌綱（Bacilli），較佳具有諸如乳酸乳桿菌（ Lactobacillus lactis）、腸膜明串珠菌（ Leuconostoc mesenteroides）之成員的乳桿菌目（Lactobacilliales），或具有諸如來自芽孢桿菌（Bacillus）屬之成員，諸如枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）或解澱粉芽孢桿菌（ B. amyloliquefaciens）的芽孢桿菌目（Bacillales）。屬於放線菌（Actinobacteria）門之後一細菌較佳屬於具有成員麩胺酸棒狀桿菌或非醱酵棒狀桿菌（ C. afermentans）之棒狀桿菌（Corynebacteriaceae）科，或屬於具有成員灰色鏈黴菌（ Streptomyces griseus）或費氏鏈黴菌（ S. fradiae）之鏈黴菌（Streptomycetaceae）科。後一酵母菌較佳屬於子囊菌（Ascomycota）門或擔子菌（Basidiomycota）門或半知菌（Deuteromycota）門或接合菌（Zygomycetes）門。後一酵母菌較佳屬於酵母菌（Saccharomyces）屬（具有如例如釀酒酵母、貝酵母（ S. bayanus）、布拉酵母（ S. boulardii）之成員）、畢赤酵母（Pichia）屬（具有如例如巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris）、異常畢赤酵母（ P. anomala）、克魯維畢赤酵母（ P. kluyveri）之成員）、駒形氏酵母屬（Komagataella）、漢遜酵母屬（Hansenula）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）（具有如例如乳酸克魯維酵母菌（ Kluyveromyces lactis）、乳酒念珠菌（ K. marxianus）、耐熱克魯維酵母（ K. thermotolerans）之成員）、德巴利酵母屬（Debaromyces）、亞羅酵母屬（Yarrowia）（如例如解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica））或斯塔莫酵母屬（Starmerella）（如例如熊蜂生斯塔莫酵母（ Starmerella bombicola））。後一酵母菌較佳選自巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris）、解脂耶氏酵母（ Yarrowia lipolitica）、釀酒酵母及乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis）。後一真菌較佳屬於根黴菌屬（ Rhizopus）、網柄菌屬（ Dictyostelium）、青黴菌屬（ Penicillium）、白黴菌屬（ Mucor）或麴菌屬（ Aspergillus）。

植物細胞包括開花及非開花植物之細胞，以及藻類細胞，例如單胞藻屬（Chlamydomonas）、綠球藻屬（Chlorella）等。較佳地，該植物為菸草、苜蓿、稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物。後一動物細胞較佳衍生自非人類哺乳動物（例如牛、水牛、豬、綿羊、小鼠、大鼠）、鳥類（例如雞、鴨、鴕鳥、火雞、野雞）、魚類（例如劍魚、鮭魚、鮪魚、海鱸、鱒魚、鯰魚）、無脊椎動物（例如龍蝦、蟹、蝦、蚌蛤、牡蠣、貽貝、海膽）、爬行動物（例如蛇、鱷魚、龜）、兩棲動物（例如蛙）或昆蟲（例如蠅、線蟲）或為衍生自排除胚胎幹細胞之人類細胞的經遺傳修飾之細胞系。人類及非人類哺乳動物細胞兩者較佳選自包含以下者之清單：上皮細胞如例如乳腺上皮細胞、胚胎腎細胞（例如HEK293或HEK 293T細胞）、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary；CHO）細胞、鼠類骨髓瘤細胞如例如N20、SP2/0或YB2/0細胞、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，諸如WO21067641中所描述。後一昆蟲細胞較佳衍生自：斜紋夜盜蟲（ Spodoptera frugiperda）如例如Sf9或Sf21細胞、家蠶（ Bombyx mori）、甘藍夜蛾（ Mamestra brassicae）、粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni）如例如BTI-TN-5B1 -4細胞或黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）如例如果蠅屬S2細胞。後一原蟲細胞較佳為蜥蜴利什曼原蟲（ Leishmania tarentolae）細胞。

在本發明之方法及/或細胞的一較佳實施方式中，與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞為存活的革蘭氏陰性細菌，該細菌包含減少或消除合成之聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG）、腸內菌共同抗原（Enterobacterial Common Antigen；ECA）、纖維素、可拉酸、核寡醣、滲透調節周質葡聚糖（Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或繭蜜糖。

在方法及/或細胞之一更佳實施方式中，該減少或消除合成之聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（PNAG）、腸內菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核寡醣、滲透調節周質葡聚糖（OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或繭蜜糖係藉由參與該聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（PNAG）、腸內菌共同抗原（ECA）、纖維素、可拉酸、核寡醣、滲透調節周質葡聚糖（OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或繭蜜糖中之任一者的合成中的任一或多種醣基轉移酶之突變提供，其中該突變提供該等醣基轉移酶中之任一者的缺失或更低表現。該等醣基轉移酶包含編碼聚-N-乙醯基-D-葡萄糖胺合酶次單元之醣基轉移酶基因、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺-十一異戊烯基-磷酸N-乙醯基葡萄糖胺磷酸轉移酶、Fuc4NAc（4-乙醯胺基-4,6-二去氧-D-半乳糖）轉移酶、UDP-N-乙醯基-D-甘露糖醛酸轉移酶、編碼纖維素合酶催化次單元之醣基轉移酶基因、纖維素生物合成蛋白、可拉酸生物合成葡萄糖醛酸基轉移酶、可拉酸生物合成半乳糖基轉移酶、可拉酸生物合成岩藻糖基轉移酶、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、推定可拉生物合成醣基轉移酶、UDP-葡萄糖醛酸:LPS（HepIII）醣基轉移酶、ADP-庚糖-LPS庚糖基轉移酶2、ADP-庚醣:LPS庚糖基轉移酶1、推定ADP-庚醣:LPS庚糖基轉移酶4、脂多醣核心生物合成蛋白、UDP-葡萄糖:(葡萄糖基)LPS α-1,2-葡萄糖基轉移酶、UDP-D-葡萄糖:(葡萄糖基)LPS α-1,3-葡萄糖基轉移酶、UDP-D-半乳糖:(葡萄糖基)脂多糖-1,6-D-半乳糖基轉移酶、脂多醣葡萄糖基轉移酶I、脂多醣核心庚醣基轉移酶3,β-1,6-半乳糖呋喃酮基轉移酶、十一異戊烯基-磷酸4-去氧-4-甲醯胺基-L-阿拉伯糖轉移酶、脂質IVA 4-胺基-4-去氧-L-阿拉伯糖基轉移酶、細菌萜醇葡萄糖基轉移酶、推定家族2醣基轉移酶、滲透調節周質葡聚糖（OPG）生物合成蛋白G、OPG生物合成蛋白質H、葡萄糖基甘油酸酯磷酸化酶、肝糖合酶、1,4-α-葡聚糖分支酶、4-α-葡聚糖轉移酶及繭蜜糖-6-磷酸合酶。在一例示性實施方式中，該細胞在該等醣基轉移酶中之任一者或多者方面經突變，該等醣基轉移酶包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP，其中該突變提供該等醣基轉移酶中之任一者的缺失或更低表現。

在方法及/或細胞之替代及/或額外較佳實施方式中，聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（PNAG）之該減少或消除合成藉由碳儲存調節子編碼基因之過度表現、Na+/H+反向搬運蛋白調節子編碼基因之缺失及/或感測器組胺酸激酶編碼基因之缺失提供。

如本文所用之微生物或細胞能夠在單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇、甘油；包括糖蜜、玉米浸液、蛋白腖、胰腖、酵母萃取物之複合培養基或其混合物（如例如混合原料，較佳混合單醣原料，如例如水解蔗糖）作為主要碳源上生長。術語「複合培養基（complex medium）」意指其中精確構成並未確定之培養基。術語主要意指相關生物產物、生物質形成、二氧化碳及/或副產物形成（諸如酸及/或醇，諸如乙酸鹽、乳酸鹽及/或乙醇）之最重要碳源，亦即所有所需碳之20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%均衍生自以上所指示碳源。在本發明之一個實施方式中，該碳源為該生物體之唯一碳源，亦即所有所需碳之100%衍生自以上所指示碳源。常見主要碳源包含（但不限於）葡萄糖、甘油、果糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、繭蜜糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖漿、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽及丙酮酸鹽。術語複合培養基意指其中精確構成並未確定之培養基。實例為糖蜜、玉米浸液、蛋白腖、胰腖或酵母萃取物。

在另一較佳實施方式中，本文所描述之微生物或細胞使用具有如WO2012/007481中所描述之製造路徑及生物質路徑的分裂代謝，該文獻以引用之方式併入本文中。該生物體可例如經遺傳修飾以藉由改變選自磷酸葡萄糖異構酶基因、磷酸果糖激酶基因、果糖-6-磷酸醛縮酶基因、果糖異構酶基因及/或果糖:PEP磷酸轉移酶基因之基因來積聚果糖-6-磷酸鹽。

根據本發明之方法之另一實施方式，容許產生混合物中之該等寡醣之條件包含使用培養基來培養本發明之細胞以產生該寡醣混合物，其中該培養基缺乏用於製造該等寡醣中之任一者之任何前驅物及/或受體，且與將至少一種前驅物及/或受體進料進一步添加至該培養基進行組合以用於製造該等寡醣中之任一者，較佳地用於製造該混合物中之該等寡醣中之全部。

在一較佳實施方式中，用於產生如本文所描述之寡醣混合物之方法包含以下步驟中之至少一者： i) 使用包含至少一種前驅物及/或受體之培養基； ii) 在反應器中向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii) 在反應器中向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，且其中較佳地，該前驅物及/或受體進料之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該前驅物及/或受體進料之溫度保持在20℃與80℃之間； iv) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料； v) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在最終培養中產生濃度為至少50 g/L，較佳至少75 g/L，更佳至少90 g/L，更佳至少100 g/L，更佳至少125 g/L，更佳至少150 g/L，更佳至少175 g/L，更佳至少200 g/L之該等寡醣中之任一者。

在另一及/或額外較佳實施方式中，用於產生如本文所描述之寡醣混合物之方法包含以下步驟中之至少一者： i) 使用包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的培養基，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內； ii) 以一個脈衝或以不連續（經脈衝）方式向培養基添加至少一種前驅物及/或受體，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料脈衝之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii) 以一個脈衝或以不連續（經脈衝）方式在反應器中向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料脈衝之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於2倍，且其中較佳地，該前驅物及/或受體進料脈衝之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該前驅物及/或受體進料脈衝之溫度保持在20℃與80℃之間； iv) 歷經5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、10小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以不連續（經脈衝）方式將至少一種前驅物及/或受體進料添加至培養基中； v) 歷經5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、10小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以不連續（經脈衝）方式向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在最終培養中產生濃度為至少50 g/L，較佳至少75 g/L，更佳至少90 g/L，更佳至少100 g/L，更佳至少125 g/L，更佳至少150 g/L，更佳至少175 g/L，更佳至少200 g/L之該等寡醣中之任一者。

在另一更佳實施方式中，用於產生如本文所描述之寡醣混合物之方法包含以下步驟中之至少一者： i) 使用包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的培養基，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內； ii) 向該培養基添加包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於2倍； iii) 向該培養基添加包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於2倍，且其中較佳地，該乳糖進料之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該乳糖進料之溫度保持在20℃與80℃之間； iv) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加乳糖進料； v) 歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加乳糖進料，且其中該乳糖進料溶液之濃度為50 g/L，較佳75 g/L，更佳100 g/L，更佳125 g/L，更佳150 g/L，更佳175 g/L，更佳200 g/L，更佳225 g/L，更佳250 g/L，更佳275 g/L，更佳300 g/L，更佳325 g/L，更佳350 g/L，更佳375 g/L，更佳400 g/L，更佳450 g/L，更佳500 g/L，甚至更佳550 g/L，最佳600 g/L；且其中較佳地，該進料溶液之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在最終培養中產生濃度為至少50 g/L，較佳至少75 g/L，更佳至少90 g/L，更佳至少100 g/L，更佳至少125 g/L，更佳至少150 g/L，更佳至少175 g/L，更佳至少200 g/L之該等寡醣中之任一者。

較佳地，該乳糖進料係藉由自該培養開始以至少5 mM之濃度，較佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150 mM之濃度，更佳以＞ 300 mM之濃度添加乳糖來實現。

在另一實施方式中，乳糖進料係藉由以一濃度向培養基添加乳糖來實現，該濃度使得在該培養之整個製造階段中獲得至少5 mM，較佳10 mM或30 mM之乳糖濃度。

在本文所描述之方法之另一實施方式中，培養宿主細胞至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。

在一較佳實施方式中，在培養基中提供碳源，較佳蔗糖，持續3天或更多天，較佳至多7天；及/或在培養基中以連續方式提供每公升初始培養物體積至少100、有利至少105、更有利至少110、甚至更有利至少120公克蔗糖，使得培養基之最終體積不超過培養之前的培養基之體積的三倍、有利不超過兩倍、更有利小於兩倍。

較佳地，當進行如本文所描述之方法時，指數式細胞生長之第一階段係藉由在將該前驅物，較佳乳糖在第二階段中添加至培養中之前將碳源，較佳葡萄糖或蔗糖添加至培養基中來提供。

在本發明之方法的另一較佳實施方式中，指數式細胞生長之第一階段係藉由將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驅物，較佳乳糖之該培養基中來提供，之後為其中僅將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至培養中之第二階段。

在本發明之方法的另一較佳實施方式中，指數式細胞生長之第一階段係藉由將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驅物，較佳乳糖之該培養基中來提供，之後為其中將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖，及前驅物，較佳乳糖添加至培養中之第二階段。

在替代較佳實施方式中，在如本文所描述之方法中，已在指數式生長之第一階段中將前驅物與碳基基質一起添加。

在方法之另一較佳實施方式中，培養基含有至少一種選自包含以下者之群的前驅物：乳糖、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖（LNB）及N-乙醯基乳糖胺（LacNAc）。

根據本發明，如本文所描述之方法較佳地包含自該培養分離該等中性岩藻糖基化寡醣中之至少一者，更佳地自該培養分離所有該等中性岩藻糖基化寡醣，甚至更佳地自該培養分離存在於根據本發明之混合物中之所有寡醣的步驟。

術語「自該培養分離（separating from said cultivation）」意謂自細胞及/或其生長之培養基中收穫、收集或擷取該等寡醣中之任一者，較佳該等寡醣中之全部。

該等寡醣中之任一者可以習知方式自水性培養基分離，細胞在該水性培養基中生長。在該寡醣仍存在於製造寡醣混合物之細胞中之情況下，可使用用以自細胞中釋放或萃取該寡醣之習知方式，諸如使用以下者進行細胞破壞：高pH、熱衝擊、音波處理、法式壓濾（French press）、均質化、酶促水解、化學水解、溶劑水解、洗滌劑、水解……培養基及/或細胞萃取物一起且分別可接著進一步用於分離該寡醣。此較佳涉及澄清該含有寡醣之混合物以移除懸浮粒子及污染物，尤其細胞、細胞組分、不可溶代謝物及由培養經遺傳修飾之細胞產生之碎片。在此步驟中，可以習知方式澄清該含有寡醣之混合物。較佳地，該含有寡醣之混合物藉由離心、絮凝、傾析及/或過濾澄清。將該寡醣與該含有寡醣之混合物分離之另一步驟較佳涉及將實質上所有蛋白質以及肽、胺基酸、RNA及DNA以及可能干擾後續分離步驟之任何內毒素及糖脂自該含有寡醣之混合物移除，較佳在已使其澄清之後。在此步驟中，蛋白質及相關雜質可以習知方式自該含有寡醣之混合物移除。較佳地，蛋白質、鹽、副產物、染料、內毒素及其他相關雜質自該含有寡醣之混合物藉由超過濾、奈米過濾、二相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、切向流高效能過濾、用非離子界面活性劑處理、酶消化、超過濾、電泳（例如使用平板（slab）-聚丙烯醯胺或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE））、親和層析（使用親和配位體，包括例如DEAE-瓊脂糖凝膠、聚-L-離胺酸及多黏菌素-B、內毒素-選擇性吸附劑基質）、離子交換層析（諸如（但不限於）陽離子交換、陰離子交換、混合床離子交換、由內而外配位體連接）、疏水性相互作用層析及/或凝膠過濾（亦即粒徑排阻層析），特定言之藉由層析，更特定言之藉由離子交換層析或疏水性相互作用層析或配位體交換層析移除。除粒徑排阻層析之外，藉由層析介質或所選膜保留蛋白質及相關雜質，該寡醣保持在該含有寡醣之混合物中。

在另一較佳實施方式中，如本文所描述之方法亦提供進一步純化來自寡醣混合物之該（等）寡醣中之任一者或多者。該（等）寡醣之進一步純化可例如藉由使用（活性）木炭或碳、奈米過濾、超過濾、電泳、酶處理或離子交換以移除任何殘留DNA、蛋白質、LPS、內毒素或其他雜質來實現。亦可使用醇（諸如乙醇）及水醇混合物。另一純化步驟藉由產物之結晶、蒸發或沈澱實現。另一純化步驟為對所製造之寡醣進行乾燥，例如噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥（band dry）、帶式乾燥（belt dry）、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥。

在一例示性實施方式中，可在一製程中進行所產生寡醣中之至少一者，較佳全部的分離及純化，該製程包含以下按任何次序之步驟： a）使培養物或其澄清形式與具有截留分子量（molecular weight cut-off；MWCO）為600-3500 Da之奈米過濾膜接觸，確保保留所製造之寡醣且使蛋白質、鹽、副產物、染料及其他相關雜質中之至少一部分通過， b）使用該膜，用無機電解質之水溶液對來自步驟a）之保留物進行透濾製程，繼而視情況用純水進行透濾以移除過量電解質， c）及收集來自該電解質之陽離子的呈鹽形式之該（等）寡醣富集的保留物。

在一替代性例示性實施方式中，可在一製程中進行所產生寡醣中之至少一種，較佳全部之分離及純化，該製程包含以下按任何次序之步驟：使用不同膜使培養物或其澄清形式經受兩種膜過濾步驟，其中 -一個膜具有約300至約500道爾頓（Dalton）之間的截留分子量，及 -另一膜，其截留分子量在約600至約800道爾頓之間。

在一替代性例示性實施方式中，可在一製程中進行所產生寡醣中之至少一者，較佳全部的分離及純化，該製程包含以下按任何次序之步驟，該等步驟包含用呈H+形式之強陽離子交換樹脂及呈自由鹼形式之弱陰離子交換樹脂處理培養物或其澄清形式之步驟。

在一替代性例示性實施方式中，以以下方式進行所產生寡醣中之至少一者，較佳全部之分離及純化。將包含所製造之寡醣、生物質、培養基組分及污染物之培養物施用於以下純化步驟： i）自培養物分離生物質， ii）進行陽離子交換劑處理以用於移除帶正電物質， iii）進行陰離子交換劑處理以用於移除帶負電物質， iv）進行奈米過濾步驟及/或電滲析步驟，其中提供一種包含所製造之寡醣的純化溶液，其純度大於或等於80%。視情況，純化溶液藉由選自包含以下者之清單的任一或多個乾燥步驟進行乾燥：噴霧乾燥，凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥、帶式乾燥、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥及真空滾筒乾燥。

在一替代性例示性實施方式中，可在一製程中進行所產生寡醣中之至少一種，較佳全部之分離，該製程包含以下按任何次序之步驟：對培養物進行酶處理；自培養物移除生物質；超過濾；奈米過濾；及進行管柱層析步驟。較佳地，此類管柱層析為單個管柱或多個管柱。更佳地，管柱層析步驟為模擬移動床層析。此類模擬移動床層析較佳包含i）至少4個管柱，其中至少一個管柱包含弱或強陽離子交換樹脂；及/或ii）具有不同流速之四個區域I、II、III及IV；及/或iii）包含水之溶離劑；及/或iv）15至60攝氏度之操作溫度。

在一特定實施方式中，本發明提供所製造之寡醣或寡醣混合物，其藉由選自包含以下者之清單的任一或多個乾燥步驟乾燥成粉末：噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥、帶式乾燥、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥及真空滾筒乾燥，其中乾粉含有＜15 -wt.%之水，較佳＜10 -wt.%之水，更佳＜7 -wt.%之水，最佳＜5 -wt.%之水。

在第三態樣中，本發明提供如本文所描述之經代謝工程改造之細胞的用途，其用於製造包含至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物。

為鑑別包含如本文所描述之細胞中產生之至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣的中性混合物中之寡醣，單體建構嵌段（例如單醣或聚醣單元組成物）、側鏈之變旋異構組態、取代基之存在及位置、聚合度/分子量及鍵聯模式可藉由所屬技術領域中已知之標準方法鑑別，該等標準方法諸如例如甲基化分析、還原裂解、水解、氣相層析-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry；GC-MS）、基質輔助雷射脫附/離子化-質譜法（Matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry；MALDI-MS）、電灑離子化-質譜法（Electrospray ionization-mass spectrometry；ESI-MS）、具有紫外線或折射率偵測之高效液相層析（HPLC）、具有脈衝安培偵測之高效能陰離子交換層析（High-Performance Anion-Exchange chromatography with Pulsed Amperometric Detection；HPAEC-PAD）、毛細管電泳（capillary electrophoresis；CE）、紅外線（infrared；IR）/拉曼光譜法及核磁共掁（Nuclear magnetic resonance；NMR）光譜技術。可使用例如固態NMR、傅立葉變換紅外（Fourier transform infrared；FT-IR）光譜法及廣角X射線散射（wide-angle X-ray scattering；WAXS）來求解晶體結構。聚合度（degree of polymerization；DP）、DP分佈及多分散性可藉由例如黏度測定法及SEC（SEC-HPLC，高效粒徑排阻層析）測定。為鑑別醣之單體組分，可使用方法諸如例如酸催化之水解、高效液相層析（high performance liquid chromatography；HPLC）或氣-液相層析（gas-liquid chromatography；GLC）（在轉化成醛醇乙酸鹽之後）。為確定糖苷鍵，在DMSO中用碘甲烷及強鹼使醣甲基化，進行水解，實現部分甲基化醣醇之還原，進行甲基化醛醇乙酸鹽之乙醯化，且藉由GLC/MS（與質譜法結合之氣-液相層析）進行分析。為測定寡醣序列，使用酸或酶進行部分解聚合以測定結構。為鑑別變旋異構組態，對寡醣進行酶分析，例如使其與對特定類型之鍵聯，例如β-半乳糖苷酶或α-葡萄糖苷酶等具有特異性之酶接觸，且NMR可用於分析產物。 包含寡醣混合物之產物

在一些實施方式中，將如本文所描述產生之寡醣混合物併入至食品（例如人類食品或進食（feed））、膳食補充劑、醫藥成分、化妝品成分或藥品中。在一些實施方式中，寡醣混合物與一或多種適用於食品、進食、膳食補充劑、醫藥成份、化妝品成分或藥品之成分混合。

在一些實施方式中，膳食補充劑包含至少一種益菌助生質成分及/或至少一種益生菌成分。

「益菌助生質（prebiotic）」為促進對宿主有益之微生物，尤其胃腸道中之微生物生長的物質。在一些實施方式中，膳食補充劑提供多種益菌助生質，包括藉由本說明書中所揭示之製程製造及/或純化之寡醣混合物，以促進一或多種有益微生物之生長。膳食補充劑之益菌助生質成分之實例包括其他益菌助生質分子（諸如HMO）及植物多醣（諸如菊糖、果膠、b-葡聚糖及木質寡醣）。「益生菌（probiotic）」產品典型地含有置換或添加至胃腸道微生物群以便接受體受益之活微生物。此類微生物之實例包括乳桿菌屬物種（例如嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）及保加利亞乳桿菌（L. bulgaricus））、雙岐桿菌屬物種（例如，動物雙岐桿菌（B. animalis）、長雙岐桿菌（B. longum）及嬰兒雙岐桿菌（B. infantis）（例如Bi-26））及布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）。在一些實施方式中，由此說明書之製程製造及/或純化之寡醣混合物與此類微生物組合經口投予。

膳食補充劑之其他成分之實例包括雙醣（諸如乳糖）、單醣（諸如葡萄糖及半乳糖）、增稠劑（諸如阿拉伯膠）、酸性調節劑（諸如檸檬酸三鈉）、水、脫脂乳及調味劑。

在一些實施方式中，寡醣混合物併入至人類嬰兒食品（例如嬰兒配方食品）中。嬰兒配方食品通常為用於作為人類母乳之完整或部分替代物向嬰兒餵養之製造食品。在一些實施方式中，嬰兒配方食品以粉末形式出售，且藉由與水混合製備以用於向嬰兒瓶餵或杯餵。嬰兒配方食品之組成物典型地經設計以大致模擬人類母乳。在一些實施方式中，在本說明書中藉由製程產生及/或純化之寡醣混合物包括於嬰兒配方食品中以提供與由人類母乳中之寡醣提供之營養益處類似的營養益處。在一些實施方式中，將寡醣混合物與嬰兒配方食品之一或多種成分混合。嬰兒配方食品成分之實例包括脫脂乳、碳水化合物來源（例如乳糖）、蛋白質來源（例如乳清蛋白濃縮物及酪蛋白）、脂肪來源（例如植物油，諸如棕櫚油、高油酸紅花油、菜籽油、椰子油及/或葵花籽油；及魚油）、維生素（諸如維生素A、Bb、Bi2、C及D）、礦物質（諸如檸檬酸鉀、檸檬酸鈣、氯化鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉及磷酸鈣）及可能之人乳寡醣（HMO）。此類HMO可包括例如DiFL、乳-N-丙糖II、LNT、LNnT、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖及乳-N-新六糖。

在一些實施方式中，一或多種嬰兒配方食品成分包含脫脂乳、碳水化合物來源、蛋白質來源、脂肪來源及/或維生素及礦物質。

在一些實施方式中，一或多種嬰兒配方食品成分包含乳糖、乳清蛋白濃縮物及/或高油酸紅花油。

在一些實施方式中，嬰兒配方食品中之寡醣混合物之濃度與通常存在於人類母乳中之寡醣之濃度為大致相同濃度。在一些實施方式中，嬰兒配方食品中之寡醣之混合物中的各單一寡醣之濃度與通常存在於人類母乳中之寡醣之濃度為大致相同濃度。

在一些實施方式中，寡醣混合物併入至進料製劑中，其中該進料係選自包含寵物食品、動物代乳品、獸醫產品、斷奶後進料或蠕變進料之清單。

除非另外明確陳述，否則在本發明之一態樣的上下文中揭示之各實施方式亦揭示於本發明之所有其他態樣的上下文中。

除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語一般具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解相同之含義。一般而言，本文所用之命名法及上文及下文所描述之細胞培養中之實驗步驟、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜合為所屬領域中熟知且常用之命名法、細胞培養中之實驗步驟、分子遺傳學、有機化學及核酸化學及雜合。使用標準技術進行核酸及肽合成。一般而言，純化步驟係根據製造商說明書進行。

其他優勢遵循特定實施方式及實例。不言而喻，以上提及之特徵及仍有待下文闡述之特徵，在不脫離本發明之範圍之情況下，不僅可以分別指定之組合使用而且可以其他組合或獨立地使用。

本發明係關於以下特定實施方式： 1.一種經代謝工程改造之細胞，其製造至少三種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物，其中該細胞 - 表現為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶，及 - 能夠合成核苷酸-糖GDP-岩藻糖（GDP-Fuc），及 - 表現至少一種額外醣基轉移酶，及 - 能夠合成至少一種或多種核苷酸-糖，其中該至少一種或多種核苷酸-糖為用於該額外醣基轉移酶之供體。 2.如實施方式1之細胞，其中該細胞經基因表現模組修飾，其中來自該等表現模組中之任一者之表現為持續型的或藉由天然誘導物產生。 3.如實施方式1至2中任一項之細胞，其中該寡醣混合物包含至少三種在聚合度方面不同之不同寡醣。 4.如實施方式1至3中任一項之細胞，其中該細胞製造四種或更多種不同中性岩藻糖基化寡醣。 5.如實施方式1至4中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者係選自包含以下者之清單：岩藻糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶。 6.如實施方式1至5中任一項之細胞，其中該細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾。 7.如實施方式1至6中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為岩藻糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）。 8.如實施方式1至7中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。 9.如實施方式1至8中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為半乳糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-半乳糖（UDP-Gal）。 10.如實施方式1至9中任一項之細胞，其中該等核苷酸-糖中之任一者係選自包含以下者之清單：GDP-Fuc、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、GDP-鼠李糖、UDP-木糖。 11.如實施方式1至10中任一項之細胞，其中該等中性岩藻糖基化寡醣中之至少一者經半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露聚糖。 12.如實施方式1至11中任一項之細胞，其中除該等三種中性岩藻糖基化寡醣以外，該寡醣混合物亦包含至少一種中性非岩藻糖基化寡醣。 13.如實施方式1至12中任一項之細胞，其中該中性寡醣混合物包含至少一種寡醣，該至少一種寡醣經岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。 14.如實施方式1至13中任一項之細胞，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與該細胞外之該混合物的該等中性寡醣中之任一者之分泌。 15.如實施方式1至14中任一項之細胞，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與吸收用於合成該等中性寡醣中之任一者的前驅物。 16.如實施方式1至15中任一項之細胞，其中該細胞製造用於合成該等中性寡醣中之任一者的前驅物。 17.如實施方式1至16中任一項之細胞，其中該等中性寡醣中之任一者為哺乳動物乳寡醣。 18.如實施方式1至17中任一項之細胞，其中所有該等中性寡醣為哺乳動物乳寡醣。 19.如實施方式1至16中任一項之細胞，其中該等中性寡醣中之任一者為人類ABO血型系統之抗原。 20.如實施方式1至16及19中任一項之細胞，其中所有該等中性寡醣為人類ABO血型系統之抗原。 21.一種藉由細胞製造至少三種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物的方法，該方法包含以下步驟： i）提供一種細胞，該細胞（a）表現為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶，且能夠合成該核苷酸-糖GDP-岩藻糖，及（b）表現至少一種額外醣基轉移酶，及（c）能夠合成至少一種或多種核苷酸-糖，其中該（等）核苷酸-糖為用於該等額外醣基轉移酶之供體，及 ii）在容許表現該等醣基轉移酶及合成該等核苷酸-糖之條件下培養該細胞，及 iii）較佳地，自該培養分離該等中性寡醣中之至少一者。 22.如實施方式21之方法，其中該細胞為如實施方式1至20中任一項之經代謝工程改造之細胞。 23.如實施方式21至22中任一項之方法，其中該寡醣混合物包含至少三種在聚合度方面不同之不同寡醣。 24.如實施方式21至23中任一項之方法，其中該細胞製造四種或更多種不同中性岩藻糖基化寡醣。 25.如實施方式21至24中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者係選自包含以下者之清單：岩藻糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶。 26.如實施方式21至25中任一項之方法，其中該細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾。 27.如實施方式21至26中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為岩藻糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）。 28.如實施方式21至27中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。 29.如實施方式21至28中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為半乳糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-半乳糖（UDP-Gal）。 30.如實施方式21至29中任一項之方法，其中該等核苷酸-糖中之任一者係選自包含以下者之清單：GDP-Fuc、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、GDP-鼠李糖、UDP-木糖。 31.如實施方式21至30中任一項之方法，其中該等中性岩藻糖基化寡醣中之至少一者經半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。 32.如實施方式21至31中任一項之方法，其中除該等三種中性岩藻糖基化寡醣以外，該寡醣混合物亦包含至少一種中性非岩藻糖基化寡醣。 33.如實施方式21至32中任一項之方法，其中該中性寡醣混合物包含至少一種寡醣，該至少一種寡醣經岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。 34.如實施方式21至33中任一項之方法，其中該細胞使用至少一種用於合成該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，較佳地，該細胞使用兩種或更多種用於合成該等寡醣中之任一者或多者的前驅物。 35.如實施方式21至34中任一項之方法，其中該細胞製造用於合成該等中性寡醣中之任一者的前驅物。 36.如實施方式21至35中任一項之方法，其中該等中性寡醣中之任一者為哺乳動物乳寡醣。 37.如實施方式21至36中任一項之方法，其中所有該等中性寡醣為哺乳動物乳寡醣。 38.如實施方式21至35中任一項之方法，其中該等中性寡醣中之任一者為人類ABO血型系統之抗原。 39.如實施方式21至35及38中任一項之方法，其中所有該等中性寡醣為人類ABO血型系統之抗原。 40.如實施方式21至39中任一項之方法，其中用於合成該等中性寡醣中之任一者的該前驅物完全轉化為該等中性寡醣中之任一者。 41.如實施方式21至40中任一項之方法，其中該分離包含以下步驟中之至少一者：澄清、超過濾、奈米過濾、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、切向流高效能過濾、切向流超過濾、親和層析、離子交換層析、疏水相互作用層析及/或凝膠過濾、配位體交換層析。 42.如實施方式21至41中任一項之方法，其進一步包含自該細胞純化該等中性寡醣中之任一者。 43.如實施方式21至42中任一項之方法，其中該純化包含以下步驟中之至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、奈米過濾、超過濾或離子交換、使用醇、使用含水醇混合物、結晶、蒸發、沈澱、乾燥、噴霧乾燥或凍乾。 44.如實施方式1至20中任一項之細胞或如實施方式21至43中任一項之方法，其中該細胞係選自由微生物、植物或動物細胞組成之群，較佳該微生物為細菌、真菌或酵母菌，較佳該植物為稻、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，較佳該動物為昆蟲、魚類、鳥或非人類哺乳動物，較佳該動物細胞為哺乳動物細胞系。 45.如實施方式1至20及44中任一項之細胞或如實施方式21至44中任一項之方法，其中該細胞為以下者之細胞：細菌，較佳大腸桿菌菌株，更佳為K-12菌株之大腸桿菌菌株，甚至更佳為大腸桿菌MG1655之大腸桿菌K12菌株。 46.如實施方式1至20及44中任一項之細胞或如實施方式21至44中任一項之方法，其中該細胞為酵母細胞。 47.一種如實施方式1至20、44至46中任一項之細胞或如實施方式21至46中任一項之方法的用途，其用於製造至少三種不同中性岩藻糖基化寡醣之混合物。

此外，本發明係關於以下較佳特定實施方式： 1.一種經代謝工程改造之細胞，其製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物，其中該細胞 -經代謝工程改造以用於製造該混合物，及 -表現為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶，及 -能夠合成核苷酸-糖GDP-岩藻糖（GDP-Fuc），及 -表現至少一種額外醣基轉移酶，及 -能夠合成至少一種或多種核苷酸-糖，其中該至少一種或多種核苷酸-糖為用於該額外醣基轉移酶之供體。 2.如較佳實施方式1之細胞，其中該細胞經基因表現模組修飾，其中來自該等表現模組中之任一者之表現為持續型的或藉由天然誘導物產生。 3.如較佳實施方式1或2中任一項之細胞，其中該細胞包含編碼一種蛋白質之相同編碼DNA序列之多個複本。 4.如較佳實施方式1至3中任一項之細胞，其中該寡醣混合物包含至少三種在聚合度方面不同之不同寡醣。 5.如較佳實施方式1至4中任一項之細胞，其中該細胞製造至少五種，較佳至少六種，更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種不同中性岩藻糖基化寡醣。 6.如較佳實施方式1至5中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者係選自包含以下者之清單：岩藻糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶， -較佳地，該岩藻糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， -較佳地，該半乳糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， -較佳地，該葡萄糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， -較佳地，該甘露糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， -較佳地，該N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶， -較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶及β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶。 7.如較佳實施方式1至6中任一項之細胞，其中該細胞能夠表現，較佳表現該等額外醣基轉移酶中之至少兩者，更佳至少三者，甚至更佳至少四者，最佳至少五者。 8.如較佳實施方式1至7中任一項之細胞，其中該細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾。 9.如較佳實施方式1至8中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為岩藻糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）。 10.如較佳實施方式1至9中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。 11.如較佳實施方式1至10中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為半乳糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-半乳糖（UDP-Gal）。 12.如較佳實施方式1至11中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶，且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）。 13.如較佳實施方式1至12中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）。 14.如較佳實施方式1至13中任一項之細胞，其中該等核苷酸-糖中之任一者係選自包含以下者之清單：GDP-Fuc、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-來蘇糖-4-己酮糖、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖。 15.如較佳實施方式1至14中任一項之細胞，其中該細胞表現一或多種選自包含以下者之清單的多肽：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透過酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙醯基半乳糖胺焦磷酸化酶，較佳其中該細胞在該等多肽中之任一者的表現或活性方面經修飾。 16.如較佳實施方式1至15中任一項之細胞，其中該細胞能夠合成至少兩種核苷酸-糖，較佳至少三種核苷酸-糖，更佳至少四種核苷酸-糖，甚至更佳至少五種核苷酸-糖。 17.如較佳實施方式1至16中任一項之細胞，其中該等中性岩藻糖基化寡醣中之至少一者經半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。 18.如較佳實施方式1至17中任一項之細胞，其中除該等四種中性岩藻糖基化寡醣以外，該寡醣混合物亦包含至少一種中性非岩藻糖基化寡醣。 19.如較佳實施方式1至18中任一項之細胞，其中該中性寡醣混合物包含至少一種寡醣，該至少一種寡醣經岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。 20.如較佳實施方式1至19中任一項之細胞，其中該細胞使用至少一種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，較佳地，該細胞使用兩種或更多種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，該（等）前驅物自培養基饋至該細胞。 21.如較佳實施方式1至20中任一項之細胞，其中該細胞製造至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物。 22.如較佳實施方式1至21中任一項之細胞，其中該至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物完全轉化為該等寡醣中之任一者。 23.如較佳實施方式1至22中任一項之細胞，其中該細胞胞內製造該等寡醣，且其中該等所製造之寡醣之一部分或實質上全部保留在胞內，及/或經由被動或主動運輸排出到該細胞外。 24.如較佳實施方式1至23中任一項之細胞，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與在該細胞外分泌來自該混合物之該等中性寡醣中之任一者，較佳地其中該膜蛋白參與自該細胞分泌來自該混合物之所有該等中性寡醣。 25.如較佳實施方式1至24中任一項之細胞，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與吸收用於合成該混合物中之該等中性寡醣中之任一者的前驅物及/或受體，較佳地其中該膜蛋白參與吸收所有所需前驅物，更佳地其中該膜蛋白參與吸收所有該等受體。 26.如較佳實施方式24或25中任一項之細胞，其中該膜蛋白係選自包含以下者之清單：搬運蛋白（porter）、P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白（transporter）、β-桶狀孔蛋白、輔助運輸蛋白（transport protein）、推定運輸蛋白及磷酸轉移驅動之基團移位蛋白，較佳地，該等搬運蛋白包含MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白，較佳地，該等P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白包含ABC運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白。 27.如較佳實施方式24至26中任一項之細胞，其中該膜蛋白提供改良之該等寡醣中之任一者之製造及/或能夠實現及/或增強之該等寡醣中之任一者之流出。 28.如較佳實施方式1至27中任一項之細胞，其中該細胞在乳糖與一或多種其他碳源合併之環境中生長時抵抗乳糖殺滅現象。 29.如較佳實施方式1至28中任一項之細胞，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含用於減少乙酸鹽之產生的修飾。 30.如較佳實施方式29之細胞，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含降低或減少表現及/或消除、減弱、降低或延遲活性之包含以下者之蛋白質中之任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶IIBC組分ptsG、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶（phosphotransferase；PTS）IIBC組分malX、酶IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷氧基轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶　醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸解離酶、乙酸激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯基轉移酶、丙酮酸脫羧酶。 31.如較佳實施方式1至30中任一項之細胞，其中該細胞能夠製造磷酸烯醇丙酮酸鹽（phosphoenolpyruvate；PEP）。 32.如較佳實施方式1至31中任一項之細胞，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞經修飾以用於增強磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）之製造及/或供應。 33.如較佳實施方式1至32中任一項之細胞，其中該等中性寡醣中之任一者為哺乳動物乳寡醣。 34.如較佳實施方式1至33中任一項之細胞，其中所有該等中性寡醣為哺乳動物乳寡醣。 35.如較佳實施方式1至34中任一項之細胞，其中該等中性寡醣中之任一者為人類ABO血型系統之抗原。 36.如較佳實施方式1至33及35中任一項之細胞，其中該等中性寡醣中之三者為人類ABO血型系統之抗原。 37.一種藉由細胞，較佳單一細胞製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物的方法，該方法包含以下步驟： i）提供一種細胞，該細胞（a）能夠表現，較佳表現為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶，且能夠合成該核苷酸-糖GDP-岩藻糖，及（b）表現至少一種額外醣基轉移酶，及（c）能夠合成至少一種或多種核苷酸-糖，其中該（等）核苷酸-糖為用於該等額外醣基轉移酶之供體，及 ii）在容許表現該等醣基轉移酶及合成該等核苷酸-糖之條件下培養該細胞，使得該細胞製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之該中性混合物，及 iii）較佳地，自該培養分離該等中性寡醣中之至少一者，更佳地，自該培養分離所有該等中性寡醣。 38.如較佳實施方式37之方法，其中該細胞為如較佳實施方式1至36中任一項之經代謝工程改造之細胞。 39.如較佳實施方式38之方法，其中該細胞經基因表現模組修飾，其中來自該等表現模組中之任一者的表現為持續型的或藉由天然誘導物產生。 40.如較佳實施方式38或39中任一項之方法，其中該細胞包含編碼一種蛋白質之相同編碼DNA序列之多個複本。 41.如較佳實施方式37至40中任一項之方法，其中該寡醣混合物包含至少三種在聚合度方面不同之不同寡醣。 42.如較佳實施方式37至41中任一項之方法，其中該細胞製造至少五種，較佳至少六種，更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種不同中性岩藻糖基化寡醣。 43.如較佳實施方式37至42中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者係選自包含以下者之清單：岩藻糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶， -較佳地，該岩藻糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， -較佳地，該半乳糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， -較佳地，該葡萄糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， -較佳地，該甘露糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， -較佳地，該N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶， -較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶及β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶。 44.如較佳實施方式37至43中任一項之方法，其中該細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾。 45.如較佳實施方式37至44中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為岩藻糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）。 46.如較佳實施方式37至45中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。 47.如較佳實施方式37至46中任一項之方法，其中該額外醣基轉移酶中之任一者為半乳糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-半乳糖（UDP-Gal）。 48.如較佳實施方式37至47中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶，且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）。 49.如較佳實施方式37至48中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）。 50.如較佳實施方式37至49中任一項之方法，其中該等核苷酸-糖中之任一者係選自包含以下者之清單：GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-來蘇糖-4-己酮糖、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖。 51.如較佳實施方式37至50中任一項之方法，其中該細胞表現一或多種選自包含以下者之清單的多肽：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透過酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙醯基半乳糖胺焦磷酸化酶，較佳其中該細胞在該等多肽中之任一者的表現或活性方面經修飾。 52.如較佳實施方式37至51中任一項之方法，其中該細胞能夠合成至少兩種核苷酸-糖，較佳至少三種核苷酸-糖，更佳至少四種核苷酸-糖，甚至更佳至少五種核苷酸-糖。 53.如較佳實施方式37至52中任一項之方法，其中該等中性岩藻糖基化寡醣中之至少一者經半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。 54.如較佳實施方式37至53中任一項之方法，其中除該等四種中性岩藻糖基化寡醣以外，該寡醣混合物亦包含至少一種中性非岩藻糖基化寡醣。 55.如較佳實施方式37至54中任一項之方法，其中該中性寡醣混合物包含至少一種寡醣，該至少一種寡醣經岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。 56.如較佳實施方式37至55中任一項之方法，其中該細胞使用至少一種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，較佳地，該細胞使用兩種或更多種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，該（等）前驅物自培養基饋至該細胞。 57.如較佳實施方式37至56中任一項之方法，其中該細胞製造至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物。 58.如較佳實施方式37至57中任一項之方法，其中該至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物完全轉化為該等寡醣中之任一者。 59.如較佳實施方式37至58中任一項之方法，其中該細胞胞內製造該等寡醣，且其中該等所製造之寡醣之一部分或實質上全部保留在胞內，及/或經由被動或主動運輸排出到該細胞外。 60.如較佳實施方式37至59中任一項之方法，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與在該細胞外分泌來自該混合物之該等中性寡醣中之任一者，較佳地其中該膜蛋白參與自該細胞分泌來自該混合物之所有該等中性寡醣。 61.如較佳實施方式37至60中任一項之方法，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與吸收用於合成該混合物中之該等中性寡醣中之任一者的前驅物及/或受體，較佳地其中該膜蛋白參與吸收所有所需前驅物，更佳地其中該膜蛋白參與吸收所有該等受體。 62.如較佳實施方式60或61中任一項之方法，其中該膜蛋白係選自包含以下者之清單：搬運蛋白、P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白、β-桶狀孔蛋白、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白及磷酸轉移驅動之基團移位蛋白，較佳地，該等搬運蛋白包含MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白，較佳地，該等P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白包含ABC運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白。 63.如較佳實施方式60至62中任一項之方法，其中該膜蛋白提供改良之該等寡醣中之任一者之製造及/或能夠實現及/或增強之該等寡醣中之任一者之流出。 64.如較佳實施方式37至63中任一項之方法，其中該細胞在乳糖與一或多種其他碳源合併之環境中生長時抵抗乳糖殺滅現象。 65.如較佳實施方式37至64中任一項之方法，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含用於減少乙酸鹽之產生的修飾。 66.如較佳實施方式65之方法，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含降低或減少表現及/或消除、減弱、降低或延遲活性之包含以下者之蛋白質中之任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶IIBC組分ptsG、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶（PTS）IIBC組分malX、酶IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷氧基轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶　醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸解離酶、乙酸激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯基轉移酶、丙酮酸脫羧酶。 67.如較佳實施方式37至66中任一項之方法，其中該細胞能夠製造磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）。 68.如較佳實施方式37至67中任一項之方法，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞經修飾以用於增強磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）之製造及/或供應。 69.如較佳實施方式37至68中任一項之方法，其中該等中性寡醣中之任一者為哺乳動物乳寡醣。 70.如較佳實施方式37至69中任一項之方法，其中所有該等中性寡醣為哺乳動物乳寡醣。 71.如較佳實施方式37至69中任一項之方法，其中該等中性寡醣中之任一者為人類ABO血型系統之抗原。 72.如較佳實施方式37至69及71中任一項之方法，其中該等中性寡醣中之三者為人類ABO血型系統之抗原。 73.如較佳實施方式37至72中任一項之方法，其中該等條件包含： -使用包含至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物及/或受體之培養基，及/或 -向該培養基添加至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物及/或受體進料。 74.如較佳實施方式37至73中任一項之方法，該方法包含以下步驟中之至少一者： i）使用包含至少一種前驅物及/或受體之培養基； ii）在反應器中向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii）在反應器中向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍；且其中較佳地，該前驅物及/或受體進料之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該前驅物及/或受體進料之溫度保持在20℃與80℃之間； iv）歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料； v)歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在最終培養中產生濃度為至少50 g/L，較佳至少75 g/L，更佳至少90 g/L，更佳至少100 g/L，更佳至少125 g/L，更佳至少150 g/L，更佳至少175 g/L，更佳至少200 g/L之該等寡醣中之任一者。 75.如較佳實施方式37至73中任一項之方法，該方法包含以下步驟中之至少一者： i）使用包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的培養基，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內； ii）向該培養基添加包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii）向該培養基添加包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，且其中較佳地，該乳糖進料之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該乳糖進料之溫度保持在20℃與80℃之間； iv）歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加乳糖進料； v）歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加乳糖進料，且其中該乳糖進料溶液之濃度為50 g/L，較佳75 g/L，更佳100 g/L，更佳125 g/L，更佳150 g/L，更佳175 g/L，更佳200 g/L，更佳225 g/L，更佳250 g/L，更佳275 g/L，更佳300 g/L，更佳325 g/L，更佳350 g/L，更佳375 g/L，更佳400 g/L，更佳450 g/L，更佳500 g/L，甚至更佳550 g/L，最佳600 g/L，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在最終培養中產生濃度為至少50 g/L，較佳至少75 g/L，更佳至少90 g/L，更佳至少100 g/L，更佳至少125 g/L，更佳至少150 g/L，更佳至少175 g/L，更佳至少200 g/L之該等寡醣中之任一者。 76.如較佳實施方式75之方法，其中該乳糖進料係藉由自該培養開始以至少5 mM之濃度，較佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150 mM之濃度，更佳以＞ 300 mM之濃度添加乳糖來實現。 77.如較佳實施方式75或76中任一項之方法，其中該乳糖進料係藉由以一濃度向該培養中添加乳糖來實現，該濃度使得在該培養之整個製造階段中獲得至少5 mM，較佳10 mM或30 mM之乳糖濃度。 78.如較佳實施方式37至77中任一項之方法，其中宿主細胞經培養至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。 79.如較佳實施方式37至78中任一項之方法，其中該細胞培養於包含碳源之培養基中，該碳源包含單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇、甘油、包括糖蜜、玉米浸液、蛋白腖、胰腖或酵母萃取物之複合培養基中；較佳地，其中該碳源係選自包含以下者之清單：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、繭蜜糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖漿、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽及丙酮酸鹽。 80.如較佳實施方式37至79中任一項之方法，其中該培養基含有至少一種選自包含以下者之群的前驅物：乳糖、半乳糖、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖（lacto-N-biose；LNB）、N-乙醯基乳糖胺（LacNAc）。 81.如較佳實施方式37至80中任一項之方法，其中指數式細胞生長之第一階段係藉由在將該前驅物，較佳乳糖在第二階段中添加至該培養基之前將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至該培養基中來提供。 82.如較佳實施方式37至81中任一項之方法，其中指數式細胞生長之第一階段係藉由將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驅物，較佳乳糖之該培養基中來提供，之後為其中僅將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至該培養基之第二階段。 83.如較佳實施方式37至82中任一項之方法，其中指數式細胞生長之第一階段係藉由將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驅物，較佳乳糖之該培養基中來提供，之後為其中將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖，及前驅物，較佳乳糖添加至該培養基之第二階段。 84.如較佳實施方式37至83中任一項之方法，其中該分離包含以下步驟中之至少一者：澄清、超過濾、奈米過濾、二相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、用非離子界面活性劑處理、酶消化、切向流高效能過濾、切向流超過濾、親和層析、離子交換層析、疏水性相互作用層析及/或凝膠過濾、配位體交換層析。 85.如較佳實施方式37至84中任一項之方法，其進一步包含自該細胞純化該等中性寡醣中之任一者。 86.如較佳實施方式85之方法，其中該純化包含以下步驟中之至少一者：使用活性炭或碳；使用木炭、奈米過濾、超過濾、電泳、酶處理或離子交換；使用醇；使用水醇混合物；結晶；蒸發；沈澱；乾燥，噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥（band drying）、帶式乾燥（belt drying）、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥。 87.如較佳實施方式1至36中任一項之細胞或如較佳實施方式37至86中任一項之方法，其中該細胞為細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、動物細胞或原蟲細胞， -較佳地，該細菌為大腸桿菌（ Escherichia coli）菌株，更佳為K-12菌株之大腸桿菌菌株，甚至更佳大腸桿菌K-12菌株為大腸桿菌MG1655， -較佳地，該真菌屬於選自包含以下者之群的屬：根黴菌屬（ Rhizopus）、網柄菌屬（ Dictyostelium）、青黴菌屬（ Penicillium）、白黴菌屬（ Mucor）或麴菌屬（ Aspergillus）， -較佳地，該酵母菌屬於選自包含以下者之群的屬：酵母菌屬（ Saccharomyces）、接合酵母屬（ Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（ Pichia）、駒形氏酵母屬（ Komagataella）、漢森酵母屬（ Hansenula）、亞羅酵母屬（ Yarrowia）、斯塔莫酵母屬（ Starmerella）、克魯維酵母屬（ Kluyveromyces）或德巴利酵母屬（ Debaromyces）， -較佳地，該植物細胞為藻類細胞或衍生自菸草、苜蓿、稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物， -較佳地，該動物細胞衍生自非人類哺乳動物、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬行動物、兩棲動物或昆蟲，或為衍生自不包括胚胎幹細胞之人類細胞的經遺傳修飾之細胞系，更佳地該人類及非人類哺乳動物細胞為上皮細胞、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary；CHO）細胞、鼠類骨髓瘤細胞、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，更佳地該昆蟲細胞衍生自斜紋夜盜蟲（ Spodoptera frugiperda）、家蠶（ Bombyx mori）、甘藍夜蛾（ Mamestra brassicae）、粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni）或黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）， -較佳地，該原蟲細胞為蜥蜴利什曼原蟲（ Leishmania tarentolae）細胞。 88.如較佳實施方式87之細胞或如較佳實施方式87之方法，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞為存活的革蘭氏陰性細菌（Gram-negative bacterium），該細菌包含減少或消除合成之聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG）、腸內菌共同抗原（Enterobacterial Common Antigen；ECA）、纖維素、可拉酸、核寡醣、滲透調節周質葡聚糖（Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或繭蜜糖。 89.一種如較佳實施方式1至36、87、88中任一項之細胞或如較佳實施方式37至88中任一項之方法的用途，其用於製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物。

本發明將在實施例中更詳細地描述。

以下實施例將充當本發明之進一步說明及闡明，且並不意欲為限制性的。 實施例 實施例 1. 大腸桿菌之物質及方法 培養基

魯利亞培養液（Luria Broth；LB）培養基係由1%胰腖（Difco，比利時埃倫博德海姆（Erembodegem, Belgium））、0.5%酵母萃取物（Difco）及0.5%氯化鈉（VWR，比利時魯汶（Leuven, Belgium））組成。培養實驗中使用的96孔盤中或搖瓶中的基本培養基含有2.00 g/L NH4Cl、5.00 g/L (NH4)2SO4、2.993 g/L KH2PO4、7.315 g/L K2HPO4、8.372 g/L MOPS、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO4.7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1 ml/L維生素溶液、100 µl/L鉬酸鹽溶液及1 mL/L硒溶液。如各別實施例中所指定，將20 g/L乳糖、20 g/L LacNAc及/或20 g/L LNB作為前驅物另外添加至培養基中。使用1M KOH將基本培養基設定為pH 7。維生素溶液係由3.6 g/L FeCl2.4H2O、5 g/L CaCl2.2H2O、1.3 g/L MnCl2.2H2O、0.38 g/L CuCl2.2H2O、0.5 g/L CoCl2.6H2O、0.94 g/L ZnCl2、0.0311 g/L H3BO4、0.4 g/L Na2EDTA.2H2O及1.01 g/L硫胺.HCl組成。鉬酸鹽溶液含有0.967 g/L NaMoO4.2H2O。硒溶液含有42 g/L Seo2。

用於醱酵之基本培養基含有6.75 g/L NH4Cl、1.25 g/L (NH4)2SO4、2.93 g/L KH2PO4及7.31 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L MgSO4.7H2O、30 g/L蔗糖或30 g/L甘油、1 mL/L維生素溶液、100 µL/L鉬酸鹽溶液及1 mL/L硒溶液，具有與如上文所描述之相同組成。如各別實施例中所指定，將20 g/L乳糖、20 g/L LacNAc及/或20 g/L LNB另外添加至培養基中。

藉由高壓處理（121℃，21分鐘）對複合培養基進行滅菌及藉由過濾（0.22 µm Sartorius）對基本培養基進行滅菌。必要時，藉由添加以下抗生素使培養基具有選擇性：例如氯黴素（20 mg/L）、卡本西林（carbenicillin）（100 mg/L）、觀黴素（40 mg/L）及/或康黴素（50 mg/L）。質體

pKD46（紅色輔助質體，安比西林（Ampicillin）抗性）、pKD3（含有FRT側接氯黴素抗性（cat）基因）、pKD4（含有FRT側接康黴素抗性（kan）基因）及pCP20（表現FLP重組酶活性）質體係獲自教授R. Cunin（Vrije Universiteit Brussel，比利時，於2007）。將質體保持在購自Invitrogen之宿主大腸桿菌DH5α（F ^-、phi80d lacZΔM15、Δ( lacZYA- argF) U169、 deoR、 recA1、 endA1、hsdR17(rk ^-, mk ⁺)、 phoA、 supE44、λ ^-、 thi-1、 gyrA96、 relA1）中。 菌株及突變

大腸桿菌K12 MG1655[λ ^-、F ^-、rph-1]係於2007年3月獲自大腸桿菌基因儲備中心（美國），CGSC菌株編號：7740。基因破壞、基因引入及基因置換係使用Datsenko及Wanner（PNAS 97 (2000), 6640-6645）公開之技術進行。此技術係基於藉由λ紅重組酶進行同源重組之後的抗生素選擇。翻轉酶重組酶之後續催化確保在最終產生菌株中移除抗生素選擇卡匣。攜有紅色輔助質體pKD46之轉型體在30℃下在10 mL具有安比西林（100 mg/L）及L-阿拉伯糖（10 mM）之LB培養基中生長至OD ₆₀₀nm為0.6。藉由第一次用50 mL冰冷水且第二次用1 mL冰冷水洗滌細胞使其為電感受態。接著，將細胞再懸浮於50 µL冰冷水中。用50 µL細胞及10-100 ng線性雙股DNA產物，藉由使用Gene Pulser™（BioRad）（600 Ω，25 µFD及250伏）進行電穿孔。在電穿孔之後，將細胞添加至1 mL之在37℃下培育1 h之LB培養基中，且最後擴散至含有25 mg/L氯黴素或50 mg/L康黴素之LB瓊脂上以選擇抗生素抗性轉型體。藉由PCR用在經修飾區上游及下游之引子驗證所選突變體，且在42℃下使其生長於LB瓊脂中以使輔助質體損失。測試突變體之安比西林敏感性。藉由PCR使用pKD3、pKD4及其衍生物作為模板獲得線性ds-DNA擴增子。所用引子具有與模板互補之序列的一部分且與染色體DNA上必須發生重組之側互補之另一部分。對於基因體基因剔除，同源區經設計在相關基因之起始及終止密碼子上游50-nt及下游50-nt。對於基因體基因嵌入，必須考慮轉錄起始點（+1）。PCR產物經PCR純化，經Dpnl消化，自瓊脂糖凝膠再純化，且懸浮於溶離緩衝液（5 mM Tris，pH 8.0）中。用pCP20質體轉型所選突變體，該質體為安比西林及氯黴素抗性質體，顯示FLP合成之溫度敏感性複製及熱誘導。在30℃下選擇安比西林抗性轉型體，其後在42℃下在LB中純化少數菌落，且接著測試所有抗生素抗性及FLP輔助質體的損失。用對照引子檢查基因剔除及基因嵌入。

在GDP-岩藻糖產生之一實施方式中，突變菌株衍生自大腸桿菌K12 MG1655，該大腸桿菌包含大腸桿菌 wcaJ及 thyA基因之基因剔除及持續型轉錄單元之基因體基因嵌入，該等持續型轉錄單元含有如例如具有SEQ ID NO 01之大腸桿菌W之CscB的蔗糖運輸蛋白、如例如源自具有SEQ ID NO 02之運動醱酵單胞菌（ Zymomonas mobilis）之Frk的果糖激酶及如例如源自具有SEQ ID NO 03之青春雙歧桿菌（ Bifidobacterium adolescentis）之BaSP的蔗糖磷酸化酶。對於岩藻糖基化寡醣之產生，突變GDP-岩藻糖產生菌株另外經表現質體修飾，該等表現質體包含α-1,2-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元，如例如具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌（ H. pylori）之HpFutC；及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元，如例如具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌之HpFucT，且經用於選擇性標記之持續型轉錄單元，如例如具有SEQ ID NO 07之大腸桿菌thyA修飾。岩藻糖基轉移酶基因之持續型轉錄單元亦可經由基因體基因嵌入存在於突變大腸桿菌菌株中。如WO2016075243及WO2012007481中所描述，GDP-岩藻糖產生可進一步藉由包含 glgC、 agp、 pfkA、 pfkB、 pgi、 arcA、 iclR、 pgi及 lon之大腸桿菌基因之基因體基因剔除在突變大腸桿菌菌株中最佳化。GDP-岩藻糖產生可另外經最佳化，包含甘露糖-6-磷酸異構酶（如例如具有SEQ ID NO 08之大腸桿菌之manA）、磷酸甘露糖變位酶（如例如具有SEQ ID NO 09之大腸桿菌之manB）、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶（如例如具有SEQ ID NO 10之大腸桿菌之manC）、GDP-甘露糖4,6-脫水酶（如例如具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之gmd）及GDP-L-岩藻糖合酶（如例如具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之fcl）的持續型轉錄單元之基因體基因嵌入。GDP-岩藻糖產生亦可藉由大腸桿菌 fucK及 fucI基因之基因體基因剔除及持續型轉錄單元之基因體基因嵌入獲得，該等持續型轉錄單元含有岩藻糖透過酶，如例如具有SEQ ID NO 13之大腸桿菌之fucP，及雙功能性岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶，如例如來自具有SEQ NO ID 14之脆弱類桿菌之fkp。若產生GDP-岩藻糖之突變菌株意欲製備岩藻糖基化乳糖結構，則菌株另外經大腸桿菌 LacZ、 LacY及 LacA基因之基因體基因剔除及經乳糖透過酶（如例如具有SEQ ID NO 15之大腸桿菌LacY）之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾。

替代地，及/或另外，產生GDP-岩藻糖及/或岩藻糖基化結構可在具有持續型轉錄單元之基因體基因嵌入之突變大腸桿菌菌株中進一步經最佳化，該持續型轉錄單元包含膜運輸蛋白，如例如來自莫金斯克羅諾桿菌之MdfA（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、來自楊氏檸檬酸桿菌之MdfA（UniProt ID D4BC23）、來自大腸桿菌之MdfA（UniProt ID P0AEY8）、來自雷金斯堡約克氏菌之MdfA（UniProt ID G9Z5F4）、來自大腸桿菌之iceT（UniProt ID A0A024L207）或來自楊氏檸檬酸桿菌之iceT（UniProt ID D4B8A6）。

在產生LN3（GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及源自其之包含乳- N-四糖（LNT）及乳- N-新四糖（LNnT）之寡醣的一實施方式中，突變菌株衍生自大腸桿菌K12 MG1655且經大腸桿菌 LacZ及 nagB基因之基因剔除修飾，且經如例如具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾。對於LNT或LNnT產生，突變菌株進一步經可經由基因體基因嵌入或自表現質體遞送至菌株之以下者之持續型轉錄單元分別修飾：如例如具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖苷基轉移酶或具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtB的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。視情況，半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶及/或N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶基因之多個複本可添加至突變大腸桿菌菌株中。此外，LNT及/或LNnT產生可藉由用如例如具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之glmS*54的L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶的持續型轉錄單元之一或多個基因體基因嵌入修飾菌株來改善UDP-GlcNAc產生進行增強。另外，菌株可視情況經修飾以藉由大腸桿菌 ushA、 galT、 ldhA及 agp基因之基因體基因剔除增強UDP-半乳糖產生。突變大腸桿菌菌株亦可視情況經調適具有以下者之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入：如例如具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE的UDP-葡萄糖-4-表異構酶、如例如具有SEQ ID NO 26之大腸桿菌之glmM的磷酸葡萄糖胺變位酶及如例如具有SEQ ID NO 27之大腸桿菌之glmU的N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶。突變菌株亦可視情況適用於經由以下者之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入在蔗糖上生長，該等持續型轉錄單元含有如例如具有SEQ ID NO 01之大腸桿菌W之CscB的蔗糖運輸蛋白、如例如源自具有SEQ ID NO 02之運動醱酵單胞菌之Frk的果糖激酶及如例如源自具有SEQ ID NO 03之青春雙歧桿菌之BaSP的蔗糖磷酸化酶。

替代地及/或另外，產生LN3、LNT、LNnT及其衍生之寡醣可進一步經持續型轉錄單元的基因體基因嵌入在突變大腸桿菌菌株中經最佳化，該持續型轉錄單元包含膜運輸蛋白，如例如來自莫金斯克羅諾桿菌之MdfA（UniProt ID A0A2T7ANQ9）、來自楊氏檸檬酸桿菌之MdfA（UniProt ID D4BC23）、來自大腸桿菌之MdfA（UniProt ID P0AEY8）、來自雷金斯堡約克氏菌之MdfA（UniProt ID G9Z5F4）、來自大腸桿菌之iceT（UniProt ID A0A024L207）或來自楊氏檸檬酸桿菌之iceT（UniProt ID D4B8A6）。

較佳但未必，醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質及/或膜運輸蛋白經N端及/或C端融合至如例如以下者之可溶性強化子標籤：SUMO標籤、MBP標籤、His、FLAG、Strep-II、Halo-標籤、NusA、硫氧還原蛋白、GST及/或Fh8標籤以增強其可溶性（Cost等人, Front. Microbiol. 2014, https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063；Fox等人, Protein Sci. 2001, 10(3), 622-630；Jia及Jeaon, Open Biol. 2016, 6: 160196）。

視情況，突變大腸桿菌菌株經編碼伴隨蛋白，如例如DnaK、DnaJ、GrpE或GroEL/ES伴隨蛋白系統之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入修飾（Baneyx F.、Palumbo J.L. (2003) Improving Heterologous Protein Folding via Molecular Chaperone and Foldase Co-Expression. In: Vaillancourt P.E.(編) E. coliGene Expression Protocols. Methods in Molecular Biology™, 第205卷. Humana Press）。

視情況，突變大腸桿菌菌株經修飾以產生糖基最小化之大腸桿菌菌株，其包含非必需醣基轉移酶基因中之任一者或多者的基因體基因剔除，該等非必需醣基轉移酶基因包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP。

所有持續型啟動子、UTR及終止子序列源自由Mutalik等人（Nat. Methods 2013, 第10期, 354-360）及Cambray等人（Nucleic Acids Res. 2013, 41(9), 5139-5148）描述之庫。所有基因在Twist Bioscience（twistbioscience.com）或IDT（eu.idtdna.com）上以合成方式定序，且使用供應商之工具調適密碼子使用。本發明中所描述之SEQ ID NO概述於表1中。

所有菌株在-80℃下儲存於冷凍小瓶中（隔夜LB培養物以1:1比率與70%甘油混合）。表 1 ：本發明中所描述之SEQ ID NO之概述

SEQ ID NO	名稱 / 標識符	生物體	來源	數位序列資訊之原產國
01	CscB	大腸桿菌W	合成	USA
02	Frk	運動醱酵單胞菌	合成	英國
03	BaSP	青春雙歧桿菌	合成	德國
04	HpFutC	幽門螺旋桿菌UA1234	合成	英國
05	HpFucT	幽門螺旋桿菌UA1234	合成	英國
06	突變HpFucT	幽門螺旋桿菌UA1234	合成	英國
07	thyA	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
08	manA	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
09	manB	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
10	manC	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
11	gmd	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
12	fcl	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
13	fucP	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
14	fkp	脆弱類桿菌	合成	英國
15	LacY	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
16	GNA1	釀酒酵母	合成	美國
17	glmS*54	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
18	LgtA	腦膜炎奈瑟氏菌	合成	英國
19	WbgO	大腸桿菌O55:H7	合成	德國
20	lgtB	腦膜炎奈瑟氏菌MC58	合成	英國
21	galE	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
22	Lac12	乳酸克魯維酵母	合成	美國
23	wbnI	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
24	BgtA	鼬鼠螺旋桿菌	合成	美國
25	突變a1,3/4岩藻糖苷酶	長雙歧桿菌嬰兒亞種	合成	美國
26	glmM	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國
27	glmU	大腸桿菌K-12 MG1655	合成	美國

培養條件

96孔微量滴定盤實驗之預培養始於冷凍小瓶，於150 µL LB中進行，且在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育隔夜。此培養物用作96孔正方形微量滴定盤之接種物，用400 µL基本培養基藉由稀釋400倍。此等最終96孔培養盤接著在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育72小時或更短或更長。為量測培養實驗結束時之糖濃度，藉由使培養液在60℃下沸騰15分鐘，之後使細胞短暫離心而自各孔獲取全培養液樣品（=胞內及胞外糖濃度之平均值）。

生物反應器之預培養始於具有某一菌株之整個1 mL冷凍小瓶，在1 L或2.5 L搖瓶中在250 mL或500 mL基本培養基中接種且在37℃下在定軌振盪器上以200 rpm培育24 h。接著接種5 L生物反應器（250 mL接種物於2 L批料培養基中）；該過程由MFCS控制軟體（Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Germany）控制。培養條件設定為37℃及最大攪拌；壓力氣體流速視菌株及生物反應器而定。使用0.5 M H2S04及20% NH4OH將pH控制在6.8。冷卻廢氣。當醱酵期間起泡升高時，添加10%聚矽氧消泡劑溶液。 光學密度

培養物之細胞密度通常藉由量測600 nm下之光學密度（Implen Nanophotometer NP80, Westburg, Belgium，或用Spark 10M微量盤讀取器，Tecan, Switzerland）來監測。 解析型分析

標準品，諸如（但不限於）蔗糖、乳糖、LacNAc、乳-N-二糖（LNB）、岩藻糖基化LacNAc（2'FLacNAc、3-FLacNAc）、岩藻糖基化LNB（2'FLNB、4'FLNB）、乳-N-丙糖II（LN3）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-新-四糖（LNnT）、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III及LNFP-V係購自Carbosynth（英國）、Elicityl（法國（France））及IsoSep（瑞典（Sweden））。用內部製造之標準品分析其他化合物。

在Waters Acquity H級UPLC上在蒸發光散射偵測器（Evaporative Light Scattering Detector；ELSD）或折射率（Refractive Index；RI）偵測下分析寡醣。在Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱（2.1×100 mm；130 Å；1.7 µm）管柱及Acquity UPLC BEH Amide VanGuard管柱（130 Å，2.1×5 mm）上注射0.7 µL體積之樣品。管柱溫度為50℃。移動相由其中添加0.2%三乙胺之¼水及¾乙腈溶液組成。該方法以0.130 mL/min之流速等度。ELS偵測器具有50℃之偏移管溫度，且N2氣體壓力為50 psi，增益200及資料傳輸率10 pps。RI偵測器之溫度設定為35℃。

對於在質譜儀上之分析，在450℃之去溶劑化溫度、650 L/h之氮氣去溶劑化氣體流速及20 V之錐體電壓下使用具有電子噴霧電離（Electron Spray Ionisation；ESI）之Waters Xevo TQ-MS。對於所有寡醣，MS在選定離子監測（selected ion monitoring；SIM）中在負模式下操作。在具有Thermo Hypercarb管柱（2.1×100 mm；3 µm）之Waters Acquity UPLC上在35℃下進行分離。使用一定梯度，其中溶離劑A為超純水及0.1%甲酸且其中溶離劑B為乙腈及0.1%甲酸。寡醣在55分鐘內使用以下梯度分離：在21分鐘內自2%至12%溶離劑B初始增加，在11分鐘內自12%至40%溶離劑B第二次增加，且在5分鐘內自40%至100%溶離劑B第三次增加。作為洗滌步驟，使用100%溶離劑B持續5分鐘。對於管柱平衡，在1分鐘內恢復2%溶離劑B之初始條件且維持12分鐘。

在Dionex HPAEC系統上用脈衝型電流偵測（pulsed amperometric detection；PAD）分析低濃度（低於50 mg/L）下之糖。在Dionex CarboPac PA200管柱4×250 mm及Dionex CarboPac PA200保護管柱4×50 mm上注射5 µL體積之樣品。管柱溫度設定成30℃。使用一定梯度，其中溶離劑A為去離子水，其中溶離劑B為200 mM氫氧化鈉且其中溶離劑C為500 mM乙酸鈉。寡醣在60分鐘內分離，同時使用以下梯度維持25%之溶離劑B的恆定比率：75%溶離劑A之初始等度步驟維持10分鐘，0%至4%溶離劑C在8分鐘內之初始增加，71%溶離劑A及4%溶離劑C之第二等度步驟維持6分鐘，4%至12%溶離劑C在2.6分鐘內之第二增加，63%溶離劑A及12%溶離劑C之第三等度步驟維持3.4分鐘，及12%至48%溶離劑C在5分鐘內之第三增加。作為洗滌步驟，使用48%溶離劑C持續3分鐘。對於管柱平衡，在1分鐘內恢復75%溶離劑A及0%溶離劑C之初始條件且維持11分鐘。應用之流速為0.5 mL/min。 實施例 2. 釀酒酵母之物質及方法 培養基

在具有完整補充混合物（SD CSM）或CSM省卻（drop-out）（SD CSM-Ura，SD CSM-Trp，SD CSM-His）之合成限定酵母培養基上生長菌株，該培養基含有6.7 g/L之不含胺基酸的酵母氮源基礎（不含AA之YNB，Difco）、20 g/L瓊脂（Difco）（固體培養物）、22 g/L葡萄糖單水合物或20 g/L乳糖及0.79 g/L CSM或0.77 g/L CSM-Ura、0.77 g/L CSM-Trp或0.77 g/L CSM-His（MP Biomedicals）。菌株

使用由Brachmann等人（Yeast (1998) 14:115-32）產生之釀酒酵母BY4742，可獲自Euroscarf培養物收集。所有突變菌株藉由使用Gietz方法（Yeast 11:355-360, 1995）之同源重組或質體轉型產生。質體

在產生GDP-岩藻糖之一實施方式中，酵母表現質體p2a_2µ_Fuc（Chan 2013, Plasmid 70, 2-17）用於釀酒酵母中之外來基因之表現。此質體含有安比西林抗性基因及細菌複製起點以允許在大腸桿菌中進行選擇及維持，以及用於在酵母中進行選擇及維持之2µ酵母ori及Ura3選擇標記。此質體另外含有用於以下者之持續型轉錄單元：如例如具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12的乳糖透過酶、如例如具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之gmd的GDP-甘露糖4,6-脫水酶及如例如具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之fcl的GDP-L-岩藻糖合酶。在另一實施方式中，酵母表現質體p2a_2µ_Fuc2可用作p2a_2µ_Fuc質體之替代表現質體，該質體包含緊接於安比西林抗性基因、細菌ori、2µ酵母ori及Ura3選擇標記之用於以下者之持續型轉錄單元：如例如具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12的乳糖滲透酶、如例如具有SEQ ID NO 13之大腸桿菌之fucP的岩藻糖透過酶及如例如來自具有SEQ NO ID 14之脆弱類桿菌之fkp的雙功能性岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶。為進一步產生岩藻糖基化寡醣，p2a_2µ_Fuc及其變異體p2a_2µ_Fuc2另外含有用於以下者之持續型轉錄單元，如例如具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之HpFutC的α-1,2-岩藻糖基轉移酶，及/或如例如具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌之HpFucT的α-1,3-岩藻糖基轉移酶。

在產生UDP-半乳糖之一實施方式中，酵母表現質體衍生自pRS420-質體系列（Christianson等人, 1992, Gene 110: 119-122），其含有HIS3選擇標記及用於如例如具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE的UDP-葡萄糖-4-表異構酶的持續型轉錄單元。為產生LN3，此質體進一步經用於以下者之持續型轉錄單元修飾：如例如具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12的乳糖滲透酶及如例如具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之lgtA的半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶。為產生如LNT或LNnT之LN3衍生之寡醣，質體進一步分別經用於以下者之持續型轉錄單元修飾：如例如具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶或及如例如具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之lgtB的N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶。

較佳但未必，醣基轉移酶、參與核苷酸活化糖合成之蛋白質及/或膜運輸蛋白中之任一者或多者經N端及/或C端融合至SUMOstar標籤（例如獲自pYSUMOstar, Life Sensors, Malvern, PA）以增強其可溶性。

視情況，突變酵母菌菌株用編碼伴隨蛋白之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾，該伴隨蛋白如例如Hsp31、Hsp32、Hsp33、Sno4、Kar2、Ssb1、Sse1、Sse2、Ssa1、Ssa2、Ssa3、Ssa4、Ssb2、Ecm10、Ssc1、Ssq1、Ssz1、Lhs1、Hsp82、Hsc82、Hsp78、Hsp104、Tcp1、Cct4、Cct8、Cct2、Cct3、Cct5、Cct6或Cct7（Gong等人, 2009, Mol. Syst. Biol. 5: 275）。

將質體保持在購自Invitrogen之宿主大腸桿菌DH5α（F ^-、phi80d lacZδM15、δ( lacZYA- argF)U169、 deoR、 recA1、 endA1、hsdR17(rk ^-、mk ⁺)、 phoA、 supE44、λ ^-、 thi-1、 gyrA96、 relA1）中。 異源及同源表現

需要表現之基因，無論其來自質體或來自基因體，均以合成方式經以下公司中之一者合成：DNA2.0、Gen9、IDT或Twist Bioscience。可藉由使密碼子使用最佳化為表現宿主之密碼子使用來進一步促進表現。使用供應商之工具使基因最佳化。 培養條件

一般而言，酵母菌株最初在SD CSM盤上生長以獲得單一菌落。使此等盤在30℃下生長2-3天。始於單一菌落，使預培養物在30℃下在5 mL下生長隔夜，在200 rpm下振盪。後續之125 mL搖瓶實驗在25 mL培養基中以此預培養物之2%接種。在30℃下在200 rpm之定軌振盪下培育此等搖瓶。 基因表現啟動子

使用合成持續型啟動子表現基因，如藉由Blazeck所描述（Biotechnology and Bioengineering,第109卷,第11號, 2012）。 實施例 3. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2 ' FLacNAc 、 3-FLacNAc 及二 -FLacNAc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述之經修飾以用於製造GDP-岩藻糖之大腸桿菌菌株進一步用具有兩種持續型轉錄單元之表現質體轉型，該等單元表現具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌α-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌α-1,3-岩藻糖基轉移酶。由於乳糖及N-乙醯基乳糖胺（LacNAc，Gal-b1,4-GlcNAc）為幽門螺旋桿菌岩藻糖基轉移酶兩者之適合受體，因此在生長實驗中根據實施例1中提供之培養條件，針對在全培養液樣品中產生包含2'FL、3-FL及岩藻糖基化LacNAc（亦即2'FLacNAc及3-FLacNAc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LacNAc作為前驅物。因為具有SEQ ID NO 04之酶亦顯示2'FL上之岩藻糖基轉移酶活性且具有SEQ ID NO 05之酶亦顯示2'FLacNAc上之岩藻糖基轉移酶活性，因此亦針對產生該寡醣混合物中之DiFL及二-FLacNAc評估新穎菌株。 實施例 4. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2 ' FLacNAc 、 3-FLacNAc 及二 -FLacNAc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於產生GDP-岩藻糖之大腸桿菌菌株進一步經調適以用於藉由以下者進行胞內乳糖合成： lacZ、 glk及 galETKM操縱子之基因體基因剔除以及用於具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之lgtB及具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之UDP-葡萄糖4-表異構酶（galE）的持續型轉錄單元的基因體基因嵌入。在下一步驟中，突變大腸桿菌菌株經具有兩種持續型轉錄單元之表現質體轉型，該等持續型轉錄單元用以表現具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌α-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌α-1,3-岩藻糖基轉移酶。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、二-FL及岩藻糖基化N-乙醯基乳糖胺（亦即2'FLacNAc、3-FLacNAc及二-FLacNAc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且LNB作為前驅物。 實施例 5. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2 ' FLacNAc 、 3-FLacNAc 及二 -FLacNAc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經最佳化以用於GDP-岩藻糖產生之大腸桿菌K-12 MG1655菌株用大腸桿菌N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶（ nagA）基因及大腸桿菌葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶（ nagB）基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入進一步修飾以用於製造GlcNAc及LacNAc：具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌的N-乙醯基葡萄糖胺β1,4-半乳糖基轉移酶（lgtB）、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌的突變體L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶（glmS*54）及具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母之葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（GNA1）。在下一步驟中，新穎菌株另外用兩種相容表現質體轉型，其中第一質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌α-1,2-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元，且第二相容質體含有具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌α-1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。替代地，新穎菌株可用一種含有具有SEQ ID NO 04及05之幽門螺旋桿菌岩藻糖基轉移酶兩者之持續型轉錄單元的表現質體轉型。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-岩藻糖基化LacNAc（2'FLacNAc）、3-岩藻糖基化LacNAc（3-FLacNAc）及二-岩藻糖基化LacNAc（二-FLacNAc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 6. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2'FLNB 、 4-FLNB 及二 -FLNB 之寡醣混合物

如實施例1中所描述之經修飾以用於製造GDP-岩藻糖之大腸桿菌菌株進一步用具有兩種持續型轉錄單元之表現質體轉型，該等單元表現具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌α-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌α-1,3-岩藻糖基轉移酶。由於乳糖及乳-N-二糖（LNB，Gal-b1,3-GlcNAc）為幽門螺旋桿菌岩藻糖基轉移酶兩者之適合受體，因此在生長實驗中根據實施例1中提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL及岩藻糖基化LNB（亦即2'FLNB、4-FLNB及二-岩藻糖基化LNB（二-FLNB））之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LNB作為前驅物。 實施例 7. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2'FLNB 、 4-FLNB 及二 -FLNB 之寡醣混合物

在另一生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、二-FL及岩藻糖基化LNB（亦即2'FLNB、4-FLNB及二-岩藻糖基化LNB（二-FLNB））之寡醣混合物評估經修飾以用於製造如實施例4中所述之2'FL、3-FL及DiFL之大腸桿菌菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且LNB作為前驅物。 實施例 8. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2'FLNB 、 4-FLNB 及二 -FLNB 之寡醣混合物

如實施例1中所述經最佳化以用於GDP-岩藻糖製造的大腸桿菌K-12 MG1655菌株進一步用大腸桿菌N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶（ nagA）基因及大腸桿菌葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶（ nagB）基因之基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾以用於製造GlcNAc及LNB：具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之N-乙醯基葡萄糖胺β1,3-半乳糖基轉移酶（WbgO）、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54及具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母之GNA1。在下一步驟中，新穎菌株另外用兩種相容表現質體轉型，其中第一質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌α-1,2-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元，且第二相容質體含有具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌α-1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。替代地，新穎菌株可用一種含有具有SEQ ID NO 04及05之幽門螺旋桿菌岩藻糖基轉移酶兩者之持續型轉錄單元的表現質體轉型。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'FLNB、4-FLNB及二-FLNB之寡醣混合物評估所有新穎菌株，其中培養含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 9. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2'FLNB 、 4-FLNB 及二 -FLNB 之寡醣混合物

如實施例4中所描述經修飾以用於製造2'FL、3-FL及DiFL之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入修飾以用於製造GlcNAc及LNB：具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54及具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母之GNA1。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'FLNB、4-FLNB及二-FLNB之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養含有蔗糖作為碳源且無前驅物。 實施例 10. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 2 ' FLNB 及 Gal-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述之經修飾以用於製造GDP-岩藻糖之大腸桿菌菌株用具有以下者之持續型轉錄單元之表現質體轉型：具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 23之大腸桿菌之α-1,3-半乳糖基轉移酶WbnI。由於乳糖及LNB為幽門螺旋桿菌α-1,2-岩藻糖基轉移酶之適合受體且2'FLNB作為大腸桿菌α-1,3-半乳糖基轉移酶之受體，因此在生長實驗中根據實施例1中提供之培養條件，針對製造包含2'FL、DiFL、2'-岩藻糖基化LNB（2'FLNB）及Gal-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LNB作為前驅物。 實施例 11. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 2 ' FLNB 及 Gal-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於製造GDP-岩藻糖之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入修飾以用於製造GlcNAc及LNB：具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54及具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母之GNA1。在下一步驟中，新穎菌株經含有以下者之持續型轉錄單元之表現質體轉型：具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的α-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 23之大腸桿菌的α-1,3-半乳糖基轉移酶WbnI。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對製造包含2'FL、DiFL、2'-岩藻糖基化LNB及Gal-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 12. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 2 ' FLNB 及 GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖產生之大腸桿菌菌株用具有以下者之持續型轉錄單元之表現質體轉型：具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 24之鼬鼠螺旋桿菌之α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶BgtA。由於乳糖及LNB為幽門螺旋桿菌α-1,2-岩藻糖基轉移酶之適合受體且2'FLNB為鼬鼠螺旋桿菌α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶之受體，因此在生長實驗中根據實施例1中提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、DiFL、2'-岩藻糖基化LNB (2'FLNB)及GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LNB作為前驅物。 實施例 13. 使用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 2 ' FLNB 及 GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖產生之大腸桿菌菌株進一步經大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入修飾以用於產生GlcNAc及LNB：具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7的WbgO、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌的突變glmS*54及具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母的GNA1。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的α-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 24之鼬鼠螺旋桿菌的α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶BgtA之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對產生包含2'FL、DiFL、2'-岩藻糖基化LNB及GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 14. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNT 、 LNFP-I 及 Gal-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（LgtA）及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株進一步用含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶的持續型轉錄單元之表現質體與含有具有SEQ ID NO 23之大腸桿菌之α-1,3-半乳糖基轉移酶WbnI的持續型轉錄單元之第二相容表現質體轉型。如實施例23中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造及用於LNFP-I製造之大腸桿菌菌株進一步經轉型。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I（Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及Gal-a1,3-LNFP-I（Gal-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 15. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNT 、 LNFP-I 及 GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（LgtA）及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株進一步用含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶的持續型轉錄單元之表現質體與含有具有SEQ ID NO 24之鼬鼠螺旋桿菌之α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶BgtA的持續型轉錄單元之第二相容表現質體轉型。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中產生包含2'FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I（Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及GalNAc-a1,3-LNFP-I（GalNAc-a1,3-(Fuc-a1,2)-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 16. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNT 及 LNFP-I 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（LgtA）及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株進一步用含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶的持續型轉錄單元之表現質體與含有具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌之a-1,3-岩藻糖基轉移酶（HpFucT）的持續型轉錄單元之第二相容表現質體轉型。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LN3、LNT及LNFP-I（Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 17. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 DiFL 、 LNFP-I 及 LNFP-II 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，為製造乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II, Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc），突變菌株進一步用含有以下者之持續型轉錄單元的表現質體轉型：具有SEQ ID NO 25之長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC 15697之突變a1,3/4岩藻糖苷酶及具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶（HpFutC）。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II，Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)- GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 18. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNT 、 LNFP-I 及 LNFP-II 之寡醣混合物

如實施例17中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造及用於LNFP-II製造之大腸桿菌菌株進一步經含有持續型轉錄單元之相容表現質體轉型，該持續型轉錄單元針對具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌之a-1,3-岩藻糖基轉移酶（HpFucT）。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II，Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 19. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNT 、 LNFP-I 及 LNFP-V 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌的截短a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V，Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 20. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNnT 、 LNFP-III 及 LNFP-VI 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNnT製造：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtB。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌的截短a-1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、乳-N-岩藻五糖III（LNFP-III, Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI，Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3-)Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 21. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

在另一生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I之寡醣混合物評估如實施例16中所描述之大腸桿菌菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LNB驅體。 實施例 22. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

在另一生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、LN3、LNT及LNFP-I之寡醣混合物評估如實施例16中所描述之大腸桿菌菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LacNAc作為前驅物。 實施例 23. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

在另一生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、2'-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I之寡醣混合物評估如實施例16中所描述之大腸桿菌菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖、LacNAc及LNB作為前驅物。 實施例 24. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GFP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母的GNA1、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌的a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 25. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GFP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母的GNA1、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌的a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、2'-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LacNAc作為前驅物。 實施例 26. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

在另一生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI之寡醣混合物評估如實施例20中所描述之大腸桿菌菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LNB作為前驅物。 實施例 27. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

在另一生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI之寡醣混合物評估如實施例20中所描述之大腸桿菌菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LacNAc作為前驅物。 實施例 28. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

在另一生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLacNAc、3-FLacNAc、Di-FLacNAc、2'-FLNB、4-FLNB、Di-FLNB、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI之寡醣混合物評估如實施例20中所描述之大腸桿菌菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖、LacNAc及LNB作為前驅物。 實施例 29. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GFP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA及 nagB基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適：具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母之GNA1、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtB。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌的a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 30. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GFP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母之GNA1、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌的a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 31. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GFP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母之GNA1、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌的a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、2'-FLNB、4-FLNB、二-FLNB、LN3、LNT及LNFP-I之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖及LacNAc作為前驅物。 實施例 32. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含中性非岩藻糖基化及岩藻糖基化寡醣結構之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GFP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 16之釀酒酵母之GNA1、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtB。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌的a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'-FLacNAc、3-FLacNAc、二-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及LNFP-VI之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 33. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 DiFL 、 LNFP-I 及 LNFP-II 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，為製造乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II，Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc），突變菌株進一步用表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 25之長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC 15697之突變a1,3/4岩藻糖苷酶之持續型轉錄單元。在最終步驟中，使突變菌株用相容表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶（HpFutC）的持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II，Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)- GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 34. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LNFP-I 及 LNFP-V 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌的截短a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V，Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 35. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LNFP-III 及 LNFP-VI 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNnT製造：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtB。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌的截短a-1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、乳-N-岩藻五糖III（LNFP-III, Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI，Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3-)Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 36. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 DiFL 、 LNFP-I 及 LNFP-II 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 fucK 、 fucI 、 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 13之大腸桿菌之fucP、具有SEQ ID NO 14之脆弱類桿菌之fkp、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，為製造乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II，Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc），突變菌株進一步用表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 25之長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC 15697之突變a1,3/4岩藻糖苷酶之持續型轉錄單元。在最終步驟中，使突變菌株用相容表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶（HpFutC）的持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II，Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)- GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 37. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LNFP-I 及 LNFP-V 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 fucK 、 fucI 、 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNT製造：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 13之大腸桿菌之fucP、具有SEQ ID NO 14之脆弱類桿菌之fkp、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌的截短a1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及乳-N-岩藻五糖V（LNFP-V，Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 38. 用經修飾之大腸桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LNFP-III 及 LNFP-VI 之寡醣混合物

如實施例1中所描述經修飾以用於GDP-岩藻糖製造之大腸桿菌菌株進一步用大腸桿菌 fucK 、 fucI 、 nagA 、 nagB 、 ushA及 galT基因之基因體基因剔除以及以下者之持續型轉錄單元的基因體基因嵌入調適以用於LN3及LNnT製造：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 13之大腸桿菌之fucP、具有SEQ ID NO 14之脆弱類桿菌之fkp、具有SEQ ID NO 17之大腸桿菌之突變glmS*54、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtB。在下一步驟中，新穎菌株經一表現質體轉型，該表現質體含有具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌的a1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌的截短a-1,3-岩藻糖基轉移酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中根據實施例1中所提供之培養條件，針對在全培養液樣品中製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、乳-N-岩藻五糖III（LNFP-III, Gal-b1,4-(Fuc-a1,3)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI，Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3-)Glc）之寡醣混合物評估新穎菌株，其中培養基含有蔗糖作為碳源且乳糖作為前驅物。 實施例 39. 用經修飾之釀酒酵母宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2'FLNB 及 4-FLNB 之寡醣混合物

如實施例2中所描述用酵母表現質體（p2a_2µ_Fuc之變異體）調適釀酒酵母菌株以用於GDP-岩藻糖製造及岩藻糖基轉移酶表現，該表現質體包含用於以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之乳糖透過酶（LAC12）、具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之GDP-甘露糖4,6-脫水酶（gmd）、具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之GDP-L-岩藻糖合酶（fcl）、具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之α-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 05之幽門螺旋桿菌之α-1,3-岩藻糖基轉移酶。在生長實驗中根據實施例2中所描述之培養條件，使用包含乳糖及LNB作為前驅物之SD CSM-Ura省卻培養基，針對製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'FLNB及4-FLNB之寡醣混合物評估突變酵母菌株。 實施例 40. 用經修飾之釀酒酵母宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 2 ' FLacNAc 、 LN3 、 LNT 及 LNFP-I 之寡醣混合物

如實施例2中所描述用第一酵母表現質體及第二酵母表現質體調適釀酒酵母菌株以用於製造GDP-岩藻糖及LNT及用於表現a-1,2-岩藻糖基轉移酶，該第一酵母表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12、具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之gmd、具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之fcl及具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶；及該第二酵母表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。在生長實驗中根據實施例2所描述中之培養條件使用包含乳糖及LacNAc作為前驅物之SD CSM-Ura-His省卻培養基，針對產生包含2'FL、DiFL、LN3、LNT、乳-N-岩藻五糖I（LNFP-I，Fuc-a1,2-Gal-b1,3-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）及2'FLacNAc之寡醣混合物評估突變酵母菌株。 實施例 41. 用經修飾之釀酒酵母宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 LNB 、 2 ' FLNB 、 LN3 、 LNT 及 LNFP-II 之寡醣混合物

如實施例2中所描述用第一酵母表現質體及第二酵母表現質體調適釀酒酵母菌株以用於製造GDP-岩藻糖及LNT及用於表現a1,3/4-岩藻糖苷酶及a-1,2-岩藻糖基轉移酶，該第一酵母表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12、具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之gmd、具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之fcl、具有SEQ ID NO 25之長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC 15697之突變a1,3/4岩藻糖苷酶及具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶；及該第二酵母表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。當在生長實驗中根據實施例2中所描述之培養條件評估時，使用包含乳糖及N-乙醯基葡萄糖胺作為前驅物之SD CSM-Ura-His省卻培養基，針對產生包含2'FL、DiFL、LNB、2'FLNB、LN3、LNT及乳-N-岩藻五糖II（LNFP-II，Gal-b1,3-(Fuc-a1,4)-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-Glc）之寡醣混合物評估突變酵母菌株。 實施例 42. 用經修飾之釀酒酵母宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LNFP-I 及 LNFP-V 之寡醣混合物

如實施例2中所描述用第一酵母表現質體及第二酵母表現質體調適釀酒酵母菌株以用於製造GDP-岩藻糖及LNT及用於表現a-1,2-岩藻糖基轉移酶及a-1,3-岩藻糖基轉移酶，該第一酵母表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12、具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之gmd、具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之fcl、具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌之截短a1,3-岩藻糖基轉移酶；及該第二酵母表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。當在生長實驗中根據實施例2中所描述之培養條件評估時，使用包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Ura-His省卻培養基，針對製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及LNFP-V之寡醣混合物評估突變酵母菌株。 實施例 43. 用經修飾之釀酒酵母宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LNFP-III 及 LNFP-VI 之寡醣混合物

如實施例2中所描述用第一酵母表現質體及第二酵母表現質體調適釀酒酵母菌株以用於製造GDP-岩藻糖及LNnT及用於表現a-1,2-岩藻糖基轉移酶及a-1,3-岩藻糖基轉移酶，該第一酵母表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12、具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之gmd、具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之fcl、具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶及具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌之截短a1,3-岩藻糖基轉移酶；及該第二酵母表現質體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtB。當在生長實驗中根據實施例2中所描述之培養條件評估時，使用包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Ura-His省卻培養基，針對製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、LNFP-III及乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI，Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3-)Glc）及乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI，Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3-)Glc）之寡醣混合物評估突變酵母菌株。實施例 44.用經修飾之釀酒酵母宿主製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LNFP-I及LNFP-V之寡醣混合物

如實施例2中所描述用酵母人工染色體（yeast artificial chromosome；YAC）調適釀酒酵母菌株以用於製造GDP-岩藻糖及LNT及用於表現a-1,2-岩藻糖基轉移酶及a-1,3-岩藻糖基轉移酶，該酵母人工染色體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12、具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之gmd、具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之fcl、具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶、具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌之截短a1,3-岩藻糖基轉移酶、具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 19之大腸桿菌O55:H7之WbgO。當在生長實驗中根據實施例2中所描述之培養條件評估時，使用包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Ura-His省卻培養基，針對製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT、LNFP-I及LNFP-V之寡醣混合物評估突變酵母菌株。 實施例 45. 用經修飾之釀酒酵母宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LNFP-III 及 LNFP-VI 之寡醣混合物

如實施例2中所描述用酵母人工染色體（YAC）調適釀酒酵母菌株以用於製造GDP-岩藻糖及LNnT及用於表現a-1,2-岩藻糖基轉移酶及a-1,3-岩藻糖基轉移酶，該酵母人工染色體包含以下者之持續型轉錄單元：具有SEQ ID NO 22之乳酸克魯維酵母之LAC12、具有SEQ ID NO 11之大腸桿菌之gmd、具有SEQ ID NO 12之大腸桿菌之fcl、具有SEQ ID NO 04之幽門螺旋桿菌之a-1,2-岩藻糖基轉移酶、具有SEQ ID NO 06之幽門螺旋桿菌之截短a1,3-岩藻糖基轉移酶、具有SEQ ID NO 21之大腸桿菌之galE、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtA及具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之LgtB。當在生長實驗中根據實施例2中所描述之培養條件評估時，使用包含乳糖作為前驅物之SD CSM-Ura-His省卻培養基，針對製造包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、LNFP-III及乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI，Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3-)Glc）及乳-N-岩藻五糖VI（LNFP-VI，Gal-b1,4-GlcNAc-b1,3-Gal-b1,4-(Fuc-a1,3-)Glc）之寡醣混合物評估突變酵母菌株。 實施例 46. 枯草芽孢桿菌之物質及方法 培養基

使用兩種不同培養基，亦即富集的魯利亞培養液（LB）及搖瓶用基本培養基（minimal medium for shake flask；MMsf）。基本培養基使用痕量元素混合物。

痕量元素混合物係由0.735 g/L CaCl2.2H2O、0.1 g/L MnCl2.2H2O、0.033 g/L CuCl2.2H2O、0.06 g/L CoCl2.6H2O、0.17 g/L ZnCl2、0.0311 g/L H3BO4、0.4 g/L Na2EDTA.2H2O及0.06 g/L Na2MoO4組成。檸檬酸鐵溶液含有0.135 g/L FeCl3.6H2O、1 g/L檸檬酸鈉（Hoch 1973 PMC1212887）。

魯利亞培養液（Luria Broth；LB）培養基係由1%胰腖（Difco，比利時埃倫博德海姆（Erembodegem, Belgium））、0.5%酵母萃取物（Difco）及0.5%氯化鈉（VWR，比利時魯汶（Leuven, Belgium））組成。魯利亞培養液瓊脂（Luria Broth agar；LBA）盤係由LB培養基組成，其中添加12 g/L瓊脂（Difco，比利時埃倫博德海姆（Erembodegem, Belgium））。

搖瓶用基本培養基（MMsf）實驗含有2.00 g/L (NH4)2SO4、7.5 g/L KH2PO4、17.5 g/L K2HPO4、1.25 g/L檸檬酸鈉、0.25 g/L MgSO4.7H2O、0.05 g/L色胺酸、10多至30 g/L葡萄糖或另一碳源（包括但不限於實施例中指定之果糖、麥芽糖、蔗糖、甘油及麥芽三糖）、10 ml/L痕量元素混合物及10 ml/L檸檬酸鐵溶液。用1M KOH將培養基設定為pH 7。視實驗而定，可添加乳糖、LNB或LacNAc。

藉由高壓處理（121℃，21'）對複合培養基（例如LB）進行滅菌及藉由過濾（0.22 µm Sartorius）對基本培養基進行滅菌。必要時，藉由添加抗生素（例如吉歐黴素（zeocin）（20 mg/L））使培養基具有選擇性。 菌株、質體及突變

枯草芽孢桿菌168，可獲自於芽孢桿菌基因儲備中心（美國俄亥俄州（Ohio, USA））。

經由Cre/lox之基因缺失的質體如由Yan等人（Appl. & Environm. Microbial., 2008年9月, 第5556-5562頁）所描述進行構築。基因破壞係經由與線性DNA同源重組及經由電穿孔轉型來進行，如Xue等人（J. Microb. Meth. 34 (1999) 183-191）所描述。基因剔除之方法由Liu等人（Metab. Engine. 24 (2014) 61-69）描述。此方法使用目標基因之上游及下游的1000bp同源性。

如由Popp等人（Sci. Rep., 2017, 7, 15158）所描述之整合載體用作表現載體且必要時可進一步用於基因體整合。用於表現之適合啟動子可源自部件儲存庫（iGem）：序列id：Bba_K143012、Bba_K823000、Bba_K823002或Bba_K823003。選殖可使用吉布森組裝、金門組裝、Cliva組裝、LCR或限制接合來進行。

在製造基於乳糖之寡醣之一實施方式中，產生枯草芽孢桿菌突變菌株以含有編碼乳糖輸入體（importer）（諸如具有SEQ ID NO 15之大腸桿菌lacY）之基因。在2'FL、3FL及/或diFL製造之一實施方式中，將α-1,2-及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶表現構築體另外添加至菌株。在LN3製造之一實施方式中，將包含半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtA（SEQ ID NO 18））之持續型轉錄單元另外添加至菌株。在LNT製造之一實施方式中，製造LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（如例如來自大腸桿菌O55:H7之WbgO（SEQ ID NO 19））的持續型轉錄單元修飾。在LNnT製造之一實施方式中，產生LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtB（SEQ ID NO 20））的持續型轉錄單元修飾。 異源及同源表現

需要表現之基因，無論其來自質體或來自基因體，均以合成方式經以下公司中之一者合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。

可藉由使密碼子使用最佳化為表現宿主之密碼子使用來進一步促進表現。使用供應商之工具使基因最佳化。 培養條件

96孔微量滴定盤實驗之預培養始於冷凍小瓶或始於LB盤之單一菌落，於150 µL LB中進行，且在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育隔夜。此培養物用作96孔正方形微量滴定盤之接種物，用400 µL MMsf培養基藉由稀釋400倍。使各菌株在96孔盤之多個孔中生長作為生物複製物。此等最終96孔培養盤接著在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育72小時或更短或更長。在培養實驗結束時，自各孔獲取樣品以量測上清液濃度（胞外糖濃度，在短暫離心細胞5分鐘後），或在短暫離心細胞前藉由使培養液在90℃下沸騰15分鐘或在60℃下沸騰60分鐘量測（=全培養液濃度，胞內及胞外糖濃度，如本文所定義）。

此外，對培養物進行稀釋以量測600 nm下之光學密度。藉由寡醣濃度除以生物質（以與參考菌株相比之相對百分比）來確定細胞效能指數或CPI。憑經驗確定生物質在600 nm下量測之光學密度之大致1/3。 實施例 47. 用經修飾之枯草芽孢桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 2 ' FLacNAc 及 3-FLacNAc 之寡醣混合物

枯草芽孢桿菌菌株如實施例46中所描述藉由持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾，該等持續型轉錄單元針對具有SEQ ID NO 15之大腸桿菌之乳糖透過酶（LacY）及具有SEQ ID NO 04之α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC及具有SEQ ID NO 05之α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT。在生長實驗中在包含乳糖及LacNAc之MMsf培養基上根據實施例46中所提供之培養條件，針對製造包含2'FL、3-FL、DiFL、2'FLacNAc及3-FLacNAc之寡醣混合物評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 48. 用經修飾之枯草芽孢桿菌宿主製造包含 2 ' FL 、 DiFL 、 LNFP-I 、 LNFP-II 、 LNT 及 LN3

枯草芽孢桿菌菌株首先藉由 nagB、 glmS及 gamA基因之基因體基因剔除及包含基因之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入經修飾以用於LN3製造及在蔗糖上之生長，該等基因編碼來自大腸桿菌之乳糖透過酶（LacY）（SEQ ID NO 15）、天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID P0CI73）、來自腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶LgtA（SEQ ID NO 18）、來自大腸桿菌W之蔗糖運輸蛋白（CscB）（SEQ ID NO 01）、來自運動醱酵單胞菌之果糖激酶（Frk）（SEQ ID NO 02）及來自青春雙歧桿菌之蔗糖磷酸化酶（BaSP）（SEQ ID NO 03）。在下一步驟中，突變菌株進一步經包含來自大腸桿菌O55:H7之N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶WbgO（SEQ ID NO 19）的持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾以製造LNT。在後續步驟中，產生LNT之菌株用表現質體轉型，該表現質體包含用於來自幽門螺旋桿菌之α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC（SEQ ID NO 04）及具有SEQ ID NO 25之長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC 15697之突變a1,3/4岩藻糖苷酶之持續型轉錄單元。在生長實驗中在包含乳糖作為前驅物之MMsf培養基上根據實施例46中所提供之培養條件，針對產生包含LN3、LNT、LNFP-I、LNFP-II、2'FL及DiFL之寡醣混合物評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 49 . 麩胺酸棒狀桿菌物質及方法 培養基

使用兩種不同培養基，亦即富集的胰腖-酵母萃取物（tryptone-yeast；TY）培養基及搖瓶用基本培養基（minimal medium for shake flask；MMsf）。基本培養基使用1000x儲備痕量元素混合物。

痕量元素混合物係由10 g/L CaCl2、10 g/L FeSO4.7H2O、10 g/L MnSO4.H2O、1 g/L ZnSO4.7H2O、0.2 g/L CuSO4、0.02 g/L NiCl2.6H2O、0.2 g/L生物素（pH 7.0）及0.03 g/L原兒茶酸組成。

搖瓶用基本培養基（MMsf）實驗含有20 g/L (NH4)2SO4、5 g/L尿素、1 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.25 g/L MgSO4.7H2O、42 g/L MOPS、10多至30 g/L葡萄糖或另一碳源（包括但不限於實施例中指定之果糖、麥芽糖、蔗糖、甘油及麥芽三糖）及1 ml/L痕量元素混合物。視實驗而定，可將乳糖、LNB及/或LacNAc添加至培養基中。

TY培養基係由1.6%胰腖（Difco，比利時埃倫博德海姆）、1%酵母萃取物（Difco）及0.5%氯化鈉（VWR，比利時魯汶）組成。TY瓊脂（TYA）盤係由TY培養基組成，其中添加12 g/L瓊脂（Difco，比利時埃倫博德海姆）。

藉由高壓處理（121℃，21'）對複合培養基（例如TY）進行滅菌及藉由過濾（0.22 µm Sartorius）對基本培養基進行滅菌。必要時，藉由添加抗生素（例如康黴素（kanamycin）、安比西林（ampicillin））使培養基具有選擇性。 菌株及突變

麩胺酸棒狀桿菌ATCC 13032可獲自於美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection）。

如藉由Suzuki等人（Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005年4月, 67(2):225-33）所描述基於Cre/loxP技術之整合質體載體及如藉由Okibe等人（Journal of Microbiological Methods 85, 2011, 155-163）所描述之熱敏穿梭載體經構築用於基因缺失、突變及插入。用於（異源）基因表現之適合啟動子可源自Yim等人（Biotechnol. Bioeng., 2013年11月, 110(11):2959-69）。選殖可使用吉布森組裝、金門組裝、Cliva組裝、LCR或限制接合來進行。

在製造基於乳糖之寡醣之一實施方式中，產生麩胺酸棒狀桿菌突變菌株以含有編碼乳糖輸入體（importer）（諸如例如具有SEQ ID NO 15之大腸桿菌lacY）之基因。在2'FL、3FL及/或diFL製造之一實施方式中，將α-1,2-及/或α-1,3-岩藻糖基轉移酶表現構築體另外添加至菌株。

在LN3製造之一實施方式中，將包含半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtA（SEQ ID NO 18））之持續型轉錄單元另外添加至菌株。在LNT製造之一實施方式中，製造LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（如例如來自大腸桿菌O55:H7之WbgO（SEQ ID NO 19））的持續型轉錄單元修飾。在LNnT製造之一實施方式中，產生LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtB（SEQ ID NO 20））的持續型轉錄單元修飾。 異源及同源表現

96孔微量滴定盤實驗之預培養始於冷凍小瓶或始於TY盤之單一菌落，於150 µL TY中進行，且在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育隔夜。此培養物用作96孔正方形微量滴定盤之接種物，用400 µL MMsf培養基藉由稀釋400倍。使各菌株在96孔盤之多個孔中生長作為生物複製物。此等最終96孔培養盤接著在37℃下在定軌振盪器上以800 rpm培育72小時或更短或更長。在培養實驗結束時，自各孔獲取樣品以量測上清液濃度（胞外糖濃度，在短暫離心細胞5分鐘後），或在短暫離心細胞前藉由使培養液在60℃下沸騰15分鐘量測（=全培養液濃度，胞內及胞外糖濃度，如本文所定義）。

此外，對培養物進行稀釋以量測600 nm下之光學密度。藉由完全培養液中量測之寡醣濃度除以生物質（以與參考菌株相比之相對百分比）來確定細胞效能指數或CPI。憑經驗確定生物質在600 nm下量測之光學密度之大致1/3。 實施例 50. 用經修飾之麩胺酸棒狀桿菌宿主製造包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNnT 、 LNFP-III 及乳 -N- 新六糖 之寡醣混合物

麩胺酸棒狀桿菌菌株藉由 nagB 、 glmS及 gamA基因之基因體基因剔除及包含基因之持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾以用於LN3製造及在蔗糖上之生長，該等基因編碼來自大腸桿菌之乳糖透過酶（LacY）（SEQ ID NO 15）、天然果糖-6-P-胺基轉移酶（UniProt ID Q8NND3）、來自腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶LgtA（SEQ ID NO 18）、來自大腸桿菌W之蔗糖運輸蛋白（CscB）（SEQ ID NO 01）、來自運動醱酵單胞菌之果糖激酶（Frk）（SEQ ID NO 02）及來自青春雙歧桿菌之蔗糖磷酸化酶（BaSP）（SEQ ID NO 03）。在下一步驟中，突變菌株進一步經包含來自腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶LgtB（SEQ ID NO 20）的持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾以製造LNnT。在後續步驟中，產生LNnT之菌株用包含持續型轉錄單元之表現質體轉型，該持續型轉錄單元針對來自幽門螺旋桿菌之α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC（SEQ ID NO 04）及來自幽門螺旋桿菌之α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT（SEQ ID NO 05）。在生長實驗中在包含乳糖作為前驅物之MMsf培養基上根據實施例49中所提供之培養條件，針對產生包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNnT、LNFP-III及乳-N-新六糖之寡醣混合物評估新穎菌株。培育72小時之後，收集培養液，且在UPLC上分析糖。 實施例 51. 萊茵衣藻 （ Chlamydomonas reinhardtii ） 之物質及方法 培養基

將萊茵衣藻細胞在三羥甲基胺基甲烷-乙酸鹽-磷酸鹽（Tris-acetate-phosphate；TAP）培養基（pH 7.0）中培養。TAP培養基使用1000x儲備Hutner氏痕量元素混合物。Hutner氏痕量元素混合物係由50 g/L Na2EDTA.H2O（Titriplex III）、22 g/L ZnSO4.7H2O、11.4 g/L H3BO3、5 g/L MnCl2.4H2O、5 g/L FeSO4.7H2O、1.6 g/L CoCl2.6H2O、1.6 g/L CuSO4.5H2O及1.1 g/L (NH4)6MoO3組成。

TAP培養基含有2.42 g/L三羥甲基胺基甲烷（參(羥甲基)胺基甲烷）、25 mg/L鹽儲備溶液、0.108 g/L K2HPO4、0.054 g/L KH2PO4及1.0 mL/L冰乙酸。鹽儲備溶液係由15 g/L NH4CL、4 g/L MgSO4.7H2O及2 g/L CaCl2.2H2O組成。作為用於醣合成之前驅物及/或受體，可添加化合物，例如半乳糖、葡萄糖、果糖、岩藻糖、乳糖、LacNAc、LNB。藉由高壓處理（121℃，21'）來對培養基進行滅菌。對於斜面瓊脂上之儲備培養物，使用含有1%瓊脂（具有經純化高強度，1000 g/cm2）之TAP培養基。 菌株、質體及突變

萊茵衣藻野生型菌株21gr（CC-1690，野生型，mt+）、6145C（CC-1691，野生型，mt－）、CC-125（137c，野生型，mt+）、CC-124（137c，野生型，mt－）可購自美國明尼蘇達大學（University of分鐘nesota, U.S.A.）之衣藻屬資源中心（Chlamydomonas Resource Center）（https://www.chlamycollection.org）。

表現質體源自pSI103，如可購自衣藻屬資源中心。選殖可使用吉布森組裝、金門組裝、Cliva組裝、LCR或限制接合來進行。用於（異源）基因表現之適合啟動子可衍生自例如Scranton等人（Algal Res. 2016, 15: 135-142）。靶向遺傳修飾（如基因剔除或基因置換）可使用如例如藉由Jiang等人（Eukaryotic Cell 2014, 13(11): 1465-1469）所描述之Crispr-Cas技術進行。

經由電穿孔之轉型係如藉由Wang等人（Biosci. Rep. 2019, 39: BSR2018210）所描述進行。在恆定通氣及光強度為8000 Lx之連續光照下，使細胞在液體TAP培養基中生長，直至細胞密度達到1.0-2.0×107個細胞/毫升。接著，將細胞以1.0×106個細胞/毫升之濃度接種至新製液體TAP培養基中且在連續光照下生長18-20 h，直至細胞密度達到4.0×106個細胞/毫升。接下來，將細胞藉由在室溫下以1250 g離心5分鐘收集，洗滌且用含有60 mM山梨醇之預冷卻液體TAP培養基（Sigma,美國）再懸浮且冰凍10分鐘。接著，將250 µL細胞懸浮液（對應於5.0×107個細胞）置放於具有100 ng質體DNA之預冷卻0.4 cm電穿孔比色管（400 ng/mL）中。使用BTX ECM830電穿孔裝置（1575 Ω，50 μFD），用6個各具有4 ms之脈衝長度及100 ms之脈衝間隔時間的500 V脈衝進行電穿孔。在電穿孔之後，立即將比色管置放於冰上持續10分鐘。最後，將細胞懸浮液轉移至含有10 mL具有60 mM山梨醇之新製液體TAP培養基的50 ml圓錐形離心管中，藉由緩慢振盪使其在暗光下恢復隔夜。在隔夜恢復之後，再收集細胞且用澱粉包埋方法接種至選擇性1.5%（w/v）瓊脂-TAP盤上，該盤含有安比西林（100 mg/L）或氯黴素（100 mg/L）。接著在23+-0.5℃下在光強度為8000 Lx之連續照明下培育盤。5-7天後分析細胞。

在製造UDP-半乳糖之一實施方式中，萊茵衣藻細胞經包含基因之轉錄單元修飾，該等基因編碼如例如阿拉伯芥之半乳糖激酶（KIN，UniProt ID Q9SEE5）及如例如來自阿拉伯芥（ A. thaliana）之USP的UDP-糖焦磷酸化酶（UniProt ID Q9C5I1）。

在LN3製造之一實施方式中，將包含半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtA（SEQ ID NO 18））之持續型轉錄單元另外添加至菌株。在LNT製造之一實施方式中，製造LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶（如例如來自大腸桿菌O55:H7之WbgO（SEQ ID NO 19））的持續型轉錄單元修飾。在LNnT製造之一實施方式中，產生LN3之菌株進一步經包含N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶（如例如來自腦膜炎奈瑟氏菌之lgtB（SEQ ID NO 20））的持續型轉錄單元修飾。

在製造GDP-岩藻糖之一實施方式中，萊茵衣藻細胞經用於如例如來自阿拉伯芥之GDP-岩藻糖合酶（GER1，UniProt ID O49213）之轉錄單元修飾。

在岩藻糖基化之一實施方式中，萊茵衣藻細胞可經包含以下者之持續型轉錄單元之表現質體修飾：如例如來自幽門螺旋桿菌之HpFutC的α-1,2-岩藻糖基轉移酶（SEQ ID NO 04）及/或如例如來自幽門螺旋桿菌之HpFucT的α-1,3-岩藻糖基轉移酶（SEQ ID NO 05）。 異源及同源表現

在23 +/- 0.5℃下，在14/10 h光/暗循環下以8000 Lx之光強度，在選擇性TAP-瓊脂盤中培養萊茵衣藻細胞。在培養5至7天之後分析細胞。

關於高密度培養物，細胞可在如藉由Chen等人（Bioresour. Technol. 2011, 102: 71-81）及Johnson等人（Biotechnol. Prog. 2018, 34: 811-827）所描述之封閉系統，如例如豎直或水平管光生物反應器、攪拌槽光生物反應器或平板光生物反應器中培養。 實施例 52. 在突變萊茵衣藻細胞中製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LacNAc 、 2 ' FLacNAc 及 3-FLacNAc 之寡醣混合物

萊茵衣藻細胞如實施例51中所描述經持續型轉錄單元之基因體基因嵌入進行工程改造以用於製造UDP-Gal，該等持續型轉錄單元包含編碼半乳糖激酶（KIN，UniProt ID Q9SEE5）及UDP-糖焦磷酸化酶（USP）（UniProt ID Q9C5I1）之阿拉伯芥基因。在下一步驟中，細胞經持續型轉錄單元之基因體基因嵌入修飾，該等持續型轉錄單元包含來自腦膜炎奈瑟氏菌之b1,4-半乳糖基轉移酶lgtB（SEQ ID NO 20）、來自阿拉伯芥之GDP-岩藻糖合酶（GER1，UniProt ID O49213）、來自幽門螺旋桿菌之α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC（SEQ ID NO 04）及來自幽門螺旋桿菌之α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT（SEQ ID NO 05）。在培養實驗中在包含半乳糖及N-乙醯基葡萄糖胺作為前驅物之TAP瓊脂盤上根據實施例51中所提供之培養條件，針對產生包含2'FL、3-FL、DiFL、LacNAc、2'FLacNAc及3-FLacNAc之寡醣混合物評估新穎菌株。培育5天之後，收集細胞，且在UPLC上分析醣產生。 實施例 53. 在突變萊茵衣藻細胞中製造包含 2 ' FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LacNAc 、 2 ' FLacNAc 、 3-FLacNAc 、 LN3 、 LNnT 、 LNFP-III 及二岩藻糖基 - 乳 -N- 新六糖之寡醣混合物

如實施例52中所描述之突變萊茵衣藻細胞進一步經用於具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶（lgtA）的持續型轉錄單元之基因體基因嵌入調適。在培養實驗中在包含半乳糖及N-乙醯基葡萄糖胺作為前驅物之TAP瓊脂盤上根據實施例51中提供之培養條件，針對產生包含2'FL、3-FL、DiFL、LacNAc、2'FLacNAc、3-FLacNAc、LN3、LNnT、LNFP-III及二岩藻糖基-乳-N-新六糖之寡醣混合物評估新穎菌株。培育5天之後，收集細胞，且在UPLC上分析醣產生。 實施例 54. 動物細胞之物質及方法 自不同哺乳動物之脂肪組織分離間葉幹細胞

新鮮脂肪組織係獲自屠宰場（例如，牛、豬、綿羊、雞、鴨、鯰魚、蛇、蛙）或抽脂手術（例如，在人類之情況下，在簽署知情同意書之後）且保持在補充有抗生素之磷酸鹽緩衝鹽水中。進行脂肪組織之酶消化，之後進行離心以分離間葉幹細胞。將經分離之間葉幹細胞轉移至細胞培養燒瓶中且在標準生長條件（例如，37℃、5% CO2）下生長。初始培養基包括DMEM-F12、RPMI及α-MEM培養基（補充有15%胎牛血清）及1%抗生素。隨後在第一次通過之後，培養基用補充有10% FBS（胎牛血清）之培養基置換。舉例而言，Ahmad及Shakoori（2013, Stem Cell Regen Med. 9(2): 29- 36），出於所有目的將其以全文引用之方式併入本文中，描述此實施例中所描述之方法之某些變化形式。 自乳汁分離間葉幹細胞

此實施例說明自在無菌條件下自人類或任何其他哺乳動物（諸如本文所描述）收集之乳汁分離間葉幹細胞。將相等體積之磷酸鹽緩衝鹽水添加至經稀釋乳汁中，之後離心20分鐘。將細胞集結粒用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌三次，且在標準培養條件下在DMEM-F12、RPMI及補充有10%胎牛血清及1%抗生素之α-MEM培養基中在細胞培養燒瓶中接種細胞。舉例而言，Hassiotou等人（2012, Stem Cells. 30(10): 2164-2174），出於所有目的將其以全文引用之方式併入本文中，描述此實施例中所描述之方法之某些變化形式。使用 2D 及 3D 培養系統分化幹細胞

經分離之間葉細胞可在2D及3D培養系統中分化成乳腺樣上皮細胞及腔細胞。參見例如Huynh等人. 1991. Exp Cell Res. 197(2): 191 -199；Gibson等人. 1991, In Vitro Cell Dev Biol Anim. 27(7): 585-594；Blatchford等人. 1999; Animal Cell Technology': Basic & Applied Aspects, Springer, Dordrecht. 141-145；Williams等人. 2009, Breast Cancer Res 11(3): 26-43；及Arevalo等人. 2015, Am J Physiol Cell Physiol. 310(5): C348 - C356；其中之各者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。

對於2D培養，將經分離之細胞在培養盤中在補充有10 ng/ml上皮生長因子及5 pg/ml胰島素之生長培養基中初始地接種。在匯合時，將細胞用補充有2%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素（100 U/ml青黴素、100 ug/ml鏈黴素）及5 pg/ml胰島素之生長培養基餵飼48h。為誘發分化，將細胞用含有5 pg/ml胰島素、1 pg/ml皮質醇、0.65 ng/ml三碘甲狀腺素、100 nM地塞米松及1 pg/ml促乳素之完整生長培養基餵飼。24小時後，自完全誘導培養基移除血清。

對於3D培養，將經分離之細胞胰蛋白酶化且在基質膠、玻尿酸或超低附著表面培養盤中培養六天，且藉由添加補充有10 ng/ml上皮生長因子及5 pg/ml胰島素之生長培養基來經誘導分化及乳酸化。在匯合時，將細胞用補充有2%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素（100 U/ml青黴素、100 ug/ml鏈黴素）及5 pg/ml胰島素之生長培養基餵飼48h。為誘發分化，將細胞用含有5 pg/ml胰島素、1 pg/ml皮質醇、0.65 ng/ml三碘甲狀腺素、100 nM地塞米松及1 pg/ml促乳素之完整生長培養基餵飼。24小時後，自完全誘導培養基移除血清。 製造乳腺樣細胞之方法

哺乳動物細胞藉由用編碼Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc之病毒載體再程式化來誘導多能性。接著在Mammocult培養基（獲自Stem Cell Technologies）或乳腺細胞富集培養基（DMEM，3% FBS、雌激素、孕酮、肝素、氫皮質酮、胰島素、EGF）中培養所得經再程式化之細胞以使其變為乳腺樣細胞，自其中可誘導所選乳汁組分之表現。替代地，表觀遺傳重塑係使用諸如CRISPR/Cas9之重塑系統執行，以活化相關之選擇基因，諸如酪蛋白、待持續型a-乳白蛋白，以允許其各自蛋白質之表現，及/或下調及/或基因剔除所選內源性基因，如例如WO21067641中所描述，出於所有目的將該文獻以全文引用之方式併入本文中。培養

完整生長培養基包括高葡萄糖DMEM/F12、10% FBS、1% NEAA、1% pen/strep、1% ITS-X、1% F-Glu、10 ng/ml EGF及5 pg/ml氫皮質酮。完整泌乳培養基包括高葡萄糖DMEM/F12、1% NEAA、1% pen/strep、1% ITS-X、1% F-Glu、10 ng/ml EGF、5 pg/ml氫皮質酮及1 pg/ml促乳素（在Hyunh 1991中為5ug/ml)。細胞以20,000個細胞/平方公分之密度接種於完整生長培養基中之經膠原蛋白塗佈之培養瓶上，且在完整生長培養基中靜置以黏附及擴增48小時，其後將該培養基換為完整泌乳培養基。在暴露於泌乳培養基後，細胞開始分化且停止生長。在約一週內，細胞開始分泌泌乳產物，諸如乳脂質、乳糖、酪蛋白及乳清至培養基中。可藉由濃縮或藉由超濾進行稀釋來實現所需濃度之泌乳培養基。可藉由透析實現泌乳培養基之所需鹽平衡，例如以自培養基移除非所需代謝產物。所使用激素及其他生長因子可藉由樹脂純化，例如使用鎳樹脂來移除His標記之生長因子來選擇性地萃取，以進一步降低乳酸化產物中污染物之水準。 實施例 55. 在非乳腺成體幹細胞中製成包含 2'FL 、 3-FL 、 DiFL 、 LN3 、 LNT 及 LNFP-I 之寡醣混合物

如實施例54中所描述之經分離間葉細胞及經再程式化成乳腺樣細胞經由CRISPR-CAS修飾以過度表現來自智人之GlcN6P合酶（UniProt ID Q06210）、來自智人之葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶（UniProt ID Q96EK6)、來自智人之磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶（UniProt ID O95394）、UDP-N-乙醯基己糖胺焦磷酸化酶（UniProt ID Q16222）、具有SEQ ID NO 18之腦膜炎奈瑟氏菌之半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶LgtA、具有SEQ ID NO 20之腦膜炎奈瑟氏菌之N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖苷基轉移酶LgtB、來自智人之GDP-岩藻糖合酶GFUS（UniProt ID Q13630）、來自幽門螺旋桿菌之α-1,2-岩藻糖基轉移酶HpFutC（SEQ ID NO 04）及來自幽門螺旋桿菌之α-1,3-岩藻糖基轉移酶HpFucT（SEQ ID NO 05）。對於宿主細胞，使引入之所有基因經密碼子最佳化。細胞以20,000個細胞/平方公分之密度接種於完整生長培養基中之經膠原蛋白塗佈之培養瓶上，且在完整生長培養基中靜置以黏附及擴增48小時，其後將該培養基換為完整泌乳培養基，持續約7天。如實施例54中所描述培養之後，細胞經受UPLC以分析包含2'FL、3-FL、DiFL、LN3、LNT及LNFP-I之寡醣混合物之製造。

無

                         
          <![CDATA[<110>  比利時商因比奧斯公司（Inbiose N.V.）]]>
          <![CDATA[<120>  藉由細胞製造中性岩藻糖基化寡醣之混合物 ]]>
          <![CDATA[<130>  021-TW]]>
          <![CDATA[<140>  TW 110129390]]>
          <![CDATA[<141>  2021-08-10]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20190198.0]]>
          <![CDATA[<151>  2020-08-10]]>
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          <![CDATA[<151>  2020-08-10]]>
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          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  415]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌W]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Ala Leu Asn Ile Pro Phe Arg Asn Ala Tyr Tyr Arg Phe Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Tyr Ser Phe Leu Phe Phe Ile Ser Trp Ser Leu Trp Trp Ser Leu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ala Ile Trp Leu Lys Gly His Leu Gly Leu Thr Gly Thr Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Thr Leu Tyr Ser Val Asn Gln Phe Thr Ser Ile Leu Phe Met Met 
              50                  55                  60                  
          Phe Tyr Gly Ile Val Gln Asp Lys Leu Gly Leu Lys Lys Pro Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Trp Cys Met Ser Phe Ile Leu Val Leu Thr Gly Pro Phe Met Ile Tyr 
                          85                  90                  95      
          Val Tyr Glu Pro Leu Leu Gln Ser Asn Phe Ser Val Gly Leu Ile Leu 
                      100                 105                 110         
          Gly Ala Leu Phe Phe Gly Leu Gly Tyr Leu Ala Gly Cys Gly Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Asp Ser Phe Thr Glu Lys Met Ala Arg Asn Phe His Phe Glu Tyr Gly 
              130                 135                 140                 
          Thr Ala Arg Ala Trp Gly Ser Phe Gly Tyr Ala Ile Gly Ala Phe Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Gly Ile Phe Phe Ser Ile Ser Pro His Ile Asn Phe Trp Leu Val 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Phe Gly Ala Val Phe Met Met Ile Asn Met Arg Phe Lys Asp 
                      180                 185                 190         
          Lys Asp His Gln Cys Val Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val Lys Lys Glu 
                  195                 200                 205             
          Asp Phe Ile Ala Val Phe Lys Asp Arg Asn Phe Trp Val Phe Val Ile 
              210                 215                 220                 
          Phe Ile Val Gly Thr Trp Ser Phe Tyr Asn Ile Phe Asp Gln Gln Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Val Phe Tyr Ser Gly Leu Phe Glu Ser His Asp Val Gly Thr 
                          245                 250                 255     
          Arg Leu Tyr Gly Tyr Leu Asn Ser Phe Gln Val Val Leu Glu Ala Leu 
                      260                 265                 270         
          Cys Met Ala Ile Ile Pro Phe Phe Val Asn Arg Val Gly Pro Lys Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Leu Leu Ile Gly Val Val Ile Met Ala Leu Arg Ile Leu Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ala Leu Phe Val Asn Pro Trp Ile Ile Ser Leu Val Lys Leu Leu His 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ile Glu Val Pro Leu Cys Val Ile Ser Val Phe Lys Tyr Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Ala Asn Phe Asp Lys Arg Leu Ser Ser Thr Ile Phe Leu Ile Gly Phe 
                      340                 345                 350         
          Gln Ile Ala Ser Ser Leu Gly Ile Val Leu Leu Ser Thr Pro Thr Gly 
                  355                 360                 365             
          Ile Leu Phe Asp His Ala Gly Tyr Gln Thr Val Phe Phe Ala Ile Ser 
              370                 375                 380                 
          Gly Ile Val Cys Leu Met Leu Leu Phe Gly Ile Phe Phe Leu Ser Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Arg Glu Gln Ile Val Met Glu Thr Pro Val Pro Ser Ala Ile 
                          405                 410                 415 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  301]]>
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          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
          Glu Phe Phe Lys Lys Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Asp Ser Phe Ala Ser 
              50                  55                  60                  
          Phe Gly Ile Ala Ser Phe Gly Pro Leu Cys Leu Asp Arg Lys Ser Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Trp Gly Tyr Ile Thr Asn Thr Pro Lys Pro Phe Trp Pro Asn Thr 
                          85                  90                  95      
          Asp Val Val Thr Pro Phe Lys Glu Ala Phe Gly Cys Pro Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Asp Thr Asp Val Asn Gly Ala Ala Leu Ala Glu Asn Phe Trp Gly Ala 
                  115                 120                 125             
          Ser Lys Gly Thr His Thr Ser Val Tyr Val Thr Val Gly Thr Gly Phe 
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          Gly Gly Gly Val Leu Ile Asp Gly Lys Pro Ile His Gly Leu Ala His 
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          Phe Glu Gly Cys Cys Pro Tyr His Gly Gly Cys Tyr Glu Gly Leu Ala 
                      180                 185                 190         
          Ser Gly Thr Ala Ile Arg Lys Arg Trp Gly Lys Ala Leu Asn Glu Met 
                  195                 200                 205             
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          Ala His Phe Asn Val Thr Leu Gln Ala Phe Ile Ser Pro Glu Arg Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Val Phe Gly Gly Gly Val Met His Val Asp Gly Met Leu Ala Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Arg Arg Gln Thr Ala Glu Ile Ala Asn Ser Tyr Phe Glu Gly Ala Asp 
                      260                 265                 270         
          Phe Glu Lys Ile Ile Val Leu Pro Gly Leu Gly Asp Gln Ala Gly Met 
                  275                 280                 285             
          Met Gly Ala Phe Ala Leu Ala Leu Ala Ala Glu Asn Lys 
              290                 295                 300     
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  504]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  青春雙歧桿菌]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Gly Thr Ile Lys Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Asp Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 
                  35                  40                  45              
          Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Glu Arg 
              50                  55                  60                  
          Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Lys Thr His Asn Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Lys Gln Phe 
                          85                  90                  95      
          Gln Asp Val Leu Ala Lys Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 
                      100                 105                 110         
          Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys 
              130                 135                 140                 
          Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Asp Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser 
                          165                 170                 175     
          Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Ser Tyr Ile Arg Leu Asp 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys 
              210                 215                 220                 
          Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro 
                          245                 250                 255     
          Pro Leu Leu Leu His Ala Leu Ser Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala 
                      260                 265                 270         
          His Trp Thr Asp Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr 
                  275                 280                 285             
          His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg 
              290                 295                 300                 
          Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Val Asp Asn Leu Val Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ile His Ala Asn Thr His Gly Glu Ser Gln Ala Ala Thr Gly Ala 
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser 
                      340                 345                 350         
          Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Ile Ala Ala Arg Ala Val Gln 
                  355                 360                 365             
          Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala 
              370                 375                 380                 
          Gly Lys Asn Asp Met Glu Leu Leu Arg Lys Thr Asn Asn Gly Arg Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Thr Ala Glu Ile Asp Glu Asn Leu Lys 
                          405                 410                 415     
          Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Lys Phe Arg Asn Glu 
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Ala Phe Asp Gly Thr Phe Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Asp Thr 
                  435                 440                 445             
          Ser Ile Ser Phe Thr Trp Arg Gly Glu Thr Ser Gln Ala Thr Leu Thr 
              450                 455                 460                 
          Phe Glu Pro Lys Arg Gly Leu Gly Val Asp Asn Thr Thr Pro Val Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Met Leu Glu Trp Glu Asp Ser Ala Gly Asp His Arg Ser Asp Asp Leu 
                          485                 490                 495     
          Ile Ala Asn Pro Pro Val Val Ala 
                      500                 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  299]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  幽門螺旋桿菌UA1234]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met 
          1               5                   10                  15      
          Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Ser Asn Thr Pro 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Leu Asp Ile Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met Gln 
                  35                  40                  45              
          Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Glu Lys Glu Ile 
              50                  55                  60                  
          Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Asn Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Gln Glu Ile Val Phe Glu Tyr 
                          85                  90                  95      
          Glu Pro Lys Leu Leu Lys Thr Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr 
                      100                 105                 110         
          Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln 
                  115                 120                 125             
          Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Pro Glu Asn Gly Asn Asn Lys Lys Lys 
              130                 135                 140                 
          Glu Glu Glu Tyr His Arg Lys Leu Ala Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Phe Val His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys 
                          165                 170                 175     
          Gln Leu Gly Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Leu Glu Tyr Met Ala Lys 
                      180                 185                 190         
          Arg Val Pro Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe 
                  195                 200                 205             
          Thr Gln Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Glu Glu Glu Ala Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Leu Ile Asn Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu 
                      260                 265                 270         
          Phe Gly His Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser 
                  275                 280                 285             
          His Phe Glu Val Lys Ser Gln Lys Tyr Asn Ala 
              290                 295                 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  478]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  幽門螺旋桿菌UA1234]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Met Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Tyr Val Glu Ser Ala Ser Ile Glu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Met Ala Ser Lys Ser Pro Pro Pro Leu Lys Ile Ala Val Ala Asn 
                      20                  25                  30          
          Trp Trp Gly Asp Glu Glu Ile Lys Glu Phe Lys Asn Ser Val Leu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Phe Ile Leu Ser Gln Arg Tyr Thr Ile Thr Leu His Gln Asn Pro Asn 
              50                  55                  60                  
          Glu Phe Ser Asp Leu Val Phe Gly Asn Pro Leu Gly Ser Ala Arg Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Leu Ser Tyr Gln Asn Ala Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly Glu Asn 
                          85                  90                  95      
          Glu Ser Pro Asn Phe Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asp Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Asp Phe Asn Asp Arg Tyr Leu Arg Met Pro Leu Tyr Tyr Asp Arg 
                  115                 120                 125             
          Leu His His Lys Ala Glu Ser Val Asn Asp Thr Thr Ala Pro Tyr Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Asp Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ser His Cys Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Lys His Pro Asn Leu Cys Ala Val Val Asn Asp Glu Ser Asp 
                          165                 170                 175     
          Pro Leu Lys Arg Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Pro Asn Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Ile Arg Asn Ala Phe Tyr Asp Ala Leu Asn Ser Ile Glu Pro Val 
                  195                 200                 205             
          Thr Gly Gly Gly Ser Val Arg Asn Thr Leu Gly Tyr Asn Val Lys Asn 
              210                 215                 220                 
          Lys Asn Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe Glu Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Gln Gly Tyr Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Ile Asp Ala Tyr Phe 
                          245                 250                 255     
          Ser His Thr Ile Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala Lys Asp 
                      260                 265                 270         
          Phe Asn Pro Lys Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Lys Asn Phe Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Lys Tyr Leu His Thr His Lys Asn Ala Tyr 
              290                 295                 300                 
          Leu Asp Met Leu Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Thr Leu Asp Gly Lys Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Phe Tyr Gln Asn Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Ala Phe Phe Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Leu Glu Asn Asp Thr Ile Tyr His Asp Asn Pro Phe Ile Phe 
                      340                 345                 350         
          Cys Arg Asp Leu Asn Glu Pro Leu Val Thr Ile Asp Asp Leu Arg Val 
                  355                 360                 365             
          Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Ile Asn Tyr 
              370                 375                 380                 
          Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Ile Asn Tyr Asp Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg 
                          405                 410                 415     
          Ile Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Arg Leu Leu Ser Lys Ala Thr Pro Leu Leu Glu Leu Ser Gln 
                  435                 440                 445             
          Asn Thr Thr Ser Lys Ile Tyr Arg Lys Ala Tyr Gln Lys Ser Leu Pro 
              450                 455                 460                 
          Leu Leu Arg Ala Ile Arg Arg Trp Val Lys Lys Leu Gly Leu 
          465                 470                 475             
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  412]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  幽門螺旋桿菌UA1234]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Met Phe Gln Pro Leu Leu Asp Ala Tyr Val Glu Ser Ala Ser Ile Glu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Met Ala Ser Lys Ser Pro Pro Pro Leu Lys Ile Ala Val Ala Asn 
                      20                  25                  30          
          Trp Trp Gly Asp Glu Glu Ile Lys Glu Phe Lys Asn Ser Val Leu Tyr 
                  35                  40                  45              
          Phe Ile Leu Ser Gln Arg Tyr Thr Ile Thr Leu His Gln Asn Pro Asn 
              50                  55                  60                  
          Glu Phe Ser Asp Leu Val Phe Gly Asn Pro Leu Gly Ser Ala Arg Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Leu Ser Tyr Gln Asn Ala Lys Arg Val Phe Tyr Thr Gly Glu Asn 
                          85                  90                  95      
          Glu Ser Pro Asn Phe Asn Leu Phe Asp Tyr Ala Ile Gly Phe Asp Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Asp Phe Asn Asp Arg Tyr Leu Arg Met Pro Leu Tyr Tyr Asp Arg 
                  115                 120                 125             
          Leu His His Lys Ala Glu Ser Val Asn Asp Thr Thr Ala Pro Tyr Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Lys Asp Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Lys Pro Ser His Cys Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Lys His Pro Asn Leu Cys Ala Val Val Asn Asp Glu Ser Asp 
                          165                 170                 175     
          Pro Leu Lys Arg Gly Phe Ala Ser Phe Val Ala Ser Asn Pro Asn Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Ile Arg Asn Ala Phe Tyr Asp Ala Leu Asn Ser Ile Glu Pro Val 
                  195                 200                 205             
          Thr Gly Gly Gly Ser Val Arg Asn Thr Leu Gly Tyr Asn Val Lys Asn 
              210                 215                 220                 
          Lys Asn Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Lys Phe Asn Leu Cys Phe Glu Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Gln Gly Tyr Gly Tyr Val Thr Glu Lys Ile Ile Asp Ala Tyr Phe 
                          245                 250                 255     
          Ser His Thr Ile Pro Ile Tyr Trp Gly Ser Pro Ser Val Ala Lys Asp 
                      260                 265                 270         
          Phe Asn Pro Lys Ser Phe Val Asn Val His Asp Phe Lys Asn Phe Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Lys Tyr Leu His Thr His Lys Asn Ala Tyr 
              290                 295                 300                 
          Leu Asp Met Leu Tyr Glu Asn Pro Leu Asn Thr Leu Asp Gly Lys Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Phe Tyr Gln Asn Leu Ser Phe Lys Lys Ile Leu Ala Phe Phe Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Leu Glu Asn Asp Thr Ile Tyr His Asp Asn Pro Phe Ile Phe 
                      340                 345                 350         
          Cys Arg Asp Leu Asn Glu Pro Leu Val Thr Ile Asp Asp Leu Arg Val 
                  355                 360                 365             
          Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Ile Asn Tyr 
              370                 375                 380                 
          Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Ile Asn Tyr Asp Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Arg Val Asn Tyr Asp Asp Leu Arg Val Asn Tyr 
                          405                 410         
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  264]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Met Lys Gln Tyr Leu Glu Leu Met Gln Lys Val Leu Asp Glu Gly Thr 
          1               5                   10                  15      
          Gln Lys Asn Asp Arg Thr Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ile Phe Gly His 
                      20                  25                  30          
          Gln Met Arg Phe Asn Leu Gln Asp Gly Phe Pro Leu Val Thr Thr Lys 
                  35                  40                  45              
          Arg Cys His Leu Arg Ser Ile Ile His Glu Leu Leu Trp Phe Leu Gln 
              50                  55                  60                  
          Gly Asp Thr Asn Ile Ala Tyr Leu His Glu Asn Asn Val Thr Ile Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Glu Trp Ala Asp Glu Asn Gly Asp Leu Gly Pro Val Tyr Gly Lys 
                          85                  90                  95      
          Gln Trp Arg Ala Trp Pro Thr Pro Asp Gly Arg His Ile Asp Gln Ile 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Val Leu Asn Gln Leu Lys Asn Asp Pro Asp Ser Arg Arg Ile 
                  115                 120                 125             
          Ile Val Ser Ala Trp Asn Val Gly Glu Leu Asp Lys Met Ala Leu Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Cys His Ala Phe Phe Gln Phe Tyr Val Ala Asp Gly Lys Leu Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Gln Leu Tyr Gln Arg Ser Cys Asp Val Phe Leu Gly Leu Pro Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Leu Leu Val His Met Met Ala Gln Gln Cys 
                      180                 185                 190         
          Asp Leu Glu Val Gly Asp Phe Val Trp Thr Gly Gly Asp Thr His Leu 
                  195                 200                 205             
          Tyr Ser Asn His Met Asp Gln Thr His Leu Gln Leu Ser Arg Glu Pro 
              210                 215                 220                 
          Arg Pro Leu Pro Lys Leu Ile Ile Lys Arg Lys Pro Glu Ser Ile Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Tyr Arg Phe Glu Asp Phe Glu Ile Glu Gly Tyr Asp Pro His Pro 
                          245                 250                 255     
          Gly Ile Lys Ala Pro Val Ala Ile 
                      260                 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  391]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Met Gln Lys Leu Ile Asn Ser Val Gln Asn Tyr Ala Trp Gly Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ala Leu Thr Glu Leu Tyr Gly Met Glu Asn Pro Ser Ser Gln Pro 
                      20                  25                  30          
          Met Ala Glu Leu Trp Met Gly Ala His Pro Lys Ser Ser Ser Arg Val 
                  35                  40                  45              
          Gln Asn Ala Ala Gly Asp Ile Val Ser Leu Arg Asp Val Ile Glu Ser 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Ser Thr Leu Leu Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe Gly Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Phe Leu Phe Lys Val Leu Cys Ala Ala Gln Pro Leu Ser Ile 
                          85                  90                  95      
          Gln Val His Pro Asn Lys His Asn Ser Glu Ile Gly Phe Ala Lys Glu 
                      100                 105                 110         
          Asn Ala Ala Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg Asn Tyr Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Pro Asn His Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Leu Thr Pro Phe Leu Ala 
              130                 135                 140                 
          Met Asn Ala Phe Arg Glu Phe Ser Glu Ile Val Ser Leu Leu Gln Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ala Gly Ala His Pro Ala Ile Ala His Phe Leu Gln Gln Pro Asp 
                          165                 170                 175     
          Ala Glu Arg Leu Ser Glu Leu Phe Ala Ser Leu Leu Asn Met Gln Gly 
                      180                 185                 190         
          Glu Glu Lys Ser Arg Ala Leu Ala Ile Leu Lys Ser Ala Leu Asp Ser 
                  195                 200                 205             
          Gln Gln Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg Leu Ile Ser Glu Phe Tyr 
              210                 215                 220                 
          Pro Glu Asp Ser Gly Leu Phe Ser Pro Leu Leu Leu Asn Val Val Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Asn Pro Gly Glu Ala Met Phe Leu Phe Ala Glu Thr Pro His Ala 
                          245                 250                 255     
          Tyr Leu Gln Gly Val Ala Leu Glu Val Met Ala Asn Ser Asp Asn Val 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Ala Gly Leu Thr Pro Lys Tyr Ile Asp Ile Pro Glu Leu Val 
                  275                 280                 285             
          Ala Asn Val Lys Phe Glu Ala Lys Pro Ala Asn Gln Leu Leu Thr Gln 
              290                 295                 300                 
          Pro Val Lys Gln Gly Ala Glu Leu Asp Phe Pro Ile Pro Val Asp Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Ala Phe Ser Leu His Asp Leu Ser Asp Lys Glu Thr Thr Ile Ser 
                          325                 330                 335     
          Gln Gln Ser Ala Ala Ile Leu Phe Cys Val Glu Gly Asp Ala Thr Leu 
                      340                 345                 350         
          Trp Lys Gly Ser Gln Gln Leu Gln Leu Lys Pro Gly Glu Ser Ala Phe 
                  355                 360                 365             
          Ile Ala Ala Asn Glu Ser Pro Val Thr Val Lys Gly His Gly Arg Leu 
              370                 375                 380                 
          Ala Arg Val Tyr Asn Lys Leu 
          385                 390     
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  456]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Met Lys Lys Leu Thr Cys Phe Lys Ala Tyr Asp Ile Arg Gly Lys Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gly Glu Glu Leu Asn Glu Asp Ile Ala Trp Arg Ile Gly Arg Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Glu Phe Leu Lys Pro Lys Thr Ile Val Leu Gly Gly Asp Val Arg 
                  35                  40                  45              
          Leu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Leu Ala Leu Ala Lys Gly Leu Gln Asp 
              50                  55                  60                  
          Ala Gly Val Asp Val Leu Asp Ile Gly Met Ser Gly Thr Glu Glu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Phe Ala Thr Phe His Leu Gly Val Asp Gly Gly Ile Glu Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser His Asn Pro Met Asp Tyr Asn Gly Met Lys Leu Val Arg Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Ala Arg Pro Ile Ser Gly Asp Thr Gly Leu Arg Asp Val Gln Arg 
                  115                 120                 125             
          Leu Ala Glu Ala Asn Asp Phe Pro Pro Val Asp Glu Thr Lys Arg Gly 
              130                 135                 140                 
          Arg Tyr Gln Gln Ile Asn Leu Arg Asp Ala Tyr Val Asp His Leu Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Tyr Ile Asn Val Lys Asn Leu Thr Pro Leu Lys Leu Val Ile Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Gly Asn Gly Ala Ala Gly Pro Val Val Asp Ala Ile Glu Ala Arg 
                      180                 185                 190         
          Phe Lys Ala Leu Gly Ala Pro Val Glu Leu Ile Lys Val His Asn Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Asp Gly Asn Phe Pro Asn Gly Ile Pro Asn Pro Leu Leu Pro Glu 
              210                 215                 220                 
          Cys Arg Asp Asp Thr Arg Asn Ala Val Ile Lys His Gly Ala Asp Met 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ile Ala Phe Asp Gly Asp Phe Asp Arg Cys Phe Leu Phe Asp Glu 
                          245                 250                 255     
          Lys Gly Gln Phe Ile Glu Gly Tyr Tyr Ile Val Gly Leu Leu Ala Glu 
                      260                 265                 270         
          Ala Phe Leu Glu Lys Asn Pro Gly Ala Lys Ile Ile His Asp Pro Arg 
                  275                 280                 285             
          Leu Ser Trp Asn Thr Val Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Gly Thr Pro 
              290                 295                 300                 
          Val Met Ser Lys Thr Gly His Ala Phe Ile Lys Glu Arg Met Arg Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Asp Ala Ile Tyr Gly Gly Glu Met Ser Ala His His Tyr Phe Arg 
                          325                 330                 335     
          Asp Phe Ala Tyr Cys Asp Ser Gly Met Ile Pro Trp Leu Leu Val Ala 
                      340                 345                 350         
          Glu Leu Val Cys Leu Lys Asp Lys Thr Leu Gly Glu Leu Val Arg Asp 
                  355                 360                 365             
          Arg Met Ala Ala Phe Pro Ala Ser Gly Glu Ile Asn Ser Lys Leu Ala 
              370                 375                 380                 
          Gln Pro Val Glu Ala Ile Asn Arg Val Glu Gln His Phe Ser Arg Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Leu Ala Val Asp Arg Thr Asp Gly Ile Ser Met Thr Phe Ala Asp 
                          405                 410                 415     
          Trp Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Asn Thr Glu Pro Val Val Arg Leu 
                      420                 425                 430         
          Asn Val Glu Ser Arg Gly Asp Val Pro Leu Met Glu Ala Arg Thr Arg 
                  435                 440                 445             
          Thr Leu Leu Thr Leu Leu Asn Glu 
              450                 455     
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  478]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Met Ala Gln Ser Lys Leu Tyr Pro Val Val Met Ala Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Arg Leu Trp Pro Leu Ser Arg Val Leu Tyr Pro Lys Gln Phe Leu 
                      20                  25                  30          
          Cys Leu Lys Gly Asp Leu Thr Met Leu Gln Thr Thr Ile Cys Arg Leu 
                  35                  40                  45              
          Asn Gly Val Glu Cys Glu Ser Pro Val Val Ile Cys Asn Glu Gln His 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ile Val Ala Glu Gln Leu Arg Gln Leu Asn Lys Leu Thr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ile Ile Leu Glu Pro Ala Gly Arg Asn Thr Ala Pro Ala Ile Ala 
                          85                  90                  95      
          Leu Ala Ala Leu Ala Ala Lys Arg His Ser Pro Glu Ser Asp Pro Leu 
                      100                 105                 110         
          Met Leu Val Leu Ala Ala Asp His Val Ile Ala Asp Glu Asp Ala Phe 
                  115                 120                 125             
          Arg Ala Ala Val Arg Asn Ala Met Pro Tyr Ala Glu Ala Gly Lys Leu 
              130                 135                 140                 
          Val Thr Phe Gly Ile Val Pro Asp Leu Pro Glu Thr Gly Tyr Gly Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Arg Arg Gly Glu Val Ser Ala Gly Glu Gln Asp Met Val Ala Phe 
                          165                 170                 175     
          Glu Val Ala Gln Phe Val Glu Lys Pro Asn Leu Glu Thr Ala Gln Ala 
                      180                 185                 190         
          Tyr Val Ala Ser Gly Glu Tyr Tyr Trp Asn Ser Gly Met Phe Leu Phe 
                  195                 200                 205             
          Arg Ala Gly Arg Tyr Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Leu Asp Ala Cys Glu Lys Ala Met Ser Ala Val Asp Pro Asp Leu Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Ile Arg Val Asp Glu Glu Ala Phe Leu Ala Cys Pro Glu Glu Ser 
                          245                 250                 255     
          Val Asp Tyr Ala Val Met Glu Arg Thr Ala Asp Ala Val Val Val Pro 
                      260                 265                 270         
          Met Asp Ala Gly Trp Ser Asp Val Gly Ser Trp Ser Ser Leu Trp Glu 
                  275                 280                 285             
          Ile Ser Ala His Thr Ala Glu Gly Asn Val Cys His Gly Asp Val Ile 
              290                 295                 300                 
          Asn His Lys Thr Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Ala Glu Ser Gly Leu Val 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Thr Val Gly Val Lys Asp Leu Val Val Val Gln Thr Lys Asp Ala 
                          325                 330                 335     
          Val Leu Ile Ala Asp Arg Asn Ala Val Gln Asp Val Lys Lys Val Val 
                      340                 345                 350         
          Glu Gln Ile Lys Ala Asp Gly Arg His Glu His Arg Val His Arg Glu 
                  355                 360                 365             
          Val Tyr Arg Pro Trp Gly Lys Tyr Asp Ser Ile Asp Ala Gly Asp Arg 
              370                 375                 380                 
          Tyr Gln Val Lys Arg Ile Thr Val Lys Pro Gly Glu Gly Leu Ser Val 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Met His His His Arg Ala Glu His Trp Val Val Val Ala Gly Thr 
                          405                 410                 415     
          Ala Lys Val Thr Ile Asp Gly Asp Ile Lys Leu Leu Gly Glu Asn Glu 
                      420                 425                 430         
          Ser Ile Tyr Ile Pro Leu Gly Ala Thr His Cys Leu Glu Asn Pro Gly 
                  435                 440                 445             
          Lys Ile Pro Leu Asp Leu Ile Glu Val Arg Ser Gly Ser Tyr Leu Glu 
              450                 455                 460                 
          Glu Asp Asp Val Val Arg Phe Ala Asp Arg Tyr Gly Arg Val 
          465                 470                 475             
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  373]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Met Ser Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Arg Arg Ala Ser Ser Phe Asn Thr Glu Arg Val Asp His Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Gln Asp Pro His Thr Cys Asn Pro Lys Phe His Leu His Tyr Gly Asp 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Asp Thr Ser Asn Leu Thr Arg Ile Leu Arg Glu Val Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Glu Val Tyr Asn Leu Gly Ala Met Ser His Val Ala Val Ser Phe 
                          85                  90                  95      
          Glu Ser Pro Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Ala Met Gly Thr Leu Arg 
                      100                 105                 110         
          Leu Leu Glu Ala Ile Arg Phe Leu Gly Leu Glu Lys Lys Thr Arg Phe 
                  115                 120                 125             
          Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Leu Val Gln Glu Ile Pro 
              130                 135                 140                 
          Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Val Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Thr Val Asn Tyr Arg Glu Ser Tyr Gly 
                          165                 170                 175     
          Met Tyr Ala Cys Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg 
                      180                 185                 190         
          Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Ile Ala Asn Ile 
                  195                 200                 205             
          Ala Gln Gly Leu Glu Ser Cys Leu Tyr Leu Gly Asn Met Asp Ser Leu 
              210                 215                 220                 
          Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Lys Met Gln Trp Met Met 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Gln Gln Glu Gln Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr Gly Val Gln 
                          245                 250                 255     
          Tyr Ser Val Arg Gln Phe Val Glu Met Ala Ala Ala Gln Leu Gly Ile 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Arg Phe Glu Gly Thr Gly Val Glu Glu Lys Gly Ile Val Val 
                  275                 280                 285             
          Ser Val Thr Gly His Asp Ala Pro Gly Val Lys Pro Gly Asp Val Ile 
              290                 295                 300                 
          Ile Ala Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Ala Glu Val Glu Thr Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala His Glu Lys Leu Gly Trp Lys Pro Glu 
                          325                 330                 335     
          Ile Thr Leu Arg Glu Met Val Ser Glu Met Val Ala Asn Asp Leu Glu 
                      340                 345                 350         
          Ala Ala Lys Lys His Ser Leu Leu Lys Ser His Gly Tyr Asp Val Ala 
                  355                 360                 365             
          Ile Ala Leu Glu Ser 
              370             
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  321]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Met Ser Lys Gln Arg Val Phe Ile Ala Gly His Arg Gly Met Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Ile Arg Arg Gln Leu Glu Gln Arg Gly Asp Val Glu Leu Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Arg Thr Arg Asp Glu Leu Asn Leu Leu Asp Ser Arg Ala Val His 
                  35                  40                  45              
          Asp Phe Phe Ala Ser Glu Arg Ile Asp Gln Val Tyr Leu Ala Ala Ala 
              50                  55                  60                  
          Lys Val Gly Gly Ile Val Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp Phe Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Gln Asn Met Met Ile Glu Ser Asn Ile Ile His Ala Ala His Gln 
                          85                  90                  95      
          Asn Asp Val Asn Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile Tyr Pro 
                      100                 105                 110         
          Lys Leu Ala Lys Gln Pro Met Ala Glu Ser Glu Leu Leu Gln Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Leu Glu Pro Thr Asn Glu Pro Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala Gly Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Cys Glu Ser Tyr Asn Arg Gln Tyr Gly Arg Asp Tyr Arg Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Val Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro His Asp Asn Phe His Pro Ser 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser His Val Ile Pro Ala Leu Leu Arg Arg Phe His Glu Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Ala Gln Asn Ala Pro Asp Val Val Val Trp Gly Ser Gly Thr Pro Met 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Phe Leu His Val Asp Asp Met Ala Ala Ala Ser Ile His Val 
              210                 215                 220                 
          Met Glu Leu Ala His Glu Val Trp Leu Glu Asn Thr Gln Pro Met Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Ser His Ile Asn Val Gly Thr Gly Val Asp Cys Thr Ile Arg Glu Leu 
                          245                 250                 255     
          Ala Gln Thr Ile Ala Lys Val Val Gly Tyr Lys Gly Arg Val Val Phe 
                      260                 265                 270         
          Asp Ala Ser Lys Pro Asp Gly Thr Pro Arg Lys Leu Leu Asp Val Thr 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu His Gln Leu Gly Trp Tyr His Glu Ile Ser Leu Glu Ala Gly 
              290                 295                 300                 
          Leu Ala Ser Thr Tyr Gln Trp Phe Leu Glu Asn Gln Asp Arg Phe Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Gly 
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  438]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Met Gly Asn Thr Ser Ile Gln Thr Gln Ser Tyr Arg Ala Val Asp Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp Ala Gly Gln Ser Arg Ser Tyr Ile Ile Pro Phe Ala Leu Leu Cys 
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Phe Phe Leu Trp Ala Val Ala Asn Asn Leu Asn Asp Ile Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Pro Gln Phe Gln Gln Ala Phe Thr Leu Thr Asn Phe Gln Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Leu Ile Gln Ser Ala Phe Tyr Phe Gly Tyr Phe Ile Ile Pro Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Gly Ile Leu Met Lys Lys Leu Ser Tyr Lys Ala Gly Ile Ile Thr 
                          85                  90                  95      
          Gly Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Leu Phe Trp Pro Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Glu Ile Met Asn Tyr Thr Leu Phe Leu Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Leu Gly Cys Leu Glu Thr Ala Ala Asn Pro Phe Val Thr Val 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Pro Glu Ser Ser Gly His Phe Arg Leu Asn Leu Ala Gln Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Asn Ser Phe Gly Ala Ile Ile Ala Val Val Phe Gly Gln Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ile Leu Ser Asn Val Pro His Gln Ser Gln Asp Val Leu Asp Lys Met 
                      180                 185                 190         
          Ser Pro Glu Gln Leu Ser Ala Tyr Lys His Ser Leu Val Leu Ser Val 
                  195                 200                 205             
          Gln Thr Pro Tyr Met Ile Ile Val Ala Ile Val Leu Leu Val Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Leu Ile Met Leu Thr Lys Phe Pro Ala Leu Gln Ser Asp Asn His Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Ala Lys Gln Gly Ser Phe Ser Ala Ser Leu Ser Arg Leu Ala Arg 
                          245                 250                 255     
          Ile Arg His Trp Arg Trp Ala Val Leu Ala Gln Phe Cys Tyr Val Gly 
                      260                 265                 270         
          Ala Gln Thr Ala Cys Trp Ser Tyr Leu Ile Arg Tyr Ala Val Glu Glu 
                  275                 280                 285             
          Ile Pro Gly Met Thr Ala Gly Phe Ala Ala Asn Tyr Leu Thr Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Met Val Cys Phe Phe Ile Gly Arg Phe Thr Gly Thr Trp Leu Ile Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Phe Ala Pro His Lys Val Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ile Ala Met 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Cys Leu Ile Ser Ala Phe Ala Gly Gly His Val Gly Leu Ile 
                      340                 345                 350         
          Ala Leu Thr Leu Cys Ser Ala Phe Met Ser Ile Gln Tyr Pro Thr Ile 
                  355                 360                 365             
          Phe Ser Leu Gly Ile Lys Asn Leu Gly Gln Asp Thr Lys Tyr Gly Ser 
              370                 375                 380                 
          Ser Phe Ile Val Met Thr Ile Ile Gly Gly Gly Ile Val Thr Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Met Gly Phe Val Ser Asp Ala Ala Gly Asn Ile Pro Thr Ala Glu Leu 
                          405                 410                 415     
          Ile Pro Ala Leu Cys Phe Ala Val Ile Phe Ile Phe Ala Arg Phe Arg 
                      420                 425                 430         
          Ser Gln Thr Ala Thr Asn 
                  435             
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  949]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  脆弱類桿菌NCTC 9343]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Met Gln Lys Leu Leu Ser Leu Pro Ser Asn Leu Val Gln Ser Phe His 
          1               5                   10                  15      
          Glu Leu Glu Arg Val Asn Arg Thr Asp Trp Phe Cys Thr Ser Asp Pro 
                      20                  25                  30          
          Val Gly Lys Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Thr Ser Trp Leu Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Glu Cys Tyr Asn Glu Tyr Ser Asp Gly Ala Thr Phe Gly Glu Trp Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Lys Glu Lys Arg Ile Leu Leu His Ala Gly Gly Gln Ser Arg Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Gly Tyr Ala Pro Ser Gly Lys Ile Leu Thr Pro Val Pro Val 
                          85                  90                  95      
          Phe Arg Trp Glu Arg Gly Gln His Leu Gly Gln Asn Leu Leu Ser Leu 
                      100                 105                 110         
          Gln Leu Pro Leu Tyr Glu Lys Ile Met Ser Leu Ala Pro Asp Lys Leu 
                  115                 120                 125             
          His Thr Leu Ile Ala Ser Gly Asp Val Tyr Ile Arg Ser Glu Lys Pro 
              130                 135                 140                 
          Leu Gln Ser Ile Pro Glu Ala Asp Val Val Cys Tyr Gly Leu Trp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Pro Ser Leu Ala Thr His His Gly Val Phe Ala Ser Asp Arg Lys 
                          165                 170                 175     
          His Pro Glu Gln Leu Asp Phe Met Leu Gln Lys Pro Ser Leu Ala Glu 
                      180                 185                 190         
          Leu Glu Ser Leu Ser Lys Thr His Leu Phe Leu Met Asp Ile Gly Ile 
                  195                 200                 205             
          Trp Leu Leu Ser Asp Arg Ala Val Glu Ile Leu Met Lys Arg Ser His 
              210                 215                 220                 
          Lys Glu Ser Ser Glu Glu Leu Lys Tyr Tyr Asp Leu Tyr Ser Asp Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Leu Ala Leu Gly Thr His Pro Arg Ile Glu Asp Glu Glu Val Asn 
                          245                 250                 255     
          Thr Leu Ser Val Ala Ile Leu Pro Leu Pro Gly Gly Glu Phe Tyr His 
                      260                 265                 270         
          Tyr Gly Thr Ser Lys Glu Leu Ile Ser Ser Thr Leu Ser Val Gln Asn 
                  275                 280                 285             
          Lys Val Tyr Asp Gln Arg Arg Ile Met His Arg Lys Val Lys Pro Asn 
              290                 295                 300                 
          Pro Ala Met Phe Val Gln Asn Ala Val Val Arg Ile Pro Leu Cys Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Asn Ala Asp Leu Trp Ile Glu Asn Ser His Ile Gly Pro Lys Trp 
                          325                 330                 335     
          Lys Ile Ala Ser Arg His Ile Ile Thr Gly Val Pro Glu Asn Asp Trp 
                      340                 345                 350         
          Ser Leu Ala Val Pro Ala Gly Val Cys Val Asp Val Val Pro Met Gly 
                  355                 360                 365             
          Asp Lys Gly Phe Val Ala Arg Pro Tyr Gly Leu Asp Asp Val Phe Lys 
              370                 375                 380                 
          Gly Asp Leu Arg Asp Ser Lys Thr Thr Leu Thr Gly Ile Pro Phe Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Trp Met Ser Lys Arg Gly Leu Ser Tyr Thr Asp Leu Lys Gly Arg 
                          405                 410                 415     
          Thr Asp Asp Leu Gln Ala Val Ser Val Phe Pro Met Val Asn Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Glu Glu Leu Gly Leu Val Leu Arg Trp Met Leu Ser Glu Pro Glu Leu 
                  435                 440                 445             
          Glu Glu Gly Lys Asn Ile Trp Leu Arg Ser Glu His Phe Ser Ala Asp 
              450                 455                 460                 
          Glu Ile Ser Ala Gly Ala Asn Leu Lys Arg Leu Tyr Ala Gln Arg Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Phe Arg Lys Gly Asn Trp Lys Ala Leu Ala Val Asn His Glu Lys 
                          485                 490                 495     
          Ser Val Phe Tyr Gln Leu Asp Leu Ala Asp Ala Ala Glu Asp Phe Val 
                      500                 505                 510         
          Arg Leu Gly Leu Asp Met Pro Glu Leu Leu Pro Glu Asp Ala Leu Gln 
                  515                 520                 525             
          Met Ser Arg Ile His Asn Arg Met Leu Arg Ala Arg Ile Leu Lys Leu 
              530                 535                 540                 
          Asp Gly Lys Asp Tyr Arg Pro Glu Glu Gln Ala Ala Phe Asp Leu Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Arg Asp Gly Leu Leu Asp Gly Ile Ser Asn Arg Lys Ser Thr Pro Lys 
                          565                 570                 575     
          Leu Asp Val Tyr Ser Asp Gln Ile Val Trp Gly Arg Ser Pro Val Arg 
                      580                 585                 590         
          Ile Asp Met Ala Gly Gly Trp Thr Asp Thr Pro Pro Tyr Ser Leu Tyr 
                  595                 600                 605             
          Ser Gly Gly Asn Val Val Asn Leu Ala Ile Glu Leu Asn Gly Gln Pro 
              610                 615                 620                 
          Pro Leu Gln Val Tyr Val Lys Pro Cys Lys Asp Phe His Ile Val Leu 
          625                 630                 635                 640 
          Arg Ser Ile Asp Met Gly Ala Met Glu Ile Val Ser Thr Phe Asp Glu 
                          645                 650                 655     
          Leu Gln Asp Tyr Lys Lys Ile Gly Ser Pro Phe Ser Ile Pro Lys Ala 
                      660                 665                 670         
          Ala Leu Ser Leu Ala Gly Phe Ala Pro Ala Phe Ser Ala Val Ser Tyr 
                  675                 680                 685             
          Ala Ser Leu Glu Glu Gln Leu Lys Asp Phe Gly Ala Gly Ile Glu Val 
              690                 695                 700                 
          Thr Leu Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Ser Gly Leu Gly Thr Ser Ser 
          705                 710                 715                 720 
          Ile Leu Ala Ser Thr Val Leu Gly Ala Ile Asn Asp Phe Cys Gly Leu 
                          725                 730                 735     
          Ala Trp Asp Lys Asn Glu Ile Cys Gln Arg Thr Leu Val Leu Glu Gln 
                      740                 745                 750         
          Leu Leu Thr Thr Gly Gly Gly Trp Gln Asp Gln Tyr Gly Gly Val Leu 
                  755                 760                 765             
          Gln Gly Val Lys Leu Leu Gln Thr Glu Ala Gly Phe Ala Gln Ser Pro 
              770                 775                 780                 
          Leu Val Arg Trp Leu Pro Asp His Leu Phe Thr His Pro Glu Tyr Lys 
          785                 790                 795                 800 
          Asp Cys His Leu Leu Tyr Tyr Thr Gly Ile Thr Arg Thr Ala Lys Gly 
                          805                 810                 815     
          Ile Leu Ala Glu Ile Val Ser Ser Met Phe Leu Asn Ser Ser Leu His 
                      820                 825                 830         
          Leu Asn Leu Leu Ser Glu Met Lys Ala His Ala Leu Asp Met Asn Glu 
                  835                 840                 845             
          Ala Ile Gln Arg Gly Ser Phe Val Glu Phe Gly Arg Leu Val Gly Lys 
              850                 855                 860                 
          Thr Trp Glu Gln Asn Lys Ala Leu Asp Ser Gly Thr Asn Pro Pro Ala 
          865                 870                 875                 880 
          Val Glu Ala Ile Ile Asp Leu Ile Lys Asp Tyr Thr Leu Gly Tyr Lys 
                          885                 890                 895     
          Leu Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Leu Tyr Met Val Ala Lys Asp 
                      900                 905                 910         
          Pro Gln Ala Ala Val Arg Ile Arg Lys Ile Leu Thr Glu Asn Ala Pro 
                  915                 920                 925             
          Asn Pro Arg Ala Arg Phe Val Glu Met Thr Leu Ser Asp Lys Gly Phe 
              930                 935                 940                 
          Gln Val Ser Arg Ser 
          945                 
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  417]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Met Tyr Tyr Leu Lys Asn Thr Asn Phe Trp Met Phe Gly Leu Phe Phe 
          1               5                   10                  15      
          Phe Phe Tyr Phe Phe Ile Met Gly Ala Tyr Phe Pro Phe Phe Pro Ile 
                      20                  25                  30          
          Trp Leu His Asp Ile Asn His Ile Ser Lys Ser Asp Thr Gly Ile Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Ala Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Leu Phe Gln Pro Leu Phe Gly 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Ser Asp Lys Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Trp Ile Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Met Leu Val Met Phe Ala Pro Phe Phe Ile Phe Ile Phe Gly 
                          85                  90                  95      
          Pro Leu Leu Gln Tyr Asn Ile Leu Val Gly Ser Ile Val Gly Gly Ile 
                      100                 105                 110         
          Tyr Leu Gly Phe Cys Phe Asn Ala Gly Ala Pro Ala Val Glu Ala Phe 
                  115                 120                 125             
          Ile Glu Lys Val Ser Arg Arg Ser Asn Phe Glu Phe Gly Arg Ala Arg 
              130                 135                 140                 
          Met Phe Gly Cys Val Gly Trp Ala Leu Cys Ala Ser Ile Val Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Met Phe Thr Ile Asn Asn Gln Phe Val Phe Trp Leu Gly Ser Gly Cys 
                          165                 170                 175     
          Ala Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu Phe Phe Ala Lys Thr Asp Ala Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ala Thr Val Ala Asn Ala Val Gly Ala Asn His Ser Ala Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Leu Lys Leu Ala Leu Glu Leu Phe Arg Gln Pro Lys Leu Trp Phe 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Tyr Val Ile Gly Val Ser Cys Thr Tyr Asp Val Phe Asp 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gln Phe Ala Asn Phe Phe Thr Ser Phe Phe Ala Thr Gly Glu Gln 
                          245                 250                 255     
          Gly Thr Arg Val Phe Gly Tyr Val Thr Thr Met Gly Glu Leu Leu Asn 
                      260                 265                 270         
          Ala Ser Ile Met Phe Phe Ala Pro Leu Ile Ile Asn Arg Ile Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Lys Asn Ala Leu Leu Leu Ala Gly Thr Ile Met Ser Val Arg Ile Ile 
              290                 295                 300                 
          Gly Ser Ser Phe Ala Thr Ser Ala Leu Glu Val Val Ile Leu Lys Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu His Met Phe Glu Val Pro Phe Leu Leu Val Gly Cys Phe Lys Tyr 
                          325                 330                 335     
          Ile Thr Ser Gln Phe Glu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ile Tyr Leu Val 
                      340                 345                 350         
          Cys Phe Cys Phe Phe Lys Gln Leu Ala Met Ile Phe Met Ser Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Ala Gly Asn Met Tyr Glu Ser Ile Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Leu Val 
              370                 375                 380                 
          Leu Gly Leu Val Ala Leu Gly Phe Thr Leu Ile Ser Val Phe Thr Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gln Val Asn Glu Val 
                          405                 410                 415     
          Ala 
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  159]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  釀酒酵母]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr 
                      20                  25                  30          
          Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro 
              50                  55                  60                  
          Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His 
                          85                  90                  95      
          Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly 
                      100                 105                 110         
          Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys 
                  115                 120                 125             
          Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu 
              130                 135                 140                 
          Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys 
          145                 150                 155                 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  609]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Gly Leu Ala Val Val Asp Thr Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu 
              50                  55                  60                  
          His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val 
                          85                  90                  95      
          Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu 
                      100                 105                 110         
          Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile 
                  115                 120                 125             
          Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly 
                          165                 170                 175     
          Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser 
                      180                 185                 190         
          Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu 
                  195                 200                 205             
          Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Cys His Tyr Met Gln Lys Glu 
                          245                 250                 255     
          Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile 
                      260                 265                 270         
          Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu 
                  275                 280                 285             
          Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser 
              290                 295                 300                 
          Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser 
                          325                 330                 335     
          Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu 
                      340                 345                 350         
          Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr 
                  355                 360                 365             
          Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu 
                          405                 410                 415     
          Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His 
                      420                 425                 430         
          Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met 
                  435                 440                 445             
          Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp 
              450                 455                 460                 
          Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu 
                          485                 490                 495     
          Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp 
                      500                 505                 510         
          Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu 
                  515                 520                 525             
          Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu 
              530                 535                 540                 
          Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met 
          545                 550                 555                 560 
          His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe 
                          565                 570                 575     
          Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys 
                      580                 585                 590         
          Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val 
                  595                 600                 605             
          Glu 
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  348]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  腦膜炎奈瑟氏菌]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Met Pro Ser Glu Ala Phe Arg Arg His Arg Ala Tyr Arg Glu Asn Lys 
          1               5                   10                  15      
          Leu Gln Pro Leu Val Ser Val Leu Ile Cys Ala Tyr Asn Val Glu Lys 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe Ala Gln Ser Leu Ala Ala Val Val Asn Gln Thr Trp Cys Asn 
                  35                  40                  45              
          Leu Asp Ile Leu Ile Val Asp Asp Gly Ser Thr Asp Gly Thr Leu Ala 
              50                  55                  60                  
          Ile Ala Gln Arg Phe Gln Glu Gln Asp Gly Arg Ile Lys Ile Leu Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ala Gln Asn Ser Gly Leu Ile Pro Ser Leu Asn Ile Gly Leu Asp 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Ala Lys Ser Gly Met Gly Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Asp Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Asp Ile Ala Ala Pro Asp Trp Ile Glu Lys Ile Val Gly Glu Met 
                  115                 120                 125             
          Glu Lys Asp Arg Ser Ile Ile Ala Met Gly Ala Trp Leu Glu Val Leu 
              130                 135                 140                 
          Ser Glu Glu Lys Asp Gly Asn Arg Leu Ala Arg His His Glu His Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ile Trp Lys Lys Pro Thr Arg His Glu Asp Ile Ala Asp Phe Phe 
                          165                 170                 175     
          Pro Phe Gly Asn Pro Ile His Asn Asn Thr Met Ile Met Arg Arg Ser 
                      180                 185                 190         
          Val Ile Asp Gly Gly Leu Arg Tyr Asn Thr Glu Arg Asp Trp Ala Glu 
                  195                 200                 205             
          Asp Tyr Gln Phe Trp Tyr Asp Val Ser Lys Leu Gly Arg Leu Ala Tyr 
              210                 215                 220                 
          Tyr Pro Glu Ala Leu Val Lys Tyr Arg Leu His Ala Asn Gln Val Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Lys Tyr Ser Ile Arg Gln His Glu Ile Ala Gln Gly Ile Gln Lys 
                          245                 250                 255     
          Thr Ala Arg Asn Asp Phe Leu Gln Ser Met Gly Phe Lys Thr Arg Phe 
                      260                 265                 270         
          Asp Ser Leu Glu Tyr Arg Gln Ile Lys Ala Val Ala Tyr Glu Leu Leu 
                  275                 280                 285             
          Glu Lys His Leu Pro Glu Glu Asp Phe Glu Arg Ala Arg Arg Phe Leu 
              290                 295                 300                 
          Tyr Gln Cys Phe Lys Arg Thr Asp Thr Leu Pro Ala Gly Val Trp Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Phe Ala Ala Asn Gly Arg Met Arg Arg Leu Phe Thr Leu Arg Gln 
                          325                 330                 335     
          Tyr Phe Gly Ile Leu His Arg Leu Leu Lys Asn Arg 
                      340                 345             
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  265]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌O55:H7]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Met Ile Ile Asp Glu Ala Glu Ser Ala Glu Ser Thr His Pro Val Val 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Ile Leu Pro Val Asn Lys Lys Asn Pro Phe Leu Asp Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Ile Asn Ser Ile Leu Ser Gln Thr Phe Ser Ser Phe Glu Ile Ile Ile 
                  35                  40                  45              
          Val Ala Asn Cys Cys Thr Asp Asp Phe Tyr Asn Glu Leu Lys His Lys 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Asp Lys Ile Lys Leu Ile Arg Thr Asn Ile Ala Tyr Leu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ser Leu Asn Lys Ala Ile Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Ile Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Met Asp Ser Asp Asp Ile Ser His Pro Asp Arg Phe Thr Lys Gln 
                      100                 105                 110         
          Val Asp Phe Leu Lys Asn Asn Pro Tyr Val Asp Val Val Gly Thr Asn 
                  115                 120                 125             
          Ala Ile Phe Ile Asp Asp Lys Gly Arg Glu Ile Asn Lys Thr Lys Leu 
              130                 135                 140                 
          Pro Glu Glu Asn Leu Asp Ile Val Lys Asn Leu Pro Tyr Lys Cys Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Val His Pro Ser Val Met Phe Arg Lys Lys Val Ile Ala Ser Ile 
                          165                 170                 175     
          Gly Gly Tyr Met Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Trp Asn 
                      180                 185                 190         
          Arg Leu Ser Leu Ala Lys Ile Lys Phe Gln Asn Leu Pro Glu Tyr Leu 
                  195                 200                 205             
          Phe Tyr Tyr Arg Leu His Glu Gly Gln Ser Thr Ala Lys Lys Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Tyr Met Val Met Val Asn Asp Leu Val Ile Lys Met Lys Cys Phe Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Gly Asn Ile Asn Tyr Leu Phe Gly Gly Ile Arg Thr Ile Ala 
                          245                 250                 255     
          Ser Phe Ile Tyr Cys Lys Tyr Ile Lys 
                      260                 265 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  275]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  腦膜炎奈瑟氏菌MC58]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Met Gln Asn His Val Ile Ser Leu Ala Ser Ala Ala Glu Arg Arg Ala 
          1               5                   10                  15      
          His Ile Ala Asp Thr Phe Gly Arg His Gly Ile Pro Phe Gln Phe Phe 
                      20                  25                  30          
          Asp Ala Leu Met Pro Ser Glu Arg Leu Glu Gln Ala Met Ala Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Val Pro Gly Leu Ser Ala His Pro Tyr Leu Ser Gly Val Glu Lys Ala 
              50                  55                  60                  
          Cys Phe Met Ser His Ala Val Leu Trp Lys Gln Ala Leu Asp Glu Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Tyr Ile Thr Val Phe Glu Asp Asp Val Leu Leu Gly Glu Gly 
                          85                  90                  95      
          Ala Glu Lys Phe Leu Ala Glu Asp Ala Trp Leu Gln Glu Arg Phe Asp 
                      100                 105                 110         
          Pro Asp Thr Ala Phe Ile Val Arg Leu Glu Thr Met Phe Met His Val 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Ser Pro Ser Gly Val Ala Asp Tyr Cys Gly Arg Ala Phe Pro 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Glu Ser Glu His Trp Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Ile Ser Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ala Met Arg Phe Phe Leu Asp Arg Phe Ala Ala Leu Pro Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Gly Leu His Pro Val Asp Leu Met Met Phe Ser Asp Phe Phe Asp Arg 
                      180                 185                 190         
          Glu Gly Met Pro Val Cys Gln Leu Asn Pro Ala Leu Cys Ala Gln Glu 
                  195                 200                 205             
          Leu His Tyr Ala Lys Phe His Asp Gln Asn Ser Ala Leu Gly Ser Leu 
              210                 215                 220                 
          Ile Glu His Asp Arg Leu Leu Asn Arg Lys Gln Gln Arg Arg Asp Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Asn Thr Phe Lys His Arg Leu Ile Arg Ala Leu Thr Lys Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Glu Arg Glu Lys Arg Arg Gln Arg Arg Glu Gln Phe Ile Val 
                      260                 265                 270         
          Pro Phe Gln 
                  275 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  338]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Met Arg Val Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr 
          1               5                   10                  15      
          Cys Val Gln Leu Leu Gln Asn Gly His Asp Val Ile Ile Leu Asp Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Cys Asn Ser Lys Arg Ser Val Leu Pro Val Ile Glu Arg Leu Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys His Pro Thr Phe Val Glu Gly Asp Ile Arg Asn Glu Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Met Thr Glu Ile Leu His Asp His Ala Ile Asp Thr Val Ile His Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Gln Lys Pro Leu Glu Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Asp Asn Asn Val Asn Gly Thr Leu Arg Leu Ile Ser Ala Met Arg 
                      100                 105                 110         
          Ala Ala Asn Val Lys Asn Phe Ile Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr 
                  115                 120                 125             
          Gly Asp Gln Pro Lys Ile Pro Tyr Val Glu Ser Phe Pro Thr Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Pro Gln Ser Pro Tyr Gly Lys Ser Lys Leu Met Val Glu Gln Ile Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Asp Leu Gln Lys Ala Gln Pro Asp Trp Ser Ile Ala Leu Leu Arg 
                          165                 170                 175     
          Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly Asp Met Gly Glu Asp 
                      180                 185                 190         
          Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Ile Ala Gln Val Ala 
                  195                 200                 205             
          Val Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Ile Phe Gly Asn Asp Tyr Pro Thr 
              210                 215                 220                 
          Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val Met Asp Leu Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Gly His Val Val Ala Met Glu Lys Leu Ala Asn Lys Pro Gly Val 
                          245                 250                 255     
          His Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gly Val Gly Asn Ser Val Leu Asp Val 
                      260                 265                 270         
          Val Asn Ala Phe Ser Lys Ala Cys Gly Lys Pro Val Asn Tyr His Phe 
                  275                 280                 285             
          Ala Pro Arg Arg Glu Gly Asp Leu Pro Ala Tyr Trp Ala Asp Ala Ser 
              290                 295                 300                 
          Lys Ala Asp Arg Glu Leu Asn Trp Arg Val Thr Arg Thr Leu Asp Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Met Ala Gln Asp Thr Trp His Trp Gln Ser Arg His Pro Gln Gly Tyr 
                          325                 330                 335     
          Pro Asp 
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  587]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  乳酸克魯維酵母菌]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Met Ala Asp His Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gln Lys Lys Pro Ile 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Ile Glu His Lys Asp Thr Leu Gly Asn Asp Arg Asp His Lys 
                      20                  25                  30          
          Glu Ala Leu Asn Ser Asp Asn Asp Asn Thr Ser Gly Leu Lys Ile Asn 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Pro Ile Glu Asp Ala Arg Glu Glu Val Leu Leu Pro Gly Tyr 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Lys Gln Tyr Tyr Lys Leu Tyr Gly Leu Cys Phe Ile Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Cys Ala Thr Met Gln Gly Tyr Asp Gly Ala Leu Met Gly Ser Ile 
                          85                  90                  95      
          Tyr Thr Glu Asp Ala Tyr Leu Lys Tyr Tyr His Leu Asp Ile Asn Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ser Gly Thr Gly Leu Val Phe Ser Ile Phe Asn Val Gly Gln Ile 
                  115                 120                 125             
          Cys Gly Ala Phe Phe Val Pro Leu Met Asp Trp Lys Gly Arg Lys Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Ile Leu Ile Gly Cys Leu Gly Val Val Ile Gly Ala Ile Ile Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Thr Thr Thr Lys Ser Ala Leu Ile Gly Gly Arg Trp Phe Val 
                          165                 170                 175     
          Ala Phe Phe Ala Thr Ile Ala Asn Ala Ala Ala Pro Thr Tyr Cys Ala 
                      180                 185                 190         
          Glu Val Ala Pro Ala His Leu Arg Gly Lys Val Ala Gly Leu Tyr Asn 
                  195                 200                 205             
          Thr Leu Trp Ser Val Gly Ser Ile Val Ala Ala Phe Ser Thr Tyr Gly 
              210                 215                 220                 
          Thr Asn Lys Asn Phe Pro Asn Ser Ser Lys Ala Phe Lys Ile Pro Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Leu Gln Met Met Phe Pro Gly Leu Val Cys Ile Phe Gly Trp Leu 
                          245                 250                 255     
          Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Gly Val Gly Arg Glu Glu Glu 
                      260                 265                 270         
          Ala Arg Glu Phe Ile Ile Lys Tyr His Leu Asn Gly Asp Arg Thr His 
                  275                 280                 285             
          Pro Leu Leu Asp Met Glu Met Ala Glu Ile Ile Glu Ser Phe His Gly 
              290                 295                 300                 
          Thr Asp Leu Ser Asn Pro Leu Glu Met Leu Asp Val Arg Ser Leu Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Thr Arg Ser Asp Arg Tyr Arg Ala Met Leu Val Ile Leu Met Ala 
                          325                 330                 335     
          Trp Phe Gly Gln Phe Ser Gly Asn Asn Val Cys Ser Tyr Tyr Leu Pro 
                      340                 345                 350         
          Thr Met Leu Arg Asn Val Gly Met Lys Ser Val Ser Leu Asn Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Met Asn Gly Val Tyr Ser Ile Val Thr Trp Ile Ser Ser Ile Cys Gly 
              370                 375                 380                 
          Ala Phe Phe Ile Asp Lys Ile Gly Arg Arg Glu Gly Phe Leu Gly Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Thr Gly Leu Ser Ile Cys Thr Ala 
                          405                 410                 415     
          Arg Tyr Glu Lys Thr Lys Lys Lys Ser Ala Ser Asn Gly Ala Leu Val 
                      420                 425                 430         
          Phe Ile Tyr Leu Phe Gly Gly Ile Phe Ser Phe Ala Phe Thr Pro Met 
                  435                 440                 445             
          Gln Ser Met Tyr Ser Thr Glu Val Ser Thr Asn Leu Thr Arg Ser Lys 
              450                 455                 460                 
          Ala Gln Leu Leu Asn Phe Val Val Ser Gly Val Ala Gln Phe Val Asn 
          465                 470                 475                 480 
          Gln Phe Ala Thr Pro Lys Ala Met Lys Asn Ile Lys Tyr Trp Phe Tyr 
                          485                 490                 495     
          Val Phe Tyr Val Phe Phe Asp Ile Phe Glu Phe Ile Val Ile Tyr Phe 
                      500                 505                 510         
          Phe Phe Val Glu Thr Lys Gly Arg Ser Leu Glu Glu Leu Glu Val Val 
                  515                 520                 525             
          Phe Glu Ala Pro Asn Pro Arg Lys Ala Ser Val Asp Gln Ala Phe Leu 
              530                 535                 540                 
          Ala Gln Val Arg Ala Thr Leu Val Gln Arg Asn Asp Val Arg Val Ala 
          545                 550                 555                 560 
          Asn Ala Gln Asn Leu Lys Glu Gln Glu Pro Leu Lys Ser Asp Ala Asp 
                          565                 570                 575     
          His Val Glu Lys Leu Ser Glu Ala Glu Ser Val 
                      580                 585         
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  234]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Met Val Ile Asn Ile Phe Tyr Ile Cys Thr Gly Glu Tyr Lys Arg Phe 
          1               5                   10                  15      
          Phe Asp Lys Phe Tyr Leu Ser Cys Glu Asp Lys Phe Ile Pro Glu Phe 
                      20                  25                  30          
          Gly Lys Lys Tyr Tyr Val Phe Thr Asp Ser Asp Arg Ile Tyr Phe Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Leu Asn Val Glu Val Ile Asn Val Glu Lys Asn Cys Trp Pro 
              50                  55                  60                  
          Leu Asn Thr Leu Leu Arg Phe Ser Tyr Phe Leu Lys Val Ile Asp Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Thr Asn Ser Tyr Thr Phe Phe Phe Asn Ala Asn Ala Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Val Lys Glu Ile Pro Phe Ser Thr Phe Met Glu Ser Asp Leu Ile Gly 
                      100                 105                 110         
          Val Ile His Pro Gly Tyr Lys Asn Arg Ile Ser Ile Leu Tyr Pro Trp 
                  115                 120                 125             
          Glu Arg Arg Lys Asn Ala Thr Cys Tyr Leu Gly Tyr Leu Lys Lys Gly 
              130                 135                 140                 
          Ile Tyr Tyr Gln Gly Cys Phe Asn Gly Gly Lys Thr Ala Ser Phe Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Leu Ile Gln Ile Cys Asn Met Met Thr Met Ala Asp Leu Lys Lys 
                          165                 170                 175     
          Asn Leu Ile Ala Lys Val His Asp Glu Ser Tyr Leu Asn Tyr Tyr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Asn Lys Pro Leu Leu Leu Ser Glu Leu Tyr Ser Trp Pro Glu 
                  195                 200                 205             
          Lys Tyr Gly Glu Asn Lys Asp Ala Lys Ile Ile Met Arg Asp Lys Glu 
              210                 215                 220                 
          Arg Glu Ser Trp Tyr Gly Asn Ile Lys Lys 
          225                 230                 
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  306]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  鼬鼠螺旋桿菌（菌株ATCC 43772）]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Met Gln Ser Thr Ala Gln Asn Thr Gln Gln Asn Thr His Phe Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ser Gln Thr Thr Pro Gln Ala Ala Gln Ser Val Gln Gln Ala Ser 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Leu Pro Lys Ser Ser Pro Thr Cys Tyr Lys Ile Ala Ile Leu 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ile Cys Thr Gly Ala Tyr Ser Ile Phe Trp Gln Asp Phe Tyr Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Ala Lys Val His Leu Leu Pro Ala His Arg Leu Thr Tyr Phe Val 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Thr Asp Ala Asp Ser Leu Tyr Ala Glu Glu Ala Ser Asp Val Arg 
                          85                  90                  95      
          Lys Ile Tyr Gln Glu Asn Leu Gly Trp Pro Phe Asn Thr Leu Lys Arg 
                      100                 105                 110         
          Phe Glu Met Phe Leu Gly Gln Glu Glu Ala Leu Arg Glu Phe Asp Phe 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Phe Phe Asn Ala Asn Cys Leu Phe Phe Gln His Ile Gly Asp 
              130                 135                 140                 
          Glu Phe Leu Pro Ile Glu Glu Asp Ile Leu Val Thr Gln His Tyr Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Arg Asp Ala Ser Pro Glu Cys Phe Thr Tyr Glu Arg Asn Pro Lys 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Ala Tyr Val Pro Phe Gly Lys Gly Lys Ala Tyr Val Tyr Gly 
                      180                 185                 190         
          Ser Thr Asn Gly Gly Lys Ala Gly Ala Phe Leu Ala Leu Ala Arg Thr 
                  195                 200                 205             
          Leu Gln Glu Arg Ile Gln Glu Asp Leu Ser Arg Gly Ile Ile Ala Ile 
              210                 215                 220                 
          Trp His Asp Glu Ser His Leu Asn Ala Tyr Ile Ile Asp His Pro Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Lys Met Leu Asp Tyr Gly Tyr Gly Phe Pro Glu Gly Tyr Gly Arg 
                          245                 250                 255     
          Val Pro Gly Gly Gly Val Tyr Ile Phe Leu Arg Asp Lys Ser Arg Val 
                      260                 265                 270         
          Ile Asp Val Asn Ala Ile Lys Gly Met Gly Ser Pro Ala Asn Arg Arg 
                  275                 280                 285             
          Leu Lys Asn Ala Leu Arg Lys Leu Lys His Phe Ser Lys Arg Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Arg 
          305     
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  291]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC 15697]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Met Leu Phe Asn Pro Arg Asn Val Asp Val Asp Gln Trp Met Asp Ala 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Ala Gly Gly Met Ala Gly Val Ile Leu Thr Cys Lys His His 
                      20                  25                  30          
          Asp Gly Phe Cys Leu Trp Pro Ser Arg Leu Thr Arg His Thr Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Pro Trp Arg Glu Gly Lys Gly Asp Leu Val Arg Glu Val Ser 
              50                  55                  60                  
          Glu Ser Ala Arg Arg His Gly Leu Lys Phe Gly Val Tyr Leu Ser Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Trp Asp Arg Thr Glu Glu Ser Tyr Gly Lys Gly Lys Ala Tyr Asp Asp 
                          85                  90                  95      
          Phe Tyr Val Gly Gln Leu Thr Glu Leu Leu Thr Gln Tyr Gly Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Phe Ser Val Trp Leu Asp Gly Ala Asn Gly Glu Gly Lys Asn Gly Lys 
                  115                 120                 125             
          Thr Gln Tyr Tyr Asp Trp Asp Arg Tyr Tyr Asn Val Ile Arg Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Gln Pro Asp Ala Val Ile Ser Val Cys Gly Pro Asp Val Arg Trp Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Asn Glu Ala Gly His Val Arg Asp Asn Glu Trp Ser Val Val Pro 
                          165                 170                 175     
          Arg Arg Leu Arg Ser Ala Glu Leu Thr Met Glu Lys Ser Gln Gln Glu 
                      180                 185                 190         
          Asp Asp Ala Ser Phe Ala Thr Thr Val Ser Ser Gln Asp Asp Asp Leu 
                  195                 200                 205             
          Gly Ser Arg Glu Ala Val Ala Gly Tyr Gly Asp Asn Val Cys Trp Tyr 
              210                 215                 220                 
          Pro Ala Glu Val Asp Thr Ser Ile Arg Pro Gly Trp Phe Tyr His Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Glu Asp Asp Lys Val Met Ser Ala Asp Gln Leu Phe Asp Leu Trp 
                          245                 250                 255     
          Leu Ser Ala Val Gly Gly Asn Ser Ser Leu Leu Leu Asn Ile Pro Pro 
                      260                 265                 270         
          Ser Pro Glu Gly Leu Leu Ala Glu Pro Asp Val Gln Ser Leu Lys Gly 
                  275                 280                 285             
          Leu Gly Arg 
              290     
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  445]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Met Ser Asn Arg Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Arg Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Asp Ala Pro Ile Thr Pro Asp Phe Val Leu Lys Leu Gly Trp Ala 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Lys Val Leu Ala Arg His Gly Ser Arg Lys Ile Ile Ile Gly 
                  35                  40                  45              
          Lys Asp Thr Arg Ile Ser Gly Tyr Met Leu Glu Ser Ala Leu Glu Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Ser Ala Leu Phe Thr Gly Pro Met Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Pro Ala Val Ala Tyr Leu Thr Arg Thr Phe Arg Ala Glu Ala Gly 
                          85                  90                  95      
          Ile Val Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Phe Tyr Asp Asn Gly Ile Lys 
                      100                 105                 110         
          Phe Phe Ser Ile Asp Gly Thr Lys Leu Pro Asp Ala Val Glu Glu Ala 
                  115                 120                 125             
          Ile Glu Ala Glu Met Glu Lys Glu Ile Ser Cys Val Asp Ser Ala Glu 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Lys Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Ile Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Cys Lys Ala Thr Phe Pro Asn Glu Leu Ser Leu Ser Glu Leu Lys 
                          165                 170                 175     
          Ile Val Val Asp Cys Ala Asn Gly Ala Thr Tyr His Ile Ala Pro Asn 
                      180                 185                 190         
          Val Leu Arg Glu Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala Ile Gly Cys Glu Pro 
                  195                 200                 205             
          Asn Gly Val Asn Ile Asn Ala Glu Val Gly Ala Thr Asp Val Arg Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Glu Lys Ala Asp Leu Gly Ile Ala Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Gly Asp Gly Asp Arg Val Ile Met Val Asp His Glu Gly Asn Lys 
                          245                 250                 255     
          Val Asp Gly Asp Gln Ile Met Tyr Ile Ile Ala Arg Glu Gly Leu Arg 
                      260                 265                 270         
          Gln Gly Gln Leu Arg Gly Gly Ala Val Gly Thr Leu Met Ser Asn Met 
                  275                 280                 285             
          Gly Leu Glu Leu Ala Leu Lys Gln Leu Gly Ile Pro Phe Ala Arg Ala 
              290                 295                 300                 
          Lys Val Gly Asp Arg Tyr Val Leu Glu Lys Met Gln Glu Lys Gly Trp 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Ile Gly Ala Glu Asn Ser Gly His Val Ile Leu Leu Asp Lys Thr 
                          325                 330                 335     
          Thr Thr Gly Asp Gly Ile Val Ala Gly Leu Gln Val Leu Ala Ala Met 
                      340                 345                 350         
          Ala Arg Asn His Met Ser Leu His Asp Leu Cys Ser Gly Met Lys Met 
                  355                 360                 365             
          Phe Pro Gln Ile Leu Val Asn Val Arg Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Asp 
              370                 375                 380                 
          Pro Leu Glu His Glu Ser Val Lys Ala Val Thr Ala Glu Val Glu Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Leu Gly Asn Arg Gly Arg Val Leu Leu Arg Lys Ser Gly Thr Glu 
                          405                 410                 415     
          Pro Leu Ile Arg Val Met Val Glu Gly Glu Asp Glu Ala Gln Val Thr 
                      420                 425                 430         
          Glu Phe Ala His Arg Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Val 
                  435                 440                 445 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  456]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌K-12 MG1655]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Met Leu Asn Asn Ala Met Ser Val Val Ile Leu Ala Ala Gly Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Arg Met Tyr Ser Asp Leu Pro Lys Val Leu His Thr Leu Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Met Val Gln His Val Ile Asp Ala Ala Asn Glu Leu Gly Ala 
                  35                  40                  45              
          Ala His Val His Leu Val Tyr Gly His Gly Gly Asp Leu Leu Lys Gln 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Lys Asp Asp Asn Leu Asn Trp Val Leu Gln Ala Glu Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Thr Gly His Ala Met Gln Gln Ala Ala Pro Phe Phe Ala Asp Asp 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Ile Leu Met Leu Tyr Gly Asp Val Pro Leu Ile Ser Val Glu 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Gln Arg Leu Arg Asp Ala Lys Pro Gln Gly Gly Ile Gly Leu 
                  115                 120                 125             
          Leu Thr Val Lys Leu Asp Asp Pro Thr Gly Tyr Gly Arg Ile Thr Arg 
              130                 135                 140                 
          Glu Asn Gly Lys Val Thr Gly Ile Val Glu His Lys Asp Ala Thr Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gln Arg Gln Ile Gln Glu Ile Asn Thr Gly Ile Leu Ile Ala Asn 
                          165                 170                 175     
          Gly Ala Asp Met Lys Arg Trp Leu Ala Lys Leu Thr Asn Asn Asn Ala 
                      180                 185                 190         
          Gln Gly Glu Tyr Tyr Ile Thr Asp Ile Ile Ala Leu Ala Tyr Gln Glu 
                  195                 200                 205             
          Gly Arg Glu Ile Val Ala Val His Pro Gln Arg Leu Ser Glu Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Gly Val Asn Asn Arg Leu Gln Leu Ser Arg Leu Glu Arg Val Tyr Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Glu Gln Ala Glu Lys Leu Leu Leu Ala Gly Val Met Leu Arg Asp 
                          245                 250                 255     
          Pro Ala Arg Phe Asp Leu Arg Gly Thr Leu Thr His Gly Arg Asp Val 
                      260                 265                 270         
          Glu Ile Asp Thr Asn Val Ile Ile Glu Gly Asn Val Thr Leu Gly His 
                  275                 280                 285             
          Arg Val Lys Ile Gly Thr Gly Cys Val Ile Lys Asn Ser Val Ile Gly 
              290                 295                 300                 
          Asp Asp Cys Glu Ile Ser Pro Tyr Thr Val Val Glu Asp Ala Asn Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Ala Ala Cys Thr Ile Gly Pro Phe Ala Arg Leu Arg Pro Gly Ala 
                          325                 330                 335     
          Glu Leu Leu Glu Gly Ala His Val Gly Asn Phe Val Glu Met Lys Lys 
                      340                 345                 350         
          Ala Arg Leu Gly Lys Gly Ser Lys Ala Gly His Leu Thr Tyr Leu Gly 
                  355                 360                 365             
          Asp Ala Glu Ile Gly Asp Asn Val Asn Ile Gly Ala Gly Thr Ile Thr 
              370                 375                 380                 
          Cys Asn Tyr Asp Gly Ala Asn Lys Phe Lys Thr Ile Ile Gly Asp Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Val Phe Val Gly Ser Asp Thr Gln Leu Val Ala Pro Val Thr Val Gly 
                          405                 410                 415     
          Lys Gly Ala Thr Ile Ala Ala Gly Thr Thr Val Thr Arg Asn Val Gly 
                      420                 425                 430         
          Glu Asn Ala Leu Ala Ile Ser Arg Val Pro Gln Thr Gln Lys Glu Gly 
                  435                 440                 445             
          Trp Arg Arg Pro Val Lys Lys Lys 
              450                 455

Claims

一種經代謝工程改造之細胞，其製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物，其中該細胞 -經代謝工程改造以用於製造該混合物，及 -表現為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶，及 -能夠合成核苷酸-糖GDP-岩藻糖（GDP-Fuc），及 -表現至少一種額外醣基轉移酶，及 -能夠合成至少一種或多種核苷酸-糖，其中該至少一種或多種核苷酸-糖為用於該額外醣基轉移酶之供體。
如請求項1之細胞，其中該細胞經基因表現模組修飾，其中來自該等表現模組中之任一者之表現為持續型的或藉由天然誘導物產生。
如請求項1或2中任一項之細胞，其中該細胞包含編碼一種蛋白質之相同編碼DNA序列之多個複本。
如請求項1至3中任一項之細胞，其中該寡醣混合物包含至少三種在聚合度方面不同之不同寡醣。
如實施方式1至4中任一項之細胞，其中該細胞製造至少五種，較佳至少六種，更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種不同中性岩藻糖基化寡醣。
如請求項1至5中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者係選自包含以下者之清單：岩藻糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺（altrosamine）轉胺酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基（enolpyruvyl）轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶， -較佳地，該岩藻糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， -較佳地，該半乳糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， -較佳地，該葡萄糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， -較佳地，該甘露糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， -較佳地，該N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶， -較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶及β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶。
如請求項1至6中任一項之細胞，其中該細胞能夠表現，較佳表現該等額外醣基轉移酶中之至少兩者，更佳至少三者，甚至更佳至少四者，最佳至少五者。
如請求項1至7中任一項之細胞，其中該細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾。
如請求項1至8中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為岩藻糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）。
如請求項1至9中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。
如請求項1至10中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為半乳糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-半乳糖（UDP-Gal）。
如請求項1至11中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶，且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）。
如請求項1至12中任一項之細胞，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）。
如請求項1至13中任一項之細胞，其中該等核苷酸-糖中之任一者係選自包含以下者之清單：GDP-Fuc、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖（arabino）-4-己酮糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-來蘇糖（lyxo）-4-己酮糖、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（pneumosamine）（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖。
如請求項1至14中任一項之細胞，其中該細胞表現一或多種選自包含以下者之清單的多肽：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透過酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙醯基半乳糖胺焦磷酸化酶，較佳其中該細胞在該等多肽中之任一者的表現或活性方面經修飾。
如請求項1至15中任一項之細胞，其中該細胞能夠合成至少兩種核苷酸-糖，較佳至少三種核苷酸-糖，更佳至少四種核苷酸-糖，甚至更佳至少五種核苷酸-糖。
如請求項1至16中任一項之細胞，其中該等中性岩藻糖基化寡醣中之至少一者經半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。
如請求項1至17中任一項之細胞，其中除該等四種中性岩藻糖基化寡醣以外，該寡醣混合物亦包含至少一種中性非岩藻糖基化寡醣。
如請求項1至18中任一項之細胞，其中該中性寡醣混合物包含至少一種寡醣，該至少一種寡醣經岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。
如請求項1至19中任一項之細胞，其中該細胞使用至少一種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，較佳地，該細胞使用兩種或更多種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，該（等）前驅物自培養基饋至該細胞。
如請求項1至20中任一項之細胞，其中該細胞製造至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物。
如請求項1至21中任一項之細胞，其中該至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物完全轉化為該等寡醣中之任一者。
如請求項1至22中任一項之細胞，其中該細胞胞內製造該等寡醣，且其中該等所製造之寡醣之一部分或實質上全部保留在胞內，及/或經由被動或主動運輸排出到該細胞外。
如請求項1至23中任一項之細胞，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與在該細胞外分泌來自該混合物之該等中性寡醣中之任一者，較佳地其中該膜蛋白參與自該細胞分泌來自該混合物之所有該等中性寡醣。
如請求項1至24中任一項之細胞，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與吸收用於合成該混合物中之該等中性寡醣中之任一者的前驅物及/或受體，較佳地其中該膜蛋白參與吸收所有所需前驅物，更佳地其中該膜蛋白參與吸收所有該等受體。
如請求項24或25中任一項之細胞，其中該膜蛋白係選自包含以下者之清單：搬運蛋白（porter）、P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白（transporter）、β-桶狀孔蛋白、輔助運輸蛋白（transport protein）、推定運輸蛋白及磷酸轉移驅動之基團移位蛋白，較佳地，該等搬運蛋白包含MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白，較佳地，該等P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白包含ABC運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白。
如請求項24至26中任一項之細胞，其中該膜蛋白提供改良之該等寡醣中之任一者之製造及/或能夠實現及/或增強之該等寡醣中之任一者之流出。
如請求項1至27中任一項之細胞，其中該細胞在乳糖與一或多種其他碳源合併之環境中生長時抵抗乳糖殺滅現象。
如請求項1至28中任一項之細胞，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含用於減少乙酸鹽之產生的修飾。
如請求項29之細胞，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含降低或減少表現及/或消除、減弱、降低或延遲活性之包含以下者之蛋白質中之任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基（undecaprenyl）-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-墨角藻糖激酶（fuculokinase）、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶IIBC組分ptsG、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶（phosphotransferase；PTS）IIBC組分malX、酶IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷氧基轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶　醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸解離酶、乙酸激酶、磷醯基轉移酶（phosphoacyltransferase）、磷酸乙醯基轉移酶、丙酮酸脫羧酶。
如請求項1至30中任一項之細胞，其中該細胞能夠製造磷酸烯醇丙酮酸鹽（phosphoenolpyruvate；PEP）。
如請求項1至31中任一項之細胞，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞經修飾以用於增強磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）之製造及/或供應。
如請求項1至32中任一項之細胞，其中該等中性寡醣中之任一者為哺乳動物乳寡醣。
如請求項1至33中任一項之細胞，其中所有該等中性寡醣為哺乳動物乳寡醣。
如請求項1至34中任一項之細胞，其中該等中性寡醣中之任一者為人類ABO血型系統之抗原。
如請求項1至33及35中任一項之細胞，其中該等中性寡醣中之三者為人類ABO血型系統之抗原。
一種藉由細胞且較佳為單一細胞製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物的方法，該方法包含以下步驟： i）提供一種細胞，該細胞（a）能夠表現，較佳表現為岩藻糖基轉移酶之醣基轉移酶，且能夠合成該核苷酸-糖GDP-岩藻糖，及（b）表現至少一種額外醣基轉移酶，及（c）能夠合成至少一種或多種核苷酸-糖，其中該（等）核苷酸-糖為用於該等額外醣基轉移酶之供體，及 ii）在容許表現該等醣基轉移酶及合成該等核苷酸-糖之條件下培養該細胞，使得該細胞製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之該中性混合物，及 iii）較佳地，自該培養分離該等中性寡醣中之至少一者，更佳地，自該培養分離所有該等中性寡醣。
如請求項37之方法，其中該細胞為如請求項1至36中任一項之經代謝工程改造之細胞。
如請求項38之方法，其中該細胞經基因表現模組修飾，其中來自該等表現模組中之任一者的表現為持續型的或藉由天然誘導物產生。
如請求項38或39中任一項之方法，其中該細胞包含編碼一種蛋白質之相同編碼DNA序列之多個複本。
如請求項37至40中任一項之方法，其中該寡醣混合物包含至少三種在聚合度方面不同之不同寡醣。
如請求項37至41中任一項之方法，其中該細胞製造至少五種，較佳至少六種，更佳至少七種，最佳至少八種、至少九種、至少十種不同中性岩藻糖基化寡醣。
如請求項37至42中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者係選自包含以下者之清單：岩藻糖基轉移酶、半乳糖基轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶、N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶、N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶、木糖基轉移酶、葡萄糖胺基轉移酶、鼠李糖基轉移酶、N-乙醯基鼠李糖基轉移酶、UDP-4-胺基-4,6-二去氧-N-乙醯基-β-L-阿卓糖胺轉胺酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺烯醇丙酮醯基轉移酶及岩藻糖胺基轉移酶， -較佳地，該岩藻糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-岩藻糖基轉移酶、α-1,3-岩藻糖基轉移酶、α-1,4-岩藻糖基轉移酶及α-1,6-岩藻糖基轉移酶， -較佳地，該半乳糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：β-1,3-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺β-1,4-半乳糖基轉移酶、α-1,3-半乳糖基轉移酶及α-1,4-半乳糖基轉移酶， -較佳地，該葡萄糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-葡萄糖基轉移酶、β-1,2-葡萄糖基轉移酶、β-1,3-葡萄糖基轉移酶及β-1,4-葡萄糖基轉移酶， -較佳地，該甘露糖基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,2-甘露糖基轉移酶、α-1,3-甘露糖基轉移酶及α-1,6-甘露糖基轉移酶， -較佳地，該N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：半乳糖苷β-1,3-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶及β-1,6-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶， -較佳地，該N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶係選自包含以下者之清單：α-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶及β-1,3-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶。
如請求項37至43中任一項之方法，其中該細胞在該等醣基轉移酶中之至少一者的表現或活性方面經修飾。
如請求項37至44中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為岩藻糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）。
如請求項37至45中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）。
如請求項37至46中任一項之方法，其中該額外醣基轉移酶中之任一者為半乳糖基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-半乳糖（UDP-Gal）。
如請求項37至47中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶，且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）。
如請求項37至48中任一項之方法，其中該等額外醣基轉移酶中之任一者為N-乙醯基甘露糖胺基轉移酶且該等供體核苷酸-糖中之一者為UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）。
如請求項37至49中任一項之方法，其中該等核苷酸-糖中之任一者係選自包含以下者之清單：GDP-岩藻糖（GDP-Fuc）、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-N-乙醯基半乳糖胺（UDP-GalNAc）、UDP-N-乙醯基甘露糖胺（UDP-ManNAc）、GDP-甘露糖（GDP-Man）、UDP-葡萄糖（UDP-Glc）、GDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-阿拉伯糖-4-己酮糖、UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧--L-來蘇糖-4-己酮糖、UDP-N-乙醯基-L-鼠李糖胺（UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-甘露糖）、dTDP-N-乙醯基岩藻糖胺、UDP-N-乙醯基岩藻糖胺（UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-半乳糖）、UDP-N-乙醯基-L-紐莫糖胺（UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-塔羅糖）、UDP-N-乙醯基胞壁酸、UDP-N-乙醯基-L-異鼠李糖胺（UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙醯胺基-2,6-二去氧-L-葡萄糖）、GDP-L-異鼠李糖。
如請求項37至50中任一項之方法，其中該細胞表現一或多種選自包含以下者之清單的多肽：甘露糖-6-磷酸異構酶、磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、GDP-甘露糖4,6-脫水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透過酶、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、岩藻糖-1-磷酸鳥苷醯基轉移酶、L-麩醯胺酸-D-果糖-6-磷酸胺基轉移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、N-醯基葡萄糖胺2-表異構酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺2-表異構酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、磷酸乙醯基葡萄糖胺變位酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯基轉移酶、半乳糖-1-表異構酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、UDP-葡萄糖4-表異構酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶、UDP-N-乙醯基葡萄糖胺4-表異構酶、N-乙醯基半乳糖胺激酶及UDP-N-乙醯基半乳糖胺焦磷酸化酶，較佳其中該細胞在該等多肽中之任一者的表現或活性方面經修飾。
如請求項37至51中任一項之方法，其中該細胞能夠合成至少兩種核苷酸-糖，較佳至少三種核苷酸-糖，更佳至少四種核苷酸-糖，甚至更佳至少五種核苷酸-糖。
如請求項37至52中任一項之方法，其中該等中性岩藻糖基化寡醣中之至少一者經半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。
如請求項37至53中任一項之方法，其中除該等四種中性岩藻糖基化寡醣以外，該寡醣混合物亦包含至少一種中性非岩藻糖基化寡醣。
如請求項37至54中任一項之方法，其中該中性寡醣混合物包含至少一種寡醣，該至少一種寡醣經岩藻糖基化、半乳糖基化、葡萄糖基化、木糖基化、甘露糖基化、含有N-乙醯基葡萄糖胺、含有N-乙醯基半乳糖胺、含有鼠李糖及/或含有N-乙醯基甘露糖胺。
如請求項37至55中任一項之方法，其中該細胞使用至少一種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，較佳地，該細胞使用兩種或更多種用於製造該等寡醣中之任一者或多者的前驅物，該（等）前驅物自培養基饋至該細胞。
如請求項37至56中任一項之方法，其中該細胞製造至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物。
如請求項37至57中任一項之方法，其中該至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物完全轉化為該等寡醣中之任一者。
如請求項37至58中任一項之方法，其中該細胞胞內製造該等寡醣，且其中該等所製造之寡醣之一部分或實質上全部保留在胞內，及/或經由被動或主動運輸排出到該細胞外。
如請求項37至59中任一項之方法，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與在該細胞外分泌來自該混合物之該等中性寡醣中之任一者，較佳地其中該膜蛋白參與自該細胞分泌來自該混合物之所有該等中性寡醣。
如請求項37至60中任一項之方法，其中該細胞進一步經遺傳修飾以用於 i）內源性膜蛋白之經修飾表現，及/或 ii）內源性膜蛋白之經修飾活性，及/或 iii）同源膜蛋白之表現，及/或 iv）異源膜蛋白之表現，其中該膜蛋白參與吸收用於合成該混合物中之該等中性寡醣中之任一者的前驅物及/或受體，較佳地其中該膜蛋白參與吸收所有所需前驅物，更佳地其中該膜蛋白參與吸收所有該等受體。
如請求項60或61中任一項之方法，其中該膜蛋白係選自包含以下者之清單：搬運蛋白、P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白、β-桶狀孔蛋白、輔助運輸蛋白、推定運輸蛋白及磷酸轉移驅動之基團移位蛋白，較佳地，該等搬運蛋白包含MFS運輸蛋白、糖流出運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白，較佳地，該等P-P-鍵水解驅動之運輸蛋白包含ABC運輸蛋白及螯鐵蛋白輸出蛋白。
如請求項60至62中任一項之方法，其中該膜蛋白提供改良之該等寡醣中之任一者之製造及/或能夠實現及/或增強之該等寡醣中之任一者之流出。
如請求項37至63中任一項之方法，其中該細胞在乳糖與一或多種其他碳源合併之環境中生長時抵抗乳糖殺滅現象。
如請求項37至64中任一項之方法，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含用於減少乙酸鹽之產生的修飾。
如請求項65之方法，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞包含降低或減少表現及/或消除、減弱、降低或延遲活性之包含以下者之蛋白質中之任一者或多者：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-磷酸去乙醯酶、葡萄糖胺-6-磷酸脫胺酶、N-乙醯基葡萄糖胺抑制蛋白、核糖核苷酸單磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖:十一異戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸轉移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖異構酶、N-乙醯基神經胺酸解離酶、N-乙醯基甘露糖胺激酶、N-乙醯基甘露糖胺-6-磷酸2-表異構酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷醯基轉移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依賴型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶、有氧呼吸控制蛋白、轉錄抑制蛋白IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶IIBC組分ptsG、葡萄糖特異性移位磷酸轉移酶（PTS）IIBC組分malX、酶IIA ^Glc、β-葡萄糖苷特異性PTS酶II、果糖特異性PTS多磷氧基轉移蛋白FruA及FruB、乙醇脫氫酶　醛脫氫酶、丙酮酸-甲酸解離酶、乙酸激酶、磷醯基轉移酶、磷酸乙醯基轉移酶、丙酮酸脫羧酶。
如請求項37至66中任一項之方法，其中該細胞能夠製造磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）。
如請求項37至67中任一項之方法，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞經修飾以用於增強磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）之製造及/或供應。
如請求項37至68中任一項之方法，其中該等中性寡醣中之任一者為哺乳動物乳寡醣。
如請求項37至69中任一項之方法，其中所有該等中性寡醣為哺乳動物乳寡醣。
如請求項37至69中任一項之方法，其中該等中性寡醣中之任一者為人類ABO血型系統之抗原。
如請求項37至69及71中任一項之方法，其中該等中性寡醣中之三者為人類ABO血型系統之抗原。
如請求項37至72中任一項之方法，其中該等條件包含： -使用包含至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物及/或受體之培養基，及/或 -向該培養基添加至少一種用於製造該等寡醣中之任一者的前驅物及/或受體進料。
如請求項37至73中任一項之方法，該方法包含以下步驟中之至少一者： i）使用包含至少一種前驅物及/或受體之培養基； ii）在反應器中向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii）在反應器中向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，其中總反應器體積在250 mL（毫升）至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該前驅物及/或受體進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍；且其中較佳地，該前驅物及/或受體進料之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該前驅物及/或受體進料之溫度保持在20℃與80℃之間； iv）歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料； v）歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加至少一種前驅物及/或受體進料，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在最終培養中產生濃度為至少50 g/L，較佳至少75 g/L，更佳至少90 g/L，更佳至少100 g/L，更佳至少125 g/L，更佳至少150 g/L，更佳至少175 g/L，更佳至少200 g/L之該等寡醣中之任一者。
如請求項37至73中任一項之方法，該方法包含以下步驟中之至少一者： i）使用包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的培養基，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內； ii）向該培養基添加包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍； iii）向該培養基添加包含每公升初始反應器體積至少50，更佳至少75，更佳至少100，更佳至少120，更佳至少150公克之乳糖的乳糖進料，其中該反應器體積在250 mL至10.000 m ³（立方公尺）範圍內，較佳以連續方式添加，且較佳使得該培養基之最終體積不超過添加該乳糖進料之前的該培養基之體積的三倍，較佳不超過兩倍，更佳小於兩倍，且其中較佳地，該乳糖進料之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該乳糖進料之溫度保持在20℃與80℃之間； iv）歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加乳糖進料； v）歷經1天、2天、3天、4天、5天之時程藉助於進料溶液以連續方式向該培養基添加乳糖進料，且其中該乳糖進料溶液之濃度為50 g/L，較佳75 g/L，更佳100 g/L，更佳125 g/L，更佳150 g/L，更佳175 g/L，更佳200 g/L，更佳225 g/L，更佳250 g/L，更佳275 g/L，更佳300 g/L，更佳325 g/L，更佳350 g/L，更佳375 g/L，更佳400 g/L，更佳450 g/L，更佳500 g/L，甚至更佳550 g/L，最佳600 g/L，且其中較佳地，該進料溶液之pH設定為3與7之間，且其中較佳地，該進料溶液之溫度保持在20℃與80℃之間；該方法在最終培養中產生濃度為至少50 g/L，較佳至少75 g/L，更佳至少90 g/L，更佳至少100 g/L，更佳至少125 g/L，更佳至少150 g/L，更佳至少175 g/L，更佳至少200 g/L之該等寡醣中之任一者。
如請求項75之方法，其中該乳糖進料係藉由自該培養開始以至少5 mM之濃度，較佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150 mM之濃度，更佳以＞ 300 mM之濃度添加乳糖來實現。
如請求項75或76中任一項之方法，其中該乳糖進料係藉由以一濃度向該培養中添加乳糖來實現，該濃度使得在該培養之整個製造階段中獲得至少5 mM，較佳10 mM或30 mM之乳糖濃度。
如請求項37至77中任一項之方法，其中宿主細胞經培養至少約60、80、100或約120小時或以連續方式培養。
如請求項37至78中任一項之方法，其中該細胞培養於包含碳源之培養基中，該碳源包含單醣、雙醣、寡醣、多醣、多元醇、甘油、包括糖蜜、玉米浸液、蛋白腖、胰腖或酵母萃取物之複合培養基中；較佳地，其中該碳源係選自包含以下者之清單：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽-寡醣、麥芽三糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、繭蜜糖、澱粉、纖維素、半纖維素、糖蜜、玉米浸液、高果糖漿、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽及丙酮酸鹽。
如請求項37至79中任一項之方法，其中該培養基含有至少一種選自包含以下者之群的前驅物：乳糖、半乳糖、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖（lacto-N-biose；LNB）、N-乙醯基乳糖胺（LacNAc）。
如請求項37至80中任一項之方法，其中指數式細胞生長之第一階段係藉由在將該前驅物，較佳乳糖在第二階段中添加至該培養基之前將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至該培養基中來提供。
如請求項37至81中任一項之方法，其中指數式細胞生長之第一階段係藉由將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驅物，較佳乳糖之該培養基中來提供，之後為其中僅將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至該培養基之第二階段。
如請求項37至82中任一項之方法，其中指數式細胞生長之第一階段係藉由將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖添加至包含前驅物，較佳乳糖之該培養基中來提供，之後為其中將碳基基質，較佳葡萄糖或蔗糖，及前驅物，較佳乳糖添加至該培養基之第二階段。
如請求項37至83中任一項之方法，其中該分離包含以下步驟中之至少一者：澄清、超過濾、奈米過濾、二相分配、逆滲透、微過濾、活性炭或碳處理、用非離子界面活性劑處理、酶消化、切向流高效能過濾、切向流超過濾、親和層析、離子交換層析、疏水性相互作用層析及/或凝膠過濾、配位體交換層析。
如請求項37至84中任一項之方法，其進一步包含自該細胞純化該等中性寡醣中之任一者。
如請求項85之方法，其中該純化包含以下步驟中之至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、奈米過濾、超過濾、電泳、酶處理或離子交換、使用醇、使用水醇混合物、結晶、蒸發、沈澱、乾燥，噴霧乾燥、凍乾、噴霧冷凍乾燥、冷凍噴霧乾燥、條帶式乾燥（band drying）、帶式乾燥（belt drying）、真空條帶式乾燥、真空帶式乾燥、轉筒乾燥、滾筒乾燥、真空轉筒乾燥或真空滾筒乾燥。
如請求項1至36中任一項之細胞或如請求項37至86中任一項之方法，其中該細胞為細菌、真菌、酵母菌、植物細胞、動物細胞或原蟲細胞， -較佳地，該細菌為大腸桿菌（ Escherichia coli）菌株，更佳為K-12菌株之大腸桿菌菌株，甚至更佳大腸桿菌K-12菌株為大腸桿菌MG1655， -較佳地，該真菌屬於選自包含以下者之群的屬：根黴菌屬（ Rhizopus）、網柄菌屬（ Dictyostelium）、青黴菌屬（ Penicillium）、白黴菌屬（ Mucor）或麴菌屬（ Aspergillus）， -較佳地，該酵母菌屬於選自包含以下者之群的屬：酵母菌屬（ Saccharomyces）、接合酵母屬（ Zygosaccharomyces）、畢赤酵母屬（ Pichia）、駒形氏酵母屬（ Komagataella）、漢森酵母屬（ Hansenula）、亞羅酵母屬（ Yarrowia）、斯塔莫酵母屬（ Starmerella）、克魯維酵母屬（ Kluyveromyces）或德巴利酵母屬（ Debaromyces）， -較佳地，該植物細胞為藻類細胞或衍生自菸草、苜蓿、稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物， -較佳地，該動物細胞衍生自非人類哺乳動物、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬行動物、兩棲動物或昆蟲，或為衍生自不包括胚胎幹細胞之人類細胞的經遺傳修飾之細胞系，更佳地該人類及非人類哺乳動物細胞為上皮細胞、胚胎腎細胞、纖維母細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary；CHO）細胞、鼠類骨髓瘤細胞、NIH-3T3細胞、非乳腺成體幹細胞或其衍生物，更佳地該昆蟲細胞衍生自斜紋夜盜蟲（ Spodoptera frugiperda）、家蠶（ Bombyx mori）、甘藍夜蛾（ Mamestra brassicae）、粉紋夜蛾（ Trichoplusia ni）或黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）， -較佳地，該原蟲細胞為蜥蜴利什曼原蟲（ Leishmania tarentolae）細胞。
如請求項87之細胞或如請求項87之方法，其中與未經修飾之先驅細胞相比，該細胞為存活的革蘭氏陰性細菌（Gram-negative bacterium），該細菌包含減少或消除合成之聚-N-乙醯基-葡萄糖胺（poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG）、腸內菌共同抗原（Enterobacterial Common Antigen；ECA）、纖維素、可拉酸（colanic acid）、核寡醣、滲透調節周質葡聚糖（Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG）、甘油葡萄糖苷、聚醣及/或繭蜜糖。
一種如請求項1至36、87、88中任一項之細胞或如請求項37至88中任一項之方法的用途，其用於製造至少四種不同中性岩藻糖基化寡醣之中性混合物。