CN104611249B - 一种利用醛缩酶全细胞合成d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents
一种利用醛缩酶全细胞合成d-阿洛酮糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104611249B CN104611249B CN201410648577.3A CN201410648577A CN104611249B CN 104611249 B CN104611249 B CN 104611249B CN 201410648577 A CN201410648577 A CN 201410648577A CN 104611249 B CN104611249 B CN 104611249B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phosphate
- psicose
- gene
- corynebacterium glutamicum
- fructose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- BJHIKXHVCXFQLS-PUFIMZNGSA-N D-psicose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PUFIMZNGSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 title abstract description 15
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims abstract description 56
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- ZKLLSNQJRLJIGT-UYFOZJQFSA-N keto-D-fructose 1-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O ZKLLSNQJRLJIGT-UYFOZJQFSA-N 0.000 claims abstract description 33
- PTVXQARCLQPGIR-SXUWKVJYSA-N beta-L-fucose 1-phosphate Chemical compound C[C@@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O PTVXQARCLQPGIR-SXUWKVJYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde Chemical compound OC[C@@H](O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 11
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 14
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 11
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 claims description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 7
- PNNNRSAQSRJVSB-KCDKBNATSA-N aldehydo-L-fucose Chemical compound C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-KCDKBNATSA-N 0.000 claims description 6
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 5
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 claims description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 2
- 101150096822 Fuca1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 abstract description 3
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 abstract description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 101710109941 D-tagatose 3-epimerase Proteins 0.000 abstract 1
- 101710141886 Ketose 3-epimerase Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 6
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108030002106 D-psicose 3-epimerases Proteins 0.000 description 5
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 5
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 5
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 4
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 3
- LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N D-allulose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O LKDRXBCSQODPBY-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 3
- 108030002100 D-tagatose 3-epimerases Proteins 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-OEXCPVAWSA-N D-tagatose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-OEXCPVAWSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerol Natural products OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- PJTTXANTBQDXME-UGDNZRGBSA-N sucrose 6(F)-phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@]1(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 PJTTXANTBQDXME-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- IUKHSWVQCORLGA-YRESGBGGSA-N (3r,4r,5r)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO IUKHSWVQCORLGA-YRESGBGGSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 1
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 101710114330 D-psicose 3-epimerase Proteins 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-IANNHFEVSA-N D-sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKDRXBCSQODPBY-IANNHFEVSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000227647 Fucus vesiculosus Species 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 108010009384 L-Iditol 2-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 241000990531 Puccinia hieracii Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108030003267 Rhamnulose-1-phosphate aldolases Proteins 0.000 description 1
- 102100026974 Sorbitol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- KNYGWWDTPGSEPD-OTWZMJIISA-N [(3s,4r,5s)-3,4,5-trihydroxy-2-oxohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O KNYGWWDTPGSEPD-OTWZMJIISA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001013 cariogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150024923 da gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940120503 dihydroxyacetone Drugs 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- BJHIKXHVCXFQLS-PYWDMBMJSA-N keto-D-sorbose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PYWDMBMJSA-N 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- -1 low in cost Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
Abstract
本发明一种利用醛缩酶全细胞合成D‑阿洛酮糖的方法，公开了一种微生物发酵法合成D‑阿洛酮糖的方法。首先构建携带有L‑墨角藻糖‑1‑磷酸醛缩酶基因和果糖‑1‑磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12，其次在基本盐培养基中添加葡萄糖和D‑甘油醛，葡萄糖经胞内的糖酵解途径合成磷酸二羟丙酮，D‑甘油醛和磷酸二羟丙酮（DHAP）在谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12携带的L‑墨角藻糖‑1‑磷酸醛缩酶和果糖‑1‑磷酸化酶的作用下合成单一产物D‑阿洛酮糖，D‑甘油醛转化率为53%。因此，本发明的D‑阿洛酮糖的生物合成方法与目前通过酮糖3‑差向异构酶体外合成D‑阿洛酮糖的方法相比，具有转化率高，产物单一，便于分离等优点，为D‑阿洛酮糖的大规模生产打下一定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法。即利用基因工程技术和微生物学方法获得谷氨酸棒杆菌重组菌株，并利用该重组菌株高效合成D-阿洛酮糖。
背景技术
稀少糖（Rare Sugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物（2002年国际稀少糖学会ISRS定义）。其具有热量低、稳定性高、无致龋齿性、耐受性高等优点，在膳食、保健、医药等领域引起了广泛关注，它们可以作为添加剂改善食品的理化性质，提高食品的生理功能和保健功能。近年来，科学家致力于研究的稀少糖主要有D-阿洛糖（D-Allose）、D-阿洛酮糖（D-psicose）、D-塔格糖（D-Tagatose）等。其中D-阿洛酮糖（果糖C-3差向异构体）是一种重要的稀少糖。研究人员分别证实了D-阿洛酮糖是零或低热量、食用安全的填充型甜味剂，它们对胰岛素没有依赖性，可改善糖尿病患者的饮食，适合于糖尿病患者食用，是低热量功能性的理想蔗糖替代品（Matsuo T, Suzuki H, Hashiguchi M, et al.D-psicose is a rare sugar that provides no energy to growing rats. J. NutrSci Vitaminol (Tokyo). 2002. 48(1): 77-80.）。美国食品与药品管理局（FDA）在2012年就将D-阿洛酮糖列为安全食品（GRAS）添加剂。
国际市场对D-阿洛酮糖的应用越来越关注，市场需求量不断增大。然而，D-阿洛酮糖在自然界中含量低、且难以化学合成，传统的化学合成法已不能满足大规模的生产需要。因此，从来源于自然界中的丰富原料通过生物转化的方法合成稀少糖，实现规模化生产是D-阿洛酮糖广泛应用的基础。日本的研究学者 Izumori于 2002 年建立了稀少糖的生物转化生产策略，即Izumoring 方法，该方法中利用酮糖差向异构酶(Ketose epimerase)、醛糖异构酶 (Aldose isomerases)和多元醇脱氢酶(Poly dehydrogenase)进行所有单糖及糖醇之间的相互转化（Izumori K. Bioproduction strategies for rare hexoses.Naturwissenschaften, 2002, 89:120-124.）。目前，生物转化法合成D-阿洛酮糖主要是通过酮糖3位差向异构酶完成，将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。该酮糖3位差向异构酶酶系根据其作用最适底物分为：D-塔格糖 3-差向异构酶（D-tagatose 3-epimerase，DTEase）和 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase，DPEase），它们的催化效率为20-32％。此外，来源于根癌农杆菌（A. tumefaciens）的DPE（D-阿洛酮糖 3-差向异构酶）和菊苣假单胞菌（P. cichorii）的DTE（D-塔格糖 3-差向异构酶）也可以将D-果糖转化为D-阿洛酮糖（Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, Lee YJ, Oh DK (2006a) Characterization of anAgrobacterium tumefaciens D-psicose 3-epimerase that converts D-fructose toD-psicose. Appl Environ Microbiol 72:981–985）。近年来研究发现醛缩酶同样可用于稀少糖的生物合成（Brovetto M, Gamenara D, Saenz Mendez P, Seoane GA.C-C bond-forming lyases in organic synthesis. Chemical Reviews 2011.111:4346-4403）。例如L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶可以以磷酸二羟丙酮和D-甘油醛为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖（Li Z, Cai L, Qi Q, Wang P. Enzymatic synthesis of D -sorbose and D -psicose with aldolase FucA: Effect of acceptor configuration on enzymestereoselectivity. Bioorg.Med.Chem. Lett. 2011).21.7081–7084）。上述D-阿洛酮糖的生物合成方法中存在一个共性问题，即反应终止时，反应液含有两种及两种以上的单糖，导致分离成本提高。所以开发一种能够合成单一产物D-阿洛酮糖的生物合成方法很有意义。
目前，与D-阿洛酮糖合成相关的国外专利主要通过3-差向异构酶及其固定化体外催化果糖来合成（Deok-Kun Oh,Hye-Jung Kim, Yong-Joo Lee, Sang-Hoon Song,Seung-Won Park, Jung-Hoon Kim,Seong-Bo Kim. D-psicose production method by D-psicose epimerase. US 8030035 B2,2011.10.04; Yang Hee Kim, Jin Ha Kim, YoungMi Lee, Young Ho Hong, Min Hae Kim, Seong Bo Kim, Seung Won Park, Seung HyunOh, Deok Kun Oh, Jin Geun Choi. D-psicose 3-epimerase mutant with improvedthermal stability, and continuous production of D-psicose using same. US2014/0199732 A1,2014.07.17; Young Plo Hong,Jin Ha Kim, Sung Bo Kim,Jung HoonKim,Young Mi Lee, Seung Won Park. Immobilization of psicose-epimerase and amethod of producing D-psicose using the same. US 8735106 B2.2014.05.27）。由于3-差向异构酶催化果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率仅有20-32%，故反应终止时，体系中同时含有果糖和D-阿洛酮糖，导致分离操作较复杂，成本较高。来源于大肠杆菌的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶可以催化磷酸二羟丙酮和D-甘油醛体外合成单一产物D-阿洛酮糖，但是由于磷酸二羟丙酮价格较贵，且不稳定，所以很难进行大规模体外合成。然而磷酸二氢丙酮还可以以葡萄糖，果糖，蔗糖为底物，通过胞内的糖酵解途径实现体内合成，所以通过构建重组菌株以葡萄糖和D-甘油醛为底物全细胞转化合成D-阿洛酮糖具有很大的应用潜力。目前国内外相关专利尚未报道。因此，通过基因工程和代谢工程的方法和思路构建微生物重组菌株，再以葡萄糖和D-甘油醛为底物发酵生产D-阿洛酮糖是本发明的一个中心思路。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于发酵生产D-阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的重组菌株。
本发明所提供的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株的名称为SY12，该菌株已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9838。
本发明另一目的在于提供一种构建谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12的方法。
构建权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12CGMCC No.9838的方法，包括以下步骤：
向野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入来源于大肠杆菌的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY12。具体的包括以下两个步骤：
1.1构建L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXRTY，其物理图谱如图2所示，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因（648bp，序列表中序列1）和果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因（567bp，序列表中序列2）、来源于pXMJ19的tac启动子（307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前再添加一个启动子），再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成的融合基因FucA-tac-YqaB（1548bp，序列表中序列4），然后将融合基因FucA-tac-YqaB连接入载体pXMJ19中，得到携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体，命名为pXFTY，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
1.2向野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中导入携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，得到携带携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12。
本发明还一目的在于提供所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12 CGMCC No.9838在合成D-阿洛酮糖中的应用。
具体的，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12可以D-甘油醛和葡萄糖为底物合成单一产物D-阿洛酮糖。即在发酵培养基中添加D-甘油醛和葡萄糖，葡萄糖经过胞内的糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮（DHAP），D-甘油醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖。
采取以上技术方案，本发明提供了一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法。实验证明，该携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12可以以D-甘油醛和葡萄糖为底物，发酵合成单一产物D-阿洛酮糖，该合成方法高效，而且产物便于分离纯化，生产的D-阿洛酮糖将在在食品和医药行业具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12合成D-阿洛酮糖的技术路线
图2为携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY的物理图谱
图3为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12以D-甘油醛为底物合成D-阿洛酮糖的高效液相色谱分析结果。
具体实施方式
本发明具体提供一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法。还具体提供了一株用于生产D-阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12及其构建方法。
本发明的技术路线如图1所示，包括以下两个步骤：（1）在野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入外源L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因，得到具有醛缩途径（即携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因）的重组谷氨酸棒杆菌SY12；（2）在发酵培养基中添加D-甘油醛和葡萄糖，葡萄糖经过胞内的糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮（DHAP），D-甘油醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖。
构建携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的重组谷氨酸棒杆菌SY12包括以下过程：
1.1构建L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，其物理图谱如图2所示，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因（648bp，序列表中序列1）和果糖-1-磷酸化酶基因（YqaB）（567bp，序列表中序列2）、来源于pXMJ19的tac启动子（307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前添加tac启动子），再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成的融合基因FucA-tac-YqaB（1548bp，序列表中序列4），然后将融合基因FucA-tac-YqaB连接入载体pXMJ19中，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体，命名为pXFTY，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
1.2野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中导入携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY12。
本发明的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12可用于合成D-阿洛酮糖，具体的在发酵培养基中添加D-甘油醛和葡萄糖，葡萄糖经过胞内的糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮（DHAP），D-甘油醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖。
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物由北京华大基因有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、构建谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12的构建，包括以下步骤：
1、构建L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY
1.1根据Genbank中大肠杆菌MG1655（购自Invitrogen）的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因（Genbank号：947282，648bp，序列表中序列1）和果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因（Genbank号：945776，567bp，序列表中序列2），设计引物1和引物2、引物5和引物6。根据Genbank中载体pXMJ19中tac启动子（307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前添加启动子）的序列，设计引物3和引物4，引物1和引物5含有RBS位点序列（AAGGAGATATAG），引物1和引物6带有Sal I和EcoR I酶切位点，引物序列如下：
引物1：5’- GGGACGTCGACAAGGAGATATAGATGGAACGAAATAAACTTGCTCG -3’
引物2：5’- CGAAGCGGCATTTACGTTTTACTCTTCAATTCGTAACCCATAG -3’；
引物3：5’- TGGGTTACGAATTGAAGAGTAAAACGTAAATGCCGCTTCGCC-3’
引物4：5’- ACGCTCGTACATCTATATCTCCTTCATGGTCCTGTTTCCTGTGTGA -3’；
引物5：5’- GGAAACAGGACCATGAAGGAGATATAGATGTACGAGCGTTATGCAGGTT -3’
引物6：5’- CCGGAATTCTTATCACAGCAAGCGAACATCCAC -3’；
1.2以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，通过引物1和引物2 PCR扩增基因L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因（648bp，序列表中序列1），通过引物5和引物6 PCR扩增果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因（567bp，序列表中序列2）。
1.3以载体pXMJ19（Genbank号：AJ133195.1，6601bp，序列表中序列5）为模板，通过引物3和引物4 PCR扩增启动子tac启动子（307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前添加启动子）。
1.4引物2和引物3有40bp的同源区（TGGGTTACGAATTGAAGAGTAAAACGTAAATGCCGCTTCG），引物4和引物5有39bp的同源区（GGAAACAGGACCATGAAGGAGATATAGATGTACGAGCGT），可用于进行融合PCR，并且在引物15和引物13含有RBS位点序列（AAGGAGATATAG），引物1和引物6带有Sal I和EcoR I酶切位点，以三个PCR产物（FucA，tac，YqaB）为模板，用引物1和引物6PCR扩增得到由FucA、tac、YqaB三个基因组成含有Sal和EcoR I酶切位点的融合基因Sal I-FucA-tac-YqaB-EcoR I（1568bp，序列表中序列4）。
1.5用限制性内切酶Sal I和EcoR I同时酶切融合基因Sal I-FucA-tac-YqaB-EcoR I和载体pXMJ19（Genbank号：AJ133195.1，6601bp，序列表中序列5），运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pXMJ19和融合基因Sal I-FucA-tac-YqaB-EcoR I进行连接，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体，命名为pXFTY，其物理图谱如图2所示，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中FucA-tac–YqaB片段的核苷酸序列对应序列表中序列5（1548bp），在序列6中为28bp-1576bp对应的部分。
1.6 将构建得到的载体pXFTY进行测序验证，相关测序工作由北京华大基因有限公司完成，验证正确后，将载体pXFTY置于﹣20°保存。
2、获得携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12
向野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中导入携带携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12，过程如下：
2.1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞（100ul），将携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY（1 ug）电转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞中，46℃热激6 min，随后放入30℃摇床中复苏45min，将菌液涂布于含有氯霉素抗生素（12.5 ug/mL）的固体培养基BHIS（脑心浸粉：51g/L，山梨醇：91g/L）中，放置于30℃培养箱中培养36h。
2.2挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性菌落，用引物1和引物6进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1568bp DNA片段（此DNA片段为载体pXFTY中Sal I-FucA-tac-YqaB-EcoRI基因片段）的为阳性克隆。
2.3保存经验证正确的菌株，即携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY12。
该谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株的名称为SY12，该菌株已于2014年10月24日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9838。
实施例2、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12在生产D-阿洛酮糖中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12的培养及诱导
选用CGXII培养基（配方：(NH4)2SO4(5g/L), urea (5g/L), KH2PO4 (1g/L),K2HPO4 (1g/L), MgSO4∙7H2O (0.25g/L), CaCl2 (10mg/L), FeSO4∙7H2O (10mg/L), MnSO4∙H2O (0.1mg/L), ZnSO4∙7H2O (1mg/L), CuSO4∙5H2O (0.2mg/L), NiCl2∙6H2O (20μg/L),生物素 (0.4mg/L), MOPS (42g/L) (pH 7.4))，培养基中添加葡萄糖（10g/L）和氯霉素（12.5mg/L），在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12进行培养，当OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mM，降低摇床转速为120rmp，诱导约12h。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12的收集和浓缩
将诱导得到的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12菌液（100mL），4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用CGXII培养基洗涤菌液两次，最终用CGXII培养基浓缩菌液至10mL。
3、D-阿洛糖的发酵生产
取10mL谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为2％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的葡萄糖和1％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的D-甘油醛进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH 7.0，菌体浓度(OD600)为30。
发酵结束后，对样品进行 14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Xtimate Sugar-Ca，流动相：EDTA-Ca（0.1mM），流速：0.4 mL/min，柱温：70℃，检测器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D-阿洛酮糖纯品为标准品，上样量为20μl。
结果如图3（（a）表示D-阿洛酮糖标品；（b）表示发酵液）所示，可以看出，经过24小时反应，发酵液中D-阿洛糖的浓度为10.6 g/L， D-甘油醛转化率为53％，发酵液中未检测到剩余葡萄糖和D-甘油醛，表明谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12可以以D-甘油醛为底物合成单一产物D-阿洛酮糖。
目前通过异构酶以果糖为底物合成阿洛酮糖，仅有25-30%的转化率，且产物不容易分离，本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12在生物合成D-阿洛酮糖方面，具有较高转化率，且整个发酵过程采用基本盐培养基，成本低廉，产物便于分离纯化，具有广阔的应用前景和竞争力。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法
<130> CN00424111
<160> 6
<210> 1
<211> 648
<212> DNA
<213> 大肠杆菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因的核苷酸序列
<400> 1
atggaacgaa ataaacttgc tcgtcagatt attgacactt gcctggaaat gacccgcctg 60
ggactgaacc aggggacagc ggggaacgtc agtgtacgtt atcaggatgg gatgctgatt 120
acgcctacag gcattccata tgaaaaactg acggagtcgc atattgtctt tattgatggc 180
aacggtaaac atgaggaagg aaagctcccc tcaagcgaat ggcgtttcca tatggcagcc 240
tatcaaagca gaccggatgc caacgcggtt gttcacaatc atgccgttca ttgcacggca 300
gtttccattc ttaaccgatc gatccccgct attcactaca tgattgcggc ggctggcggt 360
aattctattc cttgcgcgcc ttatgcgacc tttggaacac gcgaactttc tgaacatgtt 420
gcgctggctc tcaaaaatcg taaggcaact ttgttacaac atcatgggct tatcgcttgt 480
gaggtgaatc tggaaaaagc gttatggctg gcgcatgaag ttgaagtgct ggcgcaactt 540
tacctgacga ccctggcgat tacggacccg gtgccagtgc tgagcgatga agagattgcc 600
gtagtgctgg agaaattcaa aacctatggg ttacgaattg aagagtaa 648
<210> 2
<211> 567
<212> DNA
<213> 大肠杆菌MG1655的果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因的核苷酸序列
<400> 2
atgtacgagc gttatgcagg tttaattttt gatatggatg gcacaatcct ggatacggag 60
cctacgcacc gtaaagcgtg gcgcgaagta ttagggcact acggtcttca gtacgatatt 120
caggcgatga ttgcgcttaa tggatcgccc acctggcgta ttgctcaggc aattattgag 180
ctgaatcagg ccgatctcga cccgcatgcg ttagcgcgtg aaaaaacaga agcagtaaga 240
agtatgctgc tggatagcgt cgaaccgctt cctcttgttg atgtggtgaa aagttggcat 300
ggtcgtcgcc caatggctgt aggaacgggg agtgaaagcg ccatcgctga ggcattgctg 360
gcgcacctgg gattacgcca ttattttgac gccgtcgtcg ctgccgatca cgtcaaacac 420
cataaacccg cgccagacac atttttgttg tgcgcgcagc gtatgggcgt gcaaccgacg 480
cagtgtgtgg tctttgaaga tgccgatttc ggtattcagg cggcccgtgc agcaggcatg 540
gacgccgtgg atgttcgctt gctgtga 567
<210> 3
<211> 307
<212> DNA
<213> pXMJ19的tac启动子的核苷酸序列
<400> 3
aacgtaaatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg aattgcaagc tgatccgggc ttatcgactg 60
cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggctgtgca 120
ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt 180
ttttgcgccg acatcataac ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa 240
tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagg 300
accatga 307
<210> 4
<211> 1548
<212> DNA
<213> 融合基因FucA-tac-YqaB的核苷酸序列
<400> 4
aaggagatat agatggaacg aaataaactt gctcgtcaga ttattgacac ttgcctggaa 60
atgacccgcc tgggactgaa ccaggggaca gcggggaacg tcagtgtacg ttatcaggat 120
gggatgctga ttacgcctac aggcattcca tatgaaaaac tgacggagtc gcatattgtc 180
tttattgatg gcaacggtaa acatgaggaa ggaaagctcc cctcaagcga atggcgtttc 240
catatggcag cctatcaaag cagaccggat gccaacgcgg ttgttcacaa tcatgccgtt 300
cattgcacgg cagtttccat tcttaaccga tcgatccccg ctattcacta catgattgcg 360
gcggctggcg gtaattctat tccttgcgcg ccttatgcga cctttggaac acgcgaactt 420
tctgaacatg ttgcgctggc tctcaaaaat cgtaaggcaa ctttgttaca acatcatggg 480
cttatcgctt gtgaggtgaa tctggaaaaa gcgttatggc tggcgcatga agttgaagtg 540
ctggcgcaac tttacctgac gaccctggcg attacggacc cggtgccagt gctgagcgat 600
gaagagattg ccgtagtgct ggagaaattc aaaacctatg ggttacgaat tgaagagtaa 660
aacgtaaatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg aattgcaagc tgatccgggc ttatcgactg 720
cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggctgtgca 780
ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt 840
ttttgcgccg acatcataac ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa 900
tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagg 960
accatgaagg agatatagat gtacgagcgt tatgcaggtt taatttttga tatggatggc 1020
acaatcctgg atacggagcc tacgcaccgt aaagcgtggc gcgaagtatt agggcactac 1080
ggtcttcagt acgatattca ggcgatgatt gcgcttaatg gatcgcccac ctggcgtatt 1140
gctcaggcaa ttattgagct gaatcaggcc gatctcgacc cgcatgcgtt agcgcgtgaa 1200
aaaacagaag cagtaagaag tatgctgctg gatagcgtcg aaccgcttcc tcttgttgat 1260
gtggtgaaaa gttggcatgg tcgtcgccca atggctgtag gaacggggag tgaaagcgcc 1320
atcgctgagg cattgctggc gcacctggga ttacgccatt attttgacgc cgtcgtcgct 1380
gccgatcacg tcaaacacca taaacccgcg ccagacacat ttttgttgtg cgcgcagcgt 1440
atgggcgtgc aaccgacgca gtgtgtggtc tttgaagatg ccgatttcgg tattcaggcg 1500
gcccgtgcag caggcatgga cgccgtggat gttcgcttgc tgtgataa 1548
<210> 5
<211> 6601
<212> DNA
<213> 表达载体pXMJ19的核苷酸序列
<400> 5
aattaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 60
cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 120
cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 180
gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 240
catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 300
ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 360
gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 420
ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 480
tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 540
aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 600
tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 660
aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 720
aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 780
tgatgagcac ttttgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 840
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 900
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 960
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 1020
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1080
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 1140
cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 1200
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 1260
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 1320
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 1380
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 1440
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 1500
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 1560
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1620
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gggtgggcga 1680
agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccattcggg gtcgttcact 1740
ggttcccctt tctgatttct ggcatagaag aacccccgtg aactgtgtgg ttccgggggt 1800
tgctgatttt tgcgagactt ctcgcgcaat tccctagctt aggtgaaaac accatgaaac 1860
actagggaaa cacccatgaa acacccatta gggcagtagg gcggcttctt cgtctagggc 1920
ttgcatttgg gcggtgatct ggtctttagc gtgtgaaagt gtgtcgtagg tggcgtgctc 1980
aatgcactcg aacgtcacgt catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt 2040
agacattgtt ttcctcgttg tcggtggtgg tgagcttttc tagccgctcg gtaaacgcgg 2100
cgatcatgaa ctcttggagg ttttcaccgt tctgcatgcc tgcgcgcttc atgtcctcac 2160
gtagtgccaa aggaacgcgt gcggtgacca cgacgggctt agcctttgcc tgcgcttcta 2220
gtgcttcgat ggtggcttgt gcctgcgctt gctgcgcctg tagtgcctgt tgagcttctt 2280
gtagttgctg ttctagctgt gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg 2340
cgatatgtca tgcgcatgcg tagcaaacat tgtcctgcaa ctcattcatt atgtgcagtg 2400
ctcctgttac tagtcgtaca tactcatatt tacctagtct gcatgcagtg catgcacatg 2460
cagtcatgtc gtgctaatgt gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc 2520
ggagccaccc tgtccatgcg gggtgtgggg cttgccccgc cggtacagac agtgagcacc 2580
ggggcaccta gtcgcggata ccccccctag gtatcggaca cgtaaccctc ccatgtcgat 2640
gcaaatcttt aacattgagt acgggtaagc tggcacgcat agccaagcta ggcggccacc 2700
aaacaccact aaaaattaat agtccctaga caagacaaac ccccgtgcga gctaccaact 2760
catatgcacg ggggccacat aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta 2820
agacaacggg cacaacaccc gcacaaactc gcactgcgca accccgcaca acatcgggtc 2880
taggtaacac tgagtaacac tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat 2940
gagggttcta aggtcactcg cgctagggcg tggcgtaggc aaaacgtcat gtacaagatc 3000
accaatagta aggctctggc ggggtgccat aggtggcgca gggacgaagc tgttgcggtg 3060
tcctggtcgt ctaacggtgc ttcgcagttt gagggtctgc aaaactctca ctctcgctgg 3120
gggtcacctc tggctgaatt ggaagtcatg ggcgaacgcc gcattgagct ggctattgct 3180
actaagaatc acttggcggc gggtggcgcg ctcatgatgt ttgtgggcac tgttcgacac 3240
aaccgctcac agtcatttgc gcaggttgaa gcgggtatta agactgcgta ctcttcgatg 3300
gtgaaaacat ctcagtggaa gaaagaacgt gcacggtacg gggtggagca cacctatagt 3360
gactatgagg tcacagactc ttgggcgaac ggttggcact tgcaccgcaa catgctgttg 3420
ttcttggatc gtccactgtc tgacgatgaa ctcaaggcgt ttgaggattc catgttttcc 3480
cgctggtctg ctggtgtggt taaggccggt atggacgcgc cactgcgtga gcacggggtc 3540
aaacttgatc aggtgtctac ctggggtgga gacgctgcga aaatggcaac ctacctcgct 3600
aagggcatgt ctcaggaact gactggctcc gctactaaaa ccgcgtctaa ggggtcgtac 3660
acgccgtttc agatgttgga tatgttggcc gatcaaagcg acgccggcga ggatatggac 3720
gctgttttgg tggctcggtg gcgtgagtat gaggttggtt ctaaaaacct gcgttcgtcc 3780
tggtcacgtg gggctaagcg tgctttgggc attgattaca tagacgctga tgtacgtcgt 3840
gaaatggaag aagaactgta caagctcgcc ggtctggaag caccggaacg ggtcgaatca 3900
acccgcgttg ctgttgcttt ggtgaagccc gatgattgga aactgattca gtctgatttc 3960
gcggttaggc agtacgttct cgattgcgtg gataaggcta aggacgtggc cgctgcgcaa 4020
cgtgtcgcta atgaggtgct ggcaagtctg ggtgtggatt ccaccccgtg catgatcgtt 4080
atggatgatg tggacttgga cgcggttctg cctactcatg gggacgctac taagcgtgat 4140
ctgaatgcgg cggtgttcgc gggtaatgag cagactattc ttcgcaccca ctaaaagcgg 4200
cataaacccc gttcgatatt ttgtgcgatg aatttatggt caatgtcgcg ggggcaaact 4260
atgatgggtc ttgttgttgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa 4320
ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc 4380
gaagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 4440
tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc 4500
tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 4560
acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 4620
cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 4680
ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 4740
tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 4800
gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga 4860
tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 4920
ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 4980
tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 5040
gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc 5100
gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg 5160
tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg 5220
atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 5280
ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc 5340
gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 5400
cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 5460
ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 5520
tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 5580
ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 5640
ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 5700
gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 5760
tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 5820
tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 5880
gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 5940
cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 6000
gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 6060
gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 6120
ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 6180
cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 6240
tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 6300
cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 6360
cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 6420
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 6480
ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 6540
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 6600
t 6601
<210> 6
<211> 8122
<212> DNA
<213> 携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY序列
<400> 6
aattaagctt gcatgcctgc aggtcgacaa ggagatatag atggaacgaa ataaacttgc 60
tcgtcagatt attgacactt gcctggaaat gacccgcctg ggactgaacc aggggacagc 120
ggggaacgtc agtgtacgtt atcaggatgg gatgctgatt acgcctacag gcattccata 180
tgaaaaactg acggagtcgc atattgtctt tattgatggc aacggtaaac atgaggaagg 240
aaagctcccc tcaagcgaat ggcgtttcca tatggcagcc tatcaaagca gaccggatgc 300
caacgcggtt gttcacaatc atgccgttca ttgcacggca gtttccattc ttaaccgatc 360
gatccccgct attcactaca tgattgcggc ggctggcggt aattctattc cttgcgcgcc 420
ttatgcgacc tttggaacac gcgaactttc tgaacatgtt gcgctggctc tcaaaaatcg 480
taaggcaact ttgttacaac atcatgggct tatcgcttgt gaggtgaatc tggaaaaagc 540
gttatggctg gcgcatgaag ttgaagtgct ggcgcaactt tacctgacga ccctggcgat 600
tacggacccg gtgccagtgc tgagcgatga agagattgcc gtagtgctgg agaaattcaa 660
aacctatggg ttacgaattg aagagtaaaa cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa 720
ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag 780
ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc 840
aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa 900
tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag 960
cggataacaa tttcacacag gaaacaggac catgaaggag atatagatgt acgagcgtta 1020
tgcaggttta atttttgata tggatggcac aatcctggat acggagccta cgcaccgtaa 1080
agcgtggcgc gaagtattag ggcactacgg tcttcagtac gatattcagg cgatgattgc 1140
gcttaatgga tcgcccacct ggcgtattgc tcaggcaatt attgagctga atcaggccga 1200
tctcgacccg catgcgttag cgcgtgaaaa aacagaagca gtaagaagta tgctgctgga 1260
tagcgtcgaa ccgcttcctc ttgttgatgt ggtgaaaagt tggcatggtc gtcgcccaat 1320
ggctgtagga acggggagtg aaagcgccat cgctgaggca ttgctggcgc acctgggatt 1380
acgccattat tttgacgccg tcgtcgctgc cgatcacgtc aaacaccata aacccgcgcc 1440
agacacattt ttgttgtgcg cgcagcgtat gggcgtgcaa ccgacgcagt gtgtggtctt 1500
tgaagatgcc gatttcggta ttcaggcggc ccgtgcagca ggcatggacg ccgtggatgt 1560
tcgcttgctg tgataagaat tcagcttggc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc 1620
ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc 1680
agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 1740
gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 1800
aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 1860
cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg 1920
gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct 1980
gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt atttttctaa atacattcaa 2040
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 2100
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 2160
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 2220
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 2280
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttgcttc ctcgctcact gactcgctgc 2340
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 2400
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 2460
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 2520
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 2580
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 2640
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta 2700
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 2760
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 2820
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 2880
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 2940
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 3000
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 3060
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 3120
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 3180
agatcctttt ggggtgggcg aagaactcca gcatgagatc cccgcgctgg aggatcatcc 3240
agccattcgg ggtcgttcac tggttcccct ttctgatttc tggcatagaa gaacccccgt 3300
gaactgtgtg gttccggggg ttgctgattt ttgcgagact tctcgcgcaa ttccctagct 3360
taggtgaaaa caccatgaaa cactagggaa acacccatga aacacccatt agggcagtag 3420
ggcggcttct tcgtctaggg cttgcatttg ggcggtgatc tggtctttag cgtgtgaaag 3480
tgtgtcgtag gtggcgtgct caatgcactc gaacgtcacg tcatttaccg ggtcacggtg 3540
ggcaaagaga actagtgggt tagacattgt tttcctcgtt gtcggtggtg gtgagctttt 3600
ctagccgctc ggtaaacgcg gcgatcatga actcttggag gttttcaccg ttctgcatgc 3660
ctgcgcgctt catgtcctca cgtagtgcca aaggaacgcg tgcggtgacc acgacgggct 3720
tagcctttgc ctgcgcttct agtgcttcga tggtggcttg tgcctgcgct tgctgcgcct 3780
gtagtgcctg ttgagcttct tgtagttgct gttctagctg tgccttggtt gccatgcttt 3840
aagactctag tagctttcct gcgatatgtc atgcgcatgc gtagcaaaca ttgtcctgca 3900
actcattcat tatgtgcagt gctcctgtta ctagtcgtac atactcatat ttacctagtc 3960
tgcatgcagt gcatgcacat gcagtcatgt cgtgctaatg tgtaaaacat gtacatgcag 4020
attgctgggg gtgcaggggg cggagccacc ctgtccatgc ggggtgtggg gcttgccccg 4080
ccggtacaga cagtgagcac cggggcacct agtcgcggat acccccccta ggtatcggac 4140
acgtaaccct cccatgtcga tgcaaatctt taacattgag tacgggtaag ctggcacgca 4200
tagccaagct aggcggccac caaacaccac taaaaattaa tagtccctag acaagacaaa 4260
cccccgtgcg agctaccaac tcatatgcac gggggccaca taacccgaag gggtttcaat 4320
tgacaaccat agcactagct aagacaacgg gcacaacacc cgcacaaact cgcactgcgc 4380
aaccccgcac aacatcgggt ctaggtaaca ctgagtaaca ctgaaataga agtgaacacc 4440
tctaaggaac cgcaggtcaa tgagggttct aaggtcactc gcgctagggc gtggcgtagg 4500
caaaacgtca tgtacaagat caccaatagt aaggctctgg cggggtgcca taggtggcgc 4560
agggacgaag ctgttgcggt gtcctggtcg tctaacggtg cttcgcagtt tgagggtctg 4620
caaaactctc actctcgctg ggggtcacct ctggctgaat tggaagtcat gggcgaacgc 4680
cgcattgagc tggctattgc tactaagaat cacttggcgg cgggtggcgc gctcatgatg 4740
tttgtgggca ctgttcgaca caaccgctca cagtcatttg cgcaggttga agcgggtatt 4800
aagactgcgt actcttcgat ggtgaaaaca tctcagtgga agaaagaacg tgcacggtac 4860
ggggtggagc acacctatag tgactatgag gtcacagact cttgggcgaa cggttggcac 4920
ttgcaccgca acatgctgtt gttcttggat cgtccactgt ctgacgatga actcaaggcg 4980
tttgaggatt ccatgttttc ccgctggtct gctggtgtgg ttaaggccgg tatggacgcg 5040
ccactgcgtg agcacggggt caaacttgat caggtgtcta cctggggtgg agacgctgcg 5100
aaaatggcaa cctacctcgc taagggcatg tctcaggaac tgactggctc cgctactaaa 5160
accgcgtcta aggggtcgta cacgccgttt cagatgttgg atatgttggc cgatcaaagc 5220
gacgccggcg aggatatgga cgctgttttg gtggctcggt ggcgtgagta tgaggttggt 5280
tctaaaaacc tgcgttcgtc ctggtcacgt ggggctaagc gtgctttggg cattgattac 5340
atagacgctg atgtacgtcg tgaaatggaa gaagaactgt acaagctcgc cggtctggaa 5400
gcaccggaac gggtcgaatc aacccgcgtt gctgttgctt tggtgaagcc cgatgattgg 5460
aaactgattc agtctgattt cgcggttagg cagtacgttc tcgattgcgt ggataaggct 5520
aaggacgtgg ccgctgcgca acgtgtcgct aatgaggtgc tggcaagtct gggtgtggat 5580
tccaccccgt gcatgatcgt tatggatgat gtggacttgg acgcggttct gcctactcat 5640
ggggacgcta ctaagcgtga tctgaatgcg gcggtgttcg cgggtaatga gcagactatt 5700
cttcgcaccc actaaaagcg gcataaaccc cgttcgatat tttgtgcgat gaatttatgg 5760
tcaatgtcgc gggggcaaac tatgatgggt cttgttgttg gcgtcccgga aaacgattcc 5820
gaagcccaac ctttcataga aggcggcggt ggaatcgaaa tctcgtgatg gcaggttggg 5880
cgtcgcttgg tcggtcattt cgaagggcac caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg 5940
ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 6000
tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 6060
taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa 6120
tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac 6180
cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt 6240
agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc 6300
tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc 6360
attgccatac ggaactccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc 6420
ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga 6480
acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga 6540
tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc 6600
ttagctcctg aaaatctcgt cgaagctcgg cggatttgtc ctactcaagc tgatccgaca 6660
aaatccacac attatcccag gtgtccggat cggtcaaata cgctgccagc tcatagaccg 6720
tatccaaagc atccggggct gatccccggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag 6780
acgggcaaca gctgattgcc cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag caagcggtcc 6840
acgtggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac 6900
atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc 6960
cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg 7020
cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac 7080
tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc 7140
agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt 7200
gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga 7260
aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag 7320
tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc 7380
cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc 7440
gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg 7500
cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg 7560
actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg 7620
ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg 7680
aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca 7740
cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt 7800
tgcaccattc gatggtgtca acgtaaatgc cgcttcgcct tcgcgcgcga attgcaagct 7860
gatccgggct tatcgactgc acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa 7920
gctgtggtat ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac 7980
tcccgttctg gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa 8040
atgagctgtt gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 8100
atttcacaca ggaaacagaa tt 8122
Claims (3)
1.谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12，保藏编号为CGMCCNo.9838。
2.一种构建权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12 CGMCC No.9838的方法，具体方法包括以下步骤：
2.1构建携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655如序列表中序列1所示的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(FucA)基因，如序列表中序列2所示的果糖-1-磷酸化酶(YqaB)基因、来源于pXMJ19如序列表中序列3所示的tac启动子，再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成如序列表中序列4所示的融合基因FucA-tac-YqaB，然后将融合基因FucA-tac-YqaB连接入载体pXMJ19中，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体，命名为pXFTY，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
2.2向野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中导入携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，得到携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的重组谷氨酸棒杆菌SY12。
3.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12 CGMCCNo.9838在合成D-阿洛酮糖中的应用，即在发酵培养基中添加D-甘油醛和葡萄糖，葡萄 糖通过胞内的糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮，D-甘油醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮(DHAP)在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶和果糖-1-磷酸化酶的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410648577.3A CN104611249B (zh) | 2014-11-17 | 2014-11-17 | 一种利用醛缩酶全细胞合成d-阿洛酮糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410648577.3A CN104611249B (zh) | 2014-11-17 | 2014-11-17 | 一种利用醛缩酶全细胞合成d-阿洛酮糖的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104611249A CN104611249A (zh) | 2015-05-13 |
| CN104611249B true CN104611249B (zh) | 2019-06-11 |
Family
ID=53145901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410648577.3A Active CN104611249B (zh) | 2014-11-17 | 2014-11-17 | 一种利用醛缩酶全细胞合成d-阿洛酮糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104611249B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3329922A4 (en) * | 2015-07-29 | 2019-03-27 | Educational Foundation Jichi Medical University | GLP-1 secretagogue |
| BR112019004161B1 (pt) * | 2016-08-31 | 2021-07-27 | Cj Cheiljedang Corporation | Molécula de ácido nucleico que possui uma atividade promotora, cassete de expressão gênica, vetor recombinante, micro-organismo recombinante do gênero corynebacterium e método de produzir um produto-alvo |
| CN107746856A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-03-02 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 生产l‑稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法与应用 |
| CN111172123B (zh) * | 2020-01-07 | 2022-07-26 | 江南大学 | 一种以d-甘油醛为受体合成d-山梨糖和d-阿洛酮糖的方法 |
| CN112852890A (zh) * | 2020-08-27 | 2021-05-28 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 多羟基二酮以及羟基呋喃酮类化合物的生物合成方法 |
| CN114426994A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-05-03 | 郑州大学 | 一种以甘油为底物的d-阿洛酮糖全细胞合成方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102869783A (zh) * | 2009-09-30 | 2013-01-09 | Cj第一制糖株式会社 | 阿洛酮糖-差向异构酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向异构酶制备d-阿洛酮糖的方法 |
| CN103025874A (zh) * | 2010-07-12 | 2013-04-03 | 根特大学 | 用于生产附加值生物产品的代谢改造的生物 |
| CN103333935A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-10-02 | 桐乡晟泰生物科技有限公司 | D-阿洛酮糖的生产工艺 |
-
2014
- 2014-11-17 CN CN201410648577.3A patent/CN104611249B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102869783A (zh) * | 2009-09-30 | 2013-01-09 | Cj第一制糖株式会社 | 阿洛酮糖-差向异构酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向异构酶制备d-阿洛酮糖的方法 |
| CN103025874A (zh) * | 2010-07-12 | 2013-04-03 | 根特大学 | 用于生产附加值生物产品的代谢改造的生物 |
| CN103333935A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-10-02 | 桐乡晟泰生物科技有限公司 | D-阿洛酮糖的生产工艺 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 基于RhaD醛缩酶的"一锅四酶法"合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖;高雅慧等;《食品工业科技》;20130822(第21期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104611249A (zh) | 2015-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104611249B (zh) | 一种利用醛缩酶全细胞合成d-阿洛酮糖的方法 | |
| KR102056250B1 (ko) | 재조합 세포, 및 이소프렌의 생산 방법 | |
| KR101203856B1 (ko) | 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 연속적 생산 | |
| Strang et al. | Bioaugmentation of the thermophilic anaerobic biodegradation of cellulose and corn stover | |
| PT2304040T (pt) | Produção de alcenos por descarboxilação enzimática de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos | |
| CN101970648A (zh) | 具有使用蔗糖作为碳源能力的重组微生物 | |
| CN105400860B (zh) | 微生物共培养系统及其应用 | |
| US11021524B2 (en) | Proteins from anaerobic fungi and uses thereof | |
| Das et al. | Lignocellulosic fermentation of wild grass employing recombinant hydrolytic enzymes and fermentative microbes with effective bioethanol recovery | |
| CN107119063A (zh) | 一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法 | |
| Gupta et al. | Bioethanol production from hemicellulose rich Populus nigra involving recombinant hemicellulases from Clostridium thermocellum | |
| CN110819650A (zh) | 一种产β-榄香烯工程菌株及应用 | |
| CN113195705A (zh) | 无糖原的甲烷营养菌及其用途 | |
| CN101748069A (zh) | 一种重组蓝藻 | |
| KR101608078B1 (ko) | 이산화탄소 유래 숙신산 생산을 위한 균주 및 이를 이용한 이산화탄소 유래 숙신산 생산 방법 | |
| CN109321576A (zh) | 一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法 | |
| JP5946080B2 (ja) | 藍藻においてプラスチック原料および関連物質を生産する方法 | |
| CN107058368A (zh) | 一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法 | |
| US20090142816A1 (en) | Gliocladium isolate c-13 and methods of its use for producing volatile compounds and hydrocarbons | |
| CN107815435A (zh) | 具有增强的纤维素生产能力的葡糖醋杆菌 | |
| CN111378676A (zh) | 一种pCUP1载体质粒的构建及其应用 | |
| CN114591996B (zh) | 一种凝结芽孢杆菌h-1的表达载体及其构建方法与应用 | |
| US20110217740A1 (en) | Methods, microorganisms, and compositions for plant biomass processing | |
| US20090298151A1 (en) | Hydrogen producing microorganism useful for energy generation from diverse carbonaceous feedstock | |
| CN107988126A (zh) | 包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230814 Address after: Building 1-201-A218, Building 8, Huiying Industrial Park, No. 86 Zhonghuan West Road, Tianjin Binhai New Area Pilot Free Trade Zone (Airport Economic Zone), 300000 Patentee after: Tiangong Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd. Address before: No.32, Xiqi Road, Tianjin Airport Economic Zone, Binhai New Area, Tianjin, 300308 Patentee before: TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230907 Address after: Building 1-201-4, Building 8, Huiying Industrial Park, No. 86 Zhonghuan West Road, Tianjin Binhai New Area Pilot Free Trade Zone (Airport Economic Zone), 300000 Patentee after: Tianjin Yihe Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Building 1-201-A218, Building 8, Huiying Industrial Park, No. 86 Zhonghuan West Road, Tianjin Binhai New Area Pilot Free Trade Zone (Airport Economic Zone), 300000 Patentee before: Tiangong Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |