CN104611249A - 一种利用醛缩酶全细胞合成d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法，公开了一种微生物发酵法合成D-阿洛酮糖的方法。首先构建携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12，其次在基本盐培养基中添加葡萄糖和D-甘油醛，葡萄糖经胞内的糖酵解途径合成磷酸二羟丙酮，D-甘油醛和磷酸二羟丙酮（DHAP）在谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶和果糖-1-磷酸化酶的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖，D-甘油醛转化率为53%。因此，本发明的D-阿洛酮糖的生物合成方法与目前通过酮糖3-差向异构酶体外合成D-阿洛酮糖的方法相比，具有转化率高，产物单一，便于分离等优点，为D-阿洛酮糖的大规模生产打下一定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法。即利用基因工程技术和微生物学方法获得谷氨酸棒杆菌重组菌株，并利用该重组菌株高效合成D-阿洛酮糖。
背景技术
稀少糖（Rare Sugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物（2002年国际稀少糖学会ISRS定义）。其具有热量低、稳定性高、无致龋齿性、耐受性高等优点，在膳食、保健、医药等领域引起了广泛关注，它们可以作为添加剂改善食品的理化性质，提高食品的生理功能和保健功能。近年来，科学家致力于研究的稀少糖主要有D-阿洛糖（D-Allose）、D-阿洛酮糖（D-psicose）、D-塔格糖（D-Tagatose）等。其中D-阿洛酮糖（果糖C-3差向异构体）是一种重要的稀少糖。研究人员分别证实了D-阿洛酮糖是零或低热量、食用安全的填充型甜味剂，它们对胰岛素没有依赖性，可改善糖尿病患者的饮食，适合于糖尿病患者食用，是低热量功能性的理想蔗糖替代品（Matsuo T, Suzuki H, Hashiguchi M, et al. D-psicose is a rare sugar
that provides no energy to growing rats. J. Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2002.
48(1): 77-80.）。美国食品与药品管理局（FDA）在2012年就将D-阿洛酮糖列为安全食品（GRAS）添加剂。
国际市场对D-阿洛酮糖的应用越来越关注，市场需求量不断增大。然而，D-阿洛酮糖在自然界中含量低、且难以化学合成，传统的化学合成法已不能满足大规模的生产需要。因此，从来源于自然界中的丰富原料通过生物转化的方法合成稀少糖，实现规模化生产是D-阿洛酮糖广泛应用的基础。日本的研究学者 Izumori于 2002 年建立了稀少糖的生物转化生产策略，即Izumoring 方法，该方法中利用酮糖差向异构酶(Ketose epimerase)、醛糖异构酶 (Aldose isomerases)和多元醇脱氢酶(Poly dehydrogenase)进行所有单糖及糖醇之间的相互转化（Izumori
K. Bioproduction strategies for rare hexoses. Naturwissenschaften, 2002,
89:120-124.）。目前，生物转化法合成D-阿洛酮糖主要是通过酮糖3位差向异构酶完成，将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。该酮糖3位差向异构酶酶系根据其作用最适底物分为：D-塔格糖 3-差向异构酶（D-tagatose 3-epimerase，DTEase）和 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase，DPEase），它们的催化效率为20-32％。此外，来源于根癌农杆菌（A. tumefaciens）的DPE（D-阿洛酮糖 3-差向异构酶）和菊苣假单胞菌（P. cichorii）的DTE（D-塔格糖 3-差向异构酶）也可以将D-果糖转化为D-阿洛酮糖（Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, Lee YJ, Oh
DK (2006a) Characterization of an Agrobacterium tumefaciens D-psicose
3-epimerase that converts D-fructose to D-psicose. Appl Environ Microbiol
72:981–985）。近年来研究发现醛缩酶同样可用于稀少糖的生物合成（Brovetto M, Gamenara D, Saenz Mendez P, Seoane GA. C-C
bond-forming lyases in organic synthesis. Chemical Reviews 2011.111:4346-4403）。例如L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶可以以磷酸二羟丙酮和D-甘油醛为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖（Li Z, Cai L, Qi Q, Wang P. Enzymatic synthesis of D -sorbose and D
-psicose with aldolase FucA: Effect of acceptor configuration on enzyme
stereoselectivity. Bioorg.Med.Chem. Lett. 2011).21.7081–7084）。上述D-阿洛酮糖的生物合成方法中存在一个共性问题，即反应终止时，反应液含有两种及两种以上的单糖，导致分离成本提高。所以开发一种能够合成单一产物D-阿洛酮糖的生物合成方法很有意义。
目前，与D-阿洛酮糖合成相关的国外专利主要通过3-差向异构酶及其固定化体外催化果糖来合成（Deok-Kun Oh,Hye-Jung
Kim, Yong-Joo Lee, Sang-Hoon Song,Seung-Won Park, Jung-Hoon Kim,Seong-Bo Kim.
D-psicose production method by D-psicose epimerase. US 8030035 B2,2011.10.04;
Yang Hee Kim, Jin Ha Kim, Young Mi Lee, Young Ho Hong, Min Hae Kim, Seong Bo
Kim, Seung Won Park, Seung Hyun Oh, Deok Kun Oh, Jin Geun Choi. D-psicose
3-epimerase mutant with improved thermal stability, and continuous production
of D-psicose using same. US 2014/0199732 A1,2014.07.17; Young Plo Hong,Jin Ha
Kim, Sung Bo Kim,Jung Hoon Kim,Young Mi Lee, Seung Won Park. Immobilization of
psicose-epimerase and a method of producing D-psicose using the same. US
8735106 B2.2014.05.27）。由于3-差向异构酶催化果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率仅有20-32%，故反应终止时，体系中同时含有果糖和D-阿洛酮糖，导致分离操作较复杂，成本较高。来源于大肠杆菌的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶可以催化磷酸二羟丙酮和D-甘油醛体外合成单一产物D-阿洛酮糖，但是由于磷酸二羟丙酮价格较贵，且不稳定，所以很难进行大规模体外合成。然而磷酸二氢丙酮还可以以葡萄糖，果糖，蔗糖为底物，通过胞内的糖酵解途径实现体内合成，所以通过构建重组菌株以葡萄糖和D-甘油醛为底物全细胞转化合成D-阿洛酮糖具有很大的应用潜力。目前国内外相关专利尚未报道。因此，通过基因工程和代谢工程的方法和思路构建微生物重组菌株，再以葡萄糖和D-甘油醛为底物发酵生产D-阿洛酮糖是本发明的一个中心思路。
发明内容
本发明的目的是提供一株用于发酵生产D-阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的重组菌株。
本发明所提供的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株的名称为SY12，该菌株已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9838。
本发明另一目的在于提供一种构建谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12的方法。
构建权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12
CGMCC No.9838的方法，包括以下步骤：
向野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入来源于大肠杆菌的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY12。具体的包括以下两个步骤：
1.1构建L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXRTY，其物理图谱如图2所示，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因（648bp，序列表中序列1）和果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因（567bp，序列表中序列2）、来源于pXMJ19的tac启动子（307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前再添加一个启动子），再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成的融合基因FucA-tac-YqaB（1548bp，序列表中序列4），然后将融合基因FucA-tac-YqaB连接入载体pXMJ19中，得到携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体，命名为pXFTY，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
1.2向野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中导入携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，得到携带携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12。
本发明还一目的在于提供所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12
CGMCC No.9838在合成D-阿洛酮糖中的应用。
具体的，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium
glutamicum)重组菌株SY12可以D-甘油醛和葡萄糖为底物合成单一产物D-阿洛酮糖。即在发酵培养基中添加D-甘油醛和葡萄糖，葡萄糖经过胞内的糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮（DHAP），D-甘油醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖。
采取以上技术方案，本发明提供了一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法。实验证明，该携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12可以以D-甘油醛和葡萄糖为底物，发酵合成单一产物D-阿洛酮糖，该合成方法高效，而且产物便于分离纯化，生产的D-阿洛酮糖将在在食品和医药行业具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12合成D-阿洛酮糖的技术路线
图2为携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY的物理图谱
图3为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12以D-甘油醛为底物合成D-阿洛酮糖的高效液相色谱分析结果。
具体实施方式
本发明具体提供一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法。还具体提供了一株用于生产D-阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12及其构建方法。
本发明的技术路线如图1所示，包括以下两个步骤：（1）在野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中引入外源L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因，得到具有醛缩途径（即携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因）的重组谷氨酸棒杆菌SY12；（2）在发酵培养基中添加D-甘油醛和葡萄糖，葡萄糖经过胞内的糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮（DHAP），D-甘油醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖。
构建携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的重组谷氨酸棒杆菌SY12包括以下过程：
1.1构建L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，其物理图谱如图2所示，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因（648bp，序列表中序列1）和果糖-1-磷酸化酶基因（YqaB）（567bp，序列表中序列2）、来源于pXMJ19的tac启动子（307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前添加tac启动子），再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成的融合基因FucA-tac-YqaB（1548bp，序列表中序列4），然后将融合基因FucA-tac-YqaB连接入载体pXMJ19中，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体，命名为pXFTY，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
1.2野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中导入携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY12。
本发明的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium
glutamicum)重组菌株SY12可用于合成D-阿洛酮糖，具体的在发酵培养基中添加D-甘油醛和葡萄糖，葡萄糖经过胞内的糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮（DHAP），D-甘油醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖。
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd
edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物由北京华大基因有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、构建谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12的构建，包括以下步骤：
1、构建L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY
1.1根据Genbank中大肠杆菌MG1655（购自Invitrogen）的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因（Genbank号：947282，648bp，序列表中序列1）和果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因（Genbank号：945776，567bp，序列表中序列2），设计引物1和引物2、引物5和引物6。根据Genbank中载体pXMJ19中tac启动子（307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前添加启动子）的序列，设计引物3和引物4，引物1和引物5含有RBS位点序列（AAGGAGATATAG），引物1和引物6带有Sal I和EcoR I酶切位点，引物序列如下：
引物1：5’-
GGGACGTCGACAAGGAGATATAGATGGAACGAAATAAACTTGCTCG -3’
引物2：5’-
CGAAGCGGCATTTACGTTTTACTCTTCAATTCGTAACCCATAG -3’；
引物3：5’-
TGGGTTACGAATTGAAGAGTAAAACGTAAATGCCGCTTCGCC-3’
引物4：5’-
ACGCTCGTACATCTATATCTCCTTCATGGTCCTGTTTCCTGTGTGA -3’；
引物5：5’-
GGAAACAGGACCATGAAGGAGATATAGATGTACGAGCGTTATGCAGGTT -3’
引物6：5’-
CCGGAATTCTTATCACAGCAAGCGAACATCCAC -3’；
1.2以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，通过引物1和引物2 PCR扩增基因L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因（648bp，序列表中序列1），通过引物5和引物6 PCR扩增果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因（567bp，序列表中序列2）。
1.3以载体pXMJ19（Genbank号：AJ133195.1，6601bp，序列表中序列5）为模板，通过引物3和引物4 PCR扩增启动子tac启动子（307bp，序列表中序列3，作用是在基因YqaB前添加启动子）。
1.4引物2和引物3有40bp的同源区（TGGGTTACGAATTGAAGAGTAAAACGTAAATGCCGCTTCG），引物4和引物5有39bp的同源区（GGAAACAGGACCATGAAGGAGATATAGATGTACGAGCGT），可用于进行融合PCR，并且在引物15和引物13含有RBS位点序列（AAGGAGATATAG），引物1和引物6带有Sal I和EcoR I酶切位点，以三个PCR产物（FucA，tac，YqaB）为模板，用引物1和引物6 PCR扩增得到由FucA、tac、YqaB三个基因组成含有Sal和EcoR
I酶切位点的融合基因Sal I-FucA-tac-YqaB-EcoR I（1568bp，序列表中序列4）。
1.5用限制性内切酶Sal I和EcoR I同时酶切融合基因Sal
I-FucA-tac-YqaB-EcoR I和载体pXMJ19（Genbank号：AJ133195.1，6601bp，序列表中序列5），运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pXMJ19和融合基因Sal I-FucA-tac-YqaB-EcoR I进行连接，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体，命名为pXFTY，其物理图谱如图2所示，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中FucA-tac–YqaB片段的核苷酸序列对应序列表中序列5（1548bp），在序列6中为28bp-1576bp对应的部分。
1.6 将构建得到的载体pXFTY进行测序验证，相关测序工作由北京华大基因有限公司完成，验证正确后，将载体pXFTY置于﹣20°保存。
2、获得携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12
向野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中导入携带携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12，过程如下：
2.1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞（100ul），将携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY（1 ug）电转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞中，46℃热激6 min，随后放入30℃摇床中复苏45min，将菌液涂布于含有氯霉素抗生素（12.5 ug/mL）的固体培养基BHIS（脑心浸粉：51g/L，山梨醇：91g/L）中，放置于30℃培养箱中培养36h。
2.2挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性菌落，用引物1和引物6进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1568bp DNA片段（此DNA片段为载体pXFTY中Sal
I-FucA-tac-YqaB-EcoR I基因片段）的为阳性克隆。
2.3保存经验证正确的菌株，即携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY12。
该谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株的名称为SY12，该菌株已于2014年10月24日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9838。
实施例2、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12在生产D-阿洛酮糖中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12的培养及诱导
选用CGXII培养基（配方：(NH4)2SO4(5g/L),
urea (5g/L), KH2PO4 (1g/L), K2HPO4
(1g/L), MgSO4∙7H2O (0.25g/L), CaCl2
(10mg/L), FeSO4∙7H2O (10mg/L), MnSO4∙H2O
(0.1mg/L), ZnSO4∙7H2O (1mg/L), CuSO4∙5H2O
(0.2mg/L), NiCl2∙6H2O (20μg/L), 生物素 (0.4mg/L), MOPS (42g/L) (pH 7.4))，培养基中添加葡萄糖（10g/L）和氯霉素（12.5mg/L），在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12进行培养，当OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mM，降低摇床转速为120rmp，诱导约12h。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12的收集和浓缩
将诱导得到的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12菌液（100mL），4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用CGXII培养基洗涤菌液两次，最终用CGXII培养基浓缩菌液至10mL。
3、D-阿洛糖的发酵生产
取10mL谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为2％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的葡萄糖和1％（质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度）的D-甘油醛进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH 7.0，菌体浓度(OD600)为30。
发酵结束后，对样品进行
14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Xtimate Sugar-Ca，流动相：EDTA-Ca（0.1mM），流速：0.4
mL/min，柱温：70℃，检测器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D-阿洛酮糖纯品为标准品，上样量为20μl。
结果如图3（（a）表示D-阿洛酮糖标品；（b）表示发酵液）所示，可以看出，经过24小时反应，发酵液中D-阿洛糖的浓度为10.6
g/L， D-甘油醛转化率为53％，发酵液中未检测到剩余葡萄糖和D-甘油醛，表明谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12可以以D-甘油醛为底物合成单一产物D-阿洛酮糖。
目前通过异构酶以果糖为底物合成阿洛酮糖，仅有25-30%的转化率，且产物不容易分离，本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12在生物合成D-阿洛酮糖方面，具有较高转化率，且整个发酵过程采用基本盐培养基，成本低廉，产物便于分离纯化，具有广阔的应用前景和竞争力。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法
<130> CN00424111
<160> 6
<210> 1
<211> 648
<212> DNA
<213> 大肠杆菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因的核苷酸序列
<400> 1
atggaacgaa ataaacttgc
tcgtcagatt attgacactt gcctggaaat gacccgcctg 60
ggactgaacc aggggacagc
ggggaacgtc agtgtacgtt atcaggatgg gatgctgatt 120
acgcctacag gcattccata
tgaaaaactg acggagtcgc atattgtctt tattgatggc 180
aacggtaaac atgaggaagg
aaagctcccc tcaagcgaat ggcgtttcca tatggcagcc 240
tatcaaagca gaccggatgc
caacgcggtt gttcacaatc atgccgttca ttgcacggca 300
gtttccattc ttaaccgatc
gatccccgct attcactaca tgattgcggc ggctggcggt 360
aattctattc cttgcgcgcc
ttatgcgacc tttggaacac gcgaactttc tgaacatgtt 420
gcgctggctc tcaaaaatcg
taaggcaact ttgttacaac atcatgggct tatcgcttgt 480
gaggtgaatc tggaaaaagc
gttatggctg gcgcatgaag ttgaagtgct ggcgcaactt 540
tacctgacga ccctggcgat
tacggacccg gtgccagtgc tgagcgatga agagattgcc 600
gtagtgctgg agaaattcaa
aacctatggg ttacgaattg
aagagtaa
648
<210> 2
<211> 567
<212> DNA
<213> 大肠杆菌MG1655的果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因的核苷酸序列
<400> 2
atgtacgagc gttatgcagg
tttaattttt gatatggatg gcacaatcct ggatacggag 60
cctacgcacc gtaaagcgtg
gcgcgaagta ttagggcact acggtcttca gtacgatatt 120
caggcgatga ttgcgcttaa
tggatcgccc acctggcgta ttgctcaggc aattattgag 180
ctgaatcagg ccgatctcga
cccgcatgcg ttagcgcgtg aaaaaacaga agcagtaaga 240
agtatgctgc tggatagcgt
cgaaccgctt cctcttgttg atgtggtgaa aagttggcat 300
ggtcgtcgcc caatggctgt
aggaacgggg agtgaaagcg ccatcgctga ggcattgctg 360
gcgcacctgg gattacgcca
ttattttgac gccgtcgtcg ctgccgatca cgtcaaacac 420
cataaacccg cgccagacac
atttttgttg tgcgcgcagc gtatgggcgt gcaaccgacg 480
cagtgtgtgg tctttgaaga
tgccgatttc ggtattcagg cggcccgtgc agcaggcatg 540
gacgccgtgg atgttcgctt
gctgtga
567
<210> 3
<211> 307
<212> DNA
<213> pXMJ19的tac启动子的核苷酸序列
<400> 3
aacgtaaatg ccgcttcgcc
ttcgcgcgcg aattgcaagc tgatccgggc ttatcgactg 60
cacggtgcac caatgcttct
ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggctgtgca 120
ggtcgtaaat cactgcataa
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt 180
ttttgcgccg acatcataac
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa 240
tcatcggctc gtataatgtg
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagg 300
accatga
307
<210> 4
<211> 1548
<212> DNA
<213> 融合基因FucA-tac-YqaB的核苷酸序列
<400> 4
aaggagatat agatggaacg
aaataaactt gctcgtcaga ttattgacac ttgcctggaa 60
atgacccgcc tgggactgaa
ccaggggaca gcggggaacg tcagtgtacg ttatcaggat 120
gggatgctga ttacgcctac
aggcattcca tatgaaaaac tgacggagtc gcatattgtc 180
tttattgatg gcaacggtaa
acatgaggaa ggaaagctcc cctcaagcga atggcgtttc 240
catatggcag cctatcaaag
cagaccggat gccaacgcgg ttgttcacaa tcatgccgtt 300
cattgcacgg cagtttccat
tcttaaccga tcgatccccg ctattcacta catgattgcg 360
gcggctggcg gtaattctat
tccttgcgcg ccttatgcga cctttggaac acgcgaactt 420
tctgaacatg ttgcgctggc
tctcaaaaat cgtaaggcaa ctttgttaca acatcatggg 480
cttatcgctt gtgaggtgaa
tctggaaaaa gcgttatggc tggcgcatga agttgaagtg 540
ctggcgcaac tttacctgac
gaccctggcg attacggacc cggtgccagt gctgagcgat 600
gaagagattg ccgtagtgct
ggagaaattc aaaacctatg ggttacgaat tgaagagtaa 660
aacgtaaatg ccgcttcgcc
ttcgcgcgcg aattgcaagc tgatccgggc ttatcgactg 720
cacggtgcac caatgcttct
ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggctgtgca 780
ggtcgtaaat cactgcataa
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt 840
ttttgcgccg acatcataac
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa 900
tcatcggctc gtataatgtg
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagg 960
accatgaagg agatatagat
gtacgagcgt tatgcaggtt taatttttga tatggatggc 1020
acaatcctgg atacggagcc
tacgcaccgt aaagcgtggc gcgaagtatt agggcactac 1080
ggtcttcagt acgatattca
ggcgatgatt gcgcttaatg gatcgcccac ctggcgtatt 1140
gctcaggcaa ttattgagct
gaatcaggcc gatctcgacc cgcatgcgtt agcgcgtgaa 1200
aaaacagaag cagtaagaag
tatgctgctg gatagcgtcg aaccgcttcc tcttgttgat 1260
gtggtgaaaa gttggcatgg
tcgtcgccca atggctgtag gaacggggag tgaaagcgcc 1320
atcgctgagg cattgctggc
gcacctggga ttacgccatt attttgacgc cgtcgtcgct 1380
gccgatcacg tcaaacacca
taaacccgcg ccagacacat ttttgttgtg cgcgcagcgt 1440
atgggcgtgc aaccgacgca
gtgtgtggtc tttgaagatg ccgatttcgg tattcaggcg 1500
gcccgtgcag caggcatgga
cgccgtggat gttcgcttgc
tgtgataa
1548
<210> 5
<211> 6601
<212> DNA
<213> 表达载体pXMJ19的核苷酸序列
<400> 5
aattaagctt gcatgcctgc
aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 60
cagcttggct gttttggcgg
atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 120
cgcagaagcg gtctgataaa
acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 180
gaccccatgc cgaactcaga
agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 240
catgcgagag tagggaactg
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 300
ggcctttcgt tttatctgtt
gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 360
gggagcggat ttgaacgttg
cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 420
ataaactgcc aggcatcaaa
ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 480
tctacaaact cttttgttta
tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 540
aataaccctg ataaatgctt
caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 600
tccgtgtcgc ccttattccc
ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 660
aaacgctggt gaaagtaaaa
gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 720
aactggatct caacagcggt
aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 780
tgatgagcac ttttgcttcc
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 840
gagcggtatc agctcactca
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 900
caggaaagaa catgtgagca
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 960
tgctggcgtt tttccatagg
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 1020
gtcagaggtg gcgaaacccg
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1080
ccctcgtgcg ctctcctgtt
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 1140
cttcgggaag cgtggcgctt
tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 1200
tcgttcgctc caagctgggc
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 1260
tatccggtaa ctatcgtctt
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 1320
cagccactgg taacaggatt
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 1380
agtggtggcc taactacggc
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 1440
agccagttac cttcggaaaa
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 1500
gtagcggtgg tttttttgtt
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 1560
aagatccttt gatcttttct
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1620
ggattttggt catgagatta
tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gggtgggcga 1680
agaactccag catgagatcc
ccgcgctgga ggatcatcca gccattcggg gtcgttcact 1740
ggttcccctt tctgatttct
ggcatagaag aacccccgtg aactgtgtgg ttccgggggt 1800
tgctgatttt tgcgagactt
ctcgcgcaat tccctagctt aggtgaaaac accatgaaac 1860
actagggaaa cacccatgaa
acacccatta gggcagtagg gcggcttctt cgtctagggc 1920
ttgcatttgg gcggtgatct
ggtctttagc gtgtgaaagt gtgtcgtagg tggcgtgctc 1980
aatgcactcg aacgtcacgt
catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt 2040
agacattgtt ttcctcgttg
tcggtggtgg tgagcttttc tagccgctcg gtaaacgcgg 2100
cgatcatgaa ctcttggagg
ttttcaccgt tctgcatgcc tgcgcgcttc atgtcctcac 2160
gtagtgccaa aggaacgcgt
gcggtgacca cgacgggctt agcctttgcc tgcgcttcta 2220
gtgcttcgat ggtggcttgt
gcctgcgctt gctgcgcctg tagtgcctgt tgagcttctt 2280
gtagttgctg ttctagctgt
gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg 2340
cgatatgtca tgcgcatgcg
tagcaaacat tgtcctgcaa ctcattcatt atgtgcagtg 2400
ctcctgttac tagtcgtaca
tactcatatt tacctagtct gcatgcagtg catgcacatg 2460
cagtcatgtc gtgctaatgt
gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc 2520
ggagccaccc tgtccatgcg
gggtgtgggg cttgccccgc cggtacagac agtgagcacc 2580
ggggcaccta gtcgcggata
ccccccctag gtatcggaca cgtaaccctc ccatgtcgat 2640
gcaaatcttt aacattgagt
acgggtaagc tggcacgcat agccaagcta ggcggccacc 2700
aaacaccact aaaaattaat
agtccctaga caagacaaac ccccgtgcga gctaccaact 2760
catatgcacg ggggccacat
aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta 2820
agacaacggg cacaacaccc
gcacaaactc gcactgcgca accccgcaca acatcgggtc 2880
taggtaacac tgagtaacac
tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat 2940
gagggttcta aggtcactcg
cgctagggcg tggcgtaggc aaaacgtcat gtacaagatc 3000
accaatagta aggctctggc
ggggtgccat aggtggcgca gggacgaagc tgttgcggtg 3060
tcctggtcgt ctaacggtgc
ttcgcagttt gagggtctgc aaaactctca ctctcgctgg 3120
gggtcacctc tggctgaatt
ggaagtcatg ggcgaacgcc gcattgagct ggctattgct 3180
actaagaatc acttggcggc
gggtggcgcg ctcatgatgt ttgtgggcac tgttcgacac 3240
aaccgctcac agtcatttgc
gcaggttgaa gcgggtatta agactgcgta ctcttcgatg 3300
gtgaaaacat ctcagtggaa
gaaagaacgt gcacggtacg gggtggagca cacctatagt 3360
gactatgagg tcacagactc
ttgggcgaac ggttggcact tgcaccgcaa catgctgttg 3420
ttcttggatc gtccactgtc
tgacgatgaa ctcaaggcgt ttgaggattc catgttttcc 3480
cgctggtctg ctggtgtggt
taaggccggt atggacgcgc cactgcgtga gcacggggtc 3540
aaacttgatc aggtgtctac
ctggggtgga gacgctgcga aaatggcaac ctacctcgct 3600
aagggcatgt ctcaggaact gactggctcc
gctactaaaa ccgcgtctaa ggggtcgtac 3660
acgccgtttc agatgttgga
tatgttggcc gatcaaagcg acgccggcga ggatatggac 3720
gctgttttgg tggctcggtg
gcgtgagtat gaggttggtt ctaaaaacct gcgttcgtcc 3780
tggtcacgtg gggctaagcg
tgctttgggc attgattaca tagacgctga tgtacgtcgt 3840
gaaatggaag aagaactgta
caagctcgcc ggtctggaag caccggaacg ggtcgaatca 3900
acccgcgttg ctgttgcttt
ggtgaagccc gatgattgga aactgattca gtctgatttc 3960
gcggttaggc agtacgttct
cgattgcgtg gataaggcta aggacgtggc cgctgcgcaa 4020
cgtgtcgcta atgaggtgct ggcaagtctg
ggtgtggatt ccaccccgtg catgatcgtt 4080
atggatgatg tggacttgga
cgcggttctg cctactcatg gggacgctac taagcgtgat 4140
ctgaatgcgg cggtgttcgc
gggtaatgag cagactattc ttcgcaccca ctaaaagcgg 4200
cataaacccc gttcgatatt
ttgtgcgatg aatttatggt caatgtcgcg ggggcaaact 4260
atgatgggtc ttgttgttgg
cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa 4320
ggcggcggtg gaatcgaaat
ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc 4380
gaagggcacc aataactgcc
ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 4440
tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca
tggaagccat cacagacggc atgatgaacc 4500
tgaatcgcca gcggcatcag
caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 4560
acgggggcga agaagttgtc
catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 4620
cagggattgg ctgagacgaa
aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 4680
ttttcaccgt aacacgccac
atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 4740
tggtattcac tccagagcga
tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 4800
gggtgaacac tatcccatat
caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga 4860
tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga
ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 4920
ttctttacgg tctttaaaaa
ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 4980
tgagcaactg actgaaatgc
ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 5040
gtggtatatc cagtgatttt
tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc 5100
gaagctcggc ggatttgtcc
tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg 5160
tgtccggatc ggtcaaatac
gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg 5220
atccccggcg ccagggtggt
ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 5280
ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc
aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc 5340
gaaaatcctg tttgatggtg
gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 5400
cgtatcccac taccgagata
tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 5460
ttgcgcccag cgccatctga
tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 5520
tcagcatttg catggtttgt
tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 5580
ctatcggctg aatttgattg
cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 5640
ccgagacaga acttaatggg
cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 5700
gatgctccac gcccagtcgc
gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 5760
tctggtcaga gacatcaaga
aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 5820
tggcatcctg gtcatccagc
ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 5880
gattgtgcac cgccgcttta
caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 5940
cgctggcacc cagttgatcg
gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 6000
gcagggccag actggaggtg
gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 6060
gtgccacgcg gttgggaatg
taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 6120
ttttcgcaga aacgtggctg
gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 6180
cggcatactc tgcgacatcg
tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 6240
tctcttccgg gcgctatcat
gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 6300
cgtaaatgcc gcttcgcctt
cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 6360
cggtgcacca atgcttctgg
cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 6420
tcgtaaatca ctgcataatt
cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 6480
ttgcgccgac atcataacgg
ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 6540
atcggctcgt ataatgtgtg
gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 6600
t
6601
<210> 6
<211> 8122
<212> DNA
<213> 携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY序列
<400> 6
aattaagctt gcatgcctgc
aggtcgacaa ggagatatag atggaacgaa ataaacttgc 60
tcgtcagatt attgacactt
gcctggaaat gacccgcctg ggactgaacc aggggacagc 120
ggggaacgtc agtgtacgtt
atcaggatgg gatgctgatt acgcctacag gcattccata 180
tgaaaaactg acggagtcgc
atattgtctt tattgatggc aacggtaaac atgaggaagg 240
aaagctcccc tcaagcgaat
ggcgtttcca tatggcagcc tatcaaagca gaccggatgc 300
caacgcggtt gttcacaatc
atgccgttca ttgcacggca gtttccattc ttaaccgatc 360
gatccccgct attcactaca tgattgcggc
ggctggcggt aattctattc cttgcgcgcc 420
ttatgcgacc tttggaacac
gcgaactttc tgaacatgtt gcgctggctc tcaaaaatcg 480
taaggcaact ttgttacaac
atcatgggct tatcgcttgt gaggtgaatc tggaaaaagc 540
gttatggctg gcgcatgaag
ttgaagtgct ggcgcaactt tacctgacga ccctggcgat 600
tacggacccg gtgccagtgc
tgagcgatga agagattgcc gtagtgctgg agaaattcaa 660
aacctatggg ttacgaattg
aagagtaaaa cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa 720
ttgcaagctg atccgggctt
atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag 780
ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc 840
aaggcgcact cccgttctgg
ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa 900
tattctgaaa tgagctgttg
acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag 960
cggataacaa tttcacacag
gaaacaggac catgaaggag atatagatgt acgagcgtta 1020
tgcaggttta atttttgata
tggatggcac aatcctggat acggagccta cgcaccgtaa 1080
agcgtggcgc gaagtattag
ggcactacgg tcttcagtac gatattcagg cgatgattgc 1140
gcttaatgga tcgcccacct
ggcgtattgc tcaggcaatt attgagctga atcaggccga 1200
tctcgacccg catgcgttag cgcgtgaaaa
aacagaagca gtaagaagta tgctgctgga 1260
tagcgtcgaa ccgcttcctc
ttgttgatgt ggtgaaaagt tggcatggtc gtcgcccaat 1320
ggctgtagga acggggagtg
aaagcgccat cgctgaggca ttgctggcgc acctgggatt 1380
acgccattat tttgacgccg
tcgtcgctgc cgatcacgtc aaacaccata aacccgcgcc 1440
agacacattt ttgttgtgcg
cgcagcgtat gggcgtgcaa ccgacgcagt gtgtggtctt 1500
tgaagatgcc gatttcggta
ttcaggcggc ccgtgcagca ggcatggacg ccgtggatgt 1560
tcgcttgctg tgataagaat
tcagcttggc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc 1620
ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc
ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc 1680
agtagcgcgg tggtcccacc
tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 1740
gatggtagtg tggggtctcc
ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 1800
aaaggctcag tcgaaagact
gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 1860
cctgagtagg acaaatccgc
cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg 1920
gtggcgggca ggacgcccgc
cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct 1980
gacggatggc ctttttgcgt
ttctacaaac tcttttgttt atttttctaa atacattcaa 2040
atatgtatcc gctcatgaga
caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 2100
agagtatgag tattcaacat
ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 2160
ttcctgtttt tgctcaccca
gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 2220
gtgcacgagt gggttacatc
gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 2280
gccccgaaga acgttttcca
atgatgagca cttttgcttc ctcgctcact gactcgctgc 2340
gctcggtcgt tcggctgcgg
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 2400
ccacagaatc aggggataac
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 2460
ggaaccgtaa aaaggccgcg
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 2520
atcacaaaaa tcgacgctca
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 2580
aggcgtttcc ccctggaagc
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 2640
gatacctgtc cgcctttctc
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta 2700
ggtatctcag ttcggtgtag
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 2760
ttcagcccga ccgctgcgcc
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 2820
acgacttatc gccactggca
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 2880
gcggtgctac agagttcttg
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 2940
ttggtatctg cgctctgctg
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 3000
ccggcaaaca aaccaccgct
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 3060
gcagaaaaaa aggatctcaa
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 3120
ggaacgaaaa ctcacgttaa
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 3180
agatcctttt ggggtgggcg
aagaactcca gcatgagatc cccgcgctgg aggatcatcc 3240
agccattcgg ggtcgttcac
tggttcccct ttctgatttc tggcatagaa gaacccccgt 3300
gaactgtgtg gttccggggg
ttgctgattt ttgcgagact tctcgcgcaa ttccctagct 3360
taggtgaaaa caccatgaaa
cactagggaa acacccatga aacacccatt agggcagtag 3420
ggcggcttct tcgtctaggg
cttgcatttg ggcggtgatc tggtctttag cgtgtgaaag 3480
tgtgtcgtag gtggcgtgct
caatgcactc gaacgtcacg tcatttaccg ggtcacggtg 3540
ggcaaagaga actagtgggt
tagacattgt tttcctcgtt gtcggtggtg gtgagctttt 3600
ctagccgctc ggtaaacgcg
gcgatcatga actcttggag gttttcaccg ttctgcatgc 3660
ctgcgcgctt catgtcctca
cgtagtgcca aaggaacgcg tgcggtgacc acgacgggct 3720
tagcctttgc ctgcgcttct
agtgcttcga tggtggcttg tgcctgcgct tgctgcgcct 3780
gtagtgcctg ttgagcttct
tgtagttgct gttctagctg tgccttggtt gccatgcttt 3840
aagactctag tagctttcct
gcgatatgtc atgcgcatgc gtagcaaaca ttgtcctgca 3900
actcattcat tatgtgcagt
gctcctgtta ctagtcgtac atactcatat ttacctagtc 3960
tgcatgcagt gcatgcacat
gcagtcatgt cgtgctaatg tgtaaaacat gtacatgcag 4020
attgctgggg gtgcaggggg
cggagccacc ctgtccatgc ggggtgtggg gcttgccccg 4080
ccggtacaga cagtgagcac
cggggcacct agtcgcggat acccccccta ggtatcggac 4140
acgtaaccct cccatgtcga
tgcaaatctt taacattgag tacgggtaag ctggcacgca 4200
tagccaagct aggcggccac
caaacaccac taaaaattaa tagtccctag acaagacaaa 4260
cccccgtgcg agctaccaac
tcatatgcac gggggccaca taacccgaag gggtttcaat 4320
tgacaaccat agcactagct
aagacaacgg gcacaacacc cgcacaaact cgcactgcgc 4380
aaccccgcac aacatcgggt
ctaggtaaca ctgagtaaca ctgaaataga agtgaacacc 4440
tctaaggaac cgcaggtcaa
tgagggttct aaggtcactc gcgctagggc gtggcgtagg 4500
caaaacgtca tgtacaagat
caccaatagt aaggctctgg cggggtgcca taggtggcgc 4560
agggacgaag ctgttgcggt
gtcctggtcg tctaacggtg cttcgcagtt tgagggtctg 4620
caaaactctc actctcgctg
ggggtcacct ctggctgaat tggaagtcat gggcgaacgc 4680
cgcattgagc tggctattgc
tactaagaat cacttggcgg cgggtggcgc gctcatgatg 4740
tttgtgggca ctgttcgaca
caaccgctca cagtcatttg cgcaggttga agcgggtatt 4800
aagactgcgt actcttcgat
ggtgaaaaca tctcagtgga agaaagaacg tgcacggtac 4860
ggggtggagc acacctatag
tgactatgag gtcacagact cttgggcgaa cggttggcac 4920
ttgcaccgca acatgctgtt
gttcttggat cgtccactgt ctgacgatga actcaaggcg 4980
tttgaggatt ccatgttttc
ccgctggtct gctggtgtgg ttaaggccgg tatggacgcg 5040
ccactgcgtg agcacggggt
caaacttgat caggtgtcta cctggggtgg agacgctgcg 5100
aaaatggcaa cctacctcgc
taagggcatg tctcaggaac tgactggctc cgctactaaa 5160
accgcgtcta aggggtcgta
cacgccgttt cagatgttgg atatgttggc cgatcaaagc 5220
gacgccggcg aggatatgga
cgctgttttg gtggctcggt ggcgtgagta tgaggttggt 5280
tctaaaaacc tgcgttcgtc
ctggtcacgt ggggctaagc gtgctttggg cattgattac 5340
atagacgctg atgtacgtcg
tgaaatggaa gaagaactgt acaagctcgc cggtctggaa 5400
gcaccggaac gggtcgaatc
aacccgcgtt gctgttgctt tggtgaagcc cgatgattgg 5460
aaactgattc agtctgattt
cgcggttagg cagtacgttc tcgattgcgt ggataaggct 5520
aaggacgtgg ccgctgcgca
acgtgtcgct aatgaggtgc tggcaagtct gggtgtggat 5580
tccaccccgt gcatgatcgt
tatggatgat gtggacttgg acgcggttct gcctactcat 5640
ggggacgcta ctaagcgtga
tctgaatgcg gcggtgttcg cgggtaatga gcagactatt 5700
cttcgcaccc actaaaagcg
gcataaaccc cgttcgatat tttgtgcgat gaatttatgg 5760
tcaatgtcgc gggggcaaac
tatgatgggt cttgttgttg gcgtcccgga aaacgattcc 5820
gaagcccaac ctttcataga
aggcggcggt ggaatcgaaa tctcgtgatg gcaggttggg 5880
cgtcgcttgg tcggtcattt
cgaagggcac caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg 5940
ccctgccact catcgcagta
ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 6000
tcacagacgg catgatgaac
ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 6060
taatatttgc ccatggtgaa
aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa 6120
tcaaaactgg tgaaactcac
ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac 6180
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gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt 6240
agaaactgcc ggaaatcgtc
gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc 6300
tcatggaaaa cggtgtaaca
agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc 6360
attgccatac ggaactccgg
atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc 6420
ggataaaact tgtgcttatt
tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga 6480
acggtctggt tataggtaca
ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga 6540
tgccattggg atatatcaac
ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc 6600
ttagctcctg aaaatctcgt
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aaatccacac attatcccag
gtgtccggat cggtcaaata cgctgccagc tcatagaccg 6720
tatccaaagc atccggggct
gatccccggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag 6780
acgggcaaca gctgattgcc
cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag caagcggtcc 6840
acgtggtttg ccccagcagg
cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac 6900
atgagctgtc ttcggtatcg
tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc 6960
cggactcggt aatggcgcgc
attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg 7020
cagtgggaac gatgccctca
ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac 7080
tccagtcgcc ttcccgttcc
gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc 7140
agccagccag acgcagacgc
gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt 7200
gctggtgacc caatgcgacc
agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga 7260
aaataatact gttgatgggt
gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag 7320
tgcaggcagc ttccacagca
atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc 7380
cactgacgcg ttgcgcgaga
agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc 7440
gttctaccat cgacaccacc
acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg 7500
cgacaatttg cgacggcgcg
tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg 7560
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tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg 7620
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gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg 7680
aaacggtctg ataagagaca
ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca 7740
cattcaccac cctgaattga
ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt 7800
tgcaccattc gatggtgtca
acgtaaatgc cgcttcgcct tcgcgcgcga attgcaagct 7860
gatccgggct tatcgactgc
acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa 7920
gctgtggtat ggctgtgcag
gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac 7980
tcccgttctg gataatgttt
tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa 8040
atgagctgtt gacaattaat
catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 8100
atttcacaca ggaaacagaa
tt
8122
Claims (3)
1.谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium
glutamicum)重组菌株SY12，保藏编号为CGMCC
No. 9838。
2.一种构建权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium
glutamicum)重组菌株SY12 CGMCC No. 9838的方法，具体方法包括以下步骤：
2.1构建携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，其物理图谱如图2所示，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）基因（648bp，序列表中序列1）和果糖-1-磷酸化酶（YqaB）基因（567bp，序列表中序列2）、来源于pXMJ19的tac启动子（307bp，序列表中序列3），再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成的融合基因FucA-tac-YqaB（1548bp，序列表中序列4），然后将融合基因FucA-tac-YqaB连接入载体pXMJ19中，得到携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体，命名为pXFTY，其核苷酸序列如序列表中序列6所示.
2.2向野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中导入携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，得到携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12。
3.权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12 CGMCC No.9838在合成D-阿洛酮糖中的应用，即在发酵培养基中添加D-甘油醛和葡萄糖，葡糖糖通过胞内的糖酵解途径生成磷酸二羟丙酮，D-甘油醛和胞内积累的磷酸二羟丙酮（DHAP）在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶和果糖-1-磷酸化酶的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖。
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