CN107746856A - 生产l‑稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法与应用 - Google Patents

生产l‑稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生产L‑稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法与应用，提出了以葡萄糖和小分子化合物为底物合成L‑稀少糖的方法，涉及多株重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，并将重组菌株应用于L‑稀少糖的发酵合成。实现了以葡萄糖和甘油为底物发酵法合成L‑果糖、L‑塔格糖、L‑山梨糖和L‑阿洛酮糖，以葡萄糖和1，2‑丙二醇或者L‑乳酸发酵法合成L‑鼠李树胶糖、L‑墨角藻糖、6‑脱氧L‑山梨糖、6‑脱氧L‑阿洛酮糖，与现有生物转化法合成L‑稀少糖相比，本发明将有效降低L‑稀少糖的生产成本，所获得的L‑稀少糖可应用于食品、医药、化妆品等领域。

Description

生产L-稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产L-稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株及其构建方法，以及将其用于发酵生产8种L-稀少糖。
背景技术
稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物(2002年国际稀少糖学会ISRS定义)。尽管稀少糖在自然界中含量极少，但其具有热量低、 稳定性高、甜昧协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，在膳食、保健、医药 等领域引起了广泛关注，它们可以作为添加剂改善食品的理化性质，提高食品的生理功 能和保健功能。另外，大量研究结果还表明稀少糖在抗癌、清除自由基、神经保护等诸 多方面发挥着重要的生理活性作用，还可用于修饰药物或活性物质从而优化其功能活 性。
稀少糖按照单糖分子中离羰基最远的不对称碳原子上羟基的空间排布可分为D-稀 少糖和L-稀少糖，目前研究较多的是D-稀少糖，如D-阿洛糖(D-Allose)、D-阿洛酮 糖(D-阿洛酮糖)、D-塔格糖(D-Tagatose)等。美国食品与药品管理局(FDA)在2003 年就将D-塔格糖列为安全食品(GRAS)添加剂。阿洛酮糖的安全性及其在食品中的应 用已被日本厚生省批准，2011年3月完成了阿洛酮糖的商标注册，并正式申请了特定 保健食品。L-稀少糖作为稀少糖中另外一部分，研究相对较少，但其具有非常重要的功 能，例如D-果糖可被人体代谢产生能量，但同时会引起肥胖和糖尿病等代谢综合征， 然而L-果糖则不被人体代谢，属于低能量甜味剂，同时L-果糖还可以作为糖苷酶抑制 剂，杀虫剂使用；2-脱氧L-核糖作为核苷类药物的重要前体，与D-核苷相比，L-核苷 药物具有显著的抗病毒活性，而毒性较低，此外L-山梨糖是合成维生素C的重要前体， L-阿洛酮糖可用于治疗鼠单纯疱疹性角膜炎。
L-稀少糖在自然界中含量很少、且难以化学合成，传统的化学合成法需要多步保护 和脱保护步骤，不能满足大规模的生产需要。日本的研究学者Izumori于2002年建 立了稀少糖的生物转化生产策略，即Izumoring方法，该方法中利用酮糖差相异构酶 (Ketoseepimerase)、醛糖异构酶(Aldose isomerases)和多元醇脱氢酶(Poly dehydrogenase)实现D-糖与L-糖，L-糖与L-糖的相互转化(Izumori K.Bioproduction strategies for rarehexoses.Naturwissenschaften，2002，89：120-124.)，然而 以D-糖为底物合成L-糖往往需要先将D-糖还原成糖醇，再将糖醇氧化成L-糖，转化效 率低，且反应需要辅酶参与；如以L-糖为底物异构化合成另外一种L-糖，所使用的底 物往往价格非常昂贵，很难实现规模化生产。
醛缩酶是实现C-C键的不对称合成非常有效的手段之一，已经被广泛应用于糖和氨 基酸等化合物的生物合成(Brovetto M，Gamenara D，Saenz Mendez P，Seoane GA.C-Cbond-forming lyases in organic synthesis.Chemical Reviews 2011.111：4346-4403)。已有研究报道基于醛缩酶构建多酶偶联体系合成L-果糖，可 以避免使用辅酶因子，然而底物3-磷酸甘油和L-甘油醛价格昂贵，依然难以实现规模 化生产(Li Z，Cai L，Qi Q，WangP.Enzymatic synthesis of D-sorbose and D-psicose with aldolase RhaD：Effect of acceptor configuration on enzyme stereoselectivity.Bioorg.Med.Chem.Lett.2011.21.7081-7084)，所以亟待开 发以廉价原料为底物高效合成L-稀少糖的方法。随着工业生物技术产业的发展，产生 了大量廉价大宗化学品如甘油、1，2-丙二醇、L-乳酸等，通过基因工程和代谢工程的方 法构建微生物重组菌株，再以这些廉价低碳化学品为原料发酵生产L-稀少糖是本发明 的一个中心思路。
发明内容
本发明目的之一是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强醇脱氢酶、去磷酸化酶和L-鼠李树胶 糖-1-磷酸醛缩酶表达，所述的醇脱氢酶的氨基酸序列为与SEQ ID N0：1具有90％或以 上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的 去磷酸化酶氨基酸的序列为与SEQ ID N0：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％ 以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶氨 基酸序列为与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的 序列，最优选100％同源性的序列。
本发明目的之二是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强醇脱氢酶、去磷酸化酶和L-墨角藻糖 -1-磷酸醛缩酶表达，所述的醇脱氢酶的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1具有90％或以上， 优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷 酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上 同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序 列为与SEQID NO：4具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列， 最优选100％同源性的序列。
本发明目的之三是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强醇脱氢酶、去磷酸化酶和D-果糖-1，6- 二磷酸醛缩酶表达，所述的醇脱氢酶的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1具有90％或以上， 优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷 酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID N0：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上 同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶氨基酸序 列为与SEQID NO：5具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列， 最优选100％同源性的序列。
本发明目的之四是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、去 磷酸化酶和L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶表达，所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸序 列为与SEQ ID N0：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列， 最优选100％同源性的序列，所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：7具有90％或以 上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的 L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％ 以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨 基酸序列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的 序列，最优选100％同源性的序列。
本发明目的之五是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、去 磷酸化酶活性和L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶表达，所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸 序列为与SEQ ID NO：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列， 最优选100％同源性的序列，所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：7具有90％或以 上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的 L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID N0：4具有90％或以上，优选95％以上， 更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨基酸序 列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列， 最优选100％同源性的序列。
本发明目的之六是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、去 磷酸化酶活性和D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶表达，所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸 序列为与SEQ ID NO：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列， 最优选100％同源性的序列，所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：7具有90％或以 上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的 D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID N0：5具有90％或以上，优选95％以上， 更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨基酸序 列为与SEQ ID N0：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列， 最优选100％同源性的序列。
本发明目的之七是本发明目的之一、或之二、或之三任一所述的构建方法得到的谷氨酸棒状杆菌在发酵生产L-稀少糖中的应用，所述稀少糖为L-果糖，或L-塔格糖， 或L-山梨糖，或L-阿洛酮糖，或L-鼠李树胶糖，或L-墨角藻糖，或6-脱氧L-山梨糖， 或6-脱氧L-阿洛酮糖。
本发明目的之八是提供一种发酵生产L-稀少糖的方法，其特征在于，培养权利要求4-6任一所述的构建方法得到的谷氨酸棒状杆菌，以葡萄糖和L-乳酸为底物，发酵生 产L-稀少糖，所述的L-稀少糖为L-鼠李树胶糖，或L-墨角藻糖，或6-脱氧L山梨糖， 或6-脱氧L-阿洛酮糖。
在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，发酵生产条件初始菌体密度菌体浓度(OD600)为30-60；发酵温度30-32℃；发酵培养基中葡萄糖为20-80g/L，L-乳 酸10-20g/L，优选的葡萄糖为40g/L，优选的L-乳酸10g/L。
本发明目的之九是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于， 所述的遗传修饰是；敲除丙糖磷酸异构酶基因和增强酶活性的遗传修饰，所述增强酶活 性的酶包括丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶和去磷酸化酶。
在优选的实施方式中，其特征在于(a)和(b)和(c)和(d)；
(a)所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(b)所述的去磷酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(c)所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(d)所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：7具有90％或以上，优选95％以上， 更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
在更优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，所述的增强酶活性的遗传修饰是通过表达酶增强的。
本发明目的之十是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于， 所述的遗传修饰是；敲除丙糖磷酸异构酶基因和增强酶活性的遗传修饰，所述增强酶活 性的酶包括丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶和去磷酸化酶。
在优选的实施方式中，其特征在于(a)和(b)和(c)和(d)；
(a)所述的去磷酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID N0：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(b)所述的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：4具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(c)所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(d)所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID N0：7具有90％或以上，优选95％以上， 更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
在更优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，所述的增强酶活性的遗传修饰是通过表达酶增强的。
本发明目的之十一是提供一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于，所述的遗传修饰是；敲除丙糖磷酸异构酶基因和增强酶活性的遗传修饰，所述增强 酶活性的酶包括丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶和去磷 酸化酶。
在优选的实施方式中，其特征在于(a)和(b)和(c)和(d)；
(a)所述的去磷酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID N0：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(b)所述的D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID N0：5具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(c)所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列；
(d)所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID N0：7具有90％或以上，优选95％以上， 更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
在更优选的实施方式中，所述的构建方法，其特征在于，所述的增强酶活性的遗传修饰是通过表达酶增强的。
本发明的目的十二是提供一种发酵法合成L-稀少糖的方法，其特征为，通过构建工程菌株发酵葡萄糖和小分子化合物如甘油、1，2-丙二醇，L-乳酸等合成L-稀少糖， 技术路线如图1所示，具体的，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，敲除丙糖磷酸异构酶，其 目的在于以葡萄糖为底物时，胞内积累磷酸二羟丙酮；引入醇脱氢酶，其目的在于转化 甘油，1，2-丙二醇为L-甘油醛和L-乳醛；引入丙酸乙酰辅酶A转移酶和醛脱氢酶，其 目的在于转化L-乳酸为L-乳醛；引入醛缩酶和去磷酸化酶，其目的在于将胞内磷酸二 羟丙酮和醛经羟醛缩合和去磷酸化转化为L-稀少糖。
本发明的目的十三是提供用于发酵生产L-稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建 方法。
所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：
1)丙糖磷酸异构酶基因敲除的谷氨酸棒杆菌重组菌株SY6，其构建方法见专利201410055300.X。
2)在谷氨酸棒杆菌SY6中引入来源于马肝的醇脱氢酶基因HLADH，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株SY18；
3)向重组谷氨酸棒杆菌SY18中引入L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY20；
4)向重组谷氨酸棒杆菌SY18中引入L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY21；
5)向重组谷氨酸棒杆菌SY18中引入D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY22；
所述步骤2)中重组谷氨酸棒杆菌SY18的具体方法包括以下步骤：
委托江苏金唯智生物技术有限公司合成来源马肝的醇脱氢酶基因(序列表中序列1) 并要求其提供含有醇脱氢酶基因的载体pUC57-HLADH；以质粒pUC57-HLADH为模板PCR扩增来源于来源马肝脏的醇脱氢酶基因，连接至载体pEC-XK99E中，得到携带有醇脱氢 酶基因的重组载体，命名为pEH；通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY6导入重 组质粒pEH，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株SY18。
所述步骤3)中重组谷氨酸棒杆菌SY20的具体方法包括以下步骤：
PCR扩增来源于大肠埃希氏菌MG1655的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因(序列表中序列2)和去磷酸化酶(YqaB)基因(序列表中序列3)，将上述两个基因连接入载 体pXMJ19中，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pXRTY，通过电 转化方式向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY18中导入重组质粒pXRTY，得到谷氨酸棒杆菌重 组菌株SY20。
所述步骤4)中重组谷氨酸棒杆菌SY21的具体方法包括以下步骤：
PCR扩增来源于大肠埃希氏菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因(序列表中序列4)和去磷酸化酶(YqaB)基因(序列表中序列3)，将上述两个基因连接入载体 pXMJ19中，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pXFucTY，通过电转 化方式向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY18中导入重组质粒pXFucTY，得到谷氨酸棒杆菌重 组菌株SY21。
所述步骤5)中重组谷氨酸棒杆菌SY22的具体方法包括以下步骤：
PCR扩增来源于大肠埃希氏菌MG1655的D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因(序列表中序列5)和去磷酸化酶(YqaB)基因(序列表中序列3)，将上述两个基因连接入载体 pXMJ19中，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pXFruTY，通过电转 化方式向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY18中导入重组质粒pXFruTY，得到谷氨酸棒杆菌重 组菌株SY22。
本发明目的十四是提供所述谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20，SY21，SY22在合成L-型稀少糖中的应用，该应用为用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20以廉价甘油和葡萄糖为底物 合成L-果糖；用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY21以廉价甘油和葡萄糖为底物合成L-塔格糖； 用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY22以廉价甘油和葡萄糖为底物合成L-山梨糖和L-阿洛酮 糖；用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20以葡萄糖和廉价1，2-丙二醇为底物合成L-鼠李树胶 糖(L-rhamnulose)；用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY21以葡萄糖和廉价1，2-丙二醇为 底物合成L-墨角藻糖(L-fuculose)；用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY22以葡萄糖和廉价 1，2-丙二醇为底物合成6-脱氧L-山梨糖和6-脱氧L-阿洛酮糖；
本发明的目的十五是提供用于发酵葡萄糖和L-乳酸生产L-稀少糖的谷氨酸棒杆菌 重组菌株的构建方法，技术路线如图2所示。
所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：
1)在谷氨酸棒杆菌重组菌株SY6中引入来源于丙酸梭菌Clostridiumpropionicum 的丙酸乙酰辅酶A转移酶PCT和小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersirdaenterocolitica的醛 脱氢酶PdcD，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株SY19；
2)向重组谷氨酸棒杆菌SY19中引入L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY23；
3)向重组谷氨酸棒杆菌SY19中引入L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY24；
4)向重组谷氨酸棒杆菌SY19中引入D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY25；
具体的，向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY6引入丙酸乙酰辅酶A转移酶PCT和醛脱氢酶PdcD，目的在于在细胞内将L-乳酸转化为L一乳醛；向携带有醇脱氢酶基因的谷氨酸棒 杆菌重组菌株SY18引入醛缩酶和去磷酸化酶基因目的在于在细胞内将所生成的磷酸二 羟丙酮和L-乳醛转化为6-脱氧L-稀少糖。
所述步骤1)中重组谷氨酸棒杆菌SY19的具体方法包括以下步骤：
委托江苏金唯智生物技术有限公司合成丙酸乙酰辅酶A转移酶PCT基因(序列表中序列6)和醛脱氢酶PdcD(序列表中序列7)并要求其提供含有醇脱氢酶基因的载体 pUC57-PCT和pUC57-PdcD；以质粒pUC57-PCT和pUC57-PdcD为模板PCR扩增来源于来 源马肝脏的醇脱氢酶基因，连接至载体pEC-XK99E中，得到携带有醇脱氢酶基因的重组 载体，命名为pPCPD；通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY6导入重组质粒pPCPD， 得到谷氨酸棒杆菌重组菌株SY19。
所述步骤2)中重组谷氨酸棒杆菌SY23的具体方法包括以下步骤：
通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY19中导入重组质粒pXRTY，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株SY23。
所述步骤3)中重组谷氨酸棒杆菌SY24的具体方法包括以下步骤：
通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY19中导入重组质粒pXFucTY，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株SY24。
所述步骤4)中重组谷氨酸棒杆菌SY25的具体方法包括以下步骤：
通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY19中导入重组质粒pXFruTY，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株SY25。
本发明目的十六是提供所述谷氨酸棒杆菌重组菌株SY23，SY24，SY25在合成L-稀少糖中的应用，该应用为用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY23以葡萄糖和廉价L-乳酸为底物 合成L-鼠李树胶糖(L-rhamnulose)；用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY24以葡萄糖和廉价 L-乳酸为底物合成L-墨角藻糖(L-fuculose)；用谷氨酸棒杆菌重组菌株SY25以葡萄糖 和廉价L-乳酸为底物合成6-脱氧L-山梨糖和6-脱氧L-阿洛酮糖。
本发明实验证明所述谷氨酸棒杆菌重组菌株可以以葡萄糖和小分子化学品如甘油、 1，2-丙二醇、L-乳酸等为底物发酵法合成多种L-型稀少糖，因此，本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株可应用于L-稀少糖的合成领域中，所获得的L-稀少糖将在食品和医药行 业具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为以葡萄糖和小分子化学品为底物合成L-稀少糖的技术路线。
图2为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20以葡萄糖和甘油为底物合成L-果糖的高效液相色谱分析结果。
图3为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY21以葡萄糖和甘油为底物合成L-塔格糖的高效液相色谱分析结果。
图4为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY22以葡萄糖和甘油为底物合成L-山梨糖和L-阿洛酮糖的高效液相色谱分析结果。
图5为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20以葡萄糖和1，2-丙二醇为底物合成L-鼠李树胶糖的高效液相色谱分析结果。
图6为谷氨酸棒杆菌重组菌株SY21以葡萄糖和1，2-丙二醇为底物合成L-墨角藻糖的高效液相色谱分析结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位 g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单 位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操 作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20，SY21，SY22
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20的构建，包括以下步骤：
1.1、在谷氨酸棒杆菌重组菌株SY6中引入醇脱氢酶基因，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株SY18。
具体构建过程如下：
委托江苏金唯智生物技术有限公司合成来源马肝的醇脱氢酶基因HLADH(1128bp，序列表中序列1)并要求其提供含有醇脱氢酶基因的载体pUC57-HLADH，以合成的醇脱氢 酶基因序列设计引物1和引物2，其中引物1中含有EcoRI，引物2中含有HindIII酶 切位点，具体引物序列如下：
引物1：CCGGAATTCGATGGTCTAGAAACGTAAATGCCGCTTCGCC
引物2：ACTCAAGCTTCATGGTCCTGTTTCCTGTG
1.2、以含有醇脱氢酶基因的质粒pUC57-HLADH为模板，PCR扩增来源于来源马肝脏的醇脱氢酶基因(1128bp，序列表中序列1)，用限制性内切酶EcoRI和HindIII同 时切割基因片段HLADH和重组载体pEC-XK99E，用T4连接酶连接，得到含有醇脱氢酶的 重组载体，命名为pEH。
1.3、通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株SY6中导入重组载体pEH，得到携带有醇脱氢酶基因的谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株SY18。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20的构建
向重组谷氨酸棒杆菌SY18中引入L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶(YqaB)基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY20。包括以下步骤：
2.1、根据Genbank中大肠杆菌MG1655的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因(845bp，序列表中序列2)和去磷酸化酶(YqaB)基因(581bp，序列表中序列3)，设计引物3 和引物4、引物5和引物6，引物5含有RBS位点序列(AAAGGAGGACAACC)，引物3和 引物6带有Xba I和PstI酶切位点，引物4和引物5有40bp的同源区，引物序列如 下：
引物3：5’-GATGGTCTAGAGGGTCGTGCATCCGACAACACC-3’
引物4：5’-GTACATGGTTGTCCTCCTTTTTACAGCGCCAGCGCACTGG-3’；
引物5：5’-CCAGTGCGCTGGCGCTGTAAAAAGGAGGACAACCATGTACGAGCGTTATGCAGGTTTA-3’
引物6：5’-GACAACTGCAGGGCATCCAGCTTAATAATAGCGT-3’；
2.2、以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，通过引物3和引物4PCR扩增基因 L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)基因(845bp，序列表中序列2)，通过引物5和 引物6PCR扩增去磷酸化酶(YqaB)基因(581bp，序列表中序列3)，融合PCR方法获 得融合片段“rhaD-yqaB”，用限制性内切酶Pst I和Xba I同时酶切融合基因片段和载 体pXMJ19，运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pXMJ19和融合基因片段进行连接， 得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pXRTY。
2.3、采用电转化方法，将携带L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pXRTY导入重组谷氨酸棒杆菌SY18中，得到重组谷氨酸棒杆菌SY20。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY21的构建
向重组谷氨酸棒杆菌SY18中引入L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶(YqaB)基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY21。包括以下步骤：
3.1、根据Genbank中大肠杆菌MG1655的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因(648bp，序列表中序列4)和去磷酸化酶(YqaB)基因(58ibp，序列表中序列3)，设计引物7 和引物8、引物9和引物10，引物9含有RBS位点序列(AAAGGAGGACAACC)，引物7 和引物10带有Sal I和EcoR I酶切位点，引物8和引物9有40bp的同源区，引物序 列如下：
引物7：5’-GGGACGTCGACAAGGAGATATAGATGGAACGAAATAAACTTGCTCG-3’
引物8：5’-CGAAGCGGCATTTACGTTTTACTCTTCAATTCGTAACCCATAG-3’；
引物9：5’-CTATGGGTTACGAATTGAAGAGTAAAACGTAAATGCCGCTTCG-3’
引物10：5’-CCGGAATTCTTATCACAGCAAGCGAACATCCAC-3’；
3.2、以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，通过引物7和引物8PCR扩增基因 L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(FucA)基因(648bp，序列表中序列4)，通过引物9和引 物10PCR扩增果糖-1-磷酸化酶(YqaB)基因(567bp，序列表中序列3)，采用融合PCR 方法获得融合基因片段“fucA-yqaB”。用限制性内切酶Sal I和EcoR I同时酶切融合 基因片段和载体pXMJ19，运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pXMJ19和融合基因片 段进行连接，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pXFucTY。
3.3、采用电转化方法，将携带L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pXFucTY导入重组谷氨酸棒杆菌SY18中，得到重组谷氨酸棒杆菌SY21。
4、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY22的构建
向重组谷氨酸棒杆菌SY18中引入D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶(YqaB)基因，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY22。包括以下步骤：
4.1、根据Genbank中大肠杆菌MG1655的D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因(1080bp，序列表中序列5)和果糖-1-磷酸化酶(YqaB)基因(567bp，序列表中序列3)，设计 引物11和引物12、引物13和引物14，引物13中含有RBS位点序列(AAAGGAGGACAACC)， 引物12和引物13有40bp的同源区，可用于进行PCR融合，引物11和引物14带有Sal I和EcoR I酶切位点，引物序列如下：
引物11：5’-GATGGTCTAGAAAGGAGATATAGATGTCTAAGATTTTTGATTTCGTA-3’
引物12：5’-AGGAAACAGGACCATGAAGGAGATATAGATGTACGAGCGT-3’；
引物13：5’-ACGCTCGTACATCTATATCTCCTTCATGGTCCTGTTTCCTGTGTGA-3’
引物14：5’-CTACCCCCGGGTTATCACAGCAAGCGAACATCCAC-3’；
4.2、以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，通过引物11和引物12PCR扩增基因 D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因(FruA)基因(1080bp，序列表中序列5)，通过引物13 和引物14PCR扩增果糖-1-磷酸化酶(YqaB)基因(567bp，序列表中序列3)，采用融 合PCR方法获得融合基因片段“fruA-yqaB”。用限制性内切酶Sal I和EcoR I同时酶 切融合基因片段和载体pXMJ19，运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pXMJ19和融合 基因片段进行连接，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pXFruTY。
4.3、采用电转化方法，将携带L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pXFruTY导入重组谷氨酸棒杆菌SY18中，得到重组谷氨酸棒杆菌SY22。
实施例2、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20、SY21、SY22在L-型稀少糖合成中的应用
谷氨酸棒杆菌重组菌株在L-型稀少糖合成中的应用包括以下步骤：
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株的培养及诱导
选用CGXII培养基(配方：(NH4)2SO4(5g/L)，urea(5g/L)，KH2PO4(1g/L)，K2HPO4(1g/L)，MgSO4·7H2O(0.25g/L)，CaCl2(10mg/L)，FeSO4·7H2O(10mg/L)，MnSO4·H2O(0.1mg/L)，ZnSO4·7H2O(1mg/L)，CuSO4·5H2O(0.2mg/L)，NiCl2·6H2O(20μg/L)，生 物素(0.4mg/L)，MOPS(42g/L)(pH 7.4))，培养基中添加葡萄糖(10g/L)、氯霉素 (12.5mg/L)和卡那霉素(25mg/L)，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组 菌株SY20进行培养，当OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mM，降低摇床转 速为150rmp，诱导约12h。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株的收集和浓缩
将诱导得到的谷氨酸棒杆菌重组菌株菌液(100mL)，4℃、8000rmp离心15min收 集菌体，用用CGXII培养基浓缩菌液至10mL。
3、以葡萄糖和甘油为底物生产L-稀少糖
取10mL谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20，或SY21，或SY22的浓缩菌液，放置于50mL 的锥形瓶中，加入终浓度为40g/L的葡萄糖和终浓度为10g/L的甘油进行发酵，发酵 条件为：温度30℃，pH 7.0，菌体浓度(OD600)为30。
发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤， 滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱 仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检 测器：示差折光检测器，上样量为10μl。
结果如图2、3、4((a)表示纯品；(b)表示发酵液)所示，可以看出，经过96 小时反应，重组菌株SY20可以以葡萄糖和甘油合成L-果糖，浓度为1400mg/L，重组菌 株SY21可以以葡萄糖和甘油合成L-塔格糖，浓度为826mg/L，重组菌株SY22可以以葡 萄糖和甘油合成L-山梨糖和L-阿洛酮糖，L-山梨糖浓度为243mg/L，L-阿洛酮糖浓度 为189mg/L。
4、以葡萄糖和1，2-丙二醇为底物生产L-稀少糖
取10mL谷氨酸棒杆菌重组菌株SY20，或SY21，或SY22的浓缩菌液，放置于50mL 的锥形瓶中，加入终浓度为40g/L的葡萄糖和终浓度为10g/L的1，2-丙二醇进行发酵， 发酵条件为：温度30℃，pH 7.0，菌体浓度(OD600)为30。
结果如图5、6所示，可以看出，经过96小时反应，重组菌株SY20可以以葡萄糖 和1，2-丙二醇合成L-鼠李树胶糖，浓度为1600mg/L；重组菌株SY21可以以葡萄糖和 1，2-丙二醇合成L-墨角藻糖，浓度为789mg/L，重组菌株SY22可以以葡萄糖和1，2- 丙二醇合成6-脱氧L-山梨糖和6-脱氧L-阿洛酮糖，其中6-脱氧L-山梨糖浓度为324 mg/L，6-脱氧L-阿洛酮糖浓度为206mg/L。
实施例3、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株SY23、SY24、SY25
1、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株SY19
具体构建过程如下：
1.1、委托江苏金唯智生物技术有限公司合成来源于丙酸梭菌Clostridiumpropionicum的丙酸乙酰辅酶A转移酶PCT基因(1575bp，序列表中序列6)和小肠结 肠炎耶尔森氏菌Yersirda enterocolitica的醛脱氢酶PdcD基因(1389bp，序列表中序 列7)，并要求其提供含有基因的载体pUC57-PCT和pUC57-PdcD；以合成的丙酸乙酰辅 酶A转移酶基因序列设计引物15和引物16，以合成的醛脱氢酶基因序列设计引物17 和引物18，引物16和引物17含有同源区域，引物15和引物18中分别含有KpnI和XbaI 酶切位点，具体引物序列如下：
引物15：5’-TAATAGGGTACCATGCGCAAGGTTCCAATCATCAC-3’
引物16：5’-GGTCGTTGGTGTTCATCTATATCTCCTTCATGGTCCTGTT-3’；
引物17：5’-ACGCTCGTACATCTATATCTCCTTCATGGTCCTGTTTCCTGTGTGA-3’
引物18：5’-GATGGTCTAGATTAGCGGATGGAGAAGCCGTTGGT-3’；
1.2、以质粒pUC57-PCT和pUC57-PdcD为模板，扩增pct和pdcD基因，采用融合 PCR方法获得融合基因片段“pct-pdcD”。用限制性内切酶KpnI和XbaI同时酶切融合 基因片段和载体pEC-XK99E，运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pEC-XK99E和融合 基因片段进行连接，得到携带醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体，命名为pPCPD。
1.3、采用电转化方法，将携带L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的载体pPCPD导入重组谷氨酸棒杆菌SY6中，得到重组谷氨酸棒杆菌SY19。
2、向重组谷氨酸棒杆菌SY19中引入携带有L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的表达载体pXRTY，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY23。
3、向重组谷氨酸棒杆菌SY19中引入携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的表达载体pXFucTY，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY24。
4、向重组谷氨酸棒杆菌SY19中引入携带有D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶基因和去磷酸化酶基因的表达载体pXFruTY，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为SY25。
实施例4、谷氨酸棒杆菌重组菌株SY23、SY24、SY25在L-型稀少糖合成中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株的培养，诱导，收集和浓缩与实施例2相同。
2、以葡萄糖和L-乳酸为底物生产L-稀少糖
取10mL谷氨酸棒杆菌重组菌株SY23，或SY24，或SY25的浓缩菌液，放置于50mL 的锥形瓶中，加入终浓度为40g/L的葡萄糖和终浓度为10g/L的L-乳酸进行发酵，发 酵条件为：温度30℃，pH 7.0，菌体浓度(OD600)为30。
经过96小时反应，重组菌株SY23可以以葡萄糖和L-乳酸合成L-鼠李树胶糖，浓 度为1046mg/L，重组菌株SY24可以以葡萄糖和L-乳酸合成L-墨角藻糖，浓度为589 mg/L，重组菌株SY25可以以葡萄糖和L-乳酸合成6-脱氧L-山梨糖和6-脱氧L-阿洛酮 糖，其中6-脱氧L-山梨糖浓度为256mg/L，6-脱氧L-阿洛酮糖浓度为176mg/L。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 生产L-稀少糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法与应用
<130> 2017
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtctaccg ctggtaaagt tatcaaatgc aaagctgctg ttctgtggga agaaaaaaaa 60
ccgttctcta tcgaagaagt tgaagttgct ccgccgaaag ctcacgaagt tcgtatcaaa 120
atggttgcta ccggtatctg ccgttctgac gaccacgttg tttctggtac cctggttacc 180
ccgctgccgg ttatcgctgg tcacgaagct gctggtatcg ttgaatctat cggtgaaggt 240
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atcggtgttg acatcaacaa agacaaattc gctaaagcta aagaagttgg tgctaccgaa 720
tgcgttaacc cgcaggacta caaaaaaccg atccaggaag ttctgaccga aatgtctaac 780
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tcttgctgcc aggaagctta cggtgtttct gttatcgttg gtgttccgcc ggactctcag 900
aacctgtcta tgaacccgat gctgctgctg tctggtcgta cctggaaagg tgctatcttc 960
ggtggtttca aatctaaaga ctctgttccg aaactggttg ctgacttcat ggctaaaaaa 1020
ttcgctctgg acccgctgat cacccacgtt ctgccgttcg aaaaaatcaa cgaaggtttc 1080
gacctgctgc gttctggtga atctatccgt accatcctga ccttctaa 1128
<210> 2
<211> 825
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
atgcaaaaca ttactcagtc ctggtttgtc cagggaatga tcaaagccac caccgacgcc 60
tggctgaaag gctgggatga gcgcaacggc ggcaacctga cgctacgcct ggatgacgcc 120
gatatcgcac catatcacga caatttccac caacaaccgc gctatatccc gctcagccag 180
cccatgcctt tactggcaaa tacaccgttt attgtcaccg gctcgggcaa attcttccgt 240
aacgtccagc ttgatcctgc ggctaactta ggcatcgtaa aagtcgacag cgacggcgcg 300
ggctaccaca ttctttgggg gttaaccaac gaagccgtcc ccacttccga acttccggct 360
cacttccttt cccactgcga gcgcattaaa gccaccaacg gcaaagatcg ggtgatcatg 420
cactgccacg ccaccaacct gatcgccctc acctatgtac ttgaaaacga caccgcggtc 480
ttcactcgcc aactgtggga aggcagcacc gagtgtctgg tggtattccc ggatggcgtt 540
ggcattttgc cgtggatggt gcccggcacg gacgaaatcg gccaggcgac cgcacaagag 600
atgcaaaaac attcgctggt gttgtggccc ttccacggcg tcttcggcag cggaccgacg 660
ctggatgaaa ccttcggttt aatcgacacc gcagaaaaat cagcacaagt attagtgaag 720
gtttattcga tgggcggcat gaaacagacc atcagccgtg aagagttgat agcgctcggc 780
aagcgtttcg gcgttacgcc actcgccagt gcgctggcgc tgtaa 825
<210> 3
<211> 567
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
atgtacgaac gttatgcagg actgattttt gatatggatg gcacgatcct cgataccgag 60
ccgacgcatc gtaaggcatg ggacgaggtt ctgggacgtt acggcatgcg tttcgatatg 120
caggccatgg tcgcgcttaa cggatctcca acctggcgga ttgctcaggc cattattgaa 180
ttaaatcagg ctgatttaga tcctcatctt ctggcgcagg aaaaaactgc cgctgtgaaa 240
gcgatgctgc ttgatagcgt ccgtccttta ccgcttattg aggtggtcaa agagtggcac 300
ggtcgtcgtc cgatgtcagt cggtaccggc agcgagagcg ccgttgctga agcgctgctg 360
gctcatctgg gtctgcgtca ctacttctcg gcggtggttg ccgcggatca tgtcgccaac 420
cataaacccg cacctgatac tttcttactt tgcgcagagc gcatgggcgt tgcggcggag 480
aagtgcgtgg tctttgaaga tgcggacttc gggctgcagg cggcgaagcg cgccggaatg 540
gatgccgtgg acgtgcgatt gttgtaa 567
<210> 4
<211> 648
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
atggaacgaa ataaacttgc tcgtcagatt attgacactt gcctggaaat gacccgcctg 60
ggactgaacc aggggacagc ggggaacgtc agtgtacgtt atcaggatgg gatgctgatt 120
acgcctacag gcattccata tgaaaaactg acggagtcgc atattgtctt tattgatggc 180
aacggtaaac atgaggaagg aaagctcccc tcaagcgaat ggcgtttcca tatggcagcc 240
tatcaaagca gaccggatgc caacgcggtt gttcacaatc atgccgttca ttgcacggca 300
gtttccattc ttaaccgatc gatccccgct attcactaca tgattgcggc ggctggcggt 360
aattctattc cttgcgcgcc ttatgcgacc tttggaacac gcgaactttc tgaacatgtt 420
gcgctggctc tcaaaaatcg taaggcaact ttgttacaac atcatgggct tatcgcttgt 480
gaggtgaatc tggaaaaagc gttatggctg gcgcatgaag ttgaagtgct ggcgcaactt 540
tacctgacga ccctggcgat tacggacccg gtgccagtgc tgagcgatga agagattgcc 600
gtagtgctgg agaaattcaa aacctatggg ttacgaattg aagagtaa 648
<210> 5
<211> 1080
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 5
atgtctaaga tttttgattt cgtaaaacct ggcgtaatca ctggtgatga cgtacagaaa 60
gttttccagg tagcaaaaga aaacaacttc gcactgccag cagtaaactg cgtcggtact 120
gactccatca acgccgtact ggaaaccgct gctaaagtta aagcgccggt tatcgttcag 180
ttctccaacg gtggtgcttc ctttatcgct ggtaaaggcg tgaaatctga cgttccgcag 240
ggtgctgcta tcctgggcgc gatctctggt gcgcatcacg ttcaccagat ggctgaacat 300
tatggtgttc cggttatcct gcacactgac cactgcgcga agaaactgct gccgtggatc 360
gacggtctgt tggacgcggg tgaaaaacac ttcgcagcta ccggtaagcc gctgttctct 420
tctcacatga tcgacctgtc tgaagaatct ctgcaagaga acatcgaaat ctgctctaaa 480
tacctggagc gcatgtccaa aatcggcatg actctggaaa tcgaactggg ttgcaccggt 540
ggtgaagaag acggcgtgga caacagccac atggacgctt ctgcactgta cacccagccg 600
gaagacgttg attacgcata caccgaactg agcaaaatca gcccgcgttt caccatcgca 660
gcgtccttcg gtaacgtaca cggtgtttac aagccgggta acgtggttct gactccgacc 720
atcctgcgtg attctcagga atatgtttcc aagaaacaca acctgccgca caacagcctg 780
aacttcgtat tccacggtgg ttccggttct actgctcagg aaatcaaaga ctccgtaagc 840
tacggcgtag taaaaatgaa catcgatacc gatacccaat gggcaacctg ggaaggcgtt 900
ctgaactact acaaagcgaa cgaagcttat ctgcagggtc agctgggtaa cccgaaaggc 960
gaagatcagc cgaacaagaa atactacgat ccgcgcgtat ggctgcgtgc cggtcagact 1020
tcgatgatcg ctcgtctgga gaaagcattc caggaactga acgcgatcga cgttctgtaa 1080
<210> 6
<211> 1575
<212> DNA
<213> 丙酸梭菌(Clostridium propionicum)
<400> 6
atgcgcaagg ttccaatcat caccgctgac gaggctgcta agctgatcaa ggacggcgac 60
accgttacca cctccggctt cgttggcaac gctatcccag aggctctgga ccgcgctgtt 120
gagaagcgct tcctggagac cggcgagcca aagaacatca cctacgttta ctgcggctcc 180
cagggcaacc gcgacggccg cggcgctgag cacttcgctc acgagggcct gctgaagcgc 240
tacatcgctg gccactgggc taccgttcca gctctgggca agatggctat ggagaacaag 300
atggaggctt acaacgtttc ccagggcgct ctgtgccacc tgttccgcga catcgcttcc 360
cacaagccag gcgttttcac caaggttggc atcggcacct tcatcgaccc acgcaacggc 420
ggcggcaagg ttaacgacat caccaaggag gacatcgttg agctggttga gatcaagggc 480
caggagtacc tgttctaccc agctttccca atccacgttg ctctgatccg cggcacctac 540
gctgacgagt ccggcaacat caccttcgag aaggaggctg ctccactgga gggcacctcc 600
gtttgccagg ctgttaagaa ctccggcggc atcgttgttg ttcaggttga gcgcgttgtt 660
aaggctggca ccctggaccc acgccacgtt aaggttccag gcatctacgt tgactacgtt 720
gttgttgctg acccagagga ccaccagcag tccctggact gcgagtacga cccagctctg 780
tccggcgagc accgccgccc agaggttgtt ggcgagccac tgccactgtc cgctaagaag 840
gttatcggcc gccgcggcgc tatcgagctg gagaaggacg ttgctgttaa cctgggcgtt 900
ggcgctccag agtacgttgc ttccgttgct gacgaggagg gcatcgttga cttcatgacc 960
ctgaccgctg agtccggcgc tatcggcggc gttccagctg gcggcgttcg cttcggcgct 1020
tcctacaacg ctgacgctct gatcgaccag ggctaccagt tcgactacta cgacggcggc 1080
ggcctggacc tgtgctacct gggcctggct gagtgcgacg agaagggcaa catcaacgtt 1140
tcccgcttcg gcccacgcat cgctggctgc ggcggcttca tcaacatcac ccagaacacc 1200
ccaaaggttt tcttctgcgg caccttcacc gctggcggcc tgaaggttaa gatcgaggac 1260
ggcaaggtta tcatcgttca ggagggcaag cagaagaagt tcctgaaggc tgttgagcag 1320
atcaccttca acggcgacgt tgctctggct aacaagcagc aggttaccta catcaccgag 1380
cgctgcgttt tcctgctgaa ggaggacggc ctgcacctgt ccgagatcgc tccaggcatc 1440
gacctgcaga cccagatcct ggacgttatg gacttcgctc caatcatcga ccgcgacgct 1500
aacggccaga tcaagctgat ggacgctgct ctgttcgctg agggcctgat gggcctgaag 1560
gagatgaagt cctaa 1575
<210> 7
<211> 1389
<212> DNA
<213> 小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersirda enterocolitica)
<400> 7
atgaacacca acgacctgga gtccctgatc cgcaccatcc tgaccgagca gctgacccca 60
gttaccgctc cagcttcctc cgctatcttc gcttccgttg acgaggctat caacgctgct 120
cactccgctt tcctgcgcta ccagcagtcc ccaatgaaga cccgctccgc tatcatccgc 180
gctatccgcg agcagctgaa gccacagctg gtttccctgt ccgagcgcgg cgcttccgag 240
accggcatgg gcaacaagga ggacaagttc ctgaagaaca aggctgctct ggagaacacc 300
ccaggcatcg aggacctgtc caccaccgct ctgaccggcg acggcggcat ggttctgttc 360
gagtactccc cattcggcgt tatcggctcc gttaccccat ccaccaaccc aaccgagacc 420
atcatcaaca actccatctc catgctggct gctggcaacg ctgtttactt ctccccacac 480
ccaggcgcta aggctgtttc cctggacctg atcgctcaga tcgaggagat catcttcaac 540
tcctgcggca tccgcaacct ggttgttacc gttaaggagc catccttcga ggctacccag 600
cagatgatgg ctcacgacaa gatcgctctg ctggctatca ccggcggccc agctatcgtt 660
gctatgtcca tgaagtccgg caagaaggtt atcggcgctg gcgctggcaa cccaccatgc 720
ctggttgacg agaccgctga gctggttaag gctgctcagg acatcgttgc tggcgcttcc 780
ttcgactaca acctgccatg catcgctgag aagtccctga tcgttgttga gtccgttgct 840
gaccgcctgc tgcagcagat gcaggctttc gacgctctgc tgatctccaa cccacaggag 900
atcgactccc tgcgcaaggc ttgcctgacc ccacagggcc acgctaacaa gaacctggtt 960
ggcaagtccc caatcgagct gctgaaggct gctggcatca cctgcccagc taaggctcca 1020
cgcctgctgc tggttgaggt tgctggcgac gacccactgg ttaccaccga gcagctgatg 1080
ccactgctgc cagttgttcg cgttaaggac ttcgacgctg ctctgaccct ggctctgcac 1140
gttgagggcg gcctgcacca caccgctacc atgcactccc agaacgtttc ccgcctgaac 1200
ctggctgctc gcctgctgca gacctccatc ttcgttaaga acggcccatc ctacgctggc 1260
atcggcgttg gcggcgaggg cttcaccacc ttcaccatcg ctaccccaac cggcgagggc 1320
accacctccg ctcgcacctt cgctcgccag cgccgctgcg ttctgaccaa cggcttctcc 1380
atccgctaa 1389

Claims (9)

1.一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强醇脱氢酶、去磷酸化酶和L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶表达，所述的醇脱氢酶的氨基酸序列为与SEQ ID N0：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨基酸的序列为与SEQ IDNO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
2.一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强醇脱氢酶、去磷酸化酶和L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶表达，所述的醇脱氢酶的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：4具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
3.一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强醇脱氢酶、去磷酸化酶和D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶表达，所述的醇脱氢酶的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：5具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
4.一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、去磷酸化酶和L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶表达，所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：7具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：2具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
5.一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、去磷酸化酶活性和L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶表达，所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：7具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQID N0：4具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
6.一种遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于所述遗传修饰是敲除丙糖磷酸异构酶基因，增强丙酸乙酰辅酶A转移酶、醛脱氢酶、去磷酸化酶活性和D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶表达，所述的丙酸乙酰辅酶A转移酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：6具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的醛脱氢酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：7具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的D-果糖-1，6-二磷酸醛缩酶氨基酸序列为与SEQID NO：5具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列，所述的去磷酸化酶氨基酸序列为与SEQ ID NO：3具有90％或以上，优选95％以上，更优选99％以上同源性的序列，最优选100％同源性的序列。
7.权利要求1-3任一所述的构建方法得到的谷氨酸棒状杆菌在发酵生产L-稀少糖中的应用，所述稀少糖为L-果糖，或L-塔格糖，或L-山梨糖，或L-阿洛酮糖，或L-鼠李树胶糖，或L-墨角藻糖，或6-脱氧L-山梨糖，或6-脱氧L-阿洛酮糖。
8.一种发酵生产L-稀少糖的方法，其特征在于，培养权利要求4-6任一所述的构建方法得到的谷氨酸棒状杆菌，以葡萄糖和L-乳酸为底物，发酵生产L-稀少糖，所述的L-稀少糖为L-鼠李树胶糖，或L-墨角藻糖，或6-脱氧L-山梨糖，或6-脱氧L-阿洛酮糖。
9.权利要求9所述的方法，其特征在于，发酵生产条件初始菌体密度菌体浓度(OD600)为30-60；发酵温度30-32℃；发酵培养基中葡萄糖为20-80g/L，L-乳酸10-20g/L，优选的葡萄糖为40g/L，优选的L-乳酸10g/L。
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