CN115074293B

CN115074293B - 一种甘油葡糖苷提纯工艺

Info

Publication number: CN115074293B
Application number: CN202210835047.4A
Authority: CN
Inventors: 魏哲; 陈鑫鑫; 张智; 吴喜; 夏瑶瑶; 崔新冉
Original assignee: Shandong Jinyang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong Jinyang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-07-16
Filing date: 2022-07-16
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2042-07-16
Also published as: CN115074293A

Abstract

一种甘油葡糖苷提纯工艺，属于甘油葡糖苷提纯方法技术领域。甘油葡糖苷通过催化甘油与蔗糖反应生成，甘油葡糖苷粗产品中存在大量甘油、果糖杂质甘油的化学性质接近，树脂色谱，结晶等常规手段难以分离，混合溶剂萃取与膜过滤虽然可以实现分离纯化，但是成本高，污染大。本发明将待提纯的甘油葡糖苷粗产品配置成发酵培养基，利用谷氨酸棒状杆菌在发酵培养基中发酵培养，提纯获得高纯度甘油葡糖苷。利用谷氨酸棒状杆菌的特性，以甘油与果糖作为碳源，能够转化为羟脯氨酸等脯氨酸、氨基酸，而甘油葡糖苷无法被其消耗分解，从而实现了甘油葡糖苷粗产品的分离提纯，提高甘油葡糖苷纯度，能够达到90%以上纯度，提纯过程环保、提升产值。

Description

一种甘油葡糖苷提纯工艺

技术领域

一种甘油葡糖苷提纯工艺，属于甘油葡糖苷提纯方法技术领域。

背景技术

甘油葡萄糖苷是由一分子甘油及一分子葡萄糖通过糖苷键连接而形成的糖苷类化合物，甘油葡萄糖苷拥有优异的保湿能力，同时拥有良好的皮肤渗透性，能有效减少水分流失。

甘油葡糖苷通过催化甘油与蔗糖反应生成，中国发明专利CN 110734899 A公开了一种制备获得甘油葡糖苷的方法，其主要原理是利用蔗糖磷酸化酶，催化转化甘油与蔗糖获得甘油葡糖苷，为促使反应进行，甘油需要过量添加，并且反应会生成副产物果糖，因此获得的产品——甘油葡糖苷粗产品中，存在大量甘油、果糖杂质甘油的化学性质接近，树脂色谱，结晶等常规手段难以分离，混合溶剂萃取与膜过滤虽然可以实现分离纯化，但是成本高，污染大。此外，甘油、果糖被浪费，增加环保负担，甘油和果糖是发酵优质碳源，分离后的甘油果糖难以重复使用，只能进污水系统，增加环保系统负担，有酵母发酵的方法分解甘油果糖，提高甘油葡糖苷纯度，但造成甘油和果糖的浪费。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种高效、充分处理甘油葡糖苷粗产品中甘油、果糖，提高废物利用率，保护环境，节约原料的甘油葡糖苷提纯工艺。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种甘油葡糖苷提纯工艺，其特征在于：待提纯的甘油葡糖苷粗产品配置成发酵培养基，利用谷氨酸棒状杆菌在发酵培养基中发酵培养，提纯获得高纯度甘油葡糖苷。

利用谷氨酸棒状杆菌的特性，该菌种的发酵以甘油与果糖作为碳源，能够转化为羟脯氨酸等脯氨酸、氨基酸、有机酸、二氧化碳等易于分离的产物，而甘油葡糖苷无法被其消耗分解，从而实现了甘油葡糖苷粗产品的分离提纯，提高甘油葡糖苷纯度，能够达到90%以上纯度；尤其其中能够转化获得副产物羟脯氨酸，羟脯氨酸是抗病毒药物、血液症治疗药物等医学领域中必需的成分，具有较高的价值，因此在提纯甘油葡糖苷的同时，将废品、碳源转化为了高价值副产品，既提高了产品质量，又避免了高COD难处理废水产生，还充分利用资源转化价值，一举多得。

优选的，所述的谷氨酸棒状杆菌为高产羟脯氨酸的谷氨酸棒杆菌。

包括中国专利CN202011316277.7、 CN201710385500.5中提及的经过改造重建的菌株或美国Microbiologics公司生产的ATCC13807标准号的菌株。

优选菌种产生目标的氨基酸、羟脯氨酸浓度更高，更有利于提纯甘油葡糖苷，同时能够产生更多的有价值副产物。

优选的，所述的发酵培养基包括酵母提取物 6.0~8.0g/L，蛋白胨4.0~6.0g/L，Na₂HPO₄•12H₂O 20~25.0 g/L，KH₂PO₄ 4.0~6.0 g/L，柠檬酸 2.0~4.0 g/L，MgSO₄•7H₂O 1.0~2.0g/L，甘油葡糖苷粗产品100~200ml/L，调节pH至6.9~7.0。

进一步优选的，所述的发酵培养基包括酵母提取物6.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 25.0 g/L，KH₂PO₄ 6.0 g/L，柠檬酸 2.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，甘油葡糖苷粗产品100ml/L，调节pH至7.0。

优选的发酵培养基下更适于上述菌种的发酵培养，诱导分解目标甘油与果糖，以及诱导产生目标氨基酸，充分分解杂质同时避免引入新的杂质。

优选的，所述的发酵培养采用50L发酵罐发酵工艺，以种后体积25 L计，菌种液200~300ml，控制罐温30~33℃、流加氨水控制pH 6.5~7.0、DO 10~15%条件下培养，溶氧回升后流加发酵培养基，控制流加速度20~200ml/h，周期50~70h。发酵至羟脯氨酸大于60g/L后停止补料，继续发酵至甘油、果糖的含量均小于0.4g/L，停止发酵。

进一步优选的，监测DO降至12~18%提高搅拌转速。

进一步优选的，发酵至最终甘油葡糖苷含量为75~80g/L停止发酵。

采用优选的发酵工艺更有利于菌株生长分解，易于充分分解甘油与果糖产生易于分离产物，提高甘油葡糖苷后续提纯难度，提高甘油葡糖苷纯度。

优选的，包括以下步骤：接种培养、发酵、发酵液澄清除盐、树脂吸附。

进一步优选的，树脂吸附后还包括活性碳脱色、浓缩步骤。

接种培养诱导产生优选菌种，增加菌种浓度，发酵提纯甘油葡糖苷，澄清除盐步骤去除发酵产生的、易于分离的甘油葡糖苷以外的杂质，而优选的树脂吸附步骤则是能够利用吸附树脂吸附获得羟脯氨酸，获得副产物，相当于从甘油葡糖苷粗产品中获得有价值产品过程，提纯甘油葡糖苷的同时提高产值。

优选的，所述的接种培养为斜面培养，斜面培养培养基包括酵母提取物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，琼脂粉20.0 g/L，采用划线接种，培养温度35~39℃，培养10~14h。

进一步优选的，所述的斜面培养后经过种子培养，种子培养培养基包括酵母提取物8~10.0 g/L，蛋白胨 4.0~5.0 g/L，KH₂PO₄ 1.0~2.0 g/L，柠檬酸1.0~2.0 g/L，NaCl 1.0~2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0~2.0g/L，葡萄糖 20~25.0 g/L，pH为6.8~7.0，培养温度35~39℃，200~250 rpm/min培养5~9h，获得菌种种子液。

优选的斜面培养与种子培养步骤能够在较短的时间内获得大量优质目标菌种，易于在发酵提纯过程中充分分解甘油、果糖的同时，确保副产物氨基酸的纯净，避免引入新的杂质，提高提纯效果，提高甘油葡糖苷纯度与羟脯氨酸质量。

优选的，所述的发酵液澄清除盐采用50nm陶瓷膜过滤澄清，过滤所得清液采用电渗析脱盐，控制pH6~6.5。

优选的过滤方法与除盐方法能够充分分离经过发酵的甘油葡糖苷粗产品中的其他杂质颗粒、生成的酸盐，保证后续甘油葡糖苷产品与羟脯氨酸产品的纯度。

进一步优选的，所述的树脂吸附包括以下步骤：除盐后溶液pH调至1.8~2.2，加入阳离子交换树脂，以0.8~1.2BV/h流速， 1.8~2.2BV酸水洗涤，1.8~2.2BV去离子水洗涤，0.8~1.2M氨水洗脱，洗脱速率0.8~1.2BV/h，洗脱液减压浓缩除氨水，继续浓缩至密度1.13~1.15g/cm³，加入3.5~4.5BV乙醇结晶，晶体干燥后获得羟脯氨酸产品。

阳离子交换树脂的加入量优选为羟脯氨酸质量的18~22倍，羟脯氨酸质量通过HPLC检测方法获得。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果是：利用谷氨酸棒状杆菌的特性，在提纯甘油葡糖苷的同时，将废品、碳源转化为了高价值副产品，既提高了产品质量，又避免了高COD难处理废水产生，保护环境，充分利用资源转化价值，一举多得。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，实施例1是本发明的最佳实施例。

以下实施例与对比例中采用的谷氨酸棒状杆菌均为美国Microbiologics公司生产的ATCC13807标准号的菌株。

其余涉及的原料来源参加下表1。

表1 原料来源

。

在以下实施例与对比例中，涉及甘油、果糖、甘油葡糖苷检测时均采用HPLC检测方法：

HPLC检测条件：色谱柱Waters Xbridge Amide（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相由85%乙腈和15%的水组成；流速：1 mL·min^-1；进样量：10 μL；柱温：30℃；示差检测器检测。

涉及羟脯氨酸含量检测时均采用HPLC检测方法：色谱条件：色谱柱:Thermo ODS-2C1:5um*250mm，波长：263nm，流速:1.0ml/min；柱温：30℃ 进样量：5ul，积分时间：35min，保留时间：13.7min左右，样品浓度：1mg/ml，流动相B：乙腈，流动相A：0.1%(V/V)磷酸（1ml磷酸至1000ml高纯水，混匀，过滤）。

溶液的配制：A：四硼酸钠溶液7.6g加入100ml容量瓶中，加入60m1高纯水，于60℃水浴加热溶解，定容至刻度，摇匀，放至室温；B：芴甲氧羰酰氯(FMOL-CL)1.0g加入20m1乙腈(注意容量瓶、吸量管必须是干燥的)； C：样品溶液：称取25mg样品至50m1容量瓶中，先加入A液10m1溶解，再加入B液2m1，轻摇5min至有固体析出，加入10ml高纯水，摇匀、过滤。同监控时做空白。扣除空白后以面积归一化法计算其纯度或含量。

实施例1

一种甘油葡糖苷提纯工艺，依次包括以下步骤：

1）培养基配制：待提纯的甘油葡糖苷粗产品配制成发酵培养基，发酵培养基包括酵母提取物 6.0 g/L，蛋白胨 4.0 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 25.0 g/L，KH₂PO₄ 6.0 g/L，柠檬酸2.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，甘油葡糖苷粗产品100ml/L，调节pH至7.0。

斜面培养基包括酵母提取物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，琼脂粉20.0 g/L。

种子培养基包括酵母提取物 10.0 g/L，蛋白胨 5.0 g/L，KH₂PO₄ 2.0 g/L，柠檬酸2.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，葡萄糖 25.0 g/L，调节pH至7.0。

2）斜面培养：高产羟脯氨酸的谷氨酸棒杆菌从~80℃保存的甘油管中使用无菌接种环划线接种至斜面培养基，置于37℃恒温培养箱中培养12 h，用于摇瓶接种。

种子培养：将培养好的斜面种子刮取一环接种至装有200 mL种子培养基的1000mL圆底三角瓶中，37℃，220 rpm/min培养8 h，获得OD为6~8的种子液。

3）发酵培养：本实施例采用50 L发酵罐，种后体积25 L，种子250mL，控制罐温33℃、流加氨水控制pH 6.80、DO 10~15%条件下培养，溶氧回升后流加补料培养基，控制流加速度使溶氧不回升，周期60h。当DO降至15%时提高转速。发酵过程取样检测羟脯氨酸、甘油、果糖和甘油葡糖苷的含量，当羟脯氨酸大于60g/L时，停止补料，继续发酵至甘油、果糖的含量均小于0.4g/L时，的停止发酵，此时甘油葡糖苷含量在75~80g/L。

4）发酵液澄清除盐：发酵液使用50nm陶瓷膜过滤澄清，陶瓷膜清夜经过1000Da纳滤膜除杂，纳滤膜清夜使用电渗析脱盐，控制pH6.2，脱盐至电导率小于1000μS/cm。

5）树脂吸附：脱盐后溶液调pH至2.0，加入上海逊尔化工有限公司生产的XRK541阳离子交换树脂，1BV/h流速，2BV酸水洗涤，2BV去离子水洗涤，1M氨水洗脱，洗脱速率1BV/h，洗脱液减压浓缩除氨水，继续浓缩至密度1.15，加入4BV乙醇结晶，晶体干燥后既为羟脯氨酸产品，纯度≥98%。

6）活性炭脱色、浓缩

树脂吸附液加入1%重量的活性炭，60℃保温30min，过滤脱碳后浓缩至无水，即得甘油葡糖苷产品，纯度≥95%。

实施例2

一种甘油葡糖苷提纯工艺，在实施例1的基础上，步骤1）发酵培养基设置为包括酵母提取物8.0g/L，蛋白胨6.0g/L，Na₂HPO₄•12H₂O 25.0 g/L，KH₂PO₄ 6.0 g/L，柠檬酸 4.0 g/L，MgSO₄•7H₂O 2.0g/L，甘油葡糖苷粗产品150ml/L，调节pH至7.0。

其他条件与实施例1相同。

最终步骤6）获得甘油葡糖苷产品纯度≥95%。

实施例3

一种甘油葡糖苷提纯工艺，在实施例1的基础上，步骤1）发酵培养基设置为

酵母提取物8.0g/L，蛋白胨4.0g/L，Na₂HPO₄•12H₂O 20g/L，KH₂PO₄ 4.0g/L，柠檬酸4.0 g/L，MgSO₄•7H₂O2.0g/L，甘油葡糖苷粗产品200ml/L，调节pH至7.0。

其他条件与实施例1相同。

最终步骤6）获得甘油葡糖苷产品纯度≥90%。

对比例1

一种甘油葡糖苷提纯工艺，提供反应液,反应液为低纯度甘油葡萄糖苷混合物,低度甘油葡萄糖苷混合物包括甘油葡萄糖苷、甘油、以及果糖所成的群组；将酵母菌加入反应液中进行发酵反应后制得高纯度甘油葡萄糖苷。所述酵母菌加入后是在30℃下持续24小时进行的。发酵结束后离心去除酵母，浓缩除水后甘油葡糖苷含量为60%。

对比例2

一种甘油葡糖苷提纯工艺，用4％氢氧化钠和4％盐酸对树脂LX-950（西安蓝晓科技新材料股份有限公司，下同）进行交替洗脱，其次用4％的赖氨酸转型，用液相监控，当赖氨酸被完全从树脂上洗脱下来后，再用纯水洗至中性，得到氨基树脂；步骤(1)得到的氨基树脂填充至含有保温夹套的层析柱中，层析柱体积为200m L/BV，保温夹套的温度设置为35℃； (3)将含有葡萄糖和果糖的甘油葡萄糖苷混合溶液稀释3倍，其中，稀释前混合溶液中甘油葡萄糖苷的浓度为450g/L，葡萄糖的浓度为150g/L，果糖的浓度为100g/L，然后用移液管移取0.1m L稀释后的混合溶液，均匀地滴加到树脂上，用用80％体积分数的乙腈水溶液做为洗脱剂以0.1BV/h的流速对树脂进行洗脱，收集洗脱液，利用色谱柱和高效液相色谱监控，得到纯化后的甘油葡萄糖苷溶液。浓缩去除溶剂后得到产品。

对比例3

一种甘油葡糖苷提纯工艺，在实施例1的基础上，步骤1）菌种改为大肠杆菌BL21，

其他条件与实施例1相同。

步骤5）树脂吸附洗脱后未得到羟脯氨酸产物，甘油果糖被浪费。

最终步骤6）获得甘油葡糖苷产品纯度为60%。产品纯度不高，产生大量乙酸等杂质。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种甘油葡糖苷提纯方法，依次包括以下步骤：

1）培养基配制：待提纯的甘油葡糖苷粗产品配制成发酵培养基，发酵培养基包括酵母提取物 6.0 g/L，蛋白胨 4.0 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 25.0 g/L，KH₂PO₄ 6.0 g/L，柠檬酸 2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，甘油葡糖苷粗产品100ml/L，调节pH至7.0；

斜面培养基包括酵母提取物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，琼脂粉20.0g/L；

种子培养基包括酵母提取物 10.0 g/L，蛋白胨 5.0 g/L，KH₂PO₄ 2.0 g/L，柠檬酸 2.0g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0 g/L，葡萄糖 25.0 g/L，调节pH至7.0；

2）斜面培养：高产羟脯氨酸的谷氨酸棒杆菌从~80℃保存的甘油管中使用无菌接种环划线接种至斜面培养基，置于37℃恒温培养箱中培养12 h，用于摇瓶接种；

种子培养：将培养好的斜面种子刮取一环接种至装有200 mL种子培养基的1000 mL圆底三角瓶中，37℃，220 rpm/min培养8 h，获得OD为6~8的种子液；

3）发酵培养：采用50 L发酵罐，接种后体积25 L，种子250mL，控制罐温33℃、流加氨水控制pH 6.80、DO 10~15%条件下培养，溶氧回升后流加补料培养基，控制流加速度使溶氧不回升，周期60h；当DO降至15%时提高转速；发酵过程取样检测羟脯氨酸、甘油、果糖和甘油葡糖苷的含量，当羟脯氨酸大于60g/L时，停止补料，继续发酵至甘油、果糖的含量均小于0.4g/L时，停止发酵，此时甘油葡糖苷含量在75~80g/L；

4）发酵液澄清除盐：发酵液使用50nm陶瓷膜过滤澄清，陶瓷膜清液经过1000Da纳滤膜除杂，纳滤膜清液使用电渗析脱盐，控制pH6.2，脱盐至电导率小于1000μS/cm；

5）树脂吸附：脱盐后溶液调pH至2.0，加入上海逊尔化工有限公司生产的XRK541 阳离子交换树脂，1BV/h流速，2BV酸水洗涤，2BV去离子水洗涤，1M氨水洗脱，洗脱速率1BV/h，洗脱液减压浓缩除氨水，继续浓缩至密度1.15，加入4BV乙醇结晶，晶体干燥后既为羟脯氨酸产品，纯度≥98%；

6）活性炭脱色、浓缩：树脂吸附液加入1%重量的活性炭，60℃保温30min，过滤脱碳后浓缩至无水，即得甘油葡糖苷产品，纯度≥95%。