CN114292827A - 一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物及其制备方法 - Google Patents
一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物的制备方法，包括以下步骤：培养表达蔗糖磷酸化酶的微生物，获得包含蔗糖磷酸化酶的培养液；向所述培养液中加入蔗糖和甘油进行转化反应，获得含甘油葡萄糖苷的转化液；将所述转化液灭活从而结束转化反应收集上清液；以所述上清液为培养基，接种酵母菌进行培养，获得酵母菌培养液；将所述酵母菌培养液进行处理，获得含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物。本发明产生特定的酵母菌发酵产物，最终获得一种含有甘油葡萄糖苷、酵母发酵产物的，具有强效保湿、修复等功效的液体，且制备工艺操作简便、生产成本低、废液产生量低，非常适合工业上放大生产。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物及其制备方法。
背景技术
甘油葡萄糖苷是一种渗透压调节溶质，存在于多种植物、藻类和细菌体内，使生命体适应高盐胁迫和干旱环境，应用在化妆品中可以起到保湿与激活细胞的作用。甘油葡萄糖苷的制备方法有三种：化学合成法、酶催化法以及生物发酵法。其中，化学合成法制备甘油葡萄糖苷的产率低，立体选择性差，后续纯化步骤复杂；生物发酵法制备甘油葡萄糖苷的产量目前仅为每升培养液中含有毫克级的甘油葡萄糖苷，远远达不到工业化要求；酶催化法是目前最具应用前景的甘油葡萄糖苷制备方法，尤其是蔗糖磷酸化酶催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷，转化率高达90％以上，是一种有前景的甘油葡萄糖苷工业生产用酶。
甘油葡萄糖苷的分离提取方法并不简单，这是由于目标物甘油葡萄糖苷与杂质分子中含有的结构官能团类似，且分子量相近，一般的分离提取方法无法将其有效分离。文献中报道最多的分离纯化方法有柱层析和纳滤两种。其中，柱层析主要采用活性炭层析柱吸附目标物与副产物，然后用一定浓度的乙醇洗脱，目标物与副产物分别存在于不同的流出液中。这种分离方法采用的是粉末活性炭，由于粉末活性炭的粒度很小，在层析柱中的密度很大，层析柱的流速很低，加上活性炭对目标物的单位吸附量并不高，导致纯化的效率非常低，放大到工业生产中并不经济。另一个分离方法是纳滤，由于目标物甘油葡萄糖苷与副产物果糖、葡萄糖与甘油的分子量比较接近，采用纳滤将其分离并不十分充分，而且必须采用截留分子量较低的纳滤膜，所以单位时间内的处理量较低，不太适合放大到工业生产中。另外，甘油葡萄糖苷的分离提取可以参考果糖工业生产中用到的模拟移动床色谱技术。利用模拟移动床色谱可以有效地将甘油葡萄糖苷从果糖、葡萄糖和甘油中分出来。但由于模拟移动床色谱系统设备成本较高，柱温与洗脱液温度较高，生产能耗高，工业上这一分离纯化工艺无法广泛使用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物及其制备方法。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1、一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
培养表达蔗糖磷酸化酶的微生物，获得包含蔗糖磷酸化酶的培养液；
向所述培养液中加入蔗糖和甘油进行转化反应，获得含甘油葡萄糖苷的转化液；
将所述转化液灭活从而结束转化反应收集上清液；
以所述上清液为培养基，接种酵母菌进行培养，获得酵母菌培养液；
将所述酵母菌培养液进行处理，获得含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物。
2、根据项1所述的制备方法，其特征在于，在接种酵母菌进行培养之前，对上清液稀释到适当的浓度再作为培养基培养酵母，优选，将上清液稀释到2倍 -3倍的体积。
3、根据项1所述的制备方法，其特征在于，向培养液中加入蔗糖和甘油，使得初始加入的蔗糖浓度为50-500g/L，甘油的浓度为20-300g/L，转化反应结束时蔗糖的终浓度为0-50g/L，甘油的终浓度为10-200g/L。
4、根据项1所述的制备方法，其特征在于，在所述转化反应中，当所述转化液中甘油葡萄糖苷的浓度为30-300g/L，且甘油葡萄糖苷浓度不再随转化反应的时间变化而显著增加，果糖的浓度为25-250g/L，葡萄糖的浓度为5-60g/L时结束转化反应。
5、根据项1所述的制备方法，其特征在于，接种酵母菌后的OD600为0.1-1.0。
6、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述组合物中甘油葡萄糖苷的浓度为30-300g/L，甘油的浓度为10-200g/L。
7、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述组合物中蔗糖、果糖和葡萄糖的浓度低于检测下限或为0。
8、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌选自毕赤酵母菌、酿酒酵母菌、克鲁弗酵母菌中的一种或两种以上，优选克鲁弗酵母菌。
9、一种含甘油、甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物，其特征在于，所述组合物包含甘油葡萄糖苷、甘油和酵母发酵产物，其中甘油葡萄糖苷的浓度为 30-300g/L，甘油的浓度为10-200g/L，并且蔗糖、果糖和葡萄糖的浓度低于检测下限或为0。
10、根据项9所述的组合物，其由项1-8中任一项所述的制备方法得到。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：用蔗糖磷酸化酶培养液直接转化生成甘油葡萄糖苷，再在转化液中接种酵母菌进行发酵，酵母菌在消耗果糖与葡萄糖等副产物的同时，产生特定的酵母菌发酵产物，最终获得一种含有甘油葡萄糖苷、酵母发酵产物的，具有强效保湿、修复等功效的液体，且制备工艺操作简便、生产成本低、废液产生量低，非常适合工业上放大生产。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
酵母是人们应用最早、最广泛的一种微生物。各大品牌的护肤品中常常加入某种酵母菌发酵产物的提取物或滤液。酵母菌发酵产物中含有多种活性成分，除了氨基酸、核苷酸，还含有单糖、多糖、矿物质、维生素等肌肤有益成分，可以对皮肤起到保湿、促进细胞代谢等作用。
甘油，又名丙三醇。可与水以任何比例溶解，低浓度丙三醇溶液可做润滑油对皮肤进行滋润，因此作为一种优良的保湿剂，普遍添加在护肤品中。
甘油葡萄糖苷是由一分子甘油及一分子葡萄糖通过糖苷键连接而形成的糖苷类化合物，根据立体构型(α和β)及糖苷键连接位置不同，甘油葡萄糖苷有6种不同的立体结构，包括2-αGG，2S-1-αGG，2R-1-αGG，2-βGG，2S-1-βGG 和2R-1-βGG。甘油葡萄糖苷拥有优异的保湿能力，有文献证明甘油葡萄糖苷可显著提高水通道蛋白AQP3的表达，而AQP3蛋白在皮肤上皮细胞的保水功能中发挥重要作用。同时有研究证明甘油葡萄糖苷拥有良好的皮肤渗透性，能有效减少水分流失。
为了获得一种含有甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物，本发明提供以下的制备方法，包括以下步骤：
培养表达蔗糖磷酸化酶的微生物，获得包含蔗糖磷酸化酶的培养液；
向所述培养液中加入蔗糖和甘油进行转化反应，获得含甘油葡萄糖苷的转化液；
将所述转化液灭活从而结束转化反应收集上清液；
以所述上清液为培养基，接种酵母菌进行培养，获得酵母菌培养液；
将所述酵母菌培养液进行处理，获得含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物。
其中，蔗糖磷酸化酶属于糖基水解酶13家族，是一种催化转移葡萄糖苷键的酶，能够催化蔗糖和无机磷酸盐合成1-磷酸-葡萄糖。该酶主要以蔗糖、 1-磷酸-葡萄糖为供体，多类物质如多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受体，催化合成各种糖苷。蔗糖磷酸化酶可以催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷，并产生果糖、葡萄糖等副产物。
在本发明中，蔗糖磷酸化酶通过表达蔗糖磷酸化酶的微生物经过发酵培养得到。其中，所述表达蔗糖磷酸化酶的微生物为含蔗糖磷酸化酶基因的重组工程菌，选自重组大肠杆菌、重组枯草芽孢杆菌、重组谷氨酸棒状杆菌、重组酵母菌中的一种或两种以上。
蔗糖磷酸化酶基因可以是现有技术已知的任何蔗糖磷酸化酶基因，在一个具体的实施方式中，蔗糖磷酸化酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：
使用蔗糖磷酸化酶基因构建重组工程菌可以采用现有技术中已知的技术和载体实现，常用的载体有pET28a、pET30a、pMA5、pEC-XK99E等。
在一个具体的实施方式中，含蔗糖磷酸化酶基因的重组工程菌可以参考段培枫等/重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷.生物工程学报,Sep.25,2020,36(9):1918-1928.中描述的方法实现。
发酵培养基的构成为酵母粉(或酵母膏)、蛋白胨、和/或无机盐和诱导剂。
在一个具体的实施方式中，所述培养基为TB培养基(酵母粉24g/L、蛋白胨12g/L、甘油5g/L、KH2PO4 17mM、K2HPO4 73mM，纯化水溶解并定容， pH7.0)。
在一个具体的实施方式中，所述培养基为YPG诱导培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，半乳糖20g/L，纯化水溶解并定容，pH7.0)。
获得包含蔗糖磷酸化酶的培养液的步骤是为了积累充足的蔗糖磷酸化酶。在具体的实施方式中，培养所述表达蔗糖磷酸化酶的微生物使得培养液中的菌体 OD600达到10-25。
其中，OD600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率T值成反比，在数值上来说，它们之间是对数关系。它的一个重要应用，就是利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以通常用来指菌体细胞密度。
获得包含蔗糖磷酸化酶的培养液后，向培养液中加入蔗糖和甘油进行转化反应，获得含甘油葡萄糖苷的转化液。其中，向培养液中加入蔗糖和甘油，使得初始加入的蔗糖浓度为50-500g/L，甘油的浓度为20-300g/L，转化反应结束时蔗糖的终浓度为0-50g/L，甘油的终浓度为10-200g/L。
在所述转化反应中，消耗甘油和蔗糖的同时，转化生成甘油葡萄糖苷，以及果糖、葡萄糖等副产物。在具体的实施方式中，在所述转化反应中，当所述转化液中甘油葡萄糖苷的浓度为30-300g/L，且甘油葡萄糖苷浓度不再随转化反应的时间变化而显著增加，果糖的浓度为25-250g/L，葡萄糖的浓度为5-60g/L 时结束转化反应。甘油葡萄糖苷浓度不再随转化反应的时间变化而显著增加是指甘油葡萄糖苷浓度变化在±0.5g/L之内。
在一个具体的实施方式中，所述转化反应的条件为：温度控制在30-55℃， pH值控制在6.0-8.5，时间为24-48h。
上述转化液经灭活，稀释，离心收集的上清液可以作酵母菌培养的培养基，从而获得酵母菌培养液。其中，将所述转化液灭活可以采用加热的方式将其中的蔗糖磷酸化酶灭活。
在一个具体的实施方式中，在接种酵母菌进行培养之前，对上清液稀释到适当的浓度再作为培养基培养酵母，优选，将上清液稀释到2倍-3倍的体积。即，稀释之后是稀释之前体积的2倍-3倍。此处上清液稀释的目的是降低酵母菌培养基中各成分的浓度，从而解除高渗透压对酵母菌生长产生的抑制。
在一个具体的实施方式中，纯水稀释的倍数为2-3倍。
在一个具体的实施方式中，接种酵母菌后的OD600为0.1-1.0，例如可以为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0。
在一个具体的实施方式中，酵母菌发酵的条件为：温度控制在30-32℃，pH值控制在6.0-7.0，时间为24-72h。
在一个具体的实施方式中，所述酵母菌培养液按如下方法制备：
(1)种子液培养：将酵母菌划线接种到YPD固体培养基中，30-32℃，培养24h，获得酵母菌单菌落；然后挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，30-32℃， 200rpm培养24h，获得种子液。所述YPD培养基配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基加入琼脂粉20g/L)，纯化水定容。
(2)发酵培养：以转化液经酶灭活后稀释2-3倍，再离心去沉淀的上清液为发酵培养基，按照接种酵母菌后的OD600为0.1-1.0的接种量将酵母菌种子液接种并进行发酵培养，温度30-32℃，转速200-500rpm，pH值控制在6.0-7.0，时间24-72h。
在一个具体的实施方式中，在以所述上清液为培养基，接种酵母菌进行培养，获得酵母菌培养液的步骤中，当培养基中蔗糖、果糖和葡萄糖的浓度低于各自的检测下限时结束培养过程，对所述酵母菌培养液进行处理，以获得含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物。
其中，本文所述的“检测下限”是指在限定误差能满足预定要求的前提下，用特定方法能够准确定量测定被测物质的最低浓度或含量。例如，检测下限可以为1g/L、0.5g/L、0.1g/L、0.05g/L、0.01g/L、0.001g/L、0.0001g/L等。
在一个具体的实施方式中，所述酵母菌为毕赤酵母菌、酿酒酵母菌、克鲁弗酵母菌中的一种或两种以上，优选能够充分利用蔗糖、葡萄糖与果糖为发酵碳源，且发酵产物中乙醇含量低的克鲁弗酵母菌。这些酵母菌可以自行培养获得，也可以通过商购获得，例如可以从中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)买到克鲁维毕赤酵母(CGMCC2.4488)、酿酒酵母(CGMCC2.3973) 和克鲁弗酵母(CGMCC2.4070)。
酵母菌发酵可以充分利用培养液中的蔗糖、葡萄糖、果糖，在发酵结束时可完全消耗蔗糖、葡萄糖、果糖。
进一步的对所述酵母菌培养液进行处理，可以获得含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物。
其中，所述处理包括：将上述酵母菌培养液进行离心去除菌体，加热变性去除杂蛋白、活性炭吸附脱色，以及蒸发浓缩。
最终得到的含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物中甘油葡萄糖苷的浓度为30-300g/L，甘油的浓度为10-200g/L。进一步的，所述组合物中蔗糖、果糖和葡萄糖的浓度低于检测下限或为0。
本发明还提供上述一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物，所述组合物包含甘油葡萄糖苷、甘油和酵母发酵产物，其中甘油葡萄糖苷的浓度为 30-300g/L，甘油的浓度为10-200g/L，并且蔗糖、果糖和葡萄糖的浓度低于检测下限或为0。
进一步地，该组合物由上述制备方法得到。
本发明的制备方法用蔗糖磷酸化酶培养液直接转化生成甘油葡萄糖苷，再在转化液中接种酵母菌进行发酵，酵母菌产生特定的酵母菌发酵产物，制备工艺操作简便、生产成本低、废液产生量低，非常适合工业上放大生产。该制备方法能完全消耗果糖、蔗糖和葡萄糖，最终得到的含有甘油葡萄糖苷、酵母发酵产物的组合物能够促进水通道蛋白AQP3的表达，具有强效保湿、修复等功效。
实施例1
(1)将含蔗糖磷酸化酶基因的重组枯草芽孢杆菌(制备方法参考文献：段培枫等/重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷.生物工程学报,Sep.25,2020,36(9):1918-1928.)接种在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L)中，37℃下，200rpm培养12h 左右，获得种子液。将种子液以5％接种量接种TB培养基(酵母粉24g/L、蛋白胨12g/L、甘油5g/L、KH2PO4 17mM、K2HPO4 73mM，纯化水溶解并定容，pH7.0)，30-32℃下发酵培养24-48h，获得培养液。
(2)向含蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌培养液中加入蔗糖和甘油，菌体OD600为20，蔗糖和甘油在培养液中的初始浓度分别为300g/L和200g/L，温度控制在40℃，pH值控制在7.0-7.5之间，转化48h，取样，用HPLC法测定转化液中甘油葡萄糖苷、甘油、果糖、蔗糖和葡萄糖的质量体积浓度分别为 201g/L、127g/L、150g/L、14g/L和62g/L。
(3)将转化液升温至70-75℃，保温30min，使酶失活。加入纯化水稀释 2倍，5000rpm离心20min收集上清液。
(4)将商购的克鲁弗酵母菌划线接种到YPD固体培养基中，30-32℃，培养24h，获得酵母菌单菌落；然后挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，30-32℃， 200rpm培养24h，获得种子液。所述YPD培养基配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基加入琼脂粉20g/L)，纯化水定容。
(5)将步骤(3)中的上清液100℃加热处理10min后，接种步骤(4)的克鲁弗酵母菌，接种后培养液OD600为0.4，在30-32℃，200-500rpm，pH至控制在6.0-7.0条件下进行发酵培养48h。然后将培养液5000rpm离心20min收集上清液，加入2％活性炭，升温至60℃保持1h后，过滤收集滤液，取样。
用HPLC法测定酵母菌发酵上清液中甘油葡萄糖苷和甘油的质量体积浓度分别为98g/L和66g/L，检测不到果糖、蔗糖和葡萄糖。最终获得含甘油葡萄糖苷-甘油-酵母发酵产物的组合物。
其中转化液与滤液中成分分析采用HPLC法，HPLC测定方法采用离子色谱法(IC)，检测条件为：ICS-3000(DIONEX)离子色谱仪，内径为4×250mm 的carbPac○RA1色谱柱，流动相为800mM/L NaOH，流速为0.4mL/min。
实施例2
实施例2与实施例1的步骤(1)、(2)、(3)完全相同，而步骤(4)和(5) 中采用毕赤酵母菌代替克鲁弗酵母菌。具体的步骤如下：
(4)将商购的毕赤酵母菌划线接种到YPD固体培养基中，30-32℃，培养 24h，获得酵母菌单菌落；然后挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，30-32℃，200rpm培养24h，获得种子液。所述YPD培养基配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基加入琼脂粉20g/L)，纯化水定容。
(5)将步骤(3)中的上清液100℃加热处理10min后，接种步骤(4)的毕赤酵母菌，接种后培养液OD600为0.4，在30-32℃，200-500rpm，pH至控制在6.0-7.0条件下进行发酵培养48h。然后将培养液5000rpm离心20min收集上清液，加入2％活性炭，升温至60℃保持1h后，过滤收集滤液，取样。
用HPLC法测定酵母菌发酵上清液中甘油葡萄糖苷和甘油的质量体积浓度分别为98g/L和66g/L，检测不到果糖、蔗糖和葡萄糖。最终获得含甘油葡萄糖苷-甘油-酵母发酵产物的组合物。
其中转化液与滤液中成分分析采用HPLC法，HPLC测定方法采用离子色谱法(IC)，检测条件为：ICS-3000(DIONEX)离子色谱仪，内径为4×250mm 的carbPac○RA1色谱柱，流动相为800mM/L NaOH，流速为0.4mL/min。
实施例3
实施例3与实施例1的步骤(1)、(2)、(3)完全相同，而步骤(4)和(5) 中采用酿酒酵母菌代替克鲁弗酵母菌。具体的步骤如下：
(4)将商购的酿酒酵母菌划线接种到YPD固体培养基中，30-32℃，培养 24h，获得酵母菌单菌落；然后挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，30-32℃， 200rpm培养24h，获得种子液。所述YPD培养基配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基加入琼脂粉20g/L)，纯化水定容。
(5)将步骤(3)中的上清液100℃加热处理10min后，接种步骤(4)的酿酒酵母菌，接种后培养液OD600为0.4，在30-32℃，200-500rpm，pH至控制在6.0-7.0条件下进行发酵培养48h。然后将培养液5000rpm离心20min收集上清液，加入2％活性炭，升温至60℃保持1h后，过滤收集滤液，取样。
用HPLC法测定酵母发酵上清液中甘油葡萄糖苷和甘油的质量体积浓度分别为98g/L和66g/L，检测不到果糖、蔗糖和葡萄糖。最终获得含甘油葡萄糖苷-甘油-酵母发酵产物的组合物。
其中转化液与滤液中成分分析采用HPLC法，HPLC测定方法采用离子色谱法(IC)，检测条件为：ICS-3000(DIONEX)离子色谱仪，内径为4×250mm 的carbPac○RA1色谱柱，流动相为800mM/L NaOH，流速为0.4mL/min。
实施例4
(1)将含蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌(制备方法参考文献：段培枫等/重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷.生物工程学报, Sep.25,2020,36(9):1918-1928.)接种在含50μg/ml氯霉素的LB培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L)中，37℃下，200rpm培养12h左右，获得种子液。将种子液以5％接种量接种TB培养基(酵母粉24g/L、蛋白胨12g/L、甘油5g/L、KH2PO4 17mM、K2HPO4 73mM，纯化水溶解并定容，pH7.0)，30-32℃下发酵培养24-48h，获得培养液。
(2)向含蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌培养液中加入蔗糖和甘油，菌体OD600为20，蔗糖和甘油的在培养液中的初始浓度分别为300g/L和200g/L，温度控制在40℃，pH值控制在7.0-7.5之间，转化48h，取样，用HPLC法测定转化液中甘油葡萄糖苷、甘油、果糖、蔗糖和葡萄糖的质量体积浓度分别为212g/L、 123g/L、157g/L、0g/L和33g/L。
(3)将转化液升温至70-75℃，保温30min，使酶失活。加入纯化水稀释 2倍，5000rpm离心20min收集上清液。
(4)将克鲁弗酵母菌划线接种到YPD固体培养基中，30-32℃，培养24h，获得酵母菌单菌落；然后挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，30-32℃， 200rpm培养24h，获得种子液。所述YPD培养基配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基加入琼脂粉20g/L)，纯化水定容。
(5)将步骤(3)中的上清液100℃加热处理10min后，接种步骤(4)的克鲁弗酵母菌，接种后培养液OD600为0.4，在30-32℃，200-500rpm，pH至控制在6.0-7.0条件下进行发酵培养48h。然后将培养液5000rpm离心20min收集上清液，加入2％活性炭，升温至60℃保持1h后，过滤收集滤液，取样。
用HPLC法测定酵母发酵上清液中甘油葡萄糖苷和甘油的质量体积浓度分别为104g/L和63g/L，检测不到果糖、蔗糖和葡萄糖。最终获得含甘油葡萄糖苷-甘油-酵母发酵产物的组合物。
其中转化液与滤液中成分分析采用HPLC法，HPLC测定方法采用离子色谱法(IC)，检测条件为：ICS-3000(DIONEX)离子色谱仪，内径为4×250mm 的carbPac○RA1色谱柱，流动相为800mM/L NaOH，流速为0.4mL/min。
实施例5
实施例5与实施例1的不同在于，步骤(2)不直接使用步骤(1)获得的培养液，而是将培养液在4000rpm离心30min，收集上清液，弃菌体。以培养液上清为生物催化剂。
具体的，步骤(2)为：将含蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌培养液在4000rpm 离心30min，收集上清液，弃菌体。向所收集的上清液中加入蔗糖和甘油，对应的菌体OD600为20，蔗糖和甘油在培养液中的初始浓度分别为300g/L和 200g/L，温度控制在40℃，pH值控制在7.0-7.5之间，转化48h，取样，用HPLC 法测定转化液中甘油葡萄糖苷、甘油、果糖、蔗糖和葡萄糖的质量体积浓度分别为156g/L、141g/L、145g/L、23g/L和36g/L。
(3)将转化液升温至70-75℃，保温30min，使酶失活。加入纯化水稀释 2倍，5000rpm离心20min收集上清液。
(4)将克鲁弗酵母菌划线接种到YPD固体培养基中，30-32℃，培养24h，获得酵母菌单菌落；然后挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，30-32℃，200rpm培养24h，获得种子液。所述YPD培养基配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基加入琼脂粉20g/L)，纯化水定容。
(5)将步骤(3)中的上清液100℃加热处理10min后，接种步骤(4)的克鲁弗酵母菌，接种后培养液OD600为0.4，在30-32℃，200-500rpm，pH至控制在6.0-7.0条件下进行发酵培养48h。然后将培养液5000rpm离心20min收集上清液，加入2％活性炭，升温至60℃保持1h后，过滤收集滤液，取样。
用HPLC法测定酵母发酵上清液中甘油葡萄糖苷和甘油的质量体积浓度分别为75g/L和70g/L，检测不到果糖、蔗糖和葡萄糖。最终获得含甘油葡萄糖苷-甘油-酵母发酵产物的组合物。
其中转化液与滤液中成分分析采用HPLC法，HPLC测定方法采用离子色谱法(IC)，检测条件为：ICS-3000(DIONEX)离子色谱仪，内径为4×250mm 的carbPac○RA1色谱柱，流动相为800mM/L NaOH，流速为0.4mL/min。
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于，步骤(3)中没有纯化水稀释的步骤，而是直接将转化液5000rpm离心20min收集上清液。
最终，经过步骤(5)后，用HPLC法测定滤液中甘油葡萄糖苷、甘油、果糖、蔗糖和葡萄糖的质量体积浓度分别为197g/L、129g/L、132g/L、8.5g/L 和44g/L。最终获得含甘油葡萄糖苷-甘油-酵母发酵产物的组合物中，同时含有果糖、蔗糖和葡萄糖。说明在第二步发酵过程中，由于转化液未经稀释导致酵母培养基中各成分浓度偏高，造成高渗透压抑制酵母菌生长，并不能有效消耗果糖、蔗糖和葡萄糖等杂质。
对比例1
对比例1与实施例4的区别在于，步骤(2)不直接使用步骤(1)获得的培养液，而是将培养液在4000rpm离心30min，收集菌体，弃上清液。以菌体为生物催化剂。
具体的，步骤(2)为：将含蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌培养液在4000rpm 离心30min，收集菌体，弃上清液。向所收集的菌体中补加纯水至原培养液体积，向其中加入蔗糖和甘油，菌体OD600为20，蔗糖和甘油在培养液中的初始浓度分别为300g/L和200g/L，温度控制在40℃，pH值控制在7.0-7.5之间，转化48h，取样，用HPLC法测定转化液中甘油葡萄糖苷、甘油、果糖、蔗糖和葡萄糖的质量体积浓度分别为164g/L、139g/L、134g/L、64g/L和18g/L。
(3)将转化液升温至70-75℃，保温30min，使酶失活。加入纯化水稀释 2倍，5000rpm离心20min收集上清液。
(4)将克鲁弗酵母菌划线接种到YPD固体培养基中，30-32℃，培养24h，获得酵母菌单菌落；然后挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，30-32℃， 200rpm培养24h，获得种子液。所述YPD培养基配方为：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基加入琼脂粉20g/L)，纯化水定容。
(5)将步骤(3)中的上清液100℃加热处理10min后，接种步骤(4)的克鲁弗酵母菌，接种后培养液OD600为0.4，在30-32℃，200-500rpm，pH至控制在6.0-7.0条件下进行发酵培养48h。然后将培养液5000rpm离心20min收集上清液，加入2％活性炭，升温至60℃保持1h后，过滤收集滤液，取样。
用HPLC法检测到滤液中甘油葡萄糖苷、甘油、果糖、蔗糖和葡萄糖的质量体积浓度分别为79g/L、71g/L、70g/L、22g/L和4g/L。最终获得含甘油葡萄糖苷-甘油-酵母发酵产物的组合物中，同时含有果糖、蔗糖和葡萄糖。说明在第二步发酵过程中，由于酵母菌生长量小，并不能有效消耗果糖、蔗糖和葡萄糖等杂质。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，对比例2的步骤为实施例1中的步骤(1) -(3)，即不进行后续的酵母培养，得到的组合物中不含酵母发酵产物。
用HPLC法测定上清液中甘油葡萄糖苷、甘油、果糖、蔗糖和葡萄糖的质量体积浓度分别为198g/L、122g/L、146g/L、12g/L和58g/L。
具体的，各实施例和对比例的反应条件如表1所示。
表1各实施例和对比例的主要反应条件
实验例组合物对水通道蛋白AQP3表达水平的影响水通道蛋白3 (Aquaporin 3，简称AQP3)，主要定位于皮肤表皮，体内循环中的水和甘油通过AQP3到达表皮，调节角质层形成细胞的水平衡、维持皮肤水合功能、促进皮肤吸收和代谢。本实验用荧光标记AQP3，用流式细胞仪测定加入样品后细胞表面AQP3的表达情况。
测试对象：实施例1-6与对比例1-2制备的组合物。各组合物用无血清 DMEM培养基稀释至甘油葡萄糖苷质量体积浓度为10g/L后，用0.22μm滤膜过滤除菌制备样品液，现配现用。
实验材料与仪器：人表皮角质形成细胞HaCaT，DEME液体培养基，AQP3 ELISA检测试剂盒，二氧化碳培养箱，超净工作台，流式细胞仪等。
实验过程：在无血清DMEM培养基中，将冻存的HaCaT细胞复苏，至 100mm直径培养皿中继续培养至80％融合。将传至第三代的HaCaT细胞用胰酶消化后，调节细胞密度5×104/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h。弃去培养液，加入100ul样品液，阴性对照只加无血清培养液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养24h。然后按照AQP3 ELISA试剂盒的操作步骤进行操作，最后用流式细胞仪测定荧光强度值。细胞表面的AQP3表达量越高，荧光强度值越大。
实验结果：由于实施例1-3的区别仅在于所用酵母菌种类不同，制备得到的组合物中组分种类相同，且甘油葡萄糖苷与甘油的含量相同，故实施例1-3 制备的组合物对水通道蛋白AQP3表达水平的影响相差无几；实施例4和5所用的蔗糖磷酸化酶催化剂形式与实施例1-3不同，导致催化转化效率不同。测试结果表明，实施例4制备的组合物对水通道蛋白AQP3表达水平的促进效果优于实施例1-3制备的组合物；实施例5制备的组合物对水通道蛋白AQP3表达水平的促进效果低于实施例1-3制备的组合物。对比例1-2制备的组合物，对水通道蛋白AQP3表达水平的促进效果最差，推测是因为组合物中含有蔗糖、果糖和葡萄糖，以及仅含有少量甚至不含酵母发酵产物所致。具体数据见表2。
表2各组合物对细胞表面AQP3表达水平的影响(平均荧光强度值，n＝3)
| 组合物 | 平均荧光强度值 |
| 阴性对照 | 1421.79±21.70 |
| 实施例1 | 3212.49±23.79 |
| 实施例2 | 3169.85±13.22 |
| 实施例3 | 2990.51±22.76 |
| 实施例4 | 3345.36±7.54 |
| 实施例5 | 2764.0±31.16 |
| 实施例6 | 2262.13±16.95 |
| 对比例1 | 2026.15±24.09 |
| 对比例2 | 1953.85±11.54 |
SEQUENCE LISTING
<110> 华熙生物科技股份有限公司
华熙生物科技（天津）有限公司
<120> 一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物及其制备方法
<130> TPE01395
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 1
atggaaattc aaaataaagc aatgctcatc acatacgctg attcattggg taaaaacttg 60
aaggatgttc gcaaagtctt gaaagaagat attggtgatg caattggtgg tgttcacttg 120
ttgccatttt tcccatcaac gggagaccgc ggttttgcac cttctgatta cacacgtgtt 180
gattcagcat ttggtgattg gagtgatgta gaagcattag gtgaagaata ttacttgatg 240
tttgatttca tgattaacca tatttcacgt gaatctgtta tgtatcaaga tttcaagaag 300
aatcatgatg aatcaaaata taaggatttc ttcattcgct gggaaaagtt ctgggccaag 360
gctggtgaaa accgtccaac acaagccgat gttgacttga tttacaagcg taaggataag 420
gcaccaactc aagaaattac ttttgatgat ggtacaactg aaaacttgtg gaacacattt 480
ggtgatgaac aaattgatat cgatgtaaac tcagctatcg ctaaagaatt tatcaagaca 540
acgcttgaag acatggtgaa gcatggagct aacttgattc gtttggatgc ctttgcatac 600
gctgttaaaa aagttgatac aaatgacttc ttcgttgaac ctgaaatctg ggacacattg 660
aacgaggttc gtgaaatttt gacacctttg aaggccgaaa ttttgccaga aatccatgaa 720
cactattcaa ttcctaagaa gatcaatgat catggttact tcacatatga ttttgctttg 780
ccaatgacta cactttatac attgtattca ggtaaaacaa atcaattggc taaatggttg 840
aagatgtcac caatgaagca atttactact ttggatacgc acgacggtat aggtgttgtt 900
gatgcgcgtg acgtcttgac tgatgaagaa attgattatg catctgaaga gttatacaaa 960
gttggtgcta acgtgaagaa gacttactct tctgcttcat acaacaactt ggatatctac 1020
caaatcaact caacatatta ctcagctttg ggaaatgatg atgctgcata cttgctaagc 1080
cgtatcttcc aagtgttcgc tcctggtatt ccacaaatct actatgttgg tttgttggcc 1140
ggtgaaaatg atattgaatt acttgaatct tcaaaagaag gtcgtaacat caaccgtcat 1200
tactactcag ttgatgaagt taaggaagaa gttaagcgcc cagttgttgc taagttgttg 1260
aagcttttgt catggcgtaa caactttgct gcatttgatt tggacggatc aattgacgtt 1320
gaaacaccat ctgatacaac tatcaagatt actcgtaagg ataagtctgg tgaaaatgtt 1380
gcagtcttgg ttgccaacgc tgccgataag acattcacaa tcactgcaaa tggtgaagaa 1440
atcttagcca acacagaagc tgataagcaa caattgtaa 1479
Claims (10)
1.一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
培养表达蔗糖磷酸化酶的微生物，获得包含蔗糖磷酸化酶的培养液；
向所述培养液中加入蔗糖和甘油进行转化反应，获得含甘油葡萄糖苷的转化液；
将所述转化液灭活，结束转化反应收集上清液；
以所述上清液为培养基，接种酵母菌进行培养，获得酵母菌培养液；
将所述酵母菌培养液进行处理，获得含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在接种酵母菌进行培养之前，对上清液稀释到适当的浓度再作为培养基培养酵母，优选，将上清液稀释到2倍-3倍的体积。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，向培养液中加入蔗糖和甘油，使得初始加入的蔗糖浓度为50-500g/L，甘油的浓度为20-300g/L，转化反应结束时蔗糖的终浓度为0-50g/L，甘油的终浓度为10-200g/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述转化反应中，当所述转化液中甘油葡萄糖苷的浓度为30-300g/L，且甘油葡萄糖苷浓度不再随转化反应的时间变化而显著增加，果糖的浓度为25-250g/L，葡萄糖的浓度为5-60g/L时结束转化反应。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，接种酵母菌后的OD600为0.1-1.0。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述组合物中甘油葡萄糖苷的浓度为30-300g/L，甘油的浓度为10-200g/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述组合物中蔗糖、果糖和葡萄糖的浓度低于检测下限或为0。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌选自毕赤酵母菌、酿酒酵母菌、克鲁弗酵母菌中的一种或两种以上，优选克鲁弗酵母菌。
9.一种含甘油葡萄糖苷和酵母发酵产物的组合物，其特征在于，所述组合物包含甘油葡萄糖苷、甘油和酵母发酵产物，其中甘油葡萄糖苷的浓度为30-300g/L，甘油的浓度为10-200g/L，并且蔗糖、果糖和葡萄糖的浓度低于检测下限或为0。
10.根据权利要求9所述的组合物，其由权利要求1-8中任一项所述的制备方法得到。
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