CN115678873A - 发酵生产β-呋喃果糖苷酶的方法及其制备的β-呋喃果糖苷酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了发酵生产β‑呋喃果糖苷酶的方法及其制备的β‑呋喃果糖苷酶。本发明的发酵生产β‑呋喃果糖苷酶的方法包括在微生物培养基中培养甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)，收集培养物，得到β‑呋喃果糖苷酶。本发明方法的β‑呋喃果糖苷酶的产量可为423.73U/L，较基础培养基提高了29.6％。本发明方法得到的β‑呋喃果糖苷酶的分子量为45kDa。本发明还公开了该β‑呋喃果糖苷酶在低聚乳果糖合成中的应用。

Description

发酵生产β-呋喃果糖苷酶的方法及其制备的β-呋喃果糖苷酶

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体涉及发酵生产β-呋喃果糖苷酶的方法及其制备的β-呋喃果糖苷酶。

背景技术

β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase，EC3.2.1.26)又称蔗糖酶或转化酶，是一种具有果糖基水解活力并能高效转移果糖基的糖苷酶。目前，人们研究和应用的最多的是细菌和真菌来源的β呋喃果糖苷酶。大多数β-呋喃果糖苷酶既有水解活性，又具有转糖基的活性，不同来源的β-呋喃果糖苷酶其受体特异性不同，会产生不同的效应。如真菌产生的β呋喃果糖苷酶催化水解蔗糖为葡萄糖和果糖，并且还具有转糖基作用，合成低聚果糖。而细菌如节杆菌β呋喃果糖苷酶能以蔗糖和乳糖为原料，将蔗糖上的果糖基优先转移到乳糖上而高效合成低聚乳果糖。

β-呋喃果糖苷酶广泛存在于生物界，主要来源于节杆菌、酵母菌、黑曲霉、米曲霉、日本曲霉等微生物，但目前菌株产生β-呋喃果糖苷酶主要存在发酵酶活性偏低，周期长等缺陷。Driouch等利用黑曲霉生产β-呋喃果糖苷酶，酶活力最高780U/mL，但发酵周期较长达180h。Ali等在2016年采用批次发酵方法，利用酿酒酵母生产β-呋喃果糖苷酶，虽酶活达到74U/m L，但酶产量较低。不同来源的糖苷水解酶的酶学性质存在很大差异，米曲霉、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等来源的酶具有较强的转糖基活性，但水解能力较弱。来源于黑曲霉的转移酶比较安全，但酶自身的活力不高。

低聚乳果糖是一种非还原性三糖，分子式为C₁₈H₃₂O₁₆，分子量为504。其由β-D半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷和β-D呋喃果糖苷残基组成。低聚乳果糖有阴湿性，易溶于水，在溶液中持水能力高于蔗糖，纯品甜度为蔗糖的30％。低聚乳果糖在中性条件下性质稳定，同时耐酸、耐热，在pH 3.0、80℃条件下加热2h几乎不发生分解，在pH 4.5的条件下，其加热温度甚至能达到120℃。

于国萍等设计优化节杆菌发酵产β-呋喃果糖苷酶的培养基和发酵条件，其低聚乳果糖的相对含量最高约为25％。Han等人得到研究果聚糖蔗糖酶的最优合成条件为23℃，pH7.0，底物浓度为36％，最终产物含量为28.5％。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产β-呋喃果糖苷酶的方法。

本发明所提供的发酵生产β-呋喃果糖苷酶的方法，所述方法可包括在微生物培养基中培养甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)，收集培养物，得到β-呋喃果糖苷酶。

上述方法中，所述培养物是将所述甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)在微生物培养基中培养得到的物质(培养容器内的所有物质)。

上述方法中，所述物质包括所述甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)和所述甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)的代谢物。

所述方法中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。

进一步地，所述的方法中，所述甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)可为甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)LB-1。

进一步地，所述的方法中，所述微生物培养基可由溶质和溶剂组成，所述溶质可为：葡萄糖10g/L、酵母膏10g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸钙2.0g/L、七水硫酸镁0.1g/L，所述溶剂可为水。所述培养物可为发酵液。

上述方法中，所述微生物培养基的pH可为7.0。

进一步地，所述的方法中，所述培养可为37℃培养24h。

进一步地，所述培养的菌种接种量可以是3.0％。

上述方法的β-呋喃果糖苷酶的产量可为423.73U/L，较基础培养基提高了29.6％。

进一步地，所述的方法还包括从所述培养物中分离纯化β-呋喃果糖苷酶的步骤。

进一步地，所述的方法中，所述分离纯化可包括饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐和葡聚糖凝胶色谱。

具体地，所述分离纯化可包括以下步骤：

S1)、饱和硫酸铵分级沉淀法处理粗酶液，收集硫酸铵饱和度为40％～70％的沉淀；

S2)、选择截留分子量为8kDa-14kDa的透析袋，50mmol/L的磷酸盐缓冲液为透析液将S1)获得的沉淀进行透析脱盐，收集保留液；

S3)、将S2)获得的保留液使用葡聚糖凝胶G-75作为层析柱、磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行层析处理，收集洗脱液，得到β-呋喃果糖苷酶。

上述方法中，S1)所述粗酶液可为上述培养物的上清液。

本发明根据甲醇芽孢杆菌所产β-呋喃果糖苷酶的特性，确定了分离纯化流程为饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐和葡聚糖凝胶色谱G-75，方法简单快捷，纯度和得率均较好。硫酸铵饱和度为80％时可将粗酶液中的蛋白质完全沉淀下来，选择40％～70％范围可去除杂蛋白，经过凝胶色谱层析后纯化倍数可达30.04倍。

进一步地，所述的方法中，所述β-呋喃果糖苷酶的分子量为45kDa。

上述方法制备获得的β-呋喃果糖苷酶也是本发明的保护范围。

本发明还提供甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)在制备β-呋喃果糖苷酶中的应用。

上述应用中，所述甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)可为甲醇芽孢杆菌

(Bacillus methanolicus)LB-1。

上述方法在制备低聚乳果糖中的应用或上述的β-呋喃果糖苷酶在制备低聚乳果糖中的应用也是本发明的保护范围。

进一步地，所述应用具体为使用上述方法得到的β-呋喃果糖苷酶作为反应催化酶，以蔗糖和乳糖为底物进行反应合成低聚乳果糖。

进一步地，所述的应用中，所述反应的初始pH值可为4.5-8.5。

进一步地，所述反应的初始pH值可为5.5-8.5。

进一步地，所述反应的初始pH值可为6.0-8.5。

进一步地，所述反应的初始pH值可为6.0-8.0。

进一步地，所述反应的初始pH值可为6.5-7.5。

进一步地，所述反应的初始pH值可为7.0。

进一步地，所述的应用中，所述反应的反应温度可为22-47℃。

进一步地，所述反应的反应温度可为27-47℃。

进一步地，所述反应的反应温度可为32-42℃。

进一步地，所述反应的反应温度可为37℃。

进一步地，所述的应用中，所述反应的底物浓度可为10g/100mL-40g/100mL。

进一步地，所述反应的底物浓度可为15g/100mL-35g/100mL。

进一步地，所述反应的底物浓度可为20g/100mL-30g/100mL。

进一步地，所述反应的底物浓度可为25g/100mL。

进一步地，所述的应用中，所述反应的底物中，乳糖和蔗糖的质量比可为1：(1-3)。

进一步地，所述反应的底物中，乳糖和蔗糖的质量比可为1:(1-2)。

进一步地，所述反应的底物中，乳糖和蔗糖的质量比可为1:1。

进一步地，所述的应用中，所述反应酶的添加量可为100U/L-600U/L。

进一步地，所述β-呋喃果糖苷酶的添加量可为200U/L-600U/L。

进一步地，所述β-呋喃果糖苷酶的添加量可为300U/L-500U/L。

进一步地，所述β-呋喃果糖苷酶的添加量可为400U/L-500U/L。

进一步地，所述β-呋喃果糖苷酶的添加量可为400U//L。

进一步地，所述的应用中，所述反应的反应时间可为8h-32h。

进一步地，所述反应的反应时间可为16h-32h。

进一步地，所述反应的反应时间可为20h-32h。

进一步地，所述反应的反应时间可为20h-28h。

进一步地，所述反应的反应时间可为24h-28h。

进一步地，所述反应的反应时间可为28h。

本发明利用甲醇芽孢杆菌所产β-呋喃果糖苷酶进行低聚乳果糖的合成研究，确定了酶法合成低聚乳果糖的最优条件可为：底物乳糖、蔗糖以1:1质量比例混合，底物浓度可为25g/100mL，β-呋喃果糖苷酶添加量可为400U/L，初始pH值可为7.0，温度37.0℃条件下反应28h，在以上优化后的条件下，低聚乳果糖的终含量可以达到33.34％，较最初提升了8.67％，蔗糖转化率为61.48％。

附图说明

图1为甲醇芽孢杆菌LB-1菌株菌落形态及革兰氏染色照片。

图2为β-呋喃果糖苷酶标准曲线。

图3为硫酸铵沉淀上清液中β-呋喃果糖苷酶酶活力变化曲线。

图4为葡聚糖凝胶色谱G75层析洗脱曲线。

图5为纯化后蛋白SDS-PAGE图谱；其中M：标准分子量蛋白maker；泳道1：甲醇芽孢杆菌胞外酶粗酶液；泳道2：纯化后的β-呋喃果糖苷酶(产自甲醇芽孢杆菌)。

图6为反应产物的液相色谱图；峰1为果糖，峰2为葡萄糖，峰3为蔗糖，峰4为乳糖，峰5为低聚乳果糖。

图7为初始pH对低聚乳果糖含量的影响。

图8为反应温度对低聚乳果糖含量的影响

图9为底物浓度对低聚乳果糖含量的影响。

图10为底物比例对低聚乳果糖含量的影响。

图11为加酶量对低聚乳果糖含量的影响。

图12为反应产物随时间的变化曲线。

图13为β-呋喃果糖苷酶催化乳糖、蔗糖反应生成低聚乳果糖的理论结构式。

图14为β-呋喃果糖苷酶发酵菌株筛选实验中不同菌株产酶活性比较。

具体实施方式

甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)LB-1和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LB-2在文献“黄酒麦曲中产凝乳酶菌株的分离鉴定.李柳,郑喆,赵笑,曹永强,余志坚,陈超,杨贞耐.中国乳品工业.2017年第45卷第11期(总第324期)”中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用；谷氨酸杆菌(Arthrobacter sp)购自中国工业微生物菌种保藏中心，菌株编号为10137；氯酚节杆菌(Arthrobacter chlorophenolicus)购自北纳生物，菌株编号为BNCC136854。

β呋喃果糖苷酶(β-FG)ELISA检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，β呋喃果糖苷酶(β-FG)ELISA检测试剂盒组成如下：

1、预包被板:96T/48T；

2、酶标记抗体:(30倍浓缩)HRPIgG,亲合纯化0.4mL x 1；

3、标准品:-6 0.5mL x 2；

4、EIA缓冲液:含1％BSA,0.05％吐温20BPS 30mL x 1；

5、标记抗体稀释液:含1％BSA,0.05％吐温20BPS 12mL x 1；

6、显色剂:TMB底物液15mL x 1；

7、终止液:1N硫酸12mL x 1；

8、浓缩洗涤液:(40倍浓缩)含1％BSA,0.05％吐温20BPS 50mL x 1。

葡聚糖凝胶G-75购自上海源叶生物科技有限公司。

低聚乳果糖标准品购自日本FUJIFILM公司货号：122-04111；低聚乳果糖聚合度为3，分子式为C₁₈H₃₂O₁₆，分子量为504。其由β-D半乳糖苷、α-D-葡萄糖苷和β-D呋喃果糖苷残基组成。

下述实施例采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

磷酸盐缓冲液的配方为：

甲液：称取6g磷酸二氢钠溶于1L蒸馏水中得0.05mol/L NaH₂PO₄溶液；

乙液：称取7.1g磷酸氢二钠溶于1L蒸馏水中得0.05mol/L Na₂HPO₄溶液；

pH4.5：取甲液99ml、乙液1ml混合即得100mL pH4.5 50mM磷酸盐缓冲液。

pH5.0：取甲液98ml、乙液2ml混合即得100mL pH5.0 50mM磷酸盐缓冲液。

pH5.5：取甲液95.2ml、乙液4.8ml混合即得100mL pH5.5 50mM磷酸盐缓冲液。

pH6.0：取甲液89ml、乙液11ml混合即得100mL pH6.0 50mM磷酸盐缓冲液。

pH6.5：取甲液68ml、乙液32ml混合即得100mL pH6.5 50mM磷酸盐缓冲液。

pH7.0：取甲液39ml、乙液61ml混合即得100mL pH7.0 50mM磷酸盐缓冲液。

pH7.5：取甲液16.5ml、乙液83.5ml混合即得100mL pH7.5 50mM磷酸盐缓冲液。

pH8.0：取甲液6ml、乙液94ml混合即得100mL pH8.0 50mM磷酸盐缓冲液。

pH8.5：取甲液2ml、乙液98ml混合即得100mL pH8.5 50mM磷酸盐缓冲液。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、利用甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)发酵生产β-呋喃果糖苷酶

1.1、β-呋喃果糖苷酶的产生菌

1.1.1、酶的产生菌及其形态、生理生化特性

β-呋喃果糖苷酶产自本实验室从黄酒麦曲中所筛一株菌株，命名为甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)LB-1，下文称为LB-1菌株。将LB-1菌株在LB固体平板上培养24h后观察其菌落形态，LB-1菌株呈乳白色、不透明、不光滑、较干燥；在显微镜下放大倍数为40倍时观察LB-1菌株为长杆状。通过革兰氏染色确定LB-1菌株为革兰氏阳性反应，菌株形态及革兰氏染色照片分别如图1所示。

LB-1菌株的API生化试剂盒发酵结果如表1所示。

表1、LB-1菌株的API生化试剂盒发酵结果

注：“+”表示反应结果为阳性；“-”表示反应结果为阴性；“控制”表示阴性对照。

1.1.2、LB-1菌株的培养方法

活化培养基：蛋白胨10.0g、氯化钠10.0g、酵母膏5.0g，用蒸馏水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，121℃灭菌15min。

发酵培养基：葡萄糖10.0g、酵母膏5.0g、氯化钠5.0g、磷酸钙2.0g、七水硫酸镁0.1g，用蒸馏水定容至1 000mL，121℃灭菌15min。

将LB-1菌株按体积分数2％接种到活化培养基中，120r/min、37℃条件下培养，活化2代后按体积分数2％接种到500mL锥形瓶中的发酵培养基进行发酵产酶。

1.2、发酵产酶条件的优化

以β-呋喃果糖苷酶酶活力为指标，选取碳源(乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖)、氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、硫酸铵)、接种量(1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％)、初始pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、温度(27.0℃、32.0℃、37.0℃、42.0℃、47.0℃)、培养时间(12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h)六个方面进行单因素实验。探讨LB-1菌株在不同培养条件下的产酶情况，了解影响产酶的因素，为进一步研究提高酶产量及活力奠定基础。

本研究显示，甲醇芽孢杆菌最佳产酶培养条件为：葡萄糖(碳源)10g/L，酵母膏(氮源)10g/L，培养时间24h，pH值7.0，温度37℃，接种量3.0％。在优化后的产酶条件下，β-呋喃果糖苷酶产量为423.73U/L，较基础培养基提高了29.6％，与国外报道相比，显著提高了酶的生产产量，降低了生产成本。

优化后的发酵产酶培养基的配制方法如下：葡萄糖10.0g、酵母膏10g，氯化钠5.0g、磷酸钙2.0g、七水硫酸镁0.1g，用蒸馏水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，121℃灭菌15min。

pH调节剂为0.1mol/LNaOH溶液和0.1mol\LHCL溶液。

将LB-1菌株按体积分数2％接种到活化培养基中，120r/min、37℃条件下培养，活化2代后按体积分数3.0％接种到装有100mL发酵产酶培养基的500mL锥形瓶中，温度37℃120r/min震荡培养24h，收集发酵液，进行β-呋喃果糖苷酶酶活力测定。

酶活的测定：利用β呋喃果糖苷酶(β-FG)ELISA检测试剂盒测定β-呋喃果糖苷酶酶活力。

测定原理：应用双抗体夹心法测定样品中β-呋喃果糖苷酶活性，用纯化的细菌β-呋喃果糖苷酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加β-呋喃果糖苷酶，再与辣根过氧化物酶标记的β-呋喃果糖苷酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物显色，3,3',5,5'-四甲基联苯胺在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色深浅和样品中的β-呋喃果糖苷酶呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算样品中β-呋喃果糖苷酶活性。

具体操作方法：(1)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。(2)加样：分别设空白对照孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、待测样品孔，在包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃匀。(3)加酶标试剂：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。(4)温育：用封板膜封板后置于37℃温育60分钟。(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。(7)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震匀，37℃避光显色15分钟。(8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。(9)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟内进行。

标准曲线建立方法：以标准物的浓度(U/L)为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标图上绘出标准曲线，标准品的浓度依次为0、25、50、100、200、400U/L；利用酶标仪测量450nm下的OD值。通过实验所建立的β-呋喃果糖苷酶标准曲线如图2所示，回归方程为y＝0.0096x+0.050，R2＝0.998；其中，x为β-呋喃果糖苷酶酶活(U/L)，y为OD450nm。

1.3、粗酶液的制备及酶的分离纯化

1.3.1、粗酶液的制备

将LB-1菌株按体积分数2％接种到活化培养基中，120r/min、37℃条件下培养，活化2代后按体积分数3.0％接种到装有100mL发酵产酶培养基的500mL锥形瓶中，温度37℃120r/min震荡培养24h，收集发酵液，

将发酵液以8000r/min、4℃低温离心20min，收集上清液(甲醇芽孢杆菌发酵上清液)置于-20℃冰箱中过夜，再取出解冻，使没有离心干净的菌体因溶胀作用而失活，即得到用于测定胞外酶活力的粗酶液。

其中，发酵产酶培养基的配制方法如下：葡萄糖10.0g、酵母膏10.0g，氯化钠5.0g、磷酸钙2.0g、七水硫酸镁0.1g，用蒸馏水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，121℃灭菌15min。

1.3.2、β-呋喃果糖苷酶的分离纯化

1.3.2.1、硫酸铵分级沉淀

采用硫酸铵分级沉淀法提取菌株所产的目的酶。根据李英等的方法有所调整，将上述用于测定胞外酶活力的粗酶液置于冰浴中，进行磁力搅拌的同时缓慢加入研磨过的硫酸铵粉末，边加边搅拌，使硫酸铵的饱和度达到20％，在4℃条件下匀速搅拌20min，静置2h后10000r/min离心10min，分别收集上清液和沉淀。重复以上操作直到硫酸铵的饱和度为90％，空白组只添加各饱和度的PBS缓冲液。将收集到的饱和度分别为20％、30％、40％、50％、60、70％、80％、90％的沉淀用适量pH7.0磷酸盐缓冲液溶解备用。测定各梯度上清液中的酶活，得到硫酸铵分级沉淀曲线。

结果如图3，可知向粗酶液中添加的硫酸铵饱和度为20-50％范围时，甲醇芽孢杆菌发酵上清液中β-呋喃果糖苷酶活力变化不大。随着硫酸铵的饱和度逐渐增加，当饱和度达到50％以上时，上清液中残余酶活大幅度下降；当饱和度达到80％时，上清液中酶活力已很低，这表明大部分的目的酶已经沉淀下来。因此，在用硫酸铵分级沉淀提取β-呋喃果糖苷酶时，收集饱和度为40％-70％的沉淀进行后续实验，起到浓缩作用的同时也可使获得物质比酶活较高。

1.3.2.2、透析脱盐处理

烧杯中装满透析液(浓度为50mmol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液)，针对目的酶选择透析袋的截留分子量为8k-14kDa，硫酸铵分级沉淀后的酶液装入透析袋中，用塑料夹夹紧置于烧杯中，在4℃、磁力搅拌的条件下进行透析脱盐。平均每8h换一次透析液，透析1-2天，用电导率仪测定缓冲液的电导率，直到电导率不变时，收集保留液，备用。

透析法是常用的脱盐方法，选择截留量为8k-14kDa的透析袋，50mmol/L的pH7.0磷酸盐缓冲溶液为透析液，β-呋喃果糖苷酶分子较大无法穿过半透膜而留在透析袋中，而氯化钠等小分析盐类物质可通过扩散作用除去，最终得到脱盐后的β-呋喃果糖苷酶酶液。

1.3.2.3、葡聚糖凝胶柱分离纯化

取适量葡聚糖凝胶G-75填料用去离子水在室温条件下溶胀24h，过程中注意去除漂浮物，将溶胀好的填料和配置好并经脱气处理的pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液平衡至实验操作温度。层析柱底端用缓冲液润湿并保持一小段液位，填料用玻璃棒引导倒入柱内待其自由沉降。打开蠕动泵，使用磷酸盐缓冲溶液平衡10个柱体积后准备上样。

将1.3.2.2得到的保留液用0.45μm针头式滤膜过滤后每次上样1.5mL，用自动收集器进行收集洗脱液，共收集40管洗脱液，调节蠕动泵使上样阶段每支试管约收集3mL，测定每支试管中洗脱液于280nm处吸光值、β-呋喃果糖苷酶酶活。以管数为横坐标，吸光值、酶活力为纵坐标绘制洗脱曲线图。收集酶活力峰后即得到纯化后的β-呋喃果糖苷酶，经透析、冻干浓缩以便用于SDS-PAGE检验。

结果如图4，经过硫酸铵分级沉淀、透析脱盐处理后的粗酶液进一步经葡聚糖凝胶G-75柱层析的洗脱曲线。可以看出只有一个特别明显的蛋白峰，杂蛋白基本去除，波峰处吸光度较大，经检测β-呋喃果糖苷酶酶活后发现主要集中在16-28管，虽然第16、17、18、28管中也有少量酶活，但酶活力偏低，同时考虑到比酶活，最终选择19-26管进行合并收集，获得纯化后的β-呋喃果糖苷酶，冷冻干燥后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

表2、β-呋喃果糖苷酶纯化结果

1.3.2.4、聚丙烯酰胺凝胶电泳

将1.3.2.3检测出酶活较高的试管溶液合并浓缩后得到纯化后的β-呋喃果糖苷酶，测定蛋白质浓度后按适宜量与上样缓冲液(Loading Buffer)在离心管中混合，于沸水浴中加热15min，8000r/min离心5min后通过SDS-PAGE电泳进行纯度验证。配制浓度为5％的浓缩胶，浓度为10％的分离胶，进样量为20uL。浓缩胶时用25mA、分离胶用35mA进行电泳，考马斯亮蓝R-250染色30min，10％的冰醋酸和5％甲醇的脱色液脱色，期间更换脱色液直到凝胶背景脱色干净为止，利用凝胶成像仪观察结果，参照蛋白maker估计分子量大小。

电泳结果如5所示，1泳道为用于测定胞外酶活力的粗酶液出现多个条带，表明蛋白种类丰富。2泳道为纯化后的β-呋喃果糖苷酶，与标准蛋白对比后发现在分子量在48kDa偏下有较为清晰的条带。

根据甲醇芽孢杆菌所产β-呋喃果糖苷酶的特性，本实验确定了分离纯化流程为饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐和葡聚糖凝胶色谱G-75，方法简单快捷，纯度和得率均较好，纯化后的酶可达到电泳纯。硫酸铵饱和度为80％时可将粗酶液中的蛋白质完全沉淀下来，选择40％-70％范围可去除杂蛋白，经过凝胶色谱层析后纯化倍数可达30.04倍。纯化酶的电泳条带清晰，分子量在45kDa左右。

实施例2、低聚乳果糖的酶法合成

2.1、酶法合成低聚乳果糖

2.1.1、合成体系

酶法合成低聚乳果糖的反应体系为：乳糖、蔗糖以1：1比例混合，加入β-呋喃果糖苷酶400U/L，最终底物浓度为20％，反应温度37.0℃，调节反应初始pH为7.0，反应24h时取样并进行10min沸水浴终止酶反应，用0.45μm针头式滤膜过滤后进行HPLC分析，得到的低聚乳果糖产量为24.67％。β-呋喃果糖苷酶能够以蔗糖作为果糖基供体，催化转果糖基反应。当体系中含有单糖、双糖、寡糖或一些糖醇类物质时，β-呋喃果糖苷酶会以这些物质作为受体分子，将果糖基转移上去合成一些新的寡糖或糖类衍生物；该合成体系即利用β-呋喃果糖苷酶将蔗糖分解产生的果糖基转移到乳糖还原性末端的C1羟基上，催化合成低聚乳果糖。反应理论结构式如图13所示。

2.1.2、酶促反应产物的分析

采用高效液相色谱法对β-呋喃果糖苷酶催化反应的产物含量进行检测。取一定量的样品进行10min沸水浴以终止反应，使用0.45μm的针筒过滤器过滤入液相小瓶待测。检测条件：HPLC-20A型高效液相色谱仪；光电二极管矩阵(PDA)检测器；色谱柱Agilent NH2-HPLC(4.6×250mm，5um)；设置柱温为30℃；流动相为乙腈：水＝75：25(体积比)；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；蒸发光散射检测器增益值为6；气压为25.0psi。

以乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、低聚乳果糖标准品配制不同浓度梯度的标准溶液，经0.45μm滤膜过滤后，按浓度从低到高的顺序通过HPLC进行检测，以糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果如表3所示。

表3、糖的标准曲线及相关系数

糖名称	标准曲线方程	相关系数(R<sup>2</sup>)
			葡萄糖	y＝190976x-64088	0.9995
果糖	y＝82231x+37361	0.9998
			乳糖	y＝171916x-248450	0.9996
蔗糖	y＝219041x-252856	0.9996
			低聚乳果糖	y＝168134x-314404	1.0000

乳糖、蔗糖为底物，β-呋喃果糖苷酶催化反应进行，产物进行高效液相色谱分析，色谱图如图6所示，与标准物质对比后发现主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、低聚乳果糖，也进一步证实了甲醇芽孢杆菌所产的β-呋喃果糖苷酶既有水解能力又有转糖基能力。

2.2、酶法合成低聚乳果糖条件优化

为了提高低聚半乳糖的产率，针对影响β-呋喃果糖苷酶合成低聚乳果糖主要因素(初始pH值、反应温度、底物浓度、底物比例、加酶量、反应时间)进行了单因素实验，以产物低聚乳果糖浓度为量化指标，研究各因素对酶法合成低聚乳果糖的影响。

2.2.1、初始pH对低聚乳果糖合成的影响

乳糖、蔗糖以1：1的质量比例混合，加入β-呋喃果糖苷酶400U/L，最终底物浓度为20％，反应温度37.0℃，调节反应初始pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，反应24h时取样并进行10min沸水浴终止酶反应，用0.45μm针头式滤膜过滤后进行HPLC分析，计算低聚乳果糖含量。

底物乳糖和蔗糖以1：1比例混合，加入β-呋喃果糖苷酶400U/L，底物浓度为20％，设置不同的初始pH值，在温度为37℃的条件下反应24h，测定低聚乳果糖含量，结果如图7所示。pH值在4.5-8.5范围内低聚乳果糖含量呈先上升后下降的趋势，初始pH值为7.0时，低聚乳果糖含量最高，为24.67％，说明此时酶的转移活力也最高。高于或者低于7.0都会抑制低聚乳果糖的合成，选择产物产率最大时的初始pH值7.0为酶法合成的最适pH，同时也是甲醇芽孢杆菌产酶的最适pH。

2.2.2、反应温度对低聚乳果糖合成的影响

乳糖、蔗糖以1：1比例混合，加入β-呋喃果糖苷酶400U/L，最终底物浓度为20％，反应初始pH值为7.0，设置反应温度为27.0℃、32.0℃、37.0℃、42.0℃、47.0℃，反应24h时取样并进行10min沸水浴终止酶反应，用0.45μm针头式滤膜过滤后进行HPLC分析，计算低聚乳果糖含量。

以乳糖、蔗糖为底物，利用甲醇芽孢杆菌所产的β-呋喃果糖苷酶进行低聚乳果糖的酶法合成，考察不同温度对产物生成量的影响。结果如图8所示，反应温度为37℃时对低聚乳果糖的合成最有利，此时占总糖含量的27.89％。温度较低时酶的活性受到抑制，温度太高会损失酶活使低聚乳果糖产量下降，故选择37℃为最适的反应温度。

2.2.3、底物浓度对低聚乳果糖合成的影响

乳糖、蔗糖以1：1比例(按照质量比例)混合，加入β-呋喃果糖苷酶400U/L，调节底物浓度(按照重量g/体积100ml)为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，反应初始pH值为7.0，反应温度为37.0℃，反应24h时取样并进行10min沸水浴终止酶反应，用0.45μm针头式滤膜过滤后进行HPLC分析，计算低聚乳果糖含量。

利用甲醇芽孢杆菌所产的β-呋喃果糖苷酶进行低聚乳果糖的酶法合成，其他条件不变的情况下，通过改变底物(乳糖和蔗糖)浓度考察其对产物生成量的影响。结果如图9所示，当底物浓度低于25％时，低聚乳果糖的生成量随浓度增加呈逐渐上升的趋势，因为根据反应平衡原理，底物浓度越高，反应越趋向于正向移动。增加底物浓度也可以降低反应体系的水分活度，从而增加酶的转糖基酶活，促进低聚乳果糖的合成。当底物浓度增加至25％时，低聚乳果糖的最终含量达到27.8％，由图9可以看出，在底物浓度超过25％之后，随着浓度增加低聚乳果糖含量变化不明显，这是因为低聚乳果糖的酶法合成是一个可逆反应，底物浓度增加意味着水解产物葡萄糖的增加，到达一定浓度便会抑制合成反应导致低聚乳果糖水解，致使最终产物含量降低。同时β-呋喃果糖苷酶具有水解酶活和转基酶活两种酶活力，其具体表现为，当环境中底物浓度较低时，体系中水分子活性较高，此时β-呋喃果糖苷酶不会选择水分子作为受体，而是底物乳糖、蔗糖分子作为羟基受体在酶的作用下发生水解反应，生成葡萄糖和果糖，促进低聚乳果糖的合成。而当环境中底物浓度过高时，会使渗透压增大，抑制酶反应的进行导致低聚乳果糖含量降低。还考虑到本实验底物是糖类物质，增加到一定水平会使反应液的黏度增加，造成传质效率的降低，不利于酶反应进行。经以上几方面综合考虑最终选择底物浓度为25％做进一步研究。

2.2.4、底物比例对低聚乳果糖合成的影响

乳糖、蔗糖以3：1、2：1、1：1、1：2、1：3比例(质量比例)混合，加入β-呋喃果糖苷酶400U/L，最终底物浓度为25％，反应初始pH值为7.0，反应温度为37.0℃，反应24h时取样并进行10min沸水浴终止酶反应，用0.45μm针头式滤膜过滤后进行HPLC分析，计算低聚乳果糖含量。

确定酶法合成低聚乳果糖的底物浓度为25％后，还需对底物比例进一步研究，以不同比例的乳糖、蔗糖配制溶液，其他条件不变的情况下测定终产物中低聚乳果糖含量。结果如图10所示，在比例为1：1时低聚乳果糖含量最高，达到28.12％，明显高于其他比例且差异显著(P＜0.05)。这是因为β-呋喃果糖苷酶催化原理是将蔗糖分解产生的果糖基转移至乳糖还原性末端的C1位羟基上，而当底物乳糖或蔗糖量一定时，酶的催化作用无法最大限度得到发挥。Park等人曾研究枯草芽孢杆菌所产果聚糖蔗糖酶合成低聚乳果糖的底物比例，结果是225g/L蔗糖和225g/L乳糖可达到最大低聚乳果糖合成量，本实验结果与其比例一致，且为了保证底物利用率和合成产物的最大化，最终确定酶法合成低聚乳果糖的最适底物比例即乳糖：蔗糖(质量比)为1：1。

2.2.5、加酶量对低聚乳果糖合成的影响

乳糖、蔗糖以1：1比例混合，加入β-呋喃果糖苷酶100U/L、200U/L、300U/L、400U/L、500U/L、600U/L，底物浓度为25％，反应初始pH值为7.0，反应温度为37.0℃，反应24h时取样并进行10min沸水浴终止酶反应，用0.45μm针头式滤膜过滤后进行HPLC分析，计算低聚乳果糖含量。

确定乳糖、蔗糖比例为1：1，底物浓度为25％，反应初始pH值为7.0，反应温度为37.0℃，反应时间为28h，研究不同加酶量对低聚乳果糖合成的影响。结果如图11所示，随着β-呋喃果糖苷酶添加量由100增加到500U/L，低聚乳果糖含量也在逐渐升高，是由于底物浓度足够且体系中没有抑制酶活性的物质，添加的酶可充分发挥其转糖基活性。当加酶量高于500U/L时，过量的酶会发挥其水解作用水解低聚乳果糖，使得低聚乳果糖含量有所减少。加酶量为400U/L与500U/L所生成的低聚乳果糖含量仅相差0.33％，且差异不显著(P>0.05)，考虑到经济因素，最终确定最适加酶量为400U/L。

2.2.6、反应时间对低聚乳果糖合成的影响

乳糖、蔗糖以1：1比例混合，加入β-呋喃果糖苷酶400U/L，最终底物浓度为25％，反应初始pH值为7.0，反应温度37.0℃，在反应时间为8h、16h、20h、24h、28h、32h取样并进行10min沸水浴终止酶反应，用0.45μm针头式滤膜过滤后进行HPLC分析，计算低聚乳果糖含量。

在酶法合成低聚乳果糖过程中监测各反应产物浓度随时间的变化，结果如图12所示，低聚乳果糖在反应时间为10～20h合成速度较快，是由于β-呋喃果糖苷酶反应初期水解速率较快，而后期主要是转糖基酶活起作用，故在20～28h时浓度变化缓慢。在反应时间为28h时，低聚乳果糖含量达到最大值，占总糖含量的33.34％，蔗糖转化率为57.18％。而后随着反应时间继续延长，低聚乳果糖的含量缓慢减少，伴随这一过程，乳糖含量有所增加，可以推测在反应28h之后，反应平衡移动，合成的低聚乳果糖的分解速率大于乳糖与蔗糖的继续合成速率，使得低聚乳果糖的合成量缓慢减少。但蔗糖的水解仍在进行，这使得蔗糖量继续减少，致使转糖基反应的反应平衡向相反方向移动。

曾有文献报道利用果聚糖蔗糖胞内酶合成低聚乳果糖最佳反应时间为20h，可见不同微生物来源的酶可能会使低聚乳果糖的合成速率有所差异，在本实验中，利用甲醇芽孢杆菌所产β-呋喃果糖苷酶，以蔗糖、乳糖为底物合成低聚乳果糖，在pH值7.0、温度为37℃条件下，最佳反应时间为28h。

2.3、酶法合成低聚乳果糖的条件优化结果

利用甲醇芽孢杆菌所产β-呋喃果糖苷酶进行低聚乳果糖的合成研究，确定了酶法合成低聚乳果糖的最优条件为底物乳糖、蔗糖以1：1比例混合，底物浓度为25％，加酶量400U/L，初始pH值7.0，温度37.0℃条件下反应28h，在以上优化后的条件下，低聚乳果糖的终含量可以达到33.34％，较初始条件提升了8.67％，蔗糖转化率达到61.48％。

于国萍等设计优化节杆菌发酵产β-呋喃果糖苷酶的培养基和发酵条件，其低聚乳果糖的相对含量最高约为25％。Han等人得到研究果聚糖蔗糖酶的最优合成条件为23℃，pH值7.0，底物浓度为36％，最终产物含量为28.5％。可见本实验利用β-呋喃果糖苷酶合成低聚乳果糖，终产物含量相对较高，也证实甲醇芽孢杆菌所产酶具有较强的低聚乳果糖合成能力，对工业化生产可提供一定理论依据。本研究丰富了产β-呋喃果糖苷酶菌株的资源库，进而促进了低聚乳果糖酶法合成产业的升级，为进一步开发健康新颖的食品奠定了技术基础。

实施例3、β-呋喃果糖苷酶发酵菌株筛选

谷氨酸杆菌、氯酚节杆菌、甲醇芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、肠膜状明串珠菌1、肠膜状明串珠菌2中进行筛选，测定胞内、胞外β-呋喃果糖苷酶活力、蛋白质含量，选取产酶活力较高的菌株。

将谷氨酸杆菌、氯酚节杆菌、肠膜状明串珠菌1、甲醇芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、肠膜状明串珠菌2按体积分数2％接种到各自活化培养基中，120r/min、37℃条件下培养，活化2代后按体积分数2％接种到500mL锥形瓶中进行产酶菌体培养，24h后将培养液以以8000r/min、4℃低温离心20min，收集上清液置于-20℃冰箱中过夜，再取出解冻，使没有离心干净的菌体因溶胀作用而失活，即得到用于测定胞外酶活力的粗酶液；离心后的沉淀溶于适量的磷酸盐缓冲液，充分震荡后，使用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎处理，即得到用于测定胞内酶活力的粗酶液。

测定谷氨酸杆菌、氯酚节杆菌、肠膜状明串珠菌1、甲醇芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、肠膜状明串珠菌1和肠膜明串珠菌2在发酵24h时所产β呋喃果糖苷酶活及蛋白含量，得到不同菌株胞内、胞外的酶活和比酶活后进行比较。结果如图14所示。可以看出谷氨酸杆菌和甲醇芽孢杆菌的胞外酶活力和比酶活相对较高，其中谷氨酸杆菌胞外酶活力为386.02U/L，甲醇芽孢杆菌胞外比酶活最高，为0.32U/mg，谷氨酸杆菌和甲醇芽孢杆菌2菌株的胞外酶活力显著高于胞内，氯酚节杆菌则胞内酶活力较高。但6株菌的胞内酶活力均偏低，且枯草芽孢杆菌、肠膜明串珠菌1、肠膜明串珠菌2胞内和胞外基本都未检测到β-呋喃果糖苷酶的产生。

近些年报道有关谷氨酸杆菌产β-呋喃果糖苷酶的文章较多，而关于甲醇芽孢杆菌，有文献曾报道其可用于生产氨基酸，但用于生产β-呋喃果糖苷酶还未见报道，在低聚糖合成应用方面的研究基本空白。实验中甲醇芽孢杆菌的比酶活明显高于谷氨酸杆菌，用其生产β-呋喃果糖苷酶，可以丰富其产生菌的资源库。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.发酵生产β-呋喃果糖苷酶的方法，其特征在于，所述方法包括在微生物培养基中培养甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)，收集培养物，得到β-呋喃果糖苷酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇芽孢杆菌(Bacillusmethanolicus)为甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)LB-1。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微生物培养基由溶质和溶剂组成，所述溶质为：葡萄糖10g/L、酵母膏10g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸钙2.0g/L、七水硫酸镁0.1g/L，所述溶剂为水。

4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述培养为37℃培养24h。

5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括从所述培养物中分离纯化β-呋喃果糖苷酶的步骤。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离纯化包括饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐和葡聚糖凝胶色谱。

7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，所述β-呋喃果糖苷酶的分子量为45kDa。

8.由权利要求1-7中任一所述的方法制备的β-呋喃果糖苷酶。

9.甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)在制备β-呋喃果糖苷酶中的应用。

10.权利要求1-7中任一所述方法在制备低聚乳果糖中的应用或权利要求8所述的β-呋喃果糖苷酶在制备低聚乳果糖中的应用。

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