CN110643552B - 一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株及其应用 - Google Patents

一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株及其应用，可有效解决利用可溶性淀粉及菌株HKS‑D‑3，成本低、品质好制备海藻糖浆的问题。一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株HKS‑D‑3，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13052，保藏日期：2016年9月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述的菌株HKS‑D‑3在利用可溶性淀粉制备海藻糖浆中的应用。本发明制备过程无污染，产品质量好，方法简单，原料成本低，液体海藻糖浆可应用于微生物培养基中，可有效促进微生物的生长，菌丝生长，产品性能提高，质量好。

Description

一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株及其应用。
背景技术
海藻糖广泛存在于自然界（如微生物、细菌、真菌、酵母菌、昆虫、无脊椎动物低等动植物体内），海藻糖是一个由两分子葡萄糖以α-1,1糖苷键连接的非还原性双糖，稳定的化学结构及特殊的物理性质，使其成为能够保持细胞活性、防止食品劣化、提升食品品质（王一雯，2019），在食品、医学、轻工业领域中广泛应用（黎高翔，2015），海藻糖广泛且独特的生物学功能，广泛受到关注，引发了世界性的研究开发热潮，但海藻糖生产成本高、价格昂贵限制了应用，海藻糖成本高主要集中在海藻糖的分离纯化造成的困难成本高。不同生物体内存在着5条海藻糖合成途径，是一种典型的应激代谢产物（巩涛，2016），其制备方法包括合成法、发酵法、提取法、酶转化法及基因工程法等（谢定，2013），目前在实验室和生产上制备海藻糖主要有三种方法：一是从酵母细胞中提取，但是提取工艺复杂，分离提取困难，成本高；二是采用微生物发酵生产，从发酵液中提取海藻糖，由于发酵液成分复杂造成提取困难；三是采用采用微生物发酵提取相关海藻糖合成酶，采用酶的转糖基化作用酶法合成海藻糖，酶法是至今各种海藻糖生产方法中最有前途的一种，它的出现为海藻糖的大规模工业化生产奠定了可靠基础。我国淀粉资源丰富，来源广泛，淀粉价格低廉，被认为是用来生产海藻糖的最佳原料，以淀粉为底物酶法生产海藻糖有重要意义，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株及其应用，可有效解决利用可溶性淀粉及菌株HKS-D-3，成本低、品质好制备海藻糖浆的问题。
本发明解决的技术方案是，一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株HKS-D-3，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13052，保藏日期：2016年9月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
所述的菌株HKS-D-3在利用可溶性淀粉制备海藻糖浆中的应用，其应用方法包括以下步骤：
（1）配制10%可溶性淀粉：将可溶性淀粉10g加入pH5.5-6.5磷酸缓冲液，沸水浴中，边搅拌边加热溶解至溶液呈透明状，冷却至室温，补充pH5.5-6.5磷酸缓冲液至100mL；
（2）制备粗酶液：将芽孢杆菌（Bacillus sp）HKS-D-3，以重量比0.3%接种于发酵培养基中，37℃、180r/min摇床震荡培养48h，4℃、6000r/min离心10～15min，弃去上清液，将获得的菌体泥用pH5.5-6.5磷酸缓冲液震荡洗涤2-3次，收集菌体沉淀，加入与发酵培养基等重量的pH5.5-6.5磷酸缓冲液，震荡使其悬浮，在冰浴中用超声波破壁处理，300W超声5s，间隔5s，再进下一次超声，总超声时间13min，于4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，即为粗酶液；
所述发酵培养基是由重量计：可溶性淀粉20.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏2.0g，K2HPO41.0g，NaH2PO4 1.0g和MgSO4·7H2O 1.0g加蒸馏水至1.0L混匀，用盐酸或氢氧化钠调pH7.0，121℃灭菌20min制成；所述pH5.5-6.5磷酸缓冲液：取磷酸二氢钾0.68g，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释成100mL，用盐酸或氢氧化钠调节至pH5.5-6.5即得；0.1mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠0.4g，用水溶解稀释成100mL；
（3）制备海藻糖混合液：粗酶液、普鲁兰酶加入至可溶性淀粉质量含量10%的淀粉溶液中，普鲁兰酶是一种脱支酶，对可溶性淀粉进行脱支处理，在55℃、100r/min条件下震荡反应50h，使支链淀粉成为直链淀粉，得海藻糖混合液；其中每1g可溶性淀粉加粗酶液5-10mL、普鲁兰酶2-5U；
（4）后处理：海藻糖混合液经真空，在85Kpa、80℃下浓缩至海藻糖含量不小于10g/100mL的液体海藻糖浆，即为成品。
本发明是针对海藻糖生产成本高、价格昂贵应用受到限制的情况，而提供的一株菌株HKS-D-3，并利用廉价的可溶性淀粉为原料，结合酶法制备不小于10g/100mL，固形物含量不小于50g/100mL的液体海藻糖浆，真空度85Kpa条件下节约大量能源，糖类粘度大，真空低温蒸发可避免糊化，避免了脱色、离子交换树脂脱盐、色谱分离、浓缩、结晶等造成海藻糖高成本的工序，制备过程无污染，产品质量好，方法简单，原料成本低，降低了生产成本，液体海藻糖浆可应用于微生物培养基中，可有效促进微生物的生长，菌丝生长，产品性能提高，质量好，为海藻糖低成本广泛应用奠定了基础，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明菌株HKS-D-3在利用可溶性淀粉制备海藻糖浆中的应用，其应用方法包括以下步骤：
（1）配制10%可溶性淀粉：将可溶性淀粉10g加入pH6.0磷酸缓冲液，沸水浴中，边搅拌边加热溶解至溶液呈透明状，冷却至室温，补充pH6.0磷酸缓冲液至100mL；
（2）制备粗酶液：将芽孢杆菌（Bacillus sp）HKS-D-3，以重量比0.3%接种于发酵培养基中，37℃、180r/min摇床震荡培养48h，4℃、6000r/min离心12min，弃去上清液，将获得的菌体泥用pH6.0磷酸缓冲液震荡洗涤3次，收集菌体沉淀，加入与发酵培养基等重量的pH6.0磷酸缓冲液，震荡使其悬浮，在冰浴中用超声波破壁处理，300W超声5s，间隔5s，再进下一次超声，总超声时间13min，于4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，即为粗酶液；
（3）制备海藻糖混合液：粗酶液、普鲁兰酶加入至可溶性淀粉质量含量10%的淀粉溶液中，在55℃、100r/min条件下震荡反应50h，得海藻糖混合液；其中每1g可溶性淀粉加粗酶液8mL、普鲁兰酶3U；
（4）后处理：海藻糖混合液经真空，在85Kpa、80℃下浓缩至海藻糖含量不小于10g/100mL的液体海藻糖浆，即为成品。
实施例2
本发明在具体实施中，所述的每1g可溶性淀粉加粗酶液6mL、普鲁兰酶2U。
实施例3
本发明在具体实施中，所述的每1g可溶性淀粉加粗酶液7mL、普鲁兰酶4U。
实施例4
本发明在具体实施中，所述的每1g可溶性淀粉加粗酶液9mL、普鲁兰酶5U。
实施例5
本发明在具体实施中，所述的磷酸缓冲液pH值为5.8。
实施例6
本发明在具体实施中，所述的磷酸缓冲液pH值为6.2。
本发明是提供一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株HKS-D-3，并利用该菌株，用于微生物培养基来制备海藻糖，其机理是，利用普鲁兰酶对可溶性淀粉进行脱支处理，支链淀粉成为直链淀粉，普鲁兰酶是一种脱支酶，能够催化支链淀粉中α-1,6糖苷键的水解，将支链淀粉变为直链淀粉，从而提高淀粉利用率。利用芽孢杆菌（Bacillus sp）HKS-D-3的菌株所产麦芽寡糖基海藻糖合成酶（Maltooligosyl trehalose synthase，MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶 (Maltooligosyl trehalose hydrolase，MTHase) 途径（即TreY-TreZ途径），这两种酶作用于直链淀粉非磷酸化合成海藻糖，每次生成少两个葡萄糖单位的麦芽寡糖及海藻糖，其中麦芽寡糖基海藻糖合成酶（Maltooligosyl trehalose synthase，MTSase）作用于底物还原性末端，产生α-1,4糖苷键到α-1,1糖苷键的分子内转糖基作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶 (Maltooligosyl trehalosehydrolase，MTHase)则专一性的内切该中间产物麦芽寡糖基海藻糖中的麦芽寡糖基与海藻糖相连的α-1,4糖苷键，使之断裂产生海藻糖和减少葡萄糖单位的麦芽寡糖，形成海藻糖含量不小于10g/100mL的液体海藻糖浆产品，海藻糖浆含有的海藻糖及其他副产物如单糖、二糖，多糖既可以促进生长又可作为微生物生长的碳源。本发明可溶性淀粉为原料，结合酶法得到海藻糖。制备方法简单，酶成本低，降低了生产成本，液体海藻糖浆可应用于微生物培养基中，可有效促进微生物的生长，菌丝生长，产品性能提高，质量好，为海藻糖低成本广泛应用提供了技术支撑，并经实验取得了很好的有益技术效果，经试验和测试，利用芽孢杆菌（Bacillus sp）HKS-D-3制备的海藻糖成本可降低50%以上，产品质量好，有关资料如下：
一、菌株筛选
无菌条件下将采集河南省平顶山鲁山上汤温泉土样样品进行稀释分离，放入盛有99mL无菌水的三角瓶中，于30℃、180r/min摇床震荡15～20min，使微生物菌种分散，静置10min，取静置后的上清液，无菌操作，依次分别稀释成10-3 、10-4 、10-5 等系列稀释度菌悬液，分别涂布于菌种初筛培养基平板上，于28～30℃下培养2～3d，待菌落长出后，挑取不同的单菌落于菌种筛选培养上平板划线进一步分离纯化，反复2～3次，挑取分离纯化的单菌落转接于LB培养基培养基斜面试管上，于4℃冰箱中保藏备用，所述LB培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15 .0g，水1 000 mL，pH 7.2。挑取初筛出的单菌落试管斜面菌种接种于发酵产酶培养基中，进行发酵培养，250mL三角瓶装入60mL发酵培养基，37℃、180r/min摇床震荡培养48h，离心机于4℃、6000r/min离心10～15min，弃去上清液，将获得的菌体泥用50mmol/L pH5.5-6.5磷酸缓冲液震荡洗涤2-3次，收集菌体沉淀加入与发酵培养基等重量的50mmol/L pH5.5-6.5磷酸缓冲液，震荡使其悬浮，在冰浴中用超声波破壁处理，300W超声5s，间隔5s，总超声时间13 min，于4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，加入等体积的2%可溶性淀粉溶液，37℃、180r/min摇床震荡反应12h，结束后取出，沸水浴灭酶10min，冷却后于4℃、10000r/min离心15min，收集上清液，吸取1µL点样在硅胶板GF254上，用薄层层析法对上清液中的糖份进行定性分析。根据海藻糖斑点的有无，可以初步确定能够利用可溶性淀粉为原料产海藻糖的菌株，薄层层析定性分析上清液中的糖成分，挑选并标记上清液中含有海藻糖的菌株。采用青岛产硅胶板GF254，展开剂为乙醇：乙酸乙酯：水＝10:3:1（V/V），显色剂为10%浓硫酸。
取2块相同规格的硅胶板GF254，在相同位置进行点样上清液1µL，在同一展开剂相同条件下进行薄层层析，一个作为参照同时对1%葡萄糖溶液、1%麦芽糖溶液、1%海藻糖溶液标准样进行点样1 μl，进行后续显色烘干操作，以确定海藻糖斑点的具体位置，然后找出另一块硅胶板点样点的对应位置，根据海藻糖的Rf值确定其位置，将海藻糖位置的硅胶刮下，然后用其定糖的方法。刮下海藻糖斑点大小样本，放入适量0.1mol/LHCl浸泡16h，离心过滤后样品溶液按照GB/T23529-2009标准海藻糖含量的测定方法对其中的海藻糖进行定量分析。根据定量测定海藻糖的多少，进一步筛选出高产海藻糖的菌株。经过大量筛选，选育出一株可利用可溶性淀粉制备海藻糖的菌株，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp）HKS-D-3。
二、菌株鉴定：
菌株HKS-D-3菌体形态学观察及生理生化特征分析：将筛选出的菌株接种到LB培养基平板上培养24h，观察其菌落生长特征：菌落形状不规则，直径2.1-3.2mm，白色，凸起，不透明，粘稠有光泽，易于挑起，采用革兰氏染色法对菌体细胞染色革兰氏染色为阳性，有芽孢产生，并借助差相显微镜观察形态菌体呈杆状，长2.2-5.0µm，宽0.9-1.2µm。同时进行各种生理生化特性检测，菌株HKS-D-3淀粉水解阳性，接触酶阳性。
分子生物学鉴定：16S rDNA的扩增及测序，细菌DNA的提取采用美国Omega Bio-Tek 公司生产的E.Z.N.A.Bacterial DNA kit试剂盒（D3350-01），按试剂盒说明书操作流程提取。16S rDNA基因的PCR扩增采用细菌提取扩增通用引物27F:5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-；1492R: 5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。
PCR扩增体系25μL：上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，2×Es Taq MasterMix （Dye）12.5μL，ddH2O 9.5μL，提取模板DNA1.0μL。
PCR反应条件：95℃预变性10 min，94℃变性1 min，55℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环。
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析检测验证后，序列测定送北京六合华大基因科技股份有限公司完成。将测序结果序列，登陆NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上提交Genbank数据库进行BLAST同源性序列比对。经测序后，得到完整的16S rDNA的基因序列，其测序序列片段长度为1401bp，具体序列为：
1 AAAGGTTACC TCACCGACTT CGGGTGTTGC AAACTCTCGT GGTGTGACGG GCGGTGTGTA
61 CAAGGCCCGG GAACGTATTC ACCGCGGCAT GCTGATCCGC GATTACTAGC GATTCCAGCT
121 TCACGCAGTC AAGTTGCAAA CTGCGATCCG AACTGAGAAC AGATTTGTGG GATTGGCTAA
181 ACCTTGCGGT CTCGCAGCCC TTTGTTCTGT CCATTGTAGC ACGTGTGTAG CCCAGGTCAT
241 AAGGGGCATG ATGATTTGAC GTCATCCCCA CCTTCCTCCG GTTTGTCACC GGCAGTCACC
301 TTAGAGTGCC CAACTGAATG CTGGCAACTA AGATCAAGGG TTGCGCTCGT TGCGGGACTT
361 AACCCAACAT CTCACGACAC GAGCTGACGA CAACCATGCA CCACCTGTCA CTCTGTCCCC
421 GAAGGGAAAG CCCTATCTCT AGGGTTGTCA GAGGATGTCA AGACCTGGTA AGGTTCTTCG
481 CGTTGCTTCG AATTAAACCA CATGCTCCAC CGCTTGTGCG GGCCCCCGTC AATTCCTTTG
541 AGTTTCAGTC TTGCGACCGT ACTCCCCAGG CGGAGTGCTT AATGCGTTAG CTGCAGCACT
601 AAGGGGCGGA AACCCCCTAA CACTTAGCAC TCATCGTTTA CGGCGTGGAC TACCAGGGTA
661 TCTAATCCTG TTCGCTCCCC ACGCTTTCGC TCCTCAGCGT CAGTTACAGA CCAGAGAGTC
721 GCCTTCGCCA CTGGTGTTCC TCCACATCTC TACGCATTTC ACCGCTACAC GTGGAATTCC
781 ACTCTCCTCT TCTGCACTCA AGTTTCCCAG TTTCCAATGA CCCTCCCCGG TTGAGCCGGG
841 GGCTTTCACA TCAGACTTAA GAAACCGCCT GCGAGCCCTT TACGCCCAAT AATTCCGGAC
901 AACGCTTGCC ACCTACGTAT TACCGCGGCT GCTGGCACGT AGTTAGCCGT GGCTTTCTGG
961 TTAGGTACCG TCAAGGTGCA AGCAGTTACT CTTGCACTTG TTCTTCCCTA ACAACAGAGC
1021 TTTACGATCC GAAAACCTTC ATCACTCACG CGGCGTTGCT CCGTCAGACTTTCGTCCATT
1081 GCGGAAGATT CCCTACTGCT GCCTCCCGTA GGAGTCTGGG CCGTGTCTCAGTCCCAGTGT
1141 GGCCGATCAC CCTCTCAGGT CGGCTACGCA TCGTCGCCTT GGTGAGCCGTTACCTCACCA
1201 ACTAGCTAAT GCGCCGCGGG TCCATCTGTA AGTGACAGCC GAAACCGTCTTTCATCCTTG
1261 AACCATGCGG TTCAAGGAAC TATCCGGTAT TAGCTCCGGT TTCCCGGAGTTATCCCAGTC
1321 TTACAGGCAG GTTACCCACG TGTTACTCAC CCGTCCGCCG CTAACATCCGGGAGCAAGCT
1381 CCCTTCTGTC CGCTCGACTG C
经过大量筛选，选育出一株可利用可溶性淀粉制备海藻糖的菌株，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp）HKS-D-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13052，保藏日期：2016年9月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
三、菌株的应用
在真菌上应用：
As3.758是我国酿造食醋中常用的生产麸曲菌种，主要产糖化酶等，马铃薯培养基（PDA）是其常用培养基，也是一般真菌常用保藏培养基，马铃薯培养基（PDA）：马铃薯200g去皮，切成块，加适量水煮沸30min，然后2层纱布过滤，再加入葡萄糖20g，琼脂20g，溶化后水至1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。在马铃薯培养基（PDA）的基础上添加10g本发明海藻糖浆，即形成新的培养基，其配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g， 10g海藻糖浆，琼脂20g，水1000mL。
试验1：将As3.758菌种分别点种于上述2种培养基，即马铃薯培养基（PDA）及添加海藻糖浆新的马铃薯培养基（PDA）上，30℃条件下培养28h，观察其生长情况，十字交叉法测定菌落直径；试验2：As3.758菌丝生长量的测定：将As3.758菌种以重量比0.3%的接种量分别接种于上述2种液体培养基中（去除琼脂后的培养基），30℃、160r/min摇床震荡培养28h，离心机于4℃、4000r/min离心15min，收集菌丝体，烘干至恒重，分别计算菌丝干重；试验3：As3.758糖化酶活力的测定：将As3.758菌种以重量比0.3%的接种量分别接种于上述2种液体培养基中（去除琼脂后的培养基），30℃、160r/min摇床震荡培养28h，斐林试剂法测定糖化酶活力。试验结果为：试验1添加海藻糖浆的培养基较基础马铃薯培养基（PDA）上，As3.758菌丝生长迅速，基础马铃薯培养基（PDA）直径5.1cm，添加海藻糖浆的培养基直径6.3cm，提高23.5%；
试验2 基础马铃薯培养基（PDA）菌丝量为0.43g，添加海藻糖浆的培养基菌丝量为0.59g，提高37.2%；试验3基础马铃薯培养基（PDA）糖化酶活力为96U/mL发酵液，添加海藻糖浆的培养基糖化酶活力为135U/mL发酵液，提高了40.6%，达到显著水平。
在细菌上应用：
LB培养基为细菌采用培养基，LB培养基配方：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15 .0g，水1 000 mL，pH 7.2；添加海藻糖的培养基为：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠5.0 g，海藻糖浆10g，琼脂15 .0g，水1 000 mL，pH 7.2；。将德式乳杆菌德式亚种As1.2624以1×104CFU/mL培养基分别接种于LB液体培养基和添加了海藻糖浆的培养基中，37℃、180r/min摇床震荡培养20h，采用平板计数法进行活菌数测定。结果显示，基础LB培养基活菌数1.03×108CFU/mL, 添加海藻糖浆的培养基活菌数达到1.23×108CFU/mL,提高了19.4%，达到了显著水平。
海藻糖对生物体具有保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。与其它糖类一样，海藻糖可广泛应用于食品业，包括饮料、巧克力及糖果、烘烤制品和速冻食品。在医学上已经成功地应用海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂，本发明制备的海藻糖（浆），产品质量好，由于原料丰富，成本低，制备方法简单，因此，生产成本降低50%以上，易于工业化生产，有效满足了对海藻糖的需要，以造福于社会，经济和社会效益巨大。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp)
<400> 1
aaaggttacc tcaccgactt cgggtgttgc aaactctcgt ggtgtgacgg gcggtgtgta 60
caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccagct 120
tcacgcagtc aagttgcaaa ctgcgatccg aactgagaac agatttgtgg gattggctaa 180
accttgcggt ctcgcagccc tttgttctgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240
aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtcacc 300
ttagagtgcc caactgaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360
aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca ctctgtcccc 420
gaagggaaag ccctatctct agggttgtca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 480
cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 540
agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact 600
aaggggcgga aaccccctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 660
tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt cagttacaga ccagagagtc 720
gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc accgctacac gtggaattcc 780
actctcctct tctgcactca agtttcccag tttccaatga ccctccccgg ttgagccggg 840
ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct gcgagccctt tacgcccaat aattccggac 900
aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg 960
ttaggtaccg tcaaggtgca agcagttact cttgcacttg ttcttcccta acaacagagc 1020
tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt 1080
gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1140
ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt ggtgagccgt tacctcacca 1200
actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtgacagcc gaaaccgtct ttcatccttg 1260
aaccatgcgg ttcaaggaac tatccggtat tagctccggt ttcccggagt tatcccagtc 1320
ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacatccg ggagcaagct 1380
cccttctgtc cgctcgactg c 1401

Claims (8)

1.一种利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的菌株HKS-D-3，分类命名为芽孢杆菌（Bacillussp），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13052，保藏日期：2016年9月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的菌株HKS-D-3利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制10%可溶性淀粉：将可溶性淀粉10g加入pH5.5-6.5磷酸缓冲液，沸水浴中，边搅拌边加热溶解至溶液呈透明状，冷却至室温，补充pH5.5-6.5磷酸缓冲液至100mL；
（2）制备粗酶液：将芽孢杆菌（Bacillus sp）HKS-D-3，以重量比0.3%接种于发酵培养基中，37℃、180r/min摇床震荡培养48h，4℃、6000r/min离心10～15min，弃去上清液，将获得的菌体泥用pH5.5-6.5磷酸缓冲液震荡洗涤2-3次，收集菌体沉淀，加入与发酵培养基等重量的pH5.5-6.5磷酸缓冲液，震荡使其悬浮，在冰浴中用超声波破壁处理，300W超声5s，间隔5s，再进行 下一次超声，总超声时间13min，于4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，即为粗酶液；
所述发酵培养基是由重量计：可溶性淀粉20.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏2.0g，K2HPO41.0g，NaH2PO4 1.0g和MgSO4·7H2O 1.0g加蒸馏水至1.0L混匀，用盐酸或氢氧化钠调pH7.0，121℃灭菌20min制成；所述pH5.5-6.5磷酸缓冲液：取磷酸二氢钾0.68g，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释成100mL，用盐酸或氢氧化钠调节至pH5.5-6.5即得；
（3）制备海藻糖混合液：粗酶液、普鲁兰酶加入至可溶性淀粉质量含量10%的淀粉溶液中，普鲁兰酶是一种脱支酶，对可溶性淀粉进行脱支处理，在55℃、100r/min条件下震荡反应50h，使支链淀粉成为直链淀粉，得海藻糖混合液；其中每1g可溶性淀粉加粗酶液5-10mL、普鲁兰酶2-5U；
（4）后处理：海藻糖混合液经真空，在85Kpa、80℃下浓缩至海藻糖含量不小于10g/100mL的液体海藻糖浆，即为成品。
3.根据权利要求2所述的菌株HKS-D-3利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制10%可溶性淀粉：将可溶性淀粉10g加入pH6.0磷酸缓冲液，沸水浴中，边搅拌边加热溶解至溶液呈透明状，冷却至室温，补充pH6.0磷酸缓冲液至100mL；
（2）制备粗酶液：将芽孢杆菌（Bacillus sp）HKS-D-3，以重量比0.3%接种于发酵培养基中，37℃、180r/min摇床震荡培养48h，4℃、6000r/min离心12min，弃去上清液，将获得的菌体泥用pH6.0磷酸缓冲液震荡洗涤3次，收集菌体沉淀，加入与发酵培养基等重量的pH6.0磷酸缓冲液，震荡使其悬浮，在冰浴中用超声波破壁处理，300W超声5s，间隔5s，再进行 下一次超声，总超声时间13min，于4℃、12000r/min离心10min，收集上清液，即为粗酶液；
（3）制备海藻糖混合液：粗酶液、普鲁兰酶加入至可溶性淀粉质量含量10%的淀粉溶液中，在55℃、100r/min条件下震荡反应50h，即为海藻糖混合液；其中每1g可溶性淀粉加粗酶液8mL、普鲁兰酶3U；
（4）后处理：海藻糖混合液经真空，在85Kpa、80℃下浓缩至海藻糖含量不小于10g/100mL的液体海藻糖浆，即为成品。
4.根据权利要求2所述的菌株HKS-D-3利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的方法，其特征在于，所述的每1g可溶性淀粉加粗酶液6mL、普鲁兰酶2U。
5.根据权利要求2所述的菌株HKS-D-3利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的方法，其特征在于，所述的每1g可溶性淀粉加粗酶液7mL、普鲁兰酶4U。
6.根据权利要求2所述的菌株HKS-D-3利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的方法，其特征在于，所述的每1g可溶性淀粉加粗酶液9mL、普鲁兰酶5U。
7.根据权利要求2所述的菌株HKS-D-3利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲液pH值为5.8。
8.根据权利要求2所述的菌株HKS-D-3利用可溶性淀粉制备海藻糖浆的方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲液pH值为6.2。
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