CN111961619A - 一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌和应用 - Google Patents

一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，所述海生弧菌的名称为：ML17，分类名称为：弧菌Vibrio sp.，保藏编号为：CGMCC No.20377，保藏日期：2020年7月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的海生弧菌(Vibrio maritimus)分离自单齿螺(Monodonta Labio)肠道内容物，通过我妻氏血琼脂平板验证无明显溶血现象，表面其不具有潜在致病性。本发明的海生弧菌生长周期短，是单齿螺肠道中的优势菌株，产生的褐藻胶裂解酶具有良好的热稳定性。

Description

一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌和应用。
背景技术
褐藻胶是自然界中存量仅次于纤维素的一种大分子多糖类物质，主要是从海洋中存在最为广泛的海带、巨藻、马尾藻等藻类植物的细胞壁及细胞间质中提取得到，其在褐藻纲植物中存在广泛。褐藻胶主要由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸通过α/β-1,4糖苷键随机排列而成，这两种糖单元相互聚合形成三种不同的结构单元：聚甘露糖醛酸(PolyM)、聚古罗糖醛酸(PolyG)及M和G随机组合形成的杂聚物(PolyMG)。
褐藻胶裂解酶是一种专性裂解褐藻胶的多糖降解酶，可通过β消除反应切断酸性褐藻胶多糖糖苷键，并在新生成的非还原端C4，5间产生具有不饱和双键结构的寡糖产物。褐藻胶裂解酶广泛存在于海水、土壤和海洋藻类中的弧菌、假交替单胞菌、固氮菌、芽孢杆菌、黄杆菌等。在海生软体动物肠道中也发现有产褐藻胶裂解酶的存在。
褐藻胶的降解产物褐藻寡糖在医药、农业、食品等领域都具有巨大的利用潜力，有研究表明其在抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗真菌、神经保护、肠道消化吸收及植物的生长及保鲜等方面表现出良好的生物活性。同时，褐藻胶裂解酶在通过海藻制备生物乙醇的过程中起到了关键作用。
随着近年来对海洋的研究深入，越来越多海洋资源被发掘利用，对海洋大型藻类的开发利用应用潜力大，对我国的经济发展有着至关重要的作用。因此筛选出一株可产具有高酶活、高稳定性的褐藻胶裂解酶的菌株在工业生产褐藻寡糖的应用中具有重要意义。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于为弥补褐藻胶裂解酶在工业应用过程中耐热性差的不足之处，提供一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌和应用，该海生弧菌无潜在致病性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，所述海生弧菌的名称为：ML17，分类名称为：弧菌Vibrio sp.，保藏编号为：CGMCC No.20377，保藏日期：2020年7月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
而且，所述海生弧菌分离自单齿螺(Monodonta Labio)肠道内容物，是单齿螺肠道中的优势菌株。
而且，所述海生弧菌的菌落及菌体特征为：在添加海藻酸钠碳源的2216E培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘光滑，有光泽，菌落直径为0.6～0.8mm，培养基有明显凹陷圈和透明圈，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G-，菌体呈小短杆状或近球状，扫描电子显微镜观察其细胞形态，菌体呈短杆状或近球状，两端钝圆，为非典型弧菌。
而且，所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液在40℃条件下通过DNS法测定褐藻胶裂解酶活性为26.31U/mL。
而且，所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液分别在25、30、35、40、45、50、55、60℃条件下通过DNS法测定褐藻胶裂解酶相对活性分别为60％、83.7％、91.8％、100％、92.6％、72.5％、39.4％、6.6％。
而且，所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液分别在40、45、50、55℃下热处理5、15、30、60、90、120分钟，通过DNS法测定褐藻胶裂解酶相对活性，40℃热处理后分别为97.3％、95.8％、91.1％、87.4％、79.1％、65.9％，45℃热处理后分别为91.1％、88.6％、78.4％、66.4％、44.3％、32.7％，50℃热处理后分别为83.3％、58.0％、50.8％、23.5％、11.9％、0％，55℃热处理后分别为69.7％、39.2％、22.5％、5.4％、0％、0％。
如上所述的可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌在酶解褐藻胶方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明的海生弧菌(Vibrio maritimus)来源于我国南北潮间带常见的食藻螺类，经我妻氏血琼脂平板验证无溶血性和潜在致病性。
2、本发明的海生弧菌(Vibrio maritimus)分离自单齿螺(Monodonta Labio)肠道内容物，通过我妻氏血琼脂平板验证无明显溶血现象，表面其不具有潜在致病性。本发明的海生弧菌生长周期短，是单齿螺肠道中的优势菌株，产生的褐藻胶裂解酶具有良好的热稳定性。
3、本发明海生弧菌可产具有良好热稳定性的褐藻胶裂解酶，25、30、35、40、45、50、55、60℃条件下相对酶活分别为60％、83.7％、91.8％、100％、92.6％、72.5％、39.4％、6.6％。可用于工业高温环境下褐藻胶的降解。在40℃下分别热处理5、15、30、60、90、120分钟后，相对酶活分别为97.3％、95.8％、91.1％、87.4％、79.1％、65.9％，在45℃下分别热处理5、15、30、60、90、120分钟后，相对酶活分别为91.1％、88.6％、78.4％、66.4％、44.3％、32.7％，可用于工业高温环境下褐藻寡糖的生产。
附图说明
图1为本发明中海生弧菌的细胞形态图和透明圈形态；其中，左图为菌株生长48小时透明圈形态图，右图为扫描电子显微镜菌株形态图；
图2为本发明中海生弧菌的我妻氏血琼脂平板溶血性鉴定图；
图3为本发明中海生弧菌的16S rDNA系统发育树图；
图4为本发明中海生弧菌在不同碳源条件下培养12h的相对生物量和相对酶活图；
图5为本发明中海生弧菌在不同氮源条件下培养12h的相对生物量和相对酶活图；
图6为本发明中海生弧菌在不同pH条件下培养12h的相对生物量和相对酶活图；
图7为本发明中海生弧菌在不同温度条件下培养12h的相对生物量和相对酶活图；
图8为本发明中海生弧菌在不同NaCl浓度条件下培养12h的相对生物量和相对酶活图；
图9为本发明中海生弧菌在最适条件下的生长曲线和产酶曲线图；
图10为本发明中海生弧菌所产褐藻胶裂解酶的最适温度图；
图11为本发明中海生弧菌所产褐藻胶裂解酶在不同温度下的热稳定性图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，所述海生弧菌的名称为：ML17，分类名称为：弧菌Vibrio sp.，保藏编号为：CGMCC No.20377，保藏日期：2020年7月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
较优地，所述海生弧菌分离自单齿螺(Monodonta Labio)肠道内容物，是单齿螺肠道中的优势菌株。
较优地，所述海生弧菌的菌落及菌体特征为：在添加海藻酸钠碳源的2216E培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘光滑，有光泽，菌落直径为0.6～0.8mm，培养基有明显凹陷圈和透明圈，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G-，菌体呈小短杆状或近球状，扫描电子显微镜观察其细胞形态，菌体呈短杆状或近球状，两端钝圆，为非典型弧菌。
较优地，所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液在40℃条件下通过DNS法测定褐藻胶裂解酶活性为26.31U/mL。
较优地，所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液分别在25、30、35、40、45、50、55、60℃条件下通过DNS法测定褐藻胶裂解酶相对活性分别为60％、83.7％、91.8％、100％、92.6％、72.5％、39.4％、6.6％。
较优地，所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液分别在40、45、50、55℃下热处理5、15、30、60、90、120分钟，通过DNS法测定褐藻胶裂解酶相对活性，40℃热处理后分别为97.3％、95.8％、91.1％、87.4％、79.1％、65.9％，45℃热处理后分别为91.1％、88.6％、78.4％、66.4％、44.3％、32.7％，50℃热处理后分别为83.3％、58.0％、50.8％、23.5％、11.9％、0％，55℃热处理后分别为69.7％、39.2％、22.5％、5.4％、0％、0％。
如上所述的可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌在酶解褐藻胶方面中的应用。
具体地，以下实施例分别从菌株的分离鉴定、安全性测定、在不同碳源、氮源、pH、温度、NaCl浓度条件下的相对生物量相对酶活、在不同温度下酶活测定、在不同温度处理条件下酶活测定等特性来说明本发明的技术方案，具体内容如下。
实施例1菌株的分离鉴定
以下实验均在无菌条件下操作。
1.菌株的富集
在无菌条件下，用小锤将外壳敲碎，取出螺体，用剪子挑出肠道部分，短暂浸入75％的乙醇中将表面消毒，加入装有100mL 2216E培养基的三角瓶中，28℃培养48h，将富集后的样品梯度稀释至10-7，分别取各梯度下的样品100μL均匀涂布至以海藻酸钠为唯一碳源的2216E培养平板上，28℃培养48h，观察菌落生长状况。
所述的2216E培养基的制备方法为：蛋白胨5g，酵母浸粉1g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.9g，硫酸镁3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸氢钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g，蒸馏水1L。
所述的2216E固体培养基的制备方法为：海藻酸钠5g，硫酸铵5g，琼脂粉15g，人工海水1L。
2.菌株的分离
挑取步骤1中形成透明圈或凹陷圈的菌落，初步分离得到可产褐藻胶裂解酶的菌株。
3.菌株的纯化
挑取步骤2中所得的菌落在2216E平板上进行划线分离纯化3次，得到单菌落。
4.粗酶活的测定
将纯化后的单菌落点接于以海藻酸钠为唯一碳源的2216E培养平板上，30℃培养48h，观察透明圈大小。
将纯化后的单菌落分别接种于2216E种子培养基中30℃培养12h，再将种子液以1％的接种量接种于2216E发酵培养基中，30℃培养24h，将菌液在4℃条件下8000rpm离心30min，取上清液，通过DNS法测定粗酶活。
所述的酶活测定体系为：400μL含1.5％NaCl的0.5％的海藻酸钠溶液，以上百分数均为质量百分数，加入100μL发酵上清液作为粗酶液，30℃反应20min，加入500μL DNS终止反应，混匀，沸水浴10min，流水冷却，在540nm处检测光吸收值。
得到透明圈最大和粗酶活最高的菌株ML-17，粗酶活为26.31U/mL。
5.菌株的鉴定
采用菌落PCR的方法进行目标菌株16srDNA验证，取40μL裂解液加入10μL菌液，沸水浴15min，混匀，以此为模板进行PCR扩增。以27F和1492R为引物，反应条件为：为94℃预变性1min，95℃变性45s，56℃下退火1min，72℃延伸1min，，共进行30个循环；再在72℃下延伸10min。将扩增成功的PCR产物测序后拼接得到DNA序列，使用NCBI的BLAST检索系统对序列同源性进行比对分析。选择与其相似性最高的已知菌株，对其相似性进行分析。使用MEGA7.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)建立系统发育树。结果如图3所示。证明本菌株是一种新型的海生弧菌。
对步骤3中获得的纯菌进行生理生化实验研究，菌株的菌落及菌体特征为：在添加海藻酸钠碳源的2216E培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘光滑，有光泽，菌落直径为0.6～0.8mm，培养基有明显凹陷圈和透明圈，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G-，菌体呈小短杆状或近球状，扫描电子显微镜观察其细胞形态，菌体呈短杆状或近球状，两端钝圆。结果如图1所示。证明本菌株为一种非典型弧菌。
用BLAST软件经同源性比较，结果见图2，结合菌落形态特征、细胞形态特征和16SrDNA基因序列结果，确定为乳杆菌属中的一株新的海生弧菌(Vibrio maritimus)，该菌株已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.20377，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2本发明海生弧菌最适生长条件的测定
分别将菌株接种于以海藻酸钠、葡萄糖、蔗糖、淀粉、木糖为唯一碳源的2216E培养基中，30℃培养12h，测定相对生物量分别为100％、54.15％、73.65％、92.5％、15.6％，相对酶活分别为100％、0％、37.6％、55.45％、2.25％。结果如图4所示。证明本菌株生长和产酶的最适碳源为海藻酸钠。
分别将菌株接种于以酵母提取物、胰蛋白胨、硫酸铵、氯化铵为唯一氮源的2216E培养基中，30℃培养12h，测定相对生物量分别为78.85％、100％、49.45％、40.85％，相对酶活分别为81.55％、100％、37.6％、60.55％、67.7％。结果如图5所示。证明本菌株生长和产酶的最适氮源为胰蛋白胨。
分别将菌株接种于pH5、6、7、8、9的2216E培养基中，30℃培养12h，测定相对生物量分别为12.25％、30.25％、75.35％、100％、31.65％，相对酶活分别为1.75％、29.95％、100％、74.75％、17.6％。结果如图6所示。证明本菌株生长最适pH为8，产酶最适pH为7。
分别将菌株接种于2216E培养基中，在15、20、25、30、35、40℃培养12h，测定相对生物量分别为31.9％、46.1％、76.1％、100％、34.9％、6.05％，相对酶活分别为24.6％、50.85％、66.85％、100％、46.15％、0％。结果如图7所示。证明本菌株生长和产酶的最适温度为30℃。
分别将菌株接种于含1％、2％、3％、4％、5％、6％NaCl的2216E培养基中，30℃培养12h，测定相对生物量分别为41.4％、78.45％、100％、49.95％、32.55％、4.3％，相对酶活分别为46.7％、85.45％、100％、49.95％、14.3％、0％。结果如图8所示。证明本菌株生长和产酶的最适NaCl浓度为3％。
在最适生长条件下测定菌株的生长曲线和产酶曲线。结果如图9所示。证明本菌株在12小时即可达到生长平台期，在14小时达到最高产酶量。
实施例3本发明海生弧菌的酶学性质测定
1.最适温度的测定
所述菌株在30℃下培养12h，对其上清液分别在25、30、35、40、45、50、55、60℃条件下通过DNS法测定褐藻胶裂解酶相对活性分别为60％、83.7％、91.8％、100％、92.6％、72.5％、39.4％、6.6％。结果如图10所示。证明本菌株所产的褐藻胶裂解酶在40℃达到最高酶活。
2.耐热能力的测定
所述菌株在30℃下培养12h，对其上清液分别在40、45、50、55℃下热处理5、15、30、60、90、120分钟，通过DNS法测定褐藻胶裂解酶相对活性，40℃热处理后分别为97.3％、95.8％、91.1％、87.4％、79.1％、65.9％，45℃热处理后分别为91.1％、88.6％、78.4％、66.4％、44.3％、32.7％，50℃热处理后分别为83.3％、58.0％、50.8％、23.5％、11.9％、0％，55℃热处理后分别为69.7％、39.2％、22.5％、5.4％、0％、0％。结果如图11所示。证明本菌株所产的褐藻胶裂解酶在40℃和45℃具有良好的热稳定性。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (7)

1.一株可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，其特征在于：所述海生弧菌的名称为：ML17，分类名称为：弧菌Vibrio sp.，保藏编号为：CGMCC No.20377，保藏日期：2020年7月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，其特征在于：所述海生弧菌分离自单齿螺(Monodonta Labio)肠道内容物，是单齿螺肠道中的优势菌株。
3.根据权利要求1所述的可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，其特征在于：所述海生弧菌的菌落及菌体特征为：在添加海藻酸钠碳源的2216E培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘光滑，有光泽，菌落直径为0.6～0.8mm，培养基有明显凹陷圈和透明圈，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G-，菌体呈小短杆状或近球状，扫描电子显微镜观察其细胞形态，菌体呈短杆状或近球状，两端钝圆，为非典型弧菌。
4.根据权利要求1所述的可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，其特征在于：所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液在40℃条件下通过DNS法测定褐藻胶裂解酶活性为26.31U/mL。
5.根据权利要求1所述的可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，其特征在于：所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液分别在25、30、35、40、45、50、55、60℃条件下通过DNS法测定褐藻胶裂解酶相对活性分别为60％、83.7％、91.8％、100％、92.6％、72.5％、39.4％、6.6％。
6.根据权利要求1所述的可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌，其特征在于：所述海生弧菌在30℃下培养12h，对其上清液分别在40、45、50、55℃下热处理5、15、30、60、90、120分钟，通过DNS法测定褐藻胶裂解酶相对活性，40℃热处理后分别为97.3％、95.8％、91.1％、87.4％、79.1％、65.9％，45℃热处理后分别为91.1％、88.6％、78.4％、66.4％、44.3％、32.7％，50℃热处理后分别为83.3％、58.0％、50.8％、23.5％、11.9％、0％，55℃热处理后分别为69.7％、39.2％、22.5％、5.4％、0％、0％。
7.如权利要求1至6任一项所述的可产具有良好热稳定性褐藻胶裂解酶的海生弧菌在酶解褐藻胶方面中的应用。
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