CN103695341A

CN103695341A - 一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法

Info

Publication number: CN103695341A
Application number: CN201310681404.7A
Authority: CN
Inventors: 史劲松; 刘旭梅; 许正宏; 李恒; 龚劲松; 蒋敏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Chengdu Yongan Yuanhe Biotechnology Co Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-16
Also published as: CN103695341B

Abstract

本发明属于生物技术领域。具体涉及从废料样品中筛选得到的一株海洋细菌Cobetiasp.WG-007及其分泌的褐藻胶裂解酶和该酶的制备方法。结合形态学及生理生化特性，该菌株属于Cobetia属，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7964。该菌株分泌褐藻胶裂解酶，通过超滤浓缩、Q-Sepharose强阴离子交换层析、PhenylSepharose6FastFlow疏水层析和Superdex-G100凝胶过滤技术对其纯化，获得电泳纯度的褐藻胶裂解酶，经SDS-PAGE确定该菌株产生的褐藻胶裂解酶的分子量为35.0KDa。

Description

一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及一种由海洋细菌Cobetiasp. WG-007分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法。

背景技术

褐藻胶又称褐藻酸，是由 β-D-甘露糖醛酸（mannuronate，M）和 α-L-古洛糖醛酸（guluronate，G）组成的直链多糖。褐藻胶主要来源于海藻、海带、马尾藻和巨藻等，其结构复杂，物化性质多样，被广泛应用到医药、食品级化妆品等行业。褐藻胶裂解酶是一类通过β -消去反应断裂褐藻胶的酶，因其具有专一、高效及反应温和等优点，被视为改造褐藻胶的有力工具。此外，褐藻寡糖不仅具有良好的抗肿瘤活性和抗凝活性,还可以作为植物的生长促进剂。褐藻寡糖的制备方法主要由化学降解法，物理降解法和酶解法。相对前两种降解方法，酶法降解条件温和，不易破坏寡糖的结构，并且酶解方法所需要的设备简单，污染小。

褐藻胶裂解酶可用于降解褐藻细胞壁，而这种酶在人体内是缺乏的，褐藻的细胞壁破损后，海藻的营养价值得到进一步的提高。另外，褐藻胶裂解酶还可用于降解菌膜及生产生物燃料。因此，筛选褐藻胶代谢新菌株，寻找不同类型的酶对开发高值化褐藻胶及褐藻寡糖产品具有重要意义。

发明人通过文献检索、查阅资料所知，迄今为止报道的产褐藻胶裂解酶的菌株主要包括海洋细菌，黄杆菌(Flavobacuterium multivolum)、固氮菌(Azobacter vinelandii)、芽胞杆菌(Bacillus circulans)等。专利公开了Pseudomonas sp.HZJ216菌株产生的褐藻胶裂解酶分子量为60.25 KDa，Vibrio sp. JG07-007产的褐藻胶裂解酶的分子量为34.6 KDa等，经检索未见有Cobetia属的细菌产生与其相同的褐藻胶裂解酶。

发明内容

本发明的目的提供一株新型的高产褐藻酸裂解酶的菌株Cobetia sp.WG-007,利用该菌株发酵可生产高活力的褐藻胶裂解酶。该菌株生长周期短，培养成分比较简单，是一株极具开发研究价值的褐藻胶裂解酶的生产菌株。

本发明的发明人从国内生产褐藻酸钠的化工厂的废料样品,分离筛选获得一株产褐藻酸裂解酶的新型菌株,并对这株菌进行了发酵研究。根据其形态特征和生理生化特性,将其鉴定为Cobetia属, 命名为Cobetia sp. WG-007，该菌于2013年07月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学研究院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.7964。

本发明提供的菌株WG-007的形态特征与生理生化特征为:

该菌株形态呈短杆状，端圆，单个排列。革兰氏染色红色，在平板上培养24 h后菌落呈现圆形，直径约为2-3 mm，表面光滑，湿润，边缘整齐，两面颜色一致，稍有隆起，颜色为米黄色。无鞭毛,无孢子形成。

生化特性：革兰氏染色为阴性，该菌株可在盐浓度为30%条件下生长，生长温度为15-40℃，但最适生长温度为25 ℃，最适的NaCl 浓度为6.0%。接触酶呈阳性,氧化酶呈阴性, M.R阳性，V.P反应为阴性,可利用葡萄糖，乳糖，甘露醇等;不能水解淀粉,及水解明胶;具有硝酸盐还原性等生理生化特性，见表1。

表1 Cobetiasp.WG-007菌株的生理生化特性

16S rDNA序列比对及系统发育分析: 菌株WG-007的16S rDNA基因全长在该菌株的16S rDNA基因的扩增过程中，扩增出的16S rDNA序列的长度为1508 bp，将该序列信息利用Blast软件在NCBI等数据库中进行同源性搜索，选取同源性高的典型菌株的16S rDNA序列作为参比对象。经同源性比较发现该菌株与Cobetia属的16S rDNA序列相似性为99％，可认为该菌株应属于Cobetia属，将其命名为Cobetia sp. WG-007。根据该菌株已知的生理生化特性查阅伯杰细菌鉴定手册和Cobetia属的相关文献，均与该属特有的生理生化特性相符合。该菌株的基因序列号已递交至GenBank Database,序列编号为KF545599。

本发明的另一个目的是提供一种由菌株WG-007发酵产生的褐藻胶裂解酶及其纯化方法。

本发明涉及的褐藻胶裂解酶的发酵方法包括以下几个步骤：

将保存的平板，挑取单菌落于种子培养基中，在28℃、150 rpm 条件下培养16 h 后，种子生长到对数期。种子培养基配方，海藻酸钠4.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L，酵母粉1.0 g/L, NaCl 25 g/L。将生长好的种子液按1.0% 的接种量转接到发酵培养基中，在相同条件下培养30 h后，得到发酵液。

发酵培养基的成分及配比为:褐藻酸钠6g/L,蛋白胨 5.0g/L, NaCl 20g/L,K₂HPO₄ 0.25g/L。琼脂粉18.0g/L;补充蒸馏水至1 L,灭菌前调培养基的pH至8.0-8.5,在121℃高温高压灭菌。摇瓶发酵条件 25℃，150 rpm/min,发酵培养30 h。装液量为30-50 mL。

褐藻胶裂解酶活性的检测

将培养好的发酵液在8000 rpm/min下离心20-30 min,收集上清,用DNS法测定还原糖的产量,从而计算出褐藻酸裂解酶的酶活力。

附图说明

图1 菌株Cobetia sp. WG-007在自制的发酵培养基中发酵生产褐藻胶裂解酶的结果。

图2 纯化的褐藻胶裂解酶SDS-PAGE电泳结果。M为标准蛋白分子量，泳道1为初始发酵液上清，泳道2为Cobetia sp. WG-007制备并经纯化的褐藻胶裂解酶。

具体实施方式

实施例1 ：菌株Cobetia sp. WG-007的分离

本发明从国内生产褐藻酸钠的化工厂取得土样与废料样品。以褐藻酸钠作为唯一碳源，来筛选高产褐藻胶裂解酶。称取1.0-1.5 g土样于不同浓度的褐藻酸钠的培养基中,25 ℃发酵培养40 h后,取200 μl稀释液涂布于筛选固体培养基上, 25 ℃培养16 -18 h后,挑取能在褐藻酸钠平板上生长的单菌落接种到新鲜的自制液体培养基中培养20 h后, 细胞液体培养物以1%(w/v) 接种量接于装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中, 在25 ℃,以150 r/min的转速振荡培养,40 h后收集发酵液, 8000-12000 r/min离心20-30 min除去菌体，收集上清,利用DNS法测定还原糖的产量,从而计算出褐藻酸裂解酶的酶活力。

实施例2：菌株Cobetia sp. WG-007的分子生物学鉴定

菌株WG-007接种于生长培养基中，培养30 h后，取部分发酵液体于1.5 mL无菌离心管中,采用细菌基因组快速抽提试剂盒抽提该细菌的基因组,并将该基因组作为模板扩增16S rRNA基因序列。PCR反应条件为: 94 ℃预变性5 min； 95 ℃变性45s, 55 ℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s; 30个循环后72 ℃后延伸10 min。

获得的PCR产物经割胶回收试剂盒(Axygen)纯化后与TA克隆载体连接,连接液转化感受态细胞后,挑取阳性克隆由生工生物工程(上海)有限公司测序。菌株WG-007的16S rDNA序列的长度为1508 bp，将该序列信息利用Blast软件在NCBI等数据库中进行同源性搜索，选取同源性高的典型菌株的16S rDNA序列作为参比对象。经同源性比较发现该菌株与Cobetia属的16S rDNA序列相似性为99％，可认为该菌株应属于Cobetia属。

实施例3：菌株WG-007的形态及生理学特性鉴定

该菌株形态呈短杆状，端圆，单个排列。革兰氏染色红色，在平板上培养24h后菌落呈现圆形，直径约为2-3mm，表面光滑，湿润，边缘整齐，两面颜色一致，稍有隆起，颜色为米黄色。无鞭毛,无孢子形成。生化特性：革兰氏染色为阴性，该菌株可在盐浓度为30%条件下生长，生长温度为15-40℃，但最适生长温度为25 ℃，最适的NaCl浓度为6.0%。接触酶呈阳性,氧化酶呈阴性, M.R阳性，V.P反应为阴性,可利用葡萄糖，乳糖，甘露醇等;不能水解淀粉,及水解明胶;具有硝酸盐还原性等生理生化特性。

实施例4：粗酶液的制备

(1)制备种子培养液，挑取固体自制培养基上的菌株WG-007一环,接种在装有50ml自制培养基的250 ml锥形瓶中,在25-28 ℃条件下,置于摇床上以200 r/min的转速培养20-24 h至对数生长期,即制得Cobetia sp. WG-007种子培养液。

(2)发酵培养基的成分及配比为:褐藻酸钠6.0 g/l,蛋白胨5-20 g/L, NaCl 20-30g/L, K₂HPO₄ 0.25g/L,琼脂粉18-20 g/l;补充蒸馏水至1.0 L,灭菌前调培养基的pH至8.0-8.5,在121℃高压蒸汽下灭菌20 min。

（3）超滤浓缩发酵液。选用Millipore的截留面积100cm²、截留分子量为10 kDa的Biomax膜包。超滤系统置放在4℃冷库中，将处理好的样品加入超滤容器，进样流速控制为50%，出口流速为20%，超滤浓缩发酵液得到粗酶液。

实施例5 褐藻胶裂解酶的纯化

选用阴离子交换层析。经过对平衡缓冲液的 pH 的条件摸索，洗脱液的最佳 pH 为 7.5。选用不同浓度的 NaCl 为洗脱液，对目标蛋白进行梯度洗脱。将离子交换收集到的样品进一步通过疏水层析。疏水层析特点是高盐上样，低盐洗脱。用1.0 M (NH₄)₂SO₄平衡柱子，然后用不同浓度的(NH₄)₂SO₄梯度洗脱目标蛋白。将疏水层析得到的样品透析除去(NH₄)₂SO₄，将透析液通过葡聚糖凝胶G-100纯化目的蛋白。先用 50 mM磷酸钠缓冲液平衡柱子3-4个柱体积至紫外280 nm吸收达到基线，控制流速1.0 ml/min上样，用平衡缓冲液淋洗3-4个柱体积至平衡，然后控制2.0 mol / L NaCl（pH 7.5）体积比30 %，即用0.6 mol / L NaCl（pH 7.5）洗脱，洗脱速度为0.4 ml/min。收集紫外280 nm处的出峰，并取样以备SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验。

酶分子量测定:用SDS-PAGE技术确定褐藻胶裂解酶的分子量，测定结果表明其分子量为35.0 KDa。

Claims

1.一株产褐藻胶裂解酶菌株WG-007，分类命名为Cobetia sp.，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学研究院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7964，保藏日期2013年07月22日。

2. 利用权利要求1所述的菌株WG-007发酵生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：摇瓶培养为250 mL 摇瓶装液量30-50 mL，培养温度25-28 ℃，转速150-220 r/min，培养16-18 h至对数期，得到种子液；种子培养基组成如下：褐藻酸钠5.0 g/L, 蛋白胨5.0 g/L, 酵母粉1.0g/L，NaCl 30 g/L，pH 为7.0；发酵罐培养为将种子液按1.0%-4.0%的接种量接种到发酵培养基中发酵；所用发酵培养基组成如下: 褐藻酸钠6.0 g/L, 蛋白胨5.0 g/L, NaCl 20 g/L, K₂HPO₄ 0.30 g/L，pH 为8.0-8.5。

3. 利用权利要求2所述的的发酵液进行褐藻胶裂解酶的纯化制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：首先进行阴离子交换层析，将离子交换收集到的样品进通过一步疏水层析，高盐上样，低盐洗脱，用不同浓度的(NH₄)₂SO₄梯度洗脱目标蛋白，透析除去(NH₄)₂SO₄，透析液过葡聚糖凝胶G-100纯化目的蛋白，其分子量为35.0 KDa。