CN112210515A - 产褐藻胶裂解酶菌株、褐藻胶裂解酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及产褐藻胶裂解酶菌株、褐藻胶裂解酶及其应用。本发明提供了一种产褐藻胶裂解酶菌株HB182678，该菌株的分类为红树林球菌属(Mangrovicoccus)，该菌所产的褐藻胶裂解酶具有较广泛的pH稳定性。本发明还提供了一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，以及上述菌株HB182678和褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用，具有良好的应用前景。

Description

产褐藻胶裂解酶菌株、褐藻胶裂解酶及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及产褐藻胶裂解酶菌株、褐藻胶裂解酶及其应用。
背景技术
褐藻酸是由古罗糖醛酸(guluronic acid，G)及甘露糖醛酸(mannuronic acid，M)通过β-1,4糖苷键连接形成的线性高分子，是褐藻细胞壁的主要成分，广泛存在于海带、马尾藻、巨藻等褐藻细胞中。通过酶法降解制备的褐藻寡糖具有多种生理活性，如促生长、增强免疫、神经保护、抗炎、抗病毒等，在食品、药品、农业、保健品、化妆品等领域具有广泛的应用价值。酶解法反应条件温和、效率高、底物专一性强，不会产生对人体和环境有害的副产物，逐渐成为工业降解褐藻胶生产褐藻寡糖的主要手段。
褐藻胶裂解酶是多糖裂解酶的一种，可通过β-消除反应将褐藻胶降解为在非还原端具有双键的不饱和寡糖。根据底物特异性，褐藻胶裂解酶可分为G 嵌段特异性裂解酶(poly G)、M嵌段特异性裂解酶(polyM)及MG嵌段的双功能褐藻胶裂解酶(polyMG)。褐藻胶裂解酶来源广泛，已经从多种海洋动物、海洋和陆地微生物体内分离得到，海洋细菌是褐藻胶裂解酶的重要来源，如假单胞菌、黄杆菌、交替假单胞菌、弧菌、芽胞杆菌等。
目前报道的产酶细菌依然存在着酶活性较低、降解位点单一等缺陷，限制了褐藻胶裂解酶以及酶解法制备褐藻寡糖的发展。因此，筛选高效降解褐藻胶的新型菌种资源，是开发褐藻胶资源，探索高值化利用新途径的必然要求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了产褐藻胶裂解酶菌株及其应用。该菌株 HB182678及其发酵制得的褐藻胶裂解酶能够用于降解褐藻。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.，其保藏编号为GDMCCNo.61000。
基于上述研究，本发明还提供了所述产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.在制备褐藻胶裂解酶中的应用。
本发明还提供了所述产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.在降解褐藻中的应用。
本发明还提供了所述产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.发酵制得的褐藻胶裂解酶。
本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。
此外，本发明还提供了制备褐藻胶裂解酶的方法，采用所述产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.，发酵制得褐藻胶裂解酶。
在本发明的一些具体实施方案中，包括以下步骤：
步骤1、菌株活化：将所述的产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.接种于固体培养基，于28～37℃培养24～48h，得活化的菌株；
步骤2、液体培养：将所述活化的菌株接种于液体种子培养基中，于 28～37℃、120～200r/min振荡培养12～24h，制成种子液；
步骤3、发酵培养：将所述种子液接种于液体发酵培养基中，于28～37℃、 150～200r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶的粗酶液，纯化获得褐藻胶裂解酶。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述固体培养基包括海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，琼脂粉 18～20g/L，pH 6.5～8.0。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述液体种子培养基包括海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，pH 6.5～8.0；步骤2中所述接种为：将菌体从平板上刮下一环，接种到装有30mL 种子培养基的摇瓶中，28～37℃、120～200r/min振荡培养，使OD600控制在 0.8～1.2之间。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述液体发酵培养基包括海藻酸钠5～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，三水合磷酸氢二钾0.5～2g/L，七水合硫酸镁0.1～0.4g/L，pH 6.5～8.0；所述种子液接种浓度为OD600＝0.05。
本发明提供了一种产褐藻胶裂解酶菌株HB182678，该菌株的分类为红树林球菌属(Mangrovicoccus)，保藏号为GDMCC No.61000，保藏日期为2020 年4月17日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所。该菌所产的褐藻胶裂解酶具有较广泛的pH稳定性。本发明还提供了一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，以及上述菌株HB182678和褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用，具有良好的应用前景。
生物保藏说明
生物材料Mangrovicoccus sp.HB182678，分类命名：Mangrovicoccus sp. 于2020年4月17日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.61000。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明所述菌株HB182678的电镜照片；
图2示本发明所述菌株HB182678的基于16S rDNA的系统发育树；
图3示不同pH值对本发明所述菌株HB182678产生的粗酶液酶活力的影响。
具体实施方式
本发明公开了产褐藻胶裂解酶菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于提供一种红树林球菌属(Mangrovicoccus)菌株 HB182678，该菌株能够有效降解褐藻胶，还可作为一种新的褐藻胶裂解酶产生菌，也可直接用于褐藻生物降解的微生物资源。
本发明的目的还在于提供一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，该褐藻胶裂解酶能有效降解褐藻胶，且工艺成熟。
本发明的第三个目的在于提供上述红树林球菌属(Mangrovicoccus)菌株HB182678及褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐藻胶裂解酶产生菌株HB182678，该菌株的分类命名为红树林球菌(Mangrovicoccus sp. HB182678)，保藏号为GDMCC No.61000，保藏日期为2020年4月17日，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
本发明所述的红树林球菌HB182678是从海南琼海近海海域采集的褐藻样品中分离筛选得到。经微生物多相分类鉴定，鉴定菌株HB182678属于细菌域、变形菌门、α变形菌纲、红细菌目、红杆菌科、红树林球菌属的新种，暂命名为Mangrovicoccus sp.HB182678。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐藻胶裂解酶，采用上述的红树林球菌HB182678GDMCC No.61000发酵制得。
上述的褐藻胶裂解酶的制备方法，优选包括以下步骤：
(1)菌株活化：将上述的红树林球菌HB182678接种于固体培养基，于 28～37℃培养24～48h，得活化菌株；
(2)液体培养：从已纯化的平板中，挑取一环菌体接入液体种子培养基中，于28～37℃、120～200r/min振荡培养12～15h至对数生长期，制成种子液；
(3)发酵培养：将种子液接种于液体发酵培养基中，于28～37℃、150～200 r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，8000r/min离心10min，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液。
在该褐藻胶裂解酶的制备方法中：
步骤(1)中所述的固体培养基配方为：海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10 g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，琼脂粉18～20g/L，pH 6.5～8.0，以蒸馏水配制。
步骤(2)中所述的液体种子培养基组成为：海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，pH 6.5～8.0，以蒸馏水配制。
步骤(3)中所述的液体发酵培养基组成为：海藻酸钠5～12g/L，蛋白胨 2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，三水合磷酸氢二钾0.5～2g/L，七水合硫酸镁0.1～0.4g/L，pH 6.5～8.0，以蒸馏水配制。
本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的红树林球菌HB182678以及褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。褐藻包括海带、马尾藻等褐藻种类。
本发明提供的产褐藻胶裂解酶菌株及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1产酶菌株HB182678 GDMCC No.61000的分离筛选
褐藻样品采集于海南省琼海市近海海域。取10g样品，剪碎、溶浆，稀释成10-3～10-6的悬液，吸取系列悬液0.1mL，涂布于褐藻胶裂解酶分离培养基，置于30℃培养箱倒置培养2～5d。待菌落长出时，根据菌落形状、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等表型特征，挑取生长好、形态不同的菌落进行划线纯化。
对分离获得的菌株进行褐藻胶裂解酶活力测定，筛选出酶活性较强的菌株HB182678。
具体过程如下：
挑取待检测菌株点接到褐藻胶裂解酶活性检测培养基上，30℃培养2～3 d。待平板上长出明显的菌落后，测量菌落直径(d)。在平板中加入1mol/L的 CaCl2溶液，静置30～60min。待平板上显现出酶解圈后，测量酶解圈直径(D)，以酶解圈直径和菌落直径的比值(D/d)作为初筛指标。
其中菌株HB182678的酶解圈直径达到25mm，D/d值为9，活性明显。
所用培养基配方如下：
褐藻胶裂解酶分离培养基：海藻酸钠5g，酵母粉1g，蛋白胨5g，磷酸高铁0.01g，NaCl 20g，琼脂18g，以蒸馏水定容至1L，pH 7.6。
褐藻胶裂解酶活性检测培养基：海藻酸钠5g，(NH4)2SO45 g，K2HPO4 2 g，NaCl 20g，MgSO4·7H2O 1g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂18g，以蒸馏水定容至1L，pH 7.6。
实施例2红树林球菌HB182678 GDMCC No.61000的鉴定
菌株HB182678 GDMCC No.61000在2216E琼脂培养基上生长良好，培养2d后可见清晰菌落，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑凸起，直径2～4mm。电镜下观察，细胞呈椭球形，长宽约为1.3-2.0μm×1.2-1.5μm，无鞭毛。革兰氏染色呈阴性。
通过PCR扩增、转化、测序获得HB182678的16S rDNA序列1425bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。将该序列与EzBioCloud数据库中的序列进行比对，发现菌株HB182678与Mangrovicoccus ximenensis Tlg56T同源性最高(96.3％)。选择同源性高的相关菌株，利用软件MEGA7.0采用 Neighbor-joining法构建系统发育树(图2)，可以看出，菌株HB182678与 Mangrovicoccus ximenensis Tlg56T处于同一分支上，二者亲缘关系较近。比较二者的基因组平均核苷酸相似性ANI值，仅为83.5％，小于国际细菌系统分类学委员会规定的95％的种的界限。
比较两株菌的形态学、生理生化与分子特征，鉴定本发明中的菌株 HB182678(GDMCC No.61000)为Mangrovicoccus(红树林球菌)属的一个新种，暂命名为Mangrovicoccus sp.HB182678。
该菌株已于2020年4月17日在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC) 进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为GDMCC No.61000。保存地址为广州市先烈中路100号大院59号楼广东省微生物研究所。
实施例3褐藻胶裂解酶及其制备方法
本发明中的褐藻胶裂解酶是由实施例1中的保藏编号为GDMCC No.61000的Mangrovicoccus sp.HB182678发酵制成的，具体方法包括以下步骤：
(1)菌株活化：将实施例1中的红树林球菌HB182678接种于固体培养基，于30℃培养48h，得活化菌株；
(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于30℃、180r/min 振荡培养12～18h，制成种子液；使OD600控制在0.8～1.2之间；
(3)发酵培养：将种子液接种于液体发酵培养基中，于30℃、180r/min 振荡培养40h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液；所述种子液接种浓度为OD600＝0.05。
步骤(1)中的固体培养基组成为：海藻酸钠5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，氯化钠20g/L，琼脂粉18g/L，pH 7.0，以蒸馏水配制。
步骤(2)中的液体种子培养基为：海藻酸钠3g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉1.5g/L，氯化钠20g/L，pH 7.0，以蒸馏水配制。
步骤(3)中的液体发酵培养基为：海藻酸钠7g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉1.5g/L，氯化钠20g/L，三水合磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L， pH 7.0，以蒸馏水配制。
实施例4褐藻胶裂解酶酶活测定
采用紫外吸收法进行褐藻胶裂解酶酶活力测定。过程如下：
收集发酵液，离心，以实施例3中的发酵上清液作为粗酶液。
取1.8mL底物(3.0g海藻酸钠溶于1L 50mM pH7.0磷酸盐缓冲液)于 40℃预热5min，加入0.2mL待测粗酶液，40℃温浴10min，以灭活的酶液体系为空白对照，测定反应体系在OD235下的紫外吸收值。定义在上述酶活测定方法下OD235紫外吸收值每分钟增加0.01的酶量为酶的一个活力单位(1 U)。
结果显示，菌株HB182678发酵40h时褐藻胶裂解酶酶活力最大，为132.2 U/mL。
表1不同发酵时间对菌株HB182678产酶活力的影响
Figure BDA0002726437970000071
实施例5褐藻胶裂解酶的最适pH及pH稳定性
实验1：配制50mM不同pH值的缓冲液[[Na2HPO4-citric acid buffer(pH 3～7)、Tris-HCl buffer(pH 8～9)、NaHCO3-NaOH(pH 10)]。在4℃条件下，将实施例4中收集的粗酶液在不同pH值(3、4、5、6、7、8、9、10)条件下保持24h后，分别测定褐藻胶裂解酶剩余活性，确定该酶稳定性大小。定义最适pH下测得的酶活力为100％。
实验2：测定粗酶液在含海藻酸钠3g/L的50mM的不同缓冲液中的酶活力，确定该酶最佳反应pH值。定义最佳pH下测得的酶活力为100％。
结果显示，粗酶液在pH为5～8条件下4℃保持24h，剩余酶活力均达到 85％以上，pH4和pH9时酶活力仍达到70％以上，可见该酶具有较广泛的pH 稳定性。
粗酶液在pH 8时反应酶活性最高，在pH 6～8区间内酶反应活性在80％以上，pH7时剩余酶活力最高。
表2 pH值对本发明所述菌株HB182678产生的粗酶液酶活力的影响
Figure BDA0002726437970000081
实施例6 Mangrovicoccus sp.HB182678对褐藻藻体的降解
将海带(Laminaria japonica)、马尾藻(Sargassum oligocystum)浸泡4～5h，清洗干净，剪成1cm×1cm的小块，分别加入250mL锥形瓶中，并加入适量无机盐水溶液，其成份是：(NH4)2SO4 5 g，K2HPO4 2 g，NaCl 20g，MgSO4·7H2O 1g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1L，pH7.5。得到含有不同种类的褐藻培养液。
接入按实施例3制备的Mangrovicoccus sp.HB182678种子液，接种浓度为OD600＝0.1。180rpm，30℃培养，观察培养基的浑浊度及海藻形状的变化。
观察发现，随着培养时间的延长，12h时海藻逐渐溶解，无色培养液颜色逐渐加深变为褐色，溶液开始变浑浊，海带、马尾藻固体重量分别剩余83.7％、 91.6％，；24h时海藻块变小，碎屑增多，溶液浊度加深，变得不透明，海带、马尾藻固体重量分别剩余55.9％、62.3％；48h时海藻完全被降解，溶液变为浊液，海带、马尾藻固体藻块完全消失。这表明菌株HB182678能在短时间内高效降解海带和马尾藻，是褐藻资源化利用的优势菌种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 产褐藻胶裂解酶菌株、褐藻胶裂解酶及其应用
<130> MP2019526
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat catggctcag aacgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
gaacccttcg gggttagcgg cggacgggtt agtaacgcgt gggaacgtgc ccaaaggtag 120
ggaatagcct cgggaaactg agagtaatac cctatgtgcc cttcggggga aagatttatc 180
gcctttggat cggcccgcgt tagattaggt agttggtggg gtaatggcct accaagccta 240
tgatctatag ctggtttgag aggatgatca gcaacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagtg gggaatcttc ggcaatgggc gcaagcctga ccgagccatg 360
ccgcgtgagc gatgaaggcc ctagggttgt aaagctcttt cgccagggat gataatgaca 420
gtacctggta aagaaacccc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggaggggg 480
ttagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggaccgga aagttggggg 540
tgaaatcccg gggctcaacc ccggaactgc cttcaaaact ctcggtctgg agttcgagag 600
aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg aacaccagtg 660
gcgaaggcgg ctcactggct cgatactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca 720
ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gccagtcgtc gggttgcatg 780
caattcggtg acacacctaa cggattaagc attccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt 840
aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 900
gcaacgcgca gaaccttacc aacccttgac atcctcggac cgtcccagag atgggtcttc 960
cacttcggtg gccgagtgac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020
tcggttaagt ccggcaacga gcgcaaccca cacccttagt tgccagcagt tcggctgggc 1080
actctagggg aactgccgat gataagtcgg aggaaggtgt ggatgacgtc aagtcctcat 1140
ggcccttacg ggttgggcta cacacgtgct acaatggcag tgacaatggg ttaatcccaa 1200
aaagctgtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gaatcgctag 1260
taatcgcgta acagcatgac gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1320
acaccatggg agttggttct acctgacggc cgtgcgctaa cccctcgggg gggcagcgga 1380
ccacggtagg atcagcgact ggggtgaagt cgtaacaagg taacc 1425

Claims (10)

1.产褐藻酸裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.，其特征在于，其保藏编号为GDMCCNo.61000。
2.如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.在制备褐藻胶裂解酶中的应用。
3.如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.在降解褐藻中的应用。
4.如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.发酵制得的褐藻胶裂解酶。
5.如权利要求4所述的褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。
6.制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.，发酵制得褐藻胶裂解酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、菌株活化：将如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶菌株Mangrovicoccus sp.接种于固体培养基，于28～37℃培养24～48h，得活化的菌株；
步骤2、液体培养：将所述活化的菌株接种于液体种子培养基中，于28～37℃、120～200r/min振荡培养12～24h，制成种子液；
步骤3、发酵培养：将所述种子液接种于液体发酵培养基中，于28～37℃、150～200r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶的粗酶液，纯化获得褐藻胶裂解酶。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1中所述固体培养基包括海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，琼脂粉18～20g/L，pH 6.5～8.0。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2中所述液体种子培养基包括海藻酸钠3～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，pH 6.5～8.0；步骤2中所述接种为：将菌体从平板上刮下一环，接种到装有30mL种子培养基的摇瓶中，28～37℃、150～200r/min振荡培养，使OD600控制在0.8～1.2之间。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤3中所述液体发酵培养基包括海藻酸钠5～12g/L，蛋白胨2～10g/L，酵母粉0.5～4g/L，氯化钠10～30g/L，三水合磷酸氢二钾0.5～2g/L，七水合硫酸镁0.1～0.4g/L，pH 6.5～8.0；所述种子液接种浓度为OD600＝0.05。
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