CN104498412B - 一种能降解琼脂的柯恩氏菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能降解琼脂的柯恩氏菌。通过从土壤中筛菌获得一株能够降解琼脂的细菌，经16s rDNA鉴定该菌为柯恩氏菌，命名为Cohnella sp.LGH。该琼脂降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.10018，保藏日期为：2014年11月20日。该菌可在工业上用于降解琼脂，制备新琼寡糖。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种能降解琼脂的柯恩氏菌。
技术背景
琼脂是从红藻类海藻中提取的一类天然多糖物质。得益于其稳定性，在食品工业上琼脂作为增稠剂、稳定剂、悬浮剂、凝固剂和乳化剂等使用，是工业用途最为广泛的海藻胶之一。在我国琼脂的生产主要来源于江篱。琼脂是由具有凝胶性质的琼脂糖(agarose)和非凝胶性质的琼脂胶(agaropectin)构成的混合物，并以琼脂糖为主。琼脂糖的化学构成是由β-D-半乳糖和3,6-内醚-α-L-半乳糖等组成的链状线性聚合物，其中硫酸基的含量低于0.15％。琼脂胶的结构与琼脂糖相似，但3,6-内醚-α-L-半乳糖上的羟基被硫酸基、甲氧基、丙酮基等基团替代。
新琼寡糖是琼脂经琼脂酶水解后形成聚合度为2～20的海洋功能性低聚糖，主要由琼脂二糖的重复单位连接而成。琼脂粘度高，不溶于水，难以分解利用，新琼寡糖则有很好的水溶性，易于人体吸收利用。随着研究的不断进展和深入，人们逐渐发现新琼寡糖具有很多有意义的生理功能特性。新琼寡糖具有抗癌症，抗炎症，抗病毒，抗氧化，抗龋齿，预防糖尿病，增殖肠道益生菌和美白保湿等生理功能。这表明新琼寡糖在医用药物，保健品，功能饲料和化妆品等方面有着很好的应用前景。
目前获得新琼寡糖的主要方法有酸解法和酶解法，而酸解法存在污染大和效率低等缺点，酶解法有着效率高，污染小和反应条件温和等优势，代替酸解法是未来的趋势。本发明通过土壤细菌的分离和筛选获得一株具有琼脂降解能力的菌株，可在工业上用于降解琼脂，制备新琼寡糖。
发明内容
本发明目的是提供一株能降解琼脂的新型菌株，为工业降解琼脂，制备新琼寡糖提供方法。
本发明的目的可以通过以下的技术方案实现：
一株琼脂降解菌LGH，分类命名为柯恩氏菌(Cohnella sp.)，于2014年11月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.10018。
本发明琼脂降解菌LGH，菌落圆形，略微发红，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，在LB平板上划线培养能看到明显的凹陷，革兰氏染色阳性。
本发明琼脂降解菌LGH，经透射电子显微镜观察可知，该菌大小约为0.8μm×2.5μm，周生鞭毛。
本发明琼脂降解菌LGH，经16SrDNA测序及同源性比较，得到与其最相近的种属是柯恩氏菌属Cohnella sp.，16s rDNA已提交至NCBI，GenBank登录号为1771374。
本发明琼脂降解菌LGH，经培养后有琼脂酶活性，通过DNS法可检测到琼脂糖被降解成具有还原性的低聚糖。
有益效果：
本发明筛选到一株能降解琼脂的柯恩氏菌属菌株LGH，该菌株能够降解琼脂生成琼脂寡塘，为工业化制备琼脂寡糖提供菌株资源。
附图说明
图1为平板培养基上的琼脂降解菌LGH菌落形态照片；
图2为琼脂降解菌LGH透射电子显微镜观察图；
图3为不同初始pH对琼脂降解菌LGH生长的影响；
图4为不同温度对琼脂降解菌LGH生长的影响；
图5为不同Nacl浓度对琼脂降解菌LGH生长的影响；
图6为不同碳源对琼脂降解菌LGHH的影响；
图7为不同氮源对琼脂降解菌LGHH生长的影响；
图8为不同碳氮比对琼脂降解菌LGH的影响；
图9为不同通气量对琼脂降解菌LGH生长的影响；
生物材料保藏信息
琼脂降解菌LGH，分类命名为柯恩氏菌Cohnella sp.，于2014年11月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC NO.10018。
具体实施方式
实施例1：筛选琼脂降解菌
初筛：将南京麒麟镇采集土样称取10g土壤样品，放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，振荡约20min，使土样和无菌水充分混匀，得到土壤悬浮液。用灭菌的枪头吸取1ml悬液，加入到盛有9ml无菌水的试管中反复吹打使溶液充分混匀，以此类推采用梯度稀释的方法，选取10-3、10-4、10-53个梯度吸取稀释液0.1ml涂布于LB平板，30℃培养，观察平板的凹陷情况，初步挑取具有降解琼脂能力的菌株。
复筛：将挑选的菌株进行梯度稀释，挑取降解能力好单菌落培养，用以琼脂为唯一碳源的培养基多次划线纯化。培养基配方：NaCl1g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，(NH4)2SO42g，MgSO40.2g，CaCl20.2g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
卢戈氏碘液验证：将卢戈氏碘液滴加在长有琼脂降解菌的平板上，观察菌体周围是否出现透明圈。透明圈越大说明降解能力越好，挑取降解能力强的菌株于-70℃保存菌株。
通过上述方法筛选得到琼脂降解菌LGH。用高盐法提取琼脂降解菌LGH的总DNA，PCR获得16s rDNA，由南京思普金测序公司测序获得序列信息，在NCBI上利用Blast在GenBank中与其它的16SrDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与琼脂降解菌LGH的序列。使用MEGA5.2软件构建琼脂降解菌LGH的16S rDNA系统进化树，根据该菌株的生理生化特征，鉴定为柯恩氏菌。将该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2014年11月20日，保藏编号为CGMCC NO.10018。
实施例2：琼脂降解菌LGH的优化培养条件
本实验的培养基基于LB培养基优化。
LB培养基：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏5g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
检测不同pH，温度，NaCl浓度，碳源，氮源，碳氮比，通气量同琼脂降解菌LGH的生长影响
所选不同pH：4，5，6，7，8，9，10(图3)；
所选不同温度：22℃，25℃，28℃，30℃，33℃，37℃，40℃，45℃(图4)；
所选不同NaCl浓度：0，0.5％，1％，2％，3％，5％，10％(图5)；所选不同碳源：乳糖，可溶性淀粉，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，甘露醇，甘油(图6)；
所选不同氮源：(NH4)2SO4，KNO3，尿素，蛋白胨(图7)；
所选不同碳氮比：1/1，1/2，1/5，1/10，1/15(图8)；
所选不同通气量：250ml三角瓶中培养基含量为25ml，50ml，75ml，100ml，125ml(图9)。
得到琼脂降解菌LGH最佳生长条件:初始pH8.0，温度30℃，NaCl浓度1％，碳源：蔗糖，氮源：(NH4)2SO4，最适碳氮比为1/5。
得到优化培养基配方：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏5g，蔗糖20g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
实施例3
培养基配方
改良LB培养基：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏5g，蔗糖20g，琼脂15g溶于1L纯水，121℃灭菌20min。
无机盐培养基：Nacl 1g，K2HPO41.5g，KH2PO40.5g，(NH4)2SO42g，MgSO40.2g，Cacl20.2g，琼脂糖2g溶于1L纯水，121℃灭菌20min.用接种环挑取琼脂降解菌LGH至改良LB培养基中，培养18h，30℃，180r·min-1，即为种子液。
分别以接种量为2％(v/v)接种到含100ml改良LB培养基和无机盐培养基的500ml三角瓶中，培养24h，30℃，180r·min-1。
分别将上述培养液于离心管中，12000g离心10min，用10ml，pH7.0，浓度为20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液重悬菌体，置于超声细胞破碎仪中破壁12min，14000g离心15min，弃去沉淀，所得上清即为粗酶液。
取100μl粗酶液与300μl 0.2％的琼脂糖混合，50℃水浴反应10min后加入400μlDNS试剂终止反应，沸水浴10min，稀释4倍后于OD540nm处检测，酶活定义为：每毫升粗酶液1min产生1μmol还原糖所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)，以灭活的酶液作为空白对照。
取1ml粗酶液用考马斯亮蓝比色法测定粗酶液的总蛋白含量。计算比酶活。改良LB培养基的比酶活为2.23U/mg，无机盐培养基的比酶活为24.21U/mg。
Claims (6)
1.琼脂降解菌LGH，分类命名为柯恩氏菌（Cohnella sp.），于2014 年11月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO.10018。
2.权利要求1所述琼脂降解菌LGH在制备琼脂酶中的应用。
3.一种利用权利要求1所述琼脂降解菌LGH制备琼脂酶的方法，其特征在于将权利要求1所述的琼脂降解菌LGH在无机盐培养基中培养，培养结束的上清液即为含琼脂酶的粗酶液；所述的无机盐培养基配方为 Nacl 1g/L, K2HPO4 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，(NH4)2SO42g/L, MgSO4 0.2g/L，Cacl2 0.2g/L，琼脂糖2g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的培养条件为30~40℃培养24~36h。
5.权利要求1所述的琼脂降解菌LGH在降解琼脂中的应用。
6.权利要求1所述的琼脂降解菌LGH在制备新琼寡糖中的应用。
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