CN105154352B

CN105154352B - 一种海洋微生物菌株Y112及其产α-环糊精葡萄糖基转移酶

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Publication number: CN105154352B
Application number: CN201510439521.1A
Authority: CN
Inventors: 孙谧; 郝建华
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2015-07-23
Filing date: 2015-07-23
Publication date: 2018-07-13
Anticipated expiration: 2035-07-23
Also published as: CN105154352A

Abstract

本发明涉及一种产α‑环糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112及其产的酶,经过16S rDNA序列分析结合其生理生化特征，该菌株为芽孢杆菌属,测序得到16S rDNA序列长度为1420bp左右，碱基组成如图1。在医药、食品、化工、化妆品、工业和农业以及分析化学等方面得到广泛的应用。

Description

一种海洋微生物菌株Y112及其产α-环糊精葡萄糖基转移酶

技术领域

本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及一种海洋微生物菌株Y112及其产的α-环糊精葡萄糖基转移酶。

背景技术

环糊精(cyclodextrin，缩写CD)是由α-1,4-糖苷键相连而成的，环状的，无还原端的麦芽低聚糖。环糊精通常由6、7或8个葡萄糖残基组成，分别被称为α-、β-、或γ-环糊精。除了这三种常用的环糊精外，还有δ-、ε-、ζ-和η-环糊精(分别由9～12个葡萄糖单元组成)。环糊精具有能够将多种化学物质全部或部分封装入空腔内的能力，从而改变了这些化合物的物理和化学性质。环糊精是由环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉转化而成，主要产物为α-、β-、γ-环糊精的混合物。由于环糊精分离提纯工艺非常复杂，因此寻找能催化产生特定环糊精的CGTase的产生菌非常重要。目前，研究报道主要集中在β-CGTase产生菌株上，而有关α-、γ-CGTase产生菌的研究报道却很少。几乎很少有主要产α-或γ-环糊精的CGTase报道。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis No.313、嗜碱芽孢杆菌Bacillus strain290-3、芽孢杆菌Bacillus sp.AL-6和短杆菌Brevibacterium sp.No 9605是目前已知的产γ-CGTase的菌株。

目前环糊精的制备主要是采用酶法合成的，而酶法制备会产生多种环糊精的混合物，不利于生产单一环糊精及分离纯化，这极大限制了环糊精的应用。因此，寻求一种能够生产特定单一α-环糊精α--CGTase的生产菌，克服目前酶法制备产生多种环糊精混合物,降低环糊精生产成本,成为当今世界开发产酶菌,促进环糊精在医药、食品、化工、化妆品、工业和农业以及分析化学等方面得到广泛的应用关注的焦点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术酶法产生多种环糊精的混合物的不足,经发明人长期开发研究海洋微生物及其酶产物和生产实践,开发提供一种产单一α-环糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112及其产的α-环糊精葡萄糖基转移酶。

本发明提供一种产单一α-环糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112(简称菌株Y112)来自黄海海域,将得到的序列用GenBank中的BLAST进行比对分析。测序得到长度约1420bp左右的16S rDNA序列，碱基组成如图1。采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树如图2，结果表明菌株Y112与Bacillus属成员具有较高的序列相似性，因此属于芽孢杆菌属。同时菌株Y112与Bacillus agaradhaerens DSM8721的同源性达100％，说明菌株Y112与DSM8721亲缘性很近。经过16S rDNA序列分析结合其生理生化特征，该菌株被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。该产α-CGTase的海洋微生物菌株Y112于2015年7月13日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M2015447。

海洋微生物菌株Y112的形态和生理生化特征：

菌株Y112的形态特征：

菌株Y112为不规则短杆状，革兰氏阳性，菌落在琼脂培养基上呈现圆形，乳白色，表面平坦、边缘不整齐。

菌株Y112生理生化特征：

菌株Y112能在pH 8.0-11.0的条件下生长，最适生长pH为10；生长的温度范围为10-45℃，最适生长温度33℃；最高能耐受16wt％的NaCl，在含有5％wtNaCl条件下生长量最高。菌株Y112能够分解淀粉、明胶、Tween 40或Tween 60，不能分解Tween 20。氧化酶、过氧化酶或硝酸盐还原结果为阳性，硫化氢、吲哚产生试验结果为阴性。菌株Y112还能够利用精氨酸、柠檬酸、尿素或蔗糖，不能利用赖氨酸、鸟氨酸、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李醇或阿拉伯糖。

菌株Y112-16S rDNA的PCR扩增和序列分析：

对菌株Y112的16S rDNA序列进行PCR扩增，测序得到长度约1420bp左右的16SrDNA序列，碱基组成如图1。

一、产α-CGTase的海洋微生物菌株Y112的选育与鉴定：

1、粗酶液的制备

在装种子培养基液30mL的三角瓶中接种海洋微生物菌株Y112后，30℃、200r/min下活化22h，以4％(V/V)的接种量接种至装有25mL发酵培养基的三角瓶中，27℃、230r/min培养50h，收集发酵液在10000g的离心力条件下离心15min，上清为粗酶液。所述种子培养基的组成：每升培养基含可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O0.15g，NaCl 50g，121℃灭菌20min。所述发酵培养基的组成：每升培养基含玉米淀粉10g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，NaCl 50g混合均匀，121℃灭菌20min；

本发明中酶活的测定采用甲基橙褪色法。该酶活单位定义为上述条件下生成1μgα-环糊精所需的酶量

生物量的测定：采用比浊法测定生物量。

2、α-环糊精葡萄糖基转移酶产生菌的选育

1)、产CGTase的菌株筛选：

在碱性的琼脂培养基上添加0.03％(w/v)酚酞和0.01％(w/v)甲基橙作为活性筛选平板，将活化后的能够产淀粉水解酶的海洋微生物，稀释涂布于发酵复筛活性筛选平板上，30℃观察培养60h。在产CGTase的菌株形成黄色透明的水解圈。这是由于菌株所产的CGTase能够降解培养基中的可溶性淀粉形成环糊精，后者能够包埋甲基橙或酚酞，使其呈现黄色。此圈越大，菌株产的CGTase越多，选取透明圈与菌落直径比值较大的单菌落，接种到产酶培养基中进行摇瓶发酵复筛，测定其发酵液的α-CGTase活力。从中筛选出酶活较高者，利用亚硝基胍和利福平复合诱变筛选优良菌种，诱变后利用上述同样的方法进行初筛和复筛，最终选取出酶活最高且遗传稳定的菌株112，作为后续诱变的出发菌株。

2)、菌株Y112生长曲线：

配制14组液体种子培养基(250mL小瓶装液量30mL)，平行接种后在30℃环境下培养28h，接种后每隔2h，取一组测培养基的生物量。

以稀释后样品的OD值对培养时间作图，得菌株Y112生长曲线，由此可见,接种后14-24h为对数增长期。

3)、亚硝基胍(利福平)诱变：

液体种子培养基(250mL小瓶装液量30mL)接种后培养至对数期。在无菌条件下，将种子液转入无菌离心管中，4000g的离心力下离心10min，去除上清收集菌体。无菌条件下，根据平板菌落计数法测定的结果加入适量缓冲液(pH 9.0,0.1mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液)将菌悬液制成约10⁸个/mL，然后加入玻璃珠将细菌沉淀打匀；在无菌条件下，向细菌悬浮液中加入不同剂量的亚硝基胍(或利福平)，摇匀后盖上纱布，30℃，200r/min，培养30min，60min。经亚硝基胍处理的菌悬浮液，以4000g的离心力离心10min，弃去上清液，再加入磷酸缓冲液洗涤一次，并在同样条件下离心，弃去上清液。最后加入与处理时相同体积的无菌生理盐水，再用无菌生理盐水进行适当稀释，涂布于平板上。30℃培养2d左右，计算致死率。

采用亚硝基胍和利福平复合诱变筛选优良菌种，选取致死率为95％的剂量处理对数期的菌悬液，经过初筛和复筛，最终获得突变株Y112酶活最高，为出发菌株的1.37倍。同时，菌株Y112在斜面培养基上连续接种4代，产酶能力稳定，表现出良好的遗传稳定性。

3、分离菌株Y112的鉴定

1)、分离菌株Y112的形态和生理生化特征：

形态学特征：

将分离得到的菌株Y112稀释涂布于平板上，30℃培养24h，每隔一段时间进行一次形态学观察，待培养至24h，用相差显微镜观察菌体形态、大小。菌株Y112为不规则短杆状，革兰氏阳性，菌落在琼脂培养基上呈现圆形，乳白色，表面平坦、边缘不整齐。

生长特征：

测定菌株Y112在4℃-50℃范围内的生长量；在最适生长温度下，测定菌株在不同pH条件下的生长量；在最适生长温度和最适pH条件下，测定不同NaCl浓度下生长量。菌株能在pH 8.0-11.0的条件下生长，最适生长pH为10；生长的温度范围为10-45℃，最适生长温度33℃；最高能耐受16％的NaCl，在含有5％NaCl条件下生长量最高。

分离菌株Y112的生理生化特征：

生理生化反应：

测定了菌株Y112的氧化酶、过氧化酶、淀粉酶、明胶水解、酪素、酯酶、硫化氢产生、吲哚产生以及硝酸盐和亚硝酸盐还原性质。

菌株能够分解淀粉、明胶、Tween 40、Tween 60，不能分解Tween 20。氧化酶、过氧化酶、硝酸盐还原结果为阳性，硫化氢、吲哚产生试验结果为阴性。菌株还能够利用精氨酸、柠檬酸、尿素、蔗糖，不能利用赖氨酸、鸟氨酸、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李醇、阿拉伯糖。

醇糖的利用：在培养基中加入10g/L的醇糖，接种培养24h，测定OD₆₀₀，与基础培养基相比，吸光值增加一倍以上为阳性，吸光值增加不足1倍为弱阳性，其余为阴性。

2)、16S rDNA的PCR扩增和序列分析：

对分离菌株Y112的16S rDNA基因通用引物进行菌落PCR序列扩增，引物序列如下：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’)，1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’)。

PCR产物送至华大基因测序，将得到的序列用GenBank中的BLAST进行比对分析。测序得到长度约1420bp左右的16S rDNA序列，碱基组成如图1。

采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树(如图2)，结果表明菌株Y112与Bacillus属成员具有较高的序列相似性，因此属于芽孢杆菌属。同时Y112与Bacillusagaradhaerens DSM8721的同源性达100％，说明Y112与DSM8721亲缘性很近。经过16S rDNA序列分析结合其生理生化特征，该菌株被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。该产α-CGTase的海洋微生物菌株Y112于2015年7月13日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M2015447。

二、α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质

1、α-CGTase分子量的测定

采用SDS-PAGE垂直电泳法，测量出各种标准蛋白和目的蛋白的相对迁移率(Rf)，再以分子量的对数(lg M)对相对迁移率(Rf)作图，得到回归方程。依据上述SDS-PAGE接种，选取目的蛋白附近的五个标准蛋白条带，以相对迁移率(Rf)和分子量的对数绘制标准曲线可见目的蛋白的相对迁移率(26.3％)带入回归方程，求得α-CGTase的分子量为90kDa。

2、α-CGTase的最适反应pH和pH稳定性

最适反应pH：将纯化的α-CGTase在pH3.0～5.0(柠檬酸缓冲液)，pH6.0～8.0(磷酸钠缓冲液)，pH8.5～10.0(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，pH11.0～12.0(磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液)的不同pH范围内进行酶促反应，测定其酶活力，筛选出α-CGTase的最适反应pH。通过考察不同pH下酶促反应的酶活，结果显示酶活最高峰出现pH 8.5处，即此pH为该α-CGTase最适发生作用pH。

pH稳定性：将纯化的α-CGTase与不同pH缓冲液混合，室温放置1h后再测定剩余酶活，以未处理的酶活为100％，计算出相对酶活。通过考察不同pH环境对α-CGTase稳定性的影响，结果表明该酶在pH 7.0-9.0之间稳定，pH低于6或高于10都会对酶活力造成极大的影响。

3、α-CGTase的最适反应温度和热稳定性

最适反应温度：将纯化的α-CGTase在不同反应温度下进行酶促反应，测定其酶活力，筛选出α-CGTase的最适反应温度。通过考察不同温度下酶促反应的酶活，结果显示酶活最高峰出现55℃，即此温度为该α-CGTase最适宜发生作用温度。

热稳定性：将纯化的α-CGTase于不同温度下保存1h，在最适反应温度下测其剩余酶活，以未保温处理的酶活作为对照，计算出相对酶活。通过考察不同温度环境对α-CGTase稳定性的影响，结果表明在45℃以下稳定，当温度高于55℃会对酶活力造成极大的影响。

4、金属离子和化学试剂对α-CGTase活力的影响

在纯化后的酶液中加入相同浓度的不同重金属离子或化学试剂，在室温下放置2h，测定剩余酶活力，以未处理的酶活为100％，计算出相对酶活。考察不同金属离子和化学试剂对-CGTase活力的影响，结果(表7)表明，Ag⁺会使α-CGTase完全失活，Ba²⁺、Li⁺、Cu²⁺、Hg² ⁺、Al³⁺、Tween 20(非离子表面活性剂)、CTAB(阳离子表面活性剂)、DMSO(非质子有机溶剂)对酶活影响不大，Mn²⁺、Mg²⁺对酶活性有一定的促进作用；而Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、EPTA、SDS(阴离子表面活性剂)对酶活有一定程度的抑制作用。不同金属离子或化学试剂对CGTase活力的影响如下。

表7

5、动力学参数的测定

以不同浓度的可溶性淀粉为底物，测定其α-环糊精的生成速度，根据Hanes-Woolf作图法，求α-CGTase以可溶性淀粉为底物的米氏常数Km和V_max。考察不同浓度的底物(可溶性淀粉)下，α-CGTase酶促反应的初速度，根据Hanes-Woolf作图法，以[S]/v对[S]作图,并根据回归方程可以求得，α-CGTase对可溶性淀粉的米氏常数Km为5.51g/L，V_max＝0.25μmol/L/min。

本发明提供的海洋芽孢杆菌Y112所产的环糊精葡萄糖基转移酶酶学性质为α-CGTase的热稳定性较好，在弱碱性坏境条件下很稳定。α-CGTase分子量为90kDa，最适pH为8.5，最适反应温度为55℃；在pH 7.0-9.0和45℃以下稳定；Ag^+-会使α-CGTase完全失活，对Mn²⁺、Mg²⁺对酶活性有一定的促进作用；根据Hanes-Woolf作图法，求得α-CGTase以可溶淀粉为底物的米氏常数Km为5.5g/L，V_max＝0.25μmol/L/min。

本发明提供的产α-环糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112特点为：

1、海洋芽孢杆菌Y112所产的环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性较好，在弱碱性坏境条件下很稳定。α-CGTase分子量为90kDa，最适pH为8.5，最适反应温度为55℃；在pH 7.0-9.0和45℃以下稳定；Ag⁺会使α-CGTase完全失活，对Mn²⁺、Mg²⁺对酶活性有一定的促进作用；根据Hanes-Woolf作图法，求得α-CGTase以可溶淀粉为底物的米氏常数Km为5.5g/L，V_max＝0.25μmol/L/min。

2、筛选出产CGTase的菌株112。通过亚硝基胍和利福平复合诱变的方法，使其产酶能力较出发菌株提高了37％。

可应用于医药、食品加工、纺织等。

附图说明

图1菌株Y112的16S rDNA序列

图2基于16S rDNA序列同源性的菌株Y112和相关细菌的系统发育树

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1—产α-CGTase的海洋微生物菌株Y112的选育与鉴定：

1、粗酶液的制备

在250mL三角瓶装种子培养基液30mL接种产α-CGTase的海洋微生物菌株Y112后，30℃、200r/min下活化22h，以4％(V/V)的接种量接种至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃、200r/min培养60h，收集发酵液在10000g离心力的条件下离心15min，上清液即为粗酶液。所述种子培养基的组成及所述发酵培养基的组成同上。

2、α-环糊精葡萄糖基转移酶产生菌的选育

1)、产CGTase的菌株筛选：

在碱性的琼脂培养基上添加0.03％(w/v)酚酞和0.01％(w/v)甲基橙作为活性筛选平板，将活化后的能够产淀粉水解酶的海洋微生物，稀释涂布于发酵复筛活性筛选平板上，30℃观察培养60h。在产CGTase的菌株形成黄色透明的水解圈。这是由于菌株所产的CGTase能够降解培养基中的可溶性淀粉形成环糊精，后者能够包埋甲基橙或酚酞，使其呈现黄色。此圈越大，菌株产的CGTase越多，选取透明圈与菌落直径比值较大的单菌落，接种到产酶培养基中进行摇瓶发酵复筛，测定其发酵液的

α-CGTase活力。从中筛选出酶活较高者，利用亚硝基胍和利福平复合诱变筛选优良菌种，诱变后利用上述同样的方法进行初筛和复筛，最终选取出酶活最高且遗传稳定的菌株112，作为后续诱变的出发菌株。

2)、菌株Y112生长曲线：

以稀释后样品的OD值对培养时间作图，得菌株Y112生长曲线，接种后14-24h为对数增长期。

3)、亚硝基胍(利福平)诱变：

3、分离菌株Y112的鉴定

1)、分离菌株Y112的形态和生理生化特征：

形态学特征：

生长特征：

测定菌株Y112在4℃-50℃范围内的生长量；在最适生长温度下，测定菌株在不同pH条件下的生长量；在最适生长温度和最适pH条件下，测定不同NaCl浓度下生长量。

结果表明菌株能在pH 8.0-11.0的条件下生长，最适生长pH为10；生长的温度范围为10-45℃，最适生长温度33℃；最高能耐受16％的NaCl，在含有5％NaCl条件下生长量最高。

分离菌株Y112的生理生化特征：

生理生化反应：

测定了菌株Y112的氧化酶、过氧化酶、淀粉酶、明胶水解、酪素、酯酶、硫化氢产生、吲哚产生以及硝酸盐和亚硝酸盐还原性质(参照文献方法)。

结果表明菌株能够分解淀粉、明胶、Tween 40、Tween 60，不能分解Tween 20。氧化酶、过氧化酶、硝酸盐还原结果为阳性，硫化氢、吲哚产生试验结果为阴性。菌株还能够利用精氨酸、柠檬酸、尿素、蔗糖，不能利用赖氨酸、鸟氨酸、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李醇、阿拉伯糖。

2)、16S rDNA的PCR扩增和序列分析：

采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树(如图2)，结果表明菌株Y112与Bacillus属成员具有较高的序列相似性，因此属于芽孢杆菌属。同时Y112与Bacillusagaradhaerens DSM8721的同源性达100％，说明Y112与DSM8721亲缘性很近。经过16S rDNA序列分析结合其生理生化特征，该菌株被鉴定为芽孢杆菌属(拉丁名Bacillus)。

Claims

1.一种产α-环糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112,该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),所述海洋微生物菌株Y112于2015年7月13日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015447。