CN109880758A - 一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用。本发明通过对产透明质酸酶的植物乳杆菌进行诱变育种，得到高产透明质酸酶的突变菌株植物乳杆菌CnT012‑56，该菌株具有遗传稳定性好，营养条件简单，易培养等特点；本发明还涉及植物乳杆菌CnT012‑56发酵生产透明质酸酶，所得透明质酸酶的分离纯化后酶活可达70000IU/mL，所得透明质酸酶分子量为63kDa。使用本发明的菌株生产的透明质酸酶具有安全性高，活力高，稳定性好，成本低等特点，能够实现大规模培养，满足工业化应用。

Description

一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用。
背景技术
透明质酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3及β-1,4糖苷键连接而成的高分子多糖类物质，又称玻尿酸。透明质酸具有极强的保湿作用，被称为理想的天然保湿因子。它是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。透明质酸具有不同的分子量，其分布从几千到几百万道尔顿，因其分子量的不同，其性能及应用也有所不同。小分子量的透明质酸(分子量10kDa-100kDa)能渗入真皮，容易被人体吸收，因此可以用于于保健食品，美容食品及药物载体领域。降解透明质酸所用的酶主要是透明质酸酶又称为玻璃酸酶，根据作用机制的不同，可以分为三类：(1)内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，为水解酶，作用于β-1，4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。(2)水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切-β-葡糖苷酸酶，作用于β-1,3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解透明质酸。(3)细菌透明质酸酶，也称为透明质酸裂解酶，作用于β-1，4糖苷键，通过β-消去机制得到4,5-不饱和双糖。
乳酸菌是公认的人体益生菌，常用于制造酸奶、乳酪、啤酒、泡菜和其他发酵食品；在生物工程、工农业、食品加工等领域具有广泛的应用前景。植物乳杆菌是乳酸菌的一种，在发酵生产透明质酸酶的微生物中尚未发现应用植物乳杆菌发酵生产透明质酸酶。
同时，对于植物乳杆菌菌种诱变多采用化学诱变，如烷化剂、硫酸二乙醋、氮芥盐酸盐、5-溴尿嘧啶等，这些化学诱变剂对化学诱变剂往往具有专一性，一种诱变剂对基因的某部位发生作用；同时因其对人体的致畸、致癌作用,实际应用中受到一定的限制。
此外对于酶纯化方式，多采用硫酸铵沉淀，该方法会产生高氮废水，污染环境，且操作复杂。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题提供了一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用。本发明通过对透明质酸发酵液中分离纯化出的产透明质酸酶的植物乳杆菌，经多功能等离子体诱变系统诱变育种，得到一株高产透明质酸酶植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum CnT012-56)菌株，同时利用该菌株通过液体发酵获得的适用于制备小分子透明质酸或其盐的透明质酸酶。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
第一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCC NO.16836，菌种的分类命名是：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，参据微生物材料(株)：CnT012-56，保藏日期为2018年11月28日。
该菌株为圆端直杆菌，细胞直径为0.9～1.2μm×3.0～8.0μm，菌落淡黄色，呈圆形，边缘光滑。
第二方面，本发明提供该植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，包括以下步骤：
将植物乳杆菌进行筛选与纯化、菌悬液制备、多功能等离子体微生物诱变仪诱变、诱变筛选得到植物乳杆菌诱变菌株。
具体的，植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，包括以下步骤：
(1)筛选与纯化
用无菌水稀释染菌发酵液，涂布平板，分离出多个株菌，将各株菌接种于含有透明质酸的液体培养基中培养，测发酵液的运动黏度，筛选黏度下降最快，产透明质酸酶酶活最高的作为菌种；
(2)菌悬液制备：
将菌种接种于种子培养基中，静置培养使菌体处于对数生长后期，取培养液离心，收集菌体，然后用无菌生理盐水洗涤，最后将菌体重悬于无菌生理盐水中，得到菌悬液；
(3)多功能等离子体微生物诱变仪诱变：
取上述菌悬液均匀的涂布于诱变杯中，晾干后将其置于多功能等离子体诱变系统中进行诱变；
(4)诱变菌株高通量筛选
在诱变处理后的诱变杯中加入生理盐水，将菌种洗下制成菌悬液，稀释后均匀涂到固体培养基表面培养，对分离得到长势良好的单菌落进行挑取，转接到装有液体种子培养基的深孔板中进行活化、静置培养，然后取种子液加入到发酵培养基的深孔板中，静置发酵，用微孔板分光光度计酶标仪检测上述样品波长232nm处的吸收值，吸收值最高的产透明质酸酶酶活最高，确定为所需植物乳杆菌诱变菌株。
进一步的，本发明的植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，包括以下步骤：
(1)筛选与纯化
无菌水稀释染菌发酵液，涂布平板，分离出24株菌，对24株菌进行编号：CnT001——CnT024，将24株菌接种于含有透明质酸的液体培养基中，液体培养基组分为透明质酸5g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，葡萄糖2g，自来水1000mL，pH7.00；每株菌平行接种10个装有25mL培养基的三角瓶中；35℃静置培养，培养4h后，每间隔四小时取一三角瓶测发酵液的运动黏度，筛选黏度下降最快，产透明质酸酶酶活最高的作为菌种；
(2)菌悬液制备：
将上述菌种接种于种子培养基中，种子培养基中组分为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，p H 6.5，33℃静置培养10～14h，使菌体处于对数生长后期；取1m L上述种子培养液12000rpm离心2min，收集菌体，然后用无菌生理盐水洗涤3次，最后将菌体重悬于无菌生理盐水中，使细胞的终浓度为1×107CFU/m L，得到菌悬液；
(3)多功能等离子体微生物诱变仪诱变：
取上述菌悬液10μL均匀的涂布于诱变杯中，晾干后将其置于多功能等离子体诱变系统中进行诱变，诱变条件为输入功率120W，间距3mm，气流量10L/min，分别诱变时长分别为0、10s、30s、50s、70s、90s、110s、120s；
(4)诱变菌株高通量筛选
在诱变处理后的诱变杯中加入100μL生理盐水，将菌种洗下制成菌悬液，稀释到1×10-5梯度后，取100μL均匀涂到固体培养基表面，固体培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，琼脂粉18g/L，p H 6.5，33℃培养1d，对分离得到长势良好的单菌落进行编号：植物乳杆菌CnT012-1——CnT012-527挑取单菌落，转接到装有液体种子培养基的96深孔板中进行活化；33℃静置培养6h后，取40μL种子液加入到360μL的96深孔板中，发酵培养基组份为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，p H 6.5，33℃静置发酵12h后，用微孔板分光光度计酶标仪检测上述样品波长232nm处的吸收值，吸收值最高的产透明质酸酶酶活最高，确定为所需植物乳杆菌诱变菌株Lactobacillus plantarum CnT012-56。
第三方面，本发明提供上述的植物乳杆菌发酵生产透明质酸酶的应用。
该透明质酸酶通过以下方法制得：
将Lactobacillus plantarum CnT012-56菌种接种到已灭菌的种子培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-100rpm，培养8-24h，获得种子培养液；再将种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-150rpm，通气量2L/min，培养20-48h，获得透明质酸酶发酵液；离心后经过超滤膜过滤，得到纯化的透明质酸酶。
具体的，本发明的植物乳杆菌发酵生产透明质酸酶的方法，包括以下步骤：
(1)将Lactobacillus plantarum CnT012-56菌种接种到已灭菌的种子培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-100rpm，培养8-24h，获得种子培养液；
(2)将种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-150rpm，培养20-48h，获得透明质酸酶发酵液；
(3)离心上述透明质酸酶发酵液，取上清液；
(4)孔径截留分子量200kDa的超滤膜，超滤上述透明质酸酶上清液，取滤过液；
(5)然后用孔径截留分子量20kDa的超滤膜，超滤上述滤过液，除去小分子杂质，得到纯化的透明质酸酶；
其中，种子培养基组分是蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5；发酵培养基组分是蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，p H 6.5。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种高产透明质酸酶的植物乳杆菌CnT012-56及其诱变方法，该菌株遗传稳定性好，易培养。
本发明建立了一种产透明质酸酶高产菌株的诱变选育方法，以产透明质酸的植物乳杆菌CnT012为出发菌株，采用多功能等离子体诱变系统(MPMS)对其进行诱变育种，快速便捷。
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，本发明利用植物乳杆菌所制备透明质酸酶，具有酶活高，安全性高、应用广泛等特点，能够实现产业化，其所产透明质酸酶较其他来源透明质酸酶具有更高的食品安全性。同时该菌株在发酵培养基中培养得到透明质酸酶的发酵液酶活达6860IU/mL。
同时本发明透明质酸酶纯化方式，仅用离心、超滤即可得到高纯度透明质酸酶，透明质酸酶酶活达70000IU/mL。不使用硫酸铵沉淀这一传统纯化方式，不会产生高氮废水，环保节能，该高纯度、高活性透明质酸酶制备工艺更环保、更安全。
附图说明
图1：超滤纯化后的透明质酸酶SDS-PAGE电泳结果，右边为标准蛋白分子量，左边为植物乳杆菌CnT012-56制备并经纯化的透明质酸酶条带。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明
实施例1：Lactobacillus plantarum CnT012-56植物乳杆菌诱变菌株的诱变
(1)Lactobacillus plantarum CnT012-56原始菌的筛选与纯化
发酵车间一线工人发酵生产透明质酸过程中，发现pH下降迅速并且黏度急剧下降，取样镜检发现有大量短杆状杂菌。无菌水稀释染菌马疫链球菌发酵液，涂布平板，分离出24株菌。对24株菌进行编号：CnT001——CnT024。将24株菌接种于含有透明质酸的液体培养基中(透明质酸5g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，葡萄糖2g，自来水1000mL，pH7.00)。每株菌平行接种10个装有25mL培养基的三角瓶中。35℃静置培养，培养4h后，每间隔四小时取一三角瓶测发酵液的运动黏度，结果发现编号为CnT012的菌株黏度下降最快，产透明质酸酶酶活最高。
(2)菌悬液制备：
将上述编号CnT012的菌种接种于种子培养基中(蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5)，33℃静置培养10～14h，使菌体处于对数生长后期。取1m L上述种子培养液12000rpm离心2min，收集菌体，然后用无菌生理盐水洗涤3次，最后将菌体重悬于无菌生理盐水中，使细胞的终浓度为1×107CFU/mL，得到菌悬液。
(3)多功能等离子体微生物诱变仪诱变
取上述菌悬液10μL均匀的涂布于诱变杯中，晾干后将其置于多功能等离子体诱变系统(MPMS)中进行诱变，诱变条件为输入功率120W，间距3mm，气流量10L/min，分别诱变时长分别为0、10s、30s、50s、70s、90s、110s、120s。
(4)诱变菌株高通量筛选
在诱变处理后的诱变杯中加入100μL生理盐水，将菌种洗下制成菌悬液。稀释到1×10-5梯度后，取100μL均匀涂到固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，琼脂粉18g/L，pH 6.5)表面，33℃培养1d，对分离得到长势良好的单菌落进行编号：植物乳杆菌CnT012-1——CnT012-527挑取单菌落，转接到装有液体种子培养基的96深孔板中进行活化。33℃静置培养6h后，取40μL种子液加入到360μL发酵培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5)的96深孔板中，33℃静置发酵12h后，用微孔板分光光度计酶标仪检测上述样品波长232nm处的吸收值。三次重复验证，确定编号CnT012-56在波长232nm处吸收值最高，产透明质酸酶酶活最高。本发明筛得产透明质酸酶菌株CnT012-56委托中国普通微生物菌种保藏管理中心进行菌种鉴定，确定为植物乳杆菌。上述诱变得高产透明质酸植物乳杆菌命名为：Lactobacillus plantarum CnT012-56。
本发明所涉及到高通量筛选方法依据细菌来源透明质酸酶催化HA形成不饱和双糖结构，此结构在232nm处有最大光吸收(Greiling,H.Spectrophotometric method forthe determination of bacterial hyaluronidase.Hoppe Seylers Z PhysiolChem,1957)，吸收值与不饱和双糖浓度成正比。
实施例2：利用菌株Lactobacillus plantarum CnT012-56生产透明质酸酶
(1)透明质酸酶制备
将上述的Lactobacillus plantarum CnT012-56菌株接种到已灭菌的种子培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5)中，培养温度33℃，静置培养14h，获得种子培养液。将种子培养液接种到灭菌的发酵培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5)，培养温度33℃，通无菌压缩空气，通气量2L/min，转速0rpm，培养38h，获得含透明质酸酶的发酵液，发酵液酶活6860IU/mL。
同时，还进行了不用条件下的发酵液酶活测定，与上述实施例不同，对比1选择种子液培养条件：培养温度30℃，转速50rpm，培养8h；发酵液培养条件：培养温度30℃，通气量2L/min，转速100rpm，培养20h，获得透明质酸酶发酵液，发酵液酶活1200IU/mL。对比2选择种子培养条件：培养温度37℃，转速100rpm，培养24h；发酵液培养条件：培养温度37℃，通气量2L/min，转速150rpm，培养48h，获得透明质酸酶的发酵液，发酵液酶活3020IU/mL。
(2)进一步分离纯化
将上述Lactobacillus plantarum CnT012-56菌株通过冷冻离心除去发酵液菌体，离心条件：温度25℃、转速10000rpm、离心时间10min，得到含透明质酸酶的发酵上清液。发酵上清液经0.65μm纤维素膜过滤除去不溶物，得澄清粗酶液，经截留分子量为200kDa的聚醚砜超滤膜超滤，收集滤过液。将滤过液经截留分子量20kDa的聚醚砜超滤膜除去小分子杂质、浓缩至透明质酸酶酶活70 000IU/mL。上述所涉及到的透明质酸酶活定义与酶活检测方法，参考《中国药典》(2015版附录1207)《玻璃酸酶测定法》。
实施例3：菌株Lactobacillus plantarum CnT012-56遗传稳定性验证
将分离纯化后上述菌株Lactobacillus plantarum CnT012-56接种到固体斜面培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，琼脂粉18/L,pH 6.5)，33℃静置培养12-24h，待斜面铺满菌苔后，用接种环挑取一环菌体，接种到固体斜面培养基，进行第一次传代。同样传代十次后，接种到种子液培养基中，33℃静置培养14h，获得种子液。将种子液接种到灭菌的发酵培养基中，培养温度33℃，培养36h，获得含透明质酸酶的发酵液，检测发酵液酶活为6532IU/mL。该诱变选育菌种Lactobacillus plantarum CnT012-56具有良好的遗传稳定性，所产透明质酸酶酶活稳定。
实施例4：菌株Lactobacillus plantarum CnT012-56的透明质酸酶的分子量
测定配制10％的分离胶10mL，迅速沿着玻璃壁灌入玻璃板的缝隙至开口处，加上一层超纯水压平凝胶上端，静置30min，灌注5％的层积胶至玻璃板顶端，插入梳子，室温下静置聚合30min以上。待层积胶完全凝固后，拔出梳子，倒入非变性电泳缓冲液，取超滤得到的蛋白样品上样，每孔大约上样30μL。然后电泳，先用70V恒压运行30min，再100V恒压运行2h，停止电泳，整个操作过程保持恒温4℃，以防止蛋白质变性。剥胶后先用超纯水清洗，把凝胶放入考马斯亮蓝R-250染液中进行染色，然后用40％甲醇和10％乙酸溶液快速脱色。
超滤纯化后的透明质酸酶SDS-PAGE电泳结果见附图1。右边为标准蛋白分子量，左边为植物乳杆菌CnT012-56制备并经纯化的透明质酸酶条带，所制备的透明质酸酶的分子量为63kDa。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌诱变菌株，保藏日期为2018年11月28日，保藏编号为CGMCCNO.16836。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：
将植物乳杆菌进行筛选与纯化、菌悬液制备、多功能等离子体微生物诱变仪诱变、诱变筛选得到植物乳杆菌诱变菌株。
3.如权利要求2所述的植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选与纯化：
用无菌水稀释染菌发酵液，涂布平板，分离出多个株菌，将各株菌接种于含有透明质酸的液体培养基中培养，测发酵液的运动黏度，筛选黏度下降最快，产透明质酸酶酶活最高的作为菌种；
(2)菌悬液制备：
将上述菌种接种于种子培养基中，静置培养使菌体处于对数生长后期，取培养液离心，收集菌体，然后用无菌生理盐水洗涤，最后将菌体重悬于无菌生理盐水中，得到菌悬液；
(3)多功能等离子体微生物诱变仪诱变：
取上述菌悬液均匀的涂布于诱变杯中，晾干后将其置于多功能等离子体诱变系统中进行诱变；
(4)诱变菌株高通量筛选
在诱变处理后的诱变杯中加入生理盐水，将菌种洗下制成菌悬液，稀释后均匀涂到固体培养基表面培养，对分离得到长势良好的单菌落进行挑取，转接到装有液体种子培养基的深孔板中进行活化、静置培养，然后取种子液加入到发酵培养基的深孔板中，静置发酵，用微孔板分光光度计酶标仪检测上述样品波长232nm处的吸收值，吸收值最高的产透明质酸酶酶活最高，确定为所需植物乳杆菌诱变菌株。
4.如权利要求3所述的植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，其特征在于：步骤(1)中液体培养基中的成分透明质酸5g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，葡萄糖2g，自来水1000mL，pH 7.00。
5.如权利要求3所述的植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，其特征在于：步骤(2)种子培养基中的成分蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5。
6.如权利要求3所述的植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，其特征在于：步骤(4)固体培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，琼脂粉18g/L，pH 6.5；发酵培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5。
7.如权利要求2-6任一项所述的植物乳杆菌诱变菌株的诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选与纯化
无菌水稀释染菌发酵液，涂布平板，分离出24株菌，对24株菌进行编号：CnT001——CnT024，将24株菌接种于含有透明质酸的液体培养基中，液体培养基组分为透明质酸5g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，葡萄糖2g，自来水1000mL，pH7.00；每株菌平行接种10个装有25mL培养基的三角瓶中；35℃静置培养，培养4h后，每间隔四小时取一三角瓶测发酵液的运动黏度，筛选黏度下降最快，产透明质酸酶酶活最高的作为菌种；
(2)菌悬液制备：
将上述菌种接种于种子培养基中，种子培养基中组分为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5，33℃静置培养10～14h，使菌体处于对数生长后期；取1mL上述种子培养液12 000rpm离心2min，收集菌体，然后用无菌生理盐水洗涤3次，最后将菌体重悬于无菌生理盐水中，使细胞的终浓度为1×107CFU/mL，得到菌悬液；
(3)多功能等离子体微生物诱变仪诱变：
取上述菌悬液10μL均匀的涂布于诱变杯中，晾干后将其置于多功能等离子体诱变系统中进行诱变，诱变条件为输入功率120W，间距3mm，气流量10L/min，分别诱变时长分别为0、10s、30s、50s、70s、90s、110s、120s；
(4)诱变菌株高通量筛选
在诱变处理后的诱变杯中加入100μL生理盐水，将菌种洗下制成菌悬液，稀释到1×10-5梯度后，取100μL均匀涂到固体培养基表面，固体培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，琼脂粉18g/L，pH 6.5，33℃培养1d，对分离得到长势良好的单菌落进行编号：植物乳杆菌CnT012-1——CnT012-527挑取单菌落，转接到装有液体种子培养基的96深孔板中进行活化；33℃静置培养6h后，取40μL种子液加入到360μL发酵培养基的96深孔板中，发酵培养基组份为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5，33℃静置发酵12h后，用微孔板分光光度计酶标仪检测上述样品波长232nm处的吸收值，吸收值最高的产透明质酸酶酶活最高，确定为所需植物乳杆菌诱变菌株Lactobacillus plantarumCnT012-56。
8.如权利要求1所述的植物乳杆菌诱变菌株用于生产透明质酸酶的应用。
9.如权利要求8所述的植物乳杆菌诱变菌株用于生产透明质酸酶的应用，其特征在于，所述透明质酸酶的生产方法，包括以下步骤：
将Lactobacillus plantarum CnT012-56菌种接种到已灭菌的种子培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-100rpm，培养8-24h，获得种子培养液；再将种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-150rpm，培养20-48h，获得透明质酸酶发酵液；离心后经过超滤膜过滤，得到纯化的透明质酸酶。
10.如权利要求9所述的植物乳杆菌诱变菌株用于生产透明质酸酶的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Lactobacillus plantarum CnT012-56菌种接种到已灭菌的种子培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-100rpm，培养8-24h，获得种子培养液；
(2)将种子培养液接种到已灭菌的发酵培养基中，培养温度30℃-37℃、转速0-150rpm，培养20-48h，获得透明质酸酶发酵液；
(3)离心上述透明质酸酶发酵液，取上清液；
(4)孔径截留分子量200kDa的超滤膜，超滤上述透明质酸酶上清液，取滤过液；
(5)然后用孔径截留分子量20kDa的超滤膜，超滤上述滤过液，除去小分子杂质，得到纯化的透明质酸酶；
种子培养基组分是蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5；发酵培养基组分是蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，透明质酸5g/L，葡萄糖3g/L，氯化钠0.1g/L，硫酸铵2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1mL，pH 6.5。
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