CN107988115B - 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一株植物乳杆菌以及用该植物乳杆菌制备的益生菌发酵液及其制备方法，所述植物乳杆菌在发酵后能够产生大量乳酸菌及护肤活性因子，可用于护肤品，制备所述益生菌发酵液的方法条件温和，原料来源广泛，制得的益生菌发酵液中含有乳酸菌活菌和护肤活性因子，如超氧化物歧化酶和透明质酸等，这些乳酸菌以及护肤活性因子均来源于可食用的菌类微生物，而绝无人工化学添加剂，因此，用本申请提供的方法制得的益生菌发酵液绿色健康，不会对皮肤造成伤害，适于用于护肤品。

Description

植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌菌株，使用该植物乳杆菌制备的复合益生菌发酵液及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体重要的器官之一，是帮助宿主抵御致病菌入侵的第一道防线，是人体第四大微生态体系。皮肤微生态系统由许多生理、形态不同的微环境“生态位”和生活在其中各种各样的微生物群系组成。这些微生物群系以细菌为主，还包括少量的真菌、病毒和螨虫等。皮肤常驻菌群的紊乱会导致过敏性皮炎，牛皮藓，痤疮等常见的皮肤疾病发生，并且在真皮层或皮肤内部延伸导致多种组织发生病变。传统的治疗方法多使用抗生素，激素等药物，药物的使用非但不能根治疾病，并且会导致较强的药物依赖性、耐药性和抗药性。
因此，亟需开发一种能够根治皮肤疾病，而且不易产生药物依赖性、耐药性和抗药性的产品。
发明内容
本申请的目的之一是提供一种植物乳杆菌菌株；本申请的目的之二是将所述植物乳杆菌菌株制备成益生菌发酵液用于护肤。
为达到上述目的，本申请是通过以下技术方案来实现的：
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2，所述L.plantarum C2通过以下方法筛选得到：
自四川省自然发酵的泡菜样品，经无菌水适度稀释并涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于MRS固体培养基2-3次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16s rRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。
本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.14532；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2菌株具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH 6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
本申请所分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2能够用于护肤。其在皮肤上能够产生大量的有机酸从而降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机体免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力。而且，所述植物乳杆菌还可以在皮肤上产生过氧化氢、抗菌肽与细菌素等产物，这些产物对病原菌有明显的抑制作用。此外，所述植物乳杆菌还可以在皮肤上代谢产生多种护肤活性因子，如超氧化物歧化酶、透明质酸等，从而实现护肤的作用。
本申请还提供一种使用所述植物乳杆菌制备益生菌发酵液的方法，所述方法包括：
步骤1，将植物乳杆菌(L.plantarum)P-8，动物双歧杆菌乳亚种(B.lactis)V9，干酪乳杆菌(L.casei)Zhang和植物乳杆菌(L.plantarum)C2四株菌株接种于培养基中，其中，L.plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9的微生物保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469和L.plantarum C2的微生物保藏编号为CGMCC No.14532；
步骤2，将步骤1得到的体系在恒温、恒pH的条件下发酵。
在一种可能的实现方式中，在步骤1中，所述L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的接种比例为L.plantarum P-8:B.lactis V9:L.caseiZhang:L.plantarum C2＝(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)，优选为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，其中，各菌种的用量以各菌种的活菌数量计。
进一步地，所用的培养基包括：
Figure GDA0002460455250000021
在一种可能的实现方式中，步骤2中，体系的pH为4.5～7.0。
在另一种可能的实现方式中，步骤2中，体系的温度为25℃～40℃。
在另一种可能的实现方式中，步骤2中，发酵的时间为20h～50h。
本申请还提供一种根据上述方法制备的益生菌发酵液，所述益生菌发酵液中，益生菌活菌数为(5～7)×109CFU/mL，和/或超氧化物歧化酶为(95～98)U/mL，和/或透明质酸含量为(107～110)μg/mL。
本申请提供的制备益生菌发酵液的方法反应条件温和，原料来源广泛，制得的益生菌发酵液中乳酸菌活菌数量大，而且产生了数量可观的护肤活性因子，如超氧化物歧化酶和透明质酸等，其中，乳酸菌能够降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机体免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力，还可以在皮肤上产生过氧化氢、抗菌肽与细菌素等产物，这些产物对病原菌有明显的抑制作用，由于这些乳酸菌以及护肤活性因子均来源于可食用的菌类微生物，而绝无人工化学添加剂，因此，用本申请提供的方法制得的益生菌发酵液绿色健康，安全无残留，不会对皮肤造成伤害，适于用于护肤品，如可作为护肤用化妆品的原料或配料使用，能够广泛应用于面膜、乳霜、香波等产品中，调理皮肤微生态系统，维护皮肤健康。
具体实施方式
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2通过以下方法筛选得到：
自四川省自然发酵的泡菜样品，经无菌水适度稀释并涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于MRS固体培养基2-3次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16s rRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2，该菌株已于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。
本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.14532；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2菌株具有如下生物学特性：本申请所分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2菌株具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH 6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
本申请所分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2能够用于护肤。其在皮肤上能够产生大量的有机酸从而降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机体免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力。而且，所述植物乳杆菌还可以在皮肤上产生过氧化氢、抗菌肽与细菌素等产物，这些产物对病原菌有明显的抑制作用。此外，所述植物乳杆菌还可以在皮肤上代谢产生多种护肤活性因子，如超氧化物歧化酶、透明质酸等，从而实现护肤的作用。
本申请还提供一种使用所述植物乳杆菌制备益生菌发酵液的方法，所述方法包括：
步骤1，将L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2四株菌株接种于培养基中，其中，L.plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9的微生物保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469和L.plantarum C2的微生物保藏编号为CGMCC No.14532；其中，菌株L.plantarum P-8，菌株B.lactis V9和菌株L.casei Zhang为现有技术已经公开的菌株，如中国专利CN105802876A中所公开的。
步骤2，将步骤1得到的体系在恒温、恒pH的条件下发酵。
在一种可能的实现方式中，在步骤1中，所述L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的接种比例为L.plantarum P-8:B.lactis V9:L.caseiZhang:L.plantarum C2＝(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)，优选为(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)，如1:2:1:1，1:1:2:1，1:1:1:2或者1:2:2:1，最优选为1:2:2:1。本发明人发现，4株菌不同的发酵比例对混合发酵中活菌数、活性物质含量(SOD、HA)影响较大，当L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.caseiZhang和L.plantarum C2的发酵比例为1:2:2:1发酵时有利于4株菌的生长和活性物质的积累，具体请参见实施例12～15。
进一步地，本申请中所用的培养基包括：
Figure GDA0002460455250000031
优选为
Figure GDA0002460455250000032
Figure GDA0002460455250000041
如，
Figure GDA0002460455250000042
其中，基于1g计为1重量份。
本发明人发现，在培养基中加入不同量的胶原蛋白粉、乳清蛋白粉和酵母蛋白粉培养制得的发酵液中乳酸菌的数量显著不同，当按照上述比例进行配比时制得的菌液中乳酸菌的活菌数量最大，因此，本申请选择按照上述配比制备培养基，具体请参见实施例8～11。
在一种可能的实现方式中，步骤2中，体系的pH为4.5～7.0，优选为4.7～6.0，如5.0或者5.5，最优选为5.0。本发明人发现，在发酵阶段，与不控制体系的pH相比，如果体系pH保持在上述范围内，则制得的发酵液中乳酸菌活菌数以及对皮肤有益的活性物质积累较丰富，因此，本发明选择在发酵阶段控制体系pH在上述范围内，具体请参见实施例16～19。
在另一种可能的实现方式中，步骤2中，体系的温度为25℃～40℃，优选为28℃～38℃，如30℃或者37℃。本发明人发现，在发酵阶段，如果体系的温度恒定在上述温度范围内，制得的发酵液中乳酸菌活菌数以及对皮肤有益的活性物质积累较丰富，因此，本发明选择在发酵阶段使体系的温度恒定在上述温度范围内，具体请参见实施例24和25。
在另一种可能的实现方式中，步骤2中，发酵的时间为20h～50h，优选为24h～42h，如30h和36h。本发明人发现，在发酵阶段，如果发酵时间在上述时间范围内，制得的发酵液中乳酸菌活菌数以及对皮肤有益的活性物质积累较丰富，因此，本发明选择在发酵阶段使体系的发酵时间在上述时间范围内，具体请参见实施例20～23。
在本申请中，所述制备益生菌发酵液的方法包括：
步骤1，将L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2四株菌株接种于培养基中，其中，L.plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9的微生物保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469和L.plantarum C2的微生物保藏编号为CGMCC No.14532；其中，
菌株组合物的总接种量为2％，其中，L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.caseiZhang和L.plantarum C2的配比为1:2:2:1；
所述培养基包括以下重量比的组分：
Figure GDA0002460455250000043
其中，基于1g计为1重量份，
步骤2，将步骤1得到的体系在恒温、恒pH的条件下发酵，其中，发酵温度为30℃，体系pH＝5.0，发酵时间为30h。
本申请还提供一种根据上述方法制备的益生菌发酵液，所述益生菌发酵液中，益生菌活菌数为(5～7)×109CFU/mL，和/或超氧化物歧化酶为(95～98)U/mL，和/或透明质酸含量为(107～110)μg/mL。
本申请提供的制备益生菌发酵液的方法反应条件温和，原料来源广泛，制得的益生菌发酵液中乳酸菌活菌数量大，而且产生了数量可观的护肤活性因子，如超氧化物歧化酶和透明质酸等，其中，乳酸菌能够降低皮肤环境pH值，抑制致病菌的生长繁殖，同时能够提高机体免疫功能，激活巨噬细胞，维持局部抗感染能力，由于这些乳酸菌以及护肤活性因子均来源于可食用的菌类微生物，而绝无人工化学添加剂，因此，用本申请提供的方法制得的益生菌发酵液绿色健康，不会对皮肤造成伤害，适于用于护肤品。
实施例
实施例1植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2的分离、筛选与鉴定
1.材料与方法
1.1菌株来源、分离与鉴定
自四川省居民家庭采集自然发酵的泡菜样品，称取10g样品用90g无菌生理盐水稀释后，取0.1mL涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性菌株再划线于MRS固体培养基培养2-3次得到纯菌落。本菌株显微镜下观察形态为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状；在MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑，无运动特性。
对分离到的菌株进行生理生化鉴定和16s rRNA分子鉴定，根据《伯杰细菌鉴定手册》，使用细菌微量生化鉴定管(广东环凯微生物科技有限公司)进行鉴定，鉴定结果见表1。提取该菌株的DNA样品，样品经上海美吉生物医药科技有限公司进行16s rRNA分子鉴定，分子序列经NCBI数据库blastn比对，确认C2为植物乳杆菌，16s序列见本申请提供的序列表。
表1植物乳杆菌C2生化鉴定结果
Figure GDA0002460455250000051
实施例2植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C2的代谢产物测定
检测方法：
1.超氧化物歧化酶(SOD)的测定依照国标GB/T 5009.171-2003执行。
2.透明质酸(HA)含量测定
2-1.称取HA标准品，分别配制浓度为100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mL、180μg/mL、200μg/mL HA标样。
2-2.称取NaCl，稀释制得浓度为0.2μg/mL NaCl溶液。取100mL样液加入2.5gCTAB，制得25mg/mL CTAB溶液。
2-3.取10μL不同浓度标样各加入20μL CTAB溶液，充分混合，反应10min后，以CTAB溶液为空白，准确测定OD400值(400nm下测定的光密度)，绘制标准曲线。
2-4.取发酵液经4200r/min离心15min，去除菌体取上清液，加入2.5倍的无水乙醇，在4℃静置1h，离心去沉淀，加入所取上清液适当倍数体积的去离子水，振荡溶解，即制得样液，取10μL加入离心管，取20μLCTAB加入离心管混合，反应10min测定OD400值。计算出样品中HA含量。
3.苯乳酸(PLA)和4-羟基苯乳酸含量测定
3.1取一定量的发酵液与1mol/L的盐酸以体积比1:4加入到离心管中，9000rpm离心10min。吸取10ml上清液过0.22μm滤膜，过滤后即为待测样品。(当测定γ-氨基丁酸时则需10000rpm离心5min,过滤后取10μL与90μL邻苯二甲醛溶液反应1min后上机)。
3.2苯乳酸、4-羟基苯乳酸色谱条件：色谱柱Waters HSS T3，柱温30℃，流动相分别为(A)0.1％甲酸(B)甲酸乙腈溶液，梯度洗脱条件(0～2min，20％～50％B；2.1～3min，50％～95％B；3～3.1min，95％～5％B；运行时间3.1min)，流速0.4mL/min，进样体积5.0μL。质谱检测采用ESI正离子模式，毛细管电压2.5kv，锥孔电压40v，离子源温度100℃，脱溶剂气温度600℃，锥孔气流量600L/h，脱溶剂气流量0L/h，并且以亮氨酸-脑啡肽[M-H＝554.2615]作为质量校正轴的参比物。
γ-氨基丁酸色谱条件：色谱柱ZORBAX Elipse AAA C18column(3.5gym,4.6x150mm)，柱温35℃，流动相分别为(A)磷酸氢二钠(B)甲醇乙腈水溶液(45：45：10)，梯度洗脱A相97％，B相3％，流速2.0mL/min。
检测结果：将L.plantarum C2菌种接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代2次取其培养液依照实施例2的方法进行超氧化物歧化酶(SOD)、透明质酸(HA)、苯乳酸(PLA)和4-羟基苯乳酸含量的检测，监测结果见表1。
表1L.plantarum C2菌株代谢产物含量测定
Figure GDA0002460455250000061
本申请以下实施例中所述益生菌为：
L.plantarum P-8的保藏编号为：CGMCC No.6312
B.lactis V9的保藏编号为：CGMCC No.5470
L.casei Zhang的保藏编号为：CGMCC No.5469
L.plantarum C2的保藏编号为：CGMCC No.14532。
本申请以下实施例中所用原料的来源为：
MRS液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司，250g/瓶；
TPY液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司，250g/瓶。
(一)菌种的活化
1.L.plantarum P-8，L.casei Zhang和L.plantarum C2的活化
冷冻干燥保存的菌株L.plantarum P-8，L.casei Zhang和L.plantarum C2菌种接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代2次。
2.B.lactis V9的活化
冷冻干燥保存的菌株B.lactis V9菌种接种于TPY液体培养基中，37℃恒温厌氧培养24h，传代2次。
(二)活菌计数方法
采用倾注平板计数法，具体操作步骤为：依据GB 4789.35-2016方法
实施例3～7不同菌株的筛选
实验方法：向培养基中接种不同的菌株，总接种量均为2％，在37℃发酵24h，分别测定体系中代谢产物，结果如下表2所示：
表2不同菌株的筛选结果
Figure GDA0002460455250000071
由表1可知，不同菌株在相同的培养基质中，产生的乳酸菌活菌数不同，此外产生的对皮肤有益的活性物质如超氧化物歧化酶和透明质酸的积累不同，在L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的组合物混合发酵时效果最佳，所以，本申请选用L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的组合物作为发酵菌种。
实施例8～11发酵培养基的筛选
实验方法：基础培养基配方如下：大豆分离蛋白粉/脱脂大豆粉40g，蔗糖50g为主要成分，蒸馏水1L，pH 7.0，添加或不添加胶原蛋白粉、乳清蛋白粉和酵母蛋白粉，具体地，向发酵培养基中加入蒸馏水1L，调节培养基的pH＝7.0，向培养基中接种L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的组合物(1:1:1:1)，总接种量为2％，在37℃发酵24h，测定体系中代谢产物，结果如下表3所示：
表3不同发酵培养的筛选结果
Figure GDA0002460455250000072
由表3可知，以大豆分离蛋白粉/脱脂大豆粉为基础的培养基，添加胶原蛋白粉、乳清蛋白粉和酵母蛋白粉混合发酵，可获得较高的活菌数，因此，本申请优选发酵培养基为大豆分离蛋白粉/脱脂大豆粉40g，蔗糖50g，胶原蛋白粉5g，乳清蛋白粉5g，酵母蛋白粉5g，蒸馏水1L，pH＝7.0，并且以下实施例采用所述优选发酵培养基作为实验基础。
实施例12～15菌株组合物中各菌株发酵比例的筛选
实验方法：将菌株组合物接种于培养基中，在37℃发酵24h，分别测定体系中代谢产物，结果如下表4所示：
表4不同菌株配比的筛选结果
Figure GDA0002460455250000081
由表4可知，4株菌不同的发酵比例对混合发酵中活菌数、活性物质含量(SOD、HA)影响较大，当L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的发酵比例为1:2:2:1发酵时有利于4株菌的生长和活性物质的积累，因此，本申请优选L.plantarumP-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的发酵比例为1:2:2:1，并且，以下实施例采用该比例。
实施例16～19pH条件的筛选
实验方法：将菌株组合物接种于培养基中，总接种量为2％，在37℃发酵24h，在实施例17～19中，用流加10mol/L NaOH溶液的方式保持体系pH值恒定，分别测定体系中代谢产物，结果如下表5所示：
表5不同pH条件的筛选结果
Figure GDA0002460455250000082
由表5可知，发酵时体系的pH对益生菌混合发酵液中益生菌活菌数及对皮肤有益的活性物质积累(SOD、HA)的存在显著差异，经优化发现当L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的接种量为2％(1:2:2:1)，通过流加10mol/L NaOH溶液控制pH＝5.0，37℃发酵24h时其混合发酵液中活菌数、超氧化物歧化酶活性和透明质酸含量最高，在本申请中选择保持体系pH恒定为5.0，优选通过流加10mol/L NaOH溶液保持体系恒定。并且，在以下实施例中，采用该条件。
实施例20～23发酵时间的筛选
实验方法：将菌种组合物接种于培养基中，总接种量为2％，在37℃恒pH5.0发酵24h，通过流加10mol/L NaOH溶液控制pH值，分别测定体系中代谢产物，结果如下表6所示：
表6不同发酵时间的筛选结果
Figure GDA0002460455250000083
由表6可知，随着发酵时间的延长，混合发酵液中益生菌活菌数有所提高，有益于皮肤的代谢产物逐渐积累。但随着发酵时间的逐渐延伸，发酵液中营养物质和环境的恶化，益生菌生长停止并呈下降趋势，有益代谢产物积累也停止，当L.plantarum P-8，B.lactisV9，L.casei Zhang和L.plantarum C2于37℃恒pH5.0发酵30h时，混合发酵液中益生菌活菌含量、超氧化物歧化酶和透明质酸含量最高。因此，本申请选择发酵时间为30h，在以下实施例中采用该发酵时间。
实施例24～25发酵温度的筛选
实验方法：将菌种组合物接种于培养基中，总接种量为2％，在37℃下，通过流加10mol/L NaOH溶液保持体系pH恒定为5.0，发酵30h，分别测定体系中代谢产物，结果如下表7所示：
表7不同发酵温度的筛选结果
Figure GDA0002460455250000091
由表7可知，不同培养温度下，菌株自身的代谢活性酶不同，由表6可知，低温长时发酵更有利于代谢产物的积累，当L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2于30℃恒pH5.0发酵30h时，混合发酵液中益生菌活菌含量、超氧化物歧化酶和透明质酸含量最高，混合发酵液中乳酸菌活菌数为6.48×109CFU/mL，超氧化物歧化酶(SOD)为95.7U/mL，透明质酸含量为107.9μg/mL。
因此，本申请优选发酵温度为30℃。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京科拓恒通生物技术股份有限公司
<120> 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tctgtcactt aggcggctgg ttcctaaaag gttaccccac cgactttggg tgttacaaac 60
tctcatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact 180
gagaatggct ttaagagatt agcttactct cgcgagttcg caactcgttg taccatccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg caactgataa 360
taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 420
catgcaccac ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt 480
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540
tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga 600
atgcttaatg cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat 660
cgtttacggt atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct 720
cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg 780
catttcaccg ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc 840
cgatgcactt cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc 900
tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 960
gcacgtagtt agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca gttactctca 1020
gatatgttct tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc 1080
gttgctccat cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag 1140
tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat 1200
tgccatggtg agccgttacc ccaccatcta gctaatacgc cgcgggacca tccaaaagtg 1260
atagccgaag ccatctttca aactcggacc atgcggtcca agttgttatg cggtattagc 1320
atctgtttcc aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt actcaccagt 1380
tcgccactca ctcaaatgta aatcatgatg caagcaccaa tcaataccag agttcgtcga 1440
ctgcattata gcaccccgca c 1461

Claims (11)

1.一株分离的植物乳杆菌(L.plantarum)C2菌株，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCC No.14532。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌菌株在制备护肤品中的应用。
3.一种制备益生菌发酵液的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1，将植物乳杆菌(L.plantarum)P-8，动物双歧杆菌乳亚种(B.lactis)V9，干酪乳杆菌(L.casei)Zhang和植物乳杆菌(L.plantarum)C2四株菌株接种于培养基中，其中，L.plantarum P-8的微生物保藏编号为CGMCC No.6312，B.lactis V9的微生物保藏编号为CGMCC No.5470，L.casei Zhang的微生物保藏编号为CGMCC No.5469和L.plantarum C2的微生物保藏编号为CGMCC No.14532；
步骤2，将步骤1得到的体系在恒温、恒pH的条件下发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的接种比例为L.plantarum P-8的活菌数量:B.lactis V9的活菌数量:L.casei Zhang的活菌数量:L.plantarum C2的活菌数量＝(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述L.plantarum P-8，B.lactis V9，L.casei Zhang和L.plantarum C2的接种比例为L.plantarum P-8的活菌数量:B.lactis V9的活菌数量:L.casei Zhang的活菌数量:L.plantarum C2的活菌数量＝(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所用的培养基包括：
Figure FDA0002460455240000011
其中，基于1g计为1重量份。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，体系的pH为4.5～7.0。
8.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在步骤2中，体系的温度为25℃～40℃。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在步骤2中，发酵的时间为20h～50h。
10.根据权利要求9所述方法制备的益生菌发酵液，其特征在于，所述益生菌发酵液中，
益生菌活菌数为(5～7)×109CFU/mL，和/或
超氧化物歧化酶为(95～98)U/mL，和/或
透明质酸含量为(107～110)μg/mL。
11.根据权利要求10所述的益生菌发酵液在制备护肤品中的应用。
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