CN104845904B

CN104845904B - 一种植物乳杆菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN104845904B
Application number: CN201510089823.0A
Authority: CN
Inventors: 李兴峰; 贾英民; 宁亚维; 王志新; 王娟; 闫爱红
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2035-02-27
Also published as: CN104845904A

Abstract

本发明涉及一种植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)及其应用以及利用该菌株生产的泡菜。本发明的植物乳杆菌来源于中国传统发酵食品，是公认为安全的菌种，在泡菜中产生苯乳酸，能更好的发挥其益生功能。本发明提供的泡菜，同时富含乳酸菌和苯乳酸，乳酸菌活菌数为10⁸cfu/g，苯乳酸的含量可以达到217mg/kg。是一种具有较高营养价值和益生功能的中式泡菜。

Description

一种植物乳杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体的，涉及一种植物乳杆菌菌株及其应用。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，分子式为C₉H₁₀O₃，即2-羟基-3苯基丙酸，也称β-苯乳酸或3-苯基乳酸，是一种功能性的酚酸。苯乳酸安全性高，有多种促进健康的功能性质，是一种新型的功能因子，在食品、功能性食品和化妆品中有广阔的应用前景。

苯乳酸是一种新型生物防腐剂，具有良好的抑菌性，能够抑制G⁺、G^-和真菌，且具有易于在食品中扩散、热稳定高等优点。Dieuleveus等人的报道指出苯乳酸亲水性好、稳定性好，熔点为121-125℃；活性在宽广的pH范围内均保持稳定，在121℃下维持20min不被破坏。Lavermicocca报道了苯乳酸对多种引起焙烤食品腐败的真菌有抑菌作用，如黄曲霉、赭曲霉、土曲霉、青霉属的娄地青霉、桔青霉、团青霉、疣孢青霉以及产黄青霉等。

苯乳酸具有促进健康的药理作用。苯乳酸是丹参素(3,4-二羟基苯乳酸，Danshensu)的类似物，与丹参素的药理作用相同，具有扩张冠状动脉的作用。王钰英等研究发现苯乳酸对家兔急性心肌梗塞有一定疗效，对缺血性心脏病的防治作用是有利的，与普萘洛尔作用相似。其扩张冠状动脉作用可能是通过提高PGI2(血浆前列环索)/TXA2(血栓素)的比值，或者是直接作用于血管的作用。程彰华报道了苯乳酸具有抑制血小板聚集、抑制血栓形成及改善微循环的特点。此外，Yamamoto等人研究表明苯乳酸对人体内类固醇水平有一定的调节作用。

苯乳酸的安全性高。国内外研究表明：苯乳酸是乳酸菌的代谢产物，安全无毒，是一种天然防腐剂。它存在于天然蜂蜜中，对人和动物细胞无毒。乳酸菌是公认为安全的微生物，千百年来用于食品保藏。因此，苯乳酸被认为是继乳酸菌产生的第一代抑菌物质如乳酸、醋酸，第二代抑菌物质如Nisin(乳链球菌肽)等细菌素以外，可用于食品体系的新型抑菌物质。

近10余年来，利用乳酸菌生物合成苯乳酸是国内外学者研究的重点。在微生物培养基中添加苯丙酮酸可以显著提高苯乳酸的含量，但这种途径不适合于食品生产，原因是苯丙酮酸不是食品原料，存在严重的食品安全问题。乳酸菌在食品基质中发酵代谢产生苯乳酸是当前食品工业研究的热点。目前，国外已有将乳酸菌应用于生产面包的酸面团中进行富集，酸面团中苯乳酸含量可以达到5-33.47mg/kg，但苯乳酸的浓度较低。

泡菜是具有中国特色的发酵蔬菜产品，通常利用蔬菜中表面携带的乳酸菌进行自然发酵，主要代谢产物是乳酸和醋酸等有机酸，但泡菜中存在苯乳酸尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株来源安全、易于培养、高产苯乳酸的益生菌以及该益生菌在食品发酵生产中的应用。

为此，本发明的发明人从我国民间自然发酵的发酵蔬菜中，通过筛选、纯化分离出一株具有优良发酵特性和苯乳酸产量的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCCNo.8744，经过BIOMERIEUX公司VITEK 2型全自动微生物鉴定仪生理生化鉴定、补充理化试验和16S rDNA序列测定，鉴定该菌株为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

一般的，在本领域中，选做发酵剂的乳酸菌的作用是通过对糖的发酵产酸而降低pH值。pH值的降低可以抑制致病菌的生长、改善产品色泽、增加食品风味。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.8744符合上述条件。

本发明还提供了一种发酵剂，含有所述植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744。

可选的，所述发酵剂的组成成分包括植物乳杆菌菌株的浓缩菌体和冻干保护剂。

本发明所提供的发酵剂还可以含有发酵可接受的载体，例如海藻糖、碳酸钙、谷氨酸钠、低聚半乳糖、维生素C和硫酸锰等。

可选的，所述发酵剂中植物乳杆菌菌株的含量为10⁸-10¹⁰CFU/g，优选的，为了获得更好的发酵效果，所述发酵剂中，植物乳杆菌菌株的含量为10⁸CFU/g。

可选的，所述浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为1-4：1。最为优选的，所述浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为2：1。

可选的，所述冻干保护剂的组成成分包括海藻糖、谷氨酸钠、低聚半乳糖。

在本发明中，可以首先在培养基中培养植物乳杆菌菌株，再离心获得浓缩菌体，将所述浓缩菌体与冻干保护剂接触混匀后冷冻干燥，获得发酵剂。

具体的，植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744的培养可以按照以下方式进行：

(1)菌种：CGMCC No.8744；

(2)培养基，以g/100ml计：

保藏培养基：MRS培养基添加20％的甘油。葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，乙酸钠5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，柠檬酸三铵2g/L，MnSO₄.4H₂O 0.25g/L，MgSO₄.7H₂O 0.58g/L，吐温80l mL。pH调至6.2-6.4，121℃灭菌20min。

种子培养基：MRS培养基；

(3)制备工艺：

菌种保藏：所用菌种保藏在保藏培养基上，4℃保存，两周转接一次；

种子培养：从保藏培养基转入种子培养基需活化2次，每次37℃培养24h；4℃离心，菌体用灭菌生理盐水制成种子培养液。

本发明还提供了所述植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744或所述食品发酵剂在食品发酵生产中的应用。

可选的所述应用为发酵生产泡菜，包括以下步骤：

先利用蔬菜腌制液对蔬菜原料进行预腌制，再利用所述植物乳杆菌菌株CGMCCNo.8744或所述食品发酵剂对预腌制后的蔬菜原料进行发酵，发酵的条件为在25-38℃下发酵3-7天。

可选的，按质量百分比计，所述蔬菜腌制液中氯化钠的浓度为6-8％。

在本发明中，对于配制蔬菜腌制液所使用的食用盐没有特别的限制，可以为市售的普通食用精盐，也可以是海盐，优选的情况下，所述食用盐为大粒海盐，特别优选的情况下为市售的泡菜专用海盐。

在本发明中，所述蔬菜腌制液中还可以含有其它本领域常规使用的调味剂。

可选的，所述预腌制的方法为：挑选新鲜蔬菜清洗，切分沥干置于泡菜坛中，加入灭菌的蔬菜腌制液，15-30℃下腌制12-24h。

其中，相对于1kg的蔬菜原料，蔬菜腌制液的添加量为1-2kg。

可选的，相对于蔬菜原料的质量，植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744的接种量为1×10⁴-1×10⁵CFU/g进行单一菌种发酵。例如，如果蔬菜原料的质量为1kg，那么植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744的接种量为1×10⁷-1×10⁸CFU。

可选的，为了提高苯乳酸含量，所述应用还包括在预腌制结束后，在蔬菜腌制液中添加苯丙氨酸至苯丙氨酸的浓度为0.5-2g/L，然后再进行后续发酵步骤。

可选的，为了提高苯乳酸含量，所述应用还包括在预腌制结束后，在蔬菜腌制液中添加入苯丙氨酸和a-酮戊二酸，然后再进行后续发酵步骤；其中，蔬菜腌制液中苯丙氨酸和a-酮戊二酸的摩尔浓度相等，为3-18mM。

可选的，为了提高苯乳酸含量，所述应用还包括在预腌制结束后，在蔬菜腌制液中添加入苯丙氨酸和柠檬酸，然后再进行后续发酵步骤；其中，蔬菜腌制液中苯丙氨酸和柠檬酸的摩尔浓度相等，为15-30mM。

可选的，所述蔬菜选自豆角、芥菜、甘蓝、白菜、萝卜、黄瓜、青椒、姜、胡萝卜、大蒜中的至少一种。

本发明还提供了利用本发明所述的植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744或所述的食品发酵剂生产的泡菜产品。

优选的，所述泡菜产品为中式泡菜产品。

本发明所提供的泡菜产品，同时富含乳酸菌和苯乳酸，乳酸菌活菌数为10⁸cfu/g，苯乳酸的含量可以达到217mg/kg。

本发明提供了一种来源安全的益生菌。首次提供了利用乳酸菌发酵蔬菜制备出含有苯乳酸的泡菜。苯乳酸是一种新型的生理活性物质，具有抗菌消炎、降血脂、预防心血管疾病等功能性质。本发明的植物乳杆菌来源于中国传统发酵食品，是公认为安全的菌种，在泡菜中产生苯乳酸，能更好的发挥其益生功能。本发明提供的泡菜，不仅含有乳酸菌，而且富含苯乳酸，是一种具有益生功能的中式泡菜和具有较高营养价值的发酵食品。

本发明所提供的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)已于2014年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCCNo. 8744。

附图说明

图1为实施例2生产的泡菜中苯乳酸的高效液相色谱图，其中，峰1为苯乳酸的保留时间；A为苯乳酸的标准品，B为泡菜中的苯乳酸。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。

以下实施例中：

所使用的菌株通过以下方式制备：

(1)菌种：CGMCC No.8744；

(2)培养基，以g/100ml计：

保藏培养基：MRS培养基添加20％的甘油。葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，乙酸钠5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，柠檬酸三铵2g/L，MnSO₄.4H₂O 0.25g/L，MgSO₄.7H₂O 0.58g/L，吐温80l mL。pH调至6.2-6.4。121℃灭菌20min。

种子培养基：MRS培养基；

(3)制备工艺：

种子培养：从保藏培养基转入种子培养基需活化2次，每次37℃培养24h；4℃离心，菌体用灭菌生理盐水0.85％洗涤制成种子培养液。

以下实施例中所使用的蔬菜腌制液中氯化钠含量为8％(按质量百分比计)。所述蔬菜腌制液利用购自中盐河北盐业专营有限公司的海晶牌粒粒晶泡菜专用海盐加纯水配制，并进行了高温灭菌。

泡菜中苯乳酸和乳酸菌活菌数的检测方法如下：

准确称取泡菜样品10g，打浆并加水定容到20mL，超声波提取20min，离心(10000g)20min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，置于4℃冰箱中冷藏待用。色谱条件：流动相为0.05％的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05％的三氟乙酸/水(B)的混合液，梯度洗脱程序为：0-20min由10％A线性变化至100％，20-23min保持100％A，23-25min100％A线性变化至10％。流速1ml/min，检测波长210nm，柱温30℃。

乳酸菌活菌数的检测方法：在超净台上定时从泡菜坛中取泡菜，样品经过梯度稀释，选择适当的三个梯度，涂布在MRS固体培养基上，每组试验做三个平行，37℃培养24h后，活菌计数。

实施例1

本实施例用于说明蔬菜种类对乳酸菌发酵泡菜中苯乳酸的研究。

挑选新鲜豆角、芥菜和甘蓝各1000g，清洗切分沥干置于泡菜坛中，按料液质量比1:1加入灭菌的蔬菜腌制液，25℃腌制24h。将活化2代的植物乳杆菌CGMCC No.8744按1×10⁵CFU/g的接种量(相对于蔬菜原料的质量)进行接种，液封30℃静置培养，发酵5天得到泡菜产品。测定泡菜中的苯乳酸及乳酸菌的活菌数，结果见表1所示，不同蔬菜种类对泡菜中苯乳酸浓度有显著影响，豆角中的苯乳酸含量最高，其次是芥菜，甘蓝最低。

表1

蔬菜种类	豆角	芥菜	甘蓝
				苯乳酸(mg/kg)	28-32	17-23	12-18
乳酸菌活菌数(Log CFU/g)	9	8	7

实施例2

本实施例用于说明盐水预腌对乳酸菌发酵泡菜中苯乳酸富集的影响。

挑选新鲜豆角1000g，清洗切分沥干置于泡菜坛中，按料液质量比1:1加入灭菌的蔬菜腌制液，按照表2所给出的时间在25℃下腌制。将活化2代的植物乳杆菌CGMCC No.8744按1×10⁵CFU/g的接种量(相对于蔬菜原料的质量)进行接种，液封30℃静置培养，发酵5天得到泡菜产品。测定泡菜中的苯乳酸及乳酸菌的活菌数，结果见表2所示，盐水预腌时间对泡菜中苯乳酸浓度有显著影响，预腌24h的苯乳酸含量最高，预腌12h次之，不预腌最低。

表2

盐水预腌时间(h)	0h(不预腌)	12h	24h
				苯乳酸(mg/kg)	16-20	21-26	29-32
乳酸菌活菌数(Log CFU/g)	7	8	9

实施例3

本实施例用于说明发酵温度对乳酸菌发酵泡菜中苯乳酸富集的影响。

挑选新鲜豆角1000g，清洗切分沥干置于泡菜坛中，按料液质量比1:1加入灭菌的蔬菜腌制液，25℃腌制24h。将活化2代的植物乳杆菌CGMCC No.8744按1×10⁵CFU/g的接种量(相对于蔬菜原料的质量)进行接种，液封，按照表3中的发酵温度静置培养，发酵5天得到泡菜产品。测定泡菜中的苯乳酸及乳酸菌的活菌数，结果见表3所示，发酵温度对泡菜中苯乳酸浓度有显著影响，30℃发酵时苯乳酸含量最高，其次是37℃，10℃最低。

表3

发酵温度(℃)	10℃	30℃	37℃
				苯乳酸(mg/kg)	10-15	30-32	20-30
乳酸菌活菌数(Log CFU/g)	6	8	9

实施例4

本实施例用于说明发酵时间对乳酸菌发酵泡菜中苯乳酸富集的影响。

挑选新鲜豆角1000g，清洗切分沥干置于泡菜坛中，按料液质量比1:1加入灭菌的蔬菜腌制液，25℃腌制24h。将活化2代的植物乳杆菌CGMCC No.8744按1×10⁵CFU/g的接种量(相对于蔬菜原料的质量)进行接种，液封30℃静置培养，按表4中列出的时间发酵得到泡菜产品。测定泡菜中的苯乳酸及乳酸菌的活菌数，结果见表4所示，发酵时间对泡菜中苯乳酸浓度有显著影响，发酵1天时苯乳酸含量很低，发酵3天迅速增加，到第5天时达到最高，发酵7天略有下降，随后保持稳定。

表4

发酵时间(天)	1	3	5	7	10
						苯乳酸(mg/kg)	2-3	20-24	30-32	28-32	28-32
乳酸菌活菌数(Log CFU/g)	5	6	7	8	7

实施例5

本实施例用于说明添加苯丙氨酸对乳酸菌发酵泡菜中苯乳酸富集的影响。

挑选新鲜豆角1000g，清洗切分沥干置于泡菜坛中，按料液质量比1:1加入灭菌的蔬菜腌制液，25℃腌制24h。腌制结束后，按照表5中给出的浓度在腌制液中添加苯丙氨酸0-2g/L。将活化2代的植物乳杆菌CGMCC No.8744按1×10⁵CFU/g的接种量(相对于蔬菜原料的质量)进行接种，液封30℃静置培养，发酵5天得到泡菜产品。测定泡菜中的苯乳酸及乳酸菌的活菌数，结果见表5所示，添加苯丙氨酸对泡菜中苯乳酸浓度有显著影响，随着苯丙氨酸浓度的增加，苯乳酸随之增加；添加2g/L的苯丙氨酸，苯乳酸浓度可达40-42mg/kg。

表5

苯丙氨酸(g/L)	0	0.25	0.5	1	1.5	2
							苯乳酸(mg/kg)	30-32	32-34	34-36	36-38	38-40	40-42
乳酸菌活菌数(Log CFU/g)	7	7	7	8	8	8

实施例6

本实施例用于说明同时添加苯丙氨酸和a-酮戊二酸对乳酸菌发酵泡菜中苯乳酸富集的影响。

挑选新鲜豆角1000g，清洗切分沥干置于泡菜坛中，按料液质量比1:1加入灭菌的蔬菜腌制液，25℃腌制24h。腌制结束后，按照表6中给出的浓度在腌制液中等摩尔比例添加苯丙氨酸和a-酮戊二酸。将活化2代的植物乳杆菌CGMCC No.8744按1×10⁵CFU/g的接种量(相对于蔬菜原料的质量)进行接种，液封30℃静置培养，发酵5天得到泡菜产品。测定泡菜中的苯乳酸及乳酸菌的活菌数，结果见表6所示，同时添加苯丙氨酸和a-酮戊二酸对泡菜中苯乳酸浓度有极其显著的影响，随着两者浓度的增加，苯乳酸随之增加；当添加15mM的苯丙氨酸和a-酮戊二酸，苯乳酸浓度可达195-201mg/kg。

表6

实施例7

本实施例用于说明同时添加苯丙氨酸和柠檬酸对乳酸菌发酵泡菜中苯乳酸富集的影响。

挑选新鲜豆角1000g，清洗切分沥干置于泡菜坛中，按料液质量比1:1加入灭菌的蔬菜腌制液，25℃腌制24h。腌制结束后，按照表7中给出的浓度在腌制液中添加苯丙氨酸和柠檬酸。将活化2代的植物乳杆菌CGMCC No.8744按1×10⁵CFU/g的接种量(相对于蔬菜原料的质量)进行接种，液封30℃静置培养，发酵5天得到泡菜产品。测定泡菜中的苯乳酸及乳酸菌的活菌数，结果见表7所示，同时添加苯丙氨酸和柠檬酸对泡菜中苯乳酸浓度有极其显著的影响，随着两者浓度的增加，苯乳酸随之增加；当添加15mM的苯丙氨酸和柠檬酸，苯乳酸浓度可达95-100mg/kg。

表7

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)，于2014年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8744。

2.一种食品发酵剂，其特征在于，含有权利要求1所述的植物乳杆菌菌株CGMCCNo.8744。

3.根据权利要求2所述的食品发酵剂，其特征在于，所述食品发酵剂的组成成分包括所述植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744的浓缩菌体和冻干保护剂。

4.权利要求1所述的植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744或权利要求2-3中任意一项所述的食品发酵剂在食品发酵生产中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为发酵生产泡菜，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，相对于蔬菜原料的质量，植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744的接种量为1×10⁴-1×10⁵CFU/g。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，按质量百分比计，所述蔬菜腌制液中氯化钠的浓度为6-8％；其中，相对于1kg的蔬菜原料，蔬菜腌制液的添加量为1-2kg。

8.根据权利要求5-7中任意一项所述的应用，其特征在于，所述应用还包括在预腌制结束后，在蔬菜腌制液中添加苯丙氨酸至苯丙氨酸的浓度为0.5-2g/L，然后再进行后续发酵步骤。

9.根据权利要求5-7中任意一项所述的应用，其特征在于，所述应用还包括在预腌制结束后，在蔬菜腌制液中添加入苯丙氨酸和a-酮戊二酸，然后再进行后续发酵步骤；

其中，蔬菜腌制液中苯丙氨酸和a-酮戊二酸的摩尔浓度相等，为3-18mM。

10.根据权利要求5-7中任意一项所述的应用，其特征在于，所述应用还包括在预腌制结束后，在蔬菜腌制液中添加入苯丙氨酸和柠檬酸，然后再进行后续发酵步骤；

其中，蔬菜腌制液中苯丙氨酸和柠檬酸的摩尔浓度相等，为15-30mM。

11.利用权利要求1所述的植物乳杆菌菌株CGMCC No.8744或权利要求2-4中任意一项所述的食品发酵剂生产的泡菜产品。