CN111996146B - 一株高产苯乳酸的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株高产苯乳酸的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株植物乳杆菌及其应用，该菌株其被命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2‑0069，该菌株已于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020388。本发明的菌株具有优良的发酵和高产苯乳酸性能，可用于发酵豆粕。因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一株高产苯乳酸的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株高产苯乳酸的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
饲用抗生素在养殖生产中的大量长期使用，会导致病原菌耐药性、药物残留和环境污染等问题，对食品安全和人类健康造成严重威胁。农业农村部发布第194号公告，自2020年1月1日起开始全面禁抗，从在饲料中“减抗/替抗”，到现如今“饲料禁抗”政策法规的正式颁布，寻找安全高效环保的饲料已成为饲料行业的研究热点和发展方向。近年来，微生物发酵饲料，特别是乳酸菌发酵饲料，在畜禽生产中得到了广泛的研究和应用。但是，生物发酵饲料由于未进行消毒灭菌(若对发酵饲料进行消毒，会破坏饲料中的营养成分，造成其营养流失)，存在易变质、易霉变、安全性差等问题，需要通过在生物发酵饲料中额外添加防腐剂来解决上述问题，但防腐剂大量使用会对畜禽的生产性能及安全性造成影响，同时增加发酵饲料成本。
苯乳酸也称3-苯乳酸或β-苯乳酸，是一种广泛存在自然界中的小分子天然有机酸，其分子式为C9H10O3，相对分子质量为166。苯乳酸是近年来发现的可以由部分乳酸菌分泌的一种具有广谱抗菌性的新型抑菌剂，能抑制食源性致病菌、腐败菌，特别能抑制真菌的污染；溶解性好、易于在食品体系中扩散；稳定性高、具有宽广的pH范围和热稳定性。苯乳酸作为天然防腐剂价格高昂，目前合成方法主要有化学合成和生物合成。其中化学合成存在许多不利因素，比如技术条件复杂、反应条件严苛、环境污染比较大等。生物合成苯乳酸是一种新方法，微生物在合成苯乳酸起到防腐效果的同时还能产生其它有机酸成分，是目前普遍认可的一种成本低、效果好、使用安全的方法。乳酸菌，是一种广泛应用于食品、畜牧行业的益生菌，乳酸菌发酵饲料可以产生大量乳酸菌、乳酸和总酸等营养物质，改善饲料营养品质。因此筛选高产苯乳酸的乳酸菌应用于发酵饲料具有重要意义。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一株高产苯乳酸的植物乳杆菌及其应用，其菌来源安全、易于培养且高产苯乳酸。
具体地，本发明的技术方案如下所示：
在本发明的第一方面，本发明提供了一株植物乳杆菌，其命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069，该菌株已于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020388。
一般的，在本领域中，选做发酵剂的乳酸菌的作用是通过对糖的发酵产酸而降低pH值。pH值的降低可以抑制致病菌的生长、改善产品色泽、增加产品风味。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069符合上述条件。
实际上，上述植物乳杆菌是申请人自发酵食品泡菜中，通过筛选、纯化分离出的一株具有优良的发酵特性和高产苯乳酸的植物乳杆菌。同时，其可以以苯丙氨酸和苯丙酮酸为底物进行发酵，极大提升苯乳酸产量，以苯丙酮酸作为底物时效果最好，发酵48h苯乳酸产量高达4.387g/L。而在发酵豆粕中，通过优化条件，苯乳酸含量最高可达到624.499mg/kg，表现出极佳的苯乳酸高产性能。
为了便于陈述，本发明所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069在申请文件中也会简写为菌株BLCC2-0069或BLCC2-0069。
本发明的菌株BLCC2-0069为革兰氏染色阳性菌，可在MRS培养基中培养，30℃培养48h，形成乳白色圆形菌落、白色、凸起、光滑、湿润、易挑取。在显微镜下观察发现，其菌体细胞形态为杆状，单独、成对或短链排列。
优选的，所述MRS培养基组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸锰0.2g/L、硫酸镁0.5g/L、吐温-801g/L，pH 6.0，121℃灭菌30min。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种菌剂，其包含上述第一方面所述的植物乳杆菌或其发酵物或其代谢产物。
本发明所述的代谢产物包括菌体胞内代谢产物和/或胞外代谢产物。
术语发酵物用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养植物乳杆菌BLCC2-0069细菌的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的BLCC2-0069细菌产生的代谢物。
以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”(在本发明的实施方式中，上清液被标记为CFS)，并且在本发明中，上清液内含有BLCC2-0069的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。
以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物(在本发明的实施方式中，无细胞提取物被标记为CFE)，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有BLCC2-0069的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。
在本发明的第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的植物乳杆菌或上述第二方面所述的菌剂在制备发酵剂中的应用。
在本发明的实施方式中，所述发酵剂可以是乳制品发酵剂、果蔬制品发酵剂或豆制品发酵剂。
其中，所述乳制品包括但不限于酸奶、酸奶油、干酪。
所述豆制品包括但不限豆豉、豆酱、豆粕；优选为豆粕。
所述果蔬制品中果蔬包括但不限于黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜。
在本发明的第四方面，本发明提供一种发酵豆粕的制备方法，所述方法包括豆粕中加入水、糖蜜、中性蛋白酶以及苯丙酮酸，得到发酵原料；再在发酵原料中接入上述第一方面所述植物乳杆菌，进行发酵，得到富含苯乳酸的发酵豆粕。
其中，所述豆粕可以是国产去皮豆粕，植物乳杆菌接种量控制为0.5～5％，优选为2％；苯丙酮酸、中性蛋白酶和糖蜜的加入量，按豆粕计，分别为豆粕的0.1～0.5％，0.5～2.0％，2.0～5.0％，优选为0.15％，1.0％和3.0％。
在本发明的第五方面，本发明提供上述第四方面制备得到的发酵豆粕，其具有良好的发酵品质，同时富含苯乳酸，因此具有良好的防腐性能。
在本发明的第六方面，本发明提供一种发酵豆粕饲料，所述饲料包含上述第五方面的发酵豆粕。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
本发明首先筛选获得一株具有良好发酵性能和高产苯乳酸的植物乳杆菌BLCC2-0069，同时以筛选获得的植物乳杆菌BLCC2-0069作为发酵菌株，以豆粕、水、糖蜜、中性蛋白酶以及苯丙酮酸作为发酵原料，通过固态发酵工艺制备得到了可作为饲料使用的发酵豆粕；不仅有效的抑制了致病菌的生长、大大延长了饲料的保质期，并且，也使得得到的发酵豆粕饲料有良好的适口性；利用本发明方法制备得到的发酵豆粕中苯乳酸含量可达到最高624.499mg/kg，具有保质期长、适口性好、安全等优势；利用本发明方法制备得到的发酵豆粕除了能够防止饲料致病菌的产生，其在发酵过程中产生的多种有机酸也对家畜生长有益，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中苯乳酸标准品标准曲线图谱。
图2为实施例1中苯丙酮酸标准品标准曲线图谱。
图3为实施例1中苯乳酸、苯丙酮酸标准品混标图谱。
图4为实施例1中BLCC2-0069菌落图。
图5为实施例1中BLCC2-0069显微镜下菌体形态图。
图6为实施例2中BLCC2-0069产苯乳酸的薄层层析检测结果图，A、B、C、D分别代表苯丙酮酸标样、苯乳酸标样、苯乳酸发酵液、苯乳酸发酵液。
图7为实施例4中不同时间点取样对发酵液pH的影响图。
图8为实施例4中不同时间点取样对发酵液活菌数的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
1材料与方法
1.1试验材料
苯丙酮酸标准品(分析纯，纯度≥99.5％)、DL-3苯乳酸标准品(分析纯，纯度≥98％)均购自美国Sigma公司。
1.2培养基
MRS培养基：葡萄糖2.0％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、吐温-800.1％，pH6.0，固体培养基需要加1.5％琼脂粉，均为质量百分数；
富集培养基：MRS琼脂培养基中加入2.0g/L的DL-3苯乳酸标准品；
初筛1下层培养基：MRS琼脂培养基中加入5.0g/L的苯丙酮酸；
初筛1上层培养基：MRS琼脂培养基中加入30g/L的碳酸钙(单独灭菌)；
初筛2下层培养基：同初筛1下层培养基；
初筛2上层培养基：LB琼脂培养基；
保藏培养基：MRS琼脂培养基；
发酵培养基：改良MRS液体培养基中加入5.0g/L的苯丙酮酸。
1.3指示菌
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院菌种保藏中心分离保存。
1.4试验方法
1.4.1分离样品：发酵食品泡菜。
1.4.2苯乳酸含量的测定：采用高效液相色谱(HPLC)法测定发酵液中苯乳酸的产量。
1.4.3苯乳酸产生菌筛选方法
在无菌操作台中将发酵食品泡菜捣碎倒入三角瓶中，加20mL无菌水充分震荡，取1mL接入富集培养基中，30℃培养24h进行菌种富集。取0.1mL经适当稀释的菌液接入初筛1下层培养基，30℃培养24h后，注入初筛1上层培养基，继续培养24h，挑取溶钙圈大的菌落接种至初筛2下层培养基上，30℃培养24h后，注入初筛2上层培养基，凝固后接入指示菌，继续培养24h后，挑取抑菌圈大的菌落划线纯化。初筛后的菌株分别接入发酵培养基中，30℃兼性厌氧培养48h后，采用高效液相色谱法(HPLC法)测定发酵液中苯乳酸的产量，挑取高产苯乳酸菌株进行斜面和甘油保存。
1.4.4发酵液中苯乳酸的检测方法
1.4.4.1标准溶液的配制
分别准确称取DL-3苯乳酸标准品0.2058g(实含苯乳酸0.2048g)、苯丙酮酸标准品0.2143g(实含苯丙酮酸0.21g)，用超纯水溶解后定容至100mL，配制成2.048g/L的苯乳酸标准溶液和2.1g/L的苯丙酮酸标准溶液。然后从中分别吸取0.625mL、1.25mL、2.5mL和5.0mL用超纯水定容至10.0mL，各组分质量浓度如表1。
表1混合标准溶液浓度梯度组成/g.L-1
Figure BDA0002658687180000071
浓度由低至高进样测定，以峰面积和浓度作图，得到苯乳酸标准曲线回归方程，为：Y＝0.00000002151X-0.1092(R2＝0.9955)。
1.4.4.2检测方法：
发酵液经10000r/min，离心5min和0.22μm滤膜过滤后，采用岛津LC-20A高效液相色谱，SPD-20A岛津检测器进行分析。参考《苯乳酸的快速检测研究》、《苯乳酸的微生物合成及分离》等文献，色谱柱：InertSustain AQ-C185μm 4.6×250mm(W)，柱温箱：30℃，进样量：20μL，流速：1.0mL/min。流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液，流动相B：0.05％三氟乙酸甲醇溶液；梯度洗脱条件：0-15min流动相B的比例由40％升至80％，15-16min流动相B的比例保持80％，16-18min流动相B的比例由80％降至40％，洗脱完成。检测波长210nm。
1.4.5菌株鉴定
(1)形态学鉴定
挑取产苯乳酸效果较好的菌株的纯培养物接种于MRS培养基平皿中，30℃培养48h，观察菌落形态。
(2)分子生物学鉴定
将目的菌株接种于新鲜的MRS液体培养基中培养24h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：
1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’(SEQ ID NO.2)；
27f：5’-agagttgatcctggctcag-3’(SEQ ID NO.3)。
PCR反应体系(50μL)为：Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。
2试验结果
2.1高效液相色谱法(HPLC法)标准曲线
DL-3苯乳酸标准品、苯丙酮酸标准品和两者混合的标准曲线图谱分别见图1、图2和图3。
2.2菌株的分离筛选：将从发酵食品泡菜中分离得到的形态特征不同的单菌落经纯化后分别接种到含苯丙酮酸的筛选培养基平板上，挑取抑菌圈大的菌落划线纯化。初筛后的菌株分别接入发酵培养基中，30℃兼性厌氧培养48h后，采用高效液相色谱法(HPLC法)分析发酵液中苯乳酸的产量，得到一株产苯乳酸最高的菌株，编号为BLCC2-0069。
2.3 BLCC2-0069菌株的鉴定
2.3.1形态学鉴定
菌株BLCC2-0069在30℃培养48h后，培养基上的菌落形态为白色、凸起、光滑、湿润、易挑取(如图4所示)，在显微镜下观察菌体形态为杆状，单独、成对或短链排列，如图5所示，从菌落形态和菌体形态上初步判断为一种乳杆菌。
2.3.2分子生物学鉴定
菌株BLCC2-0069的16S rDNAPCR产物电泳结果显示，在分子量大小为1500bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致，并进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示。将测序序列与http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上已登录的部分菌株的16S rDNA基因序列进行比对，结果表明，菌株BLCC2-0069与已报道的Lactobacillusplantarum(MT464064.1、MG983980.1、MK418664.1和MT463807.1等)的序列同源性为99％。鉴定BLCC2-0069菌株属于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，其16S rDNA序列如下：
CGTGGCGGGGTCCCTATACATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGCAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAAGTGGAACCT(SEQ ID NO.1)。
实施例2：不同乳酸菌发酵液产苯乳酸能力定性比较
1材料与方法
1.1材料
1.1.1苯丙酮酸标准品(分析纯，纯度≥99.5％)、DL-3苯乳酸标准品(分析纯，纯度≥98％)均购自美国Sigma公司。
1.1.2被试菌株：本发明实施例1筛选得到的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069。乳酸菌BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0021、BLCC2-0063、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0126、BLCC2-0296和BLCC2-0410均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种资源保藏中心提供。
1.1.3苯乳酸样品的获得
苯丙酮酸、DL-3苯乳酸标准品分别用去离子水配制成1mg/mL。
苯乳酸发酵样品的获得：本发明实施例1筛选得到的植物乳杆菌BLCC2-0069和山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种资源保藏中心保藏的乳酸菌BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0021、BLCC2-0063、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0126、BLCC2-0296和BLCC2-0410，以含苯丙酮酸为底物(含量为3g/L)的MRS培养基发酵培养，37℃静置发酵24h；4000r/min离心10min，弃菌体，取发酵上清液为苯乳酸发酵样品进行检测分析。
1.2方法
吸取5-8μL的上述发酵上清液，点样至硅胶板，进行薄层层析检测分析。点样时在硅胶板距离下边缘1.5cm处用铅笔划线，用0.2-2μL的移液枪吸取样品处理液2μL，分多次点样，每次点样都要用吹风机迅速吹干，少量多次，两个样品的点样点相距2cm。展开剂V(三氯甲烷)：V(甲醇)：V(冰醋酸)＝8:1:0.1；层析结束后在85℃加热10min，先用0.1g/mL硫酸的甲醇溶液处理，烘干后再用0.05g/mL磷钼酸的甲醇溶液进行显色，再置于110℃中加热10min，观察现象，样品在白色背景上呈现蓝色斑点。2min左右，苯丙酮酸层析条带开始显蓝色，8min左右，苯乳酸层析条带开始显蓝色。
2结果
对被试菌株发酵液进行薄层层析检测分析，结果显示菌株BLCC2-0021、BLCC2-0069和BLCC2-0410在以苯丙酮酸为底物时可以产生苯乳酸，其余菌株未检测到苯乳酸产生。
实施例3：不同乳酸菌发酵液产苯乳酸能力定量比较
1材料与方法
1.1材料
1.1.1苯丙酮酸标准品(分析纯，纯度≥99.5％)、DL-3苯乳酸标准品(分析纯，纯度≥98％)均购自美国Sigma公司。
1.1.2被试菌株：本发明实施例1筛选得到的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069。乳酸菌BLCC2-0021和BLCC2-0410均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种资源保藏中心提供，均由实施例2薄层层析法验证可以产生苯乳酸。
1.1.3MRS培养基：按质量百分数计：葡萄糖2.0％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、吐温-800.1％，pH 6.0，固体培养基需要加1.5％琼脂粉。
1.2试验方法
1.2.1苯乳酸样品的获得
被试菌株分别接种到MRS液体培养基中静止培养，各接种3组，每组3个重复。试验1组：MRS液体培养基中额外添加3.0g/L苯丙氨酸；试验2组：MRS液体培养基中额外添加3.0g/L苯丙酮酸；第3组为对照组，不额外添加任何添加剂，放入37℃培养箱静置培养24小时和48小时。
1.2.2发酵液样品预处理
分别取24h和48h发酵液5.0mL，10000rpm离心5min，上清液经0.22μm滤膜过滤后即为待测样品，利用高效液相色谱法(HPLC法)检测发酵液中苯乳酸含量，方法同本发明实施例1中苯乳酸检测方法。
2结果
2.1不同菌株发酵液对苯乳酸含量的影响
表2不同菌株发酵液对苯乳酸含量的影响(g/L)
Figure BDA0002658687180000121
注：不同小写字母表示结果差异显著(P＜0.05)，相同字母或无字母表示结果差异不显著(P＞0.05)。下表同。
由表2可知，24h时菌株BLCC2-0069发酵液中苯乳酸含量最高，为1.259g/L，显著高于其余各菌株(P＜0.05)；48h时菌株BLCC2-0069发酵液中苯乳酸含量为1.435g/L，分别高于菌株BLCC2-0021和BLCC2-041058.21％和8.79％，差异显著(P＜0.05)。
2.2不同添加底物对BLCC2-0069发酵液苯乳酸含量的影响
表3不同底物对菌株BLCC2-0069发酵液苯乳酸含量的影响(g/L)
Figure BDA0002658687180000122
Figure BDA0002658687180000131
分别测定菌株BLCC2-0069以苯丙氨酸和苯丙酮酸为底物发酵24h和48h发酵液中苯乳酸含量，结果见表3。24h时以苯丙酮酸为底物时发酵液中苯乳酸含量最高，为3.965g/L，显著高于对照组和苯丙氨酸组(P＜0.05)。以苯丙氨酸为底物时发酵液中苯乳酸含量次之，为2.099g/L，显著高于对照组66.72％(P＜0.05)；随发酵时间延长发酵液中苯乳酸含量增加，48h时苯丙酮酸为底物时发酵液中苯乳酸含量高达4.387g/L，其次是苯丙氨酸为底物组，但均显著高于对照组(P＜0.05)。以3g/L添加苯丙氨酸和苯丙酮酸均能够提高发酵液中苯乳酸含量，以苯丙酮酸效果最好，发酵48h发酵液中苯乳酸含量高达4.387g/L。
实施例4：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069菌粉的制备
1基础培养基
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069菌株菌粉的生产采用MRS培养基为基础培养基。
2菌种：选用本发明实施例1的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069；
MRS培养基：葡萄糖2.0％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、柠檬酸铵0.2％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、吐温-800.1％，pH6.0，固体培养基需要加1.5％琼脂粉，均为质量百分数。
斜面培养：将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069冻干粉菌种接种于MRS固体斜面培养基上，37℃培养24h；
一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接2环于100mLMRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24h，制得一级种子液；
二级种子培养：将培养好的一级种子液按照2.0％接种量接入3.0L MRS液体培养基中，在37℃条件下静置培养24h，制得二级种子液；
3 500L发酵罐发酵
3.1培养基：同一级种子液培养基，装量为300L。
3.2灭菌
灭菌：空消，121℃30min；
实消：夹层加温，121℃30min完成实消。
3.3接种
待培养基温度降至室温接种，按照2％(体积百分数)接种量接入二级种子液。
3.4发酵：接种后37℃培养，发酵期间每2h取样一次，镜检和检测pH值，待pH值稳定不再下降时停止发酵。
4不同时间点取样对pH值和活菌数的影响
由图8可知，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069在0-4h处于延滞期，4-10h处于对数生长期，10h后进入稳定期。活菌数最高为17.8×108cfu/mL。
5后处理
发酵结束后，立即离心冻干，即得菌粉成品，菌粉活菌数≥1.0×1011cfu/g。
实施例5：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069安全性实验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌株：本发明实施例4制备的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069菌粉，活菌数≥1.0×1011cfu/g。
1.1.2试验动物：昆明系小白鼠，体重20±2g，购自山东鲁抗医药股份有限公司。
1.1.3试验设计：选择体重20±2g健康昆明种小鼠120只，雌雄各半。基础日粮预饲一周后随机分为4组，每组30只，雌雄各15只，分笼喂养，其中一组为对照组，其余三组为试验组，分别灌胃1.0×108cfu/mL、10.0×108cfu/mL和100.0×108cfu/mL植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069菌粉。
1.1.4给药
给药方式为灌胃，各组小鼠禁食16h后，对照组灌胃生理盐水，其余三个试验组分别灌胃生理盐水稀释好的菌粉，按照0.4mL/20g体重的受试样品量进行灌胃给样，连续灌胃两天，每次灌胃后密切观察2h，2h后常规饮食，连续观察14天，每天定时观察记录。
1.1.5观察指标
(1)肉眼观察详细记录被毛和皮肤、眼睛和粘膜、呼吸、循环、自主神经和中枢神经系统、肢体活动和行为等改变。特别注意是否出现震颤、抽搐、流涎、腹泻、嗜睡和昏迷等症状。应记录毒作用体征出现和消失的时间和死亡时间。
(2)小鼠体重于试验开始时、7d和14d分别对每组雌雄小鼠进行称重，比较其体重情况。
(3)病理学检查14d时对各组小鼠全部进行尸检，观察脏器器官病变，对观察有变化的脏器需进行组织病理学检查。
2试验结果
2.1各组小白鼠的生长和死亡情况
表4 BLCC2-0069菌粉对各组雌性小鼠生长和死亡情况的影响
Figure BDA0002658687180000151
由表4可知，在14d观察期内，雌性小鼠体态观察正常，四肢活动正常，对体重无显著性影响，各组均没有出现死亡情况。解剖仔细观察肝脏、肾脏和脾脏，均无肉眼可见病变。
表5 BLCC2-0069菌粉对各组雄性小鼠生长和死亡情况的影响
Figure BDA0002658687180000161
由表5可知，在14d观察期内，雄性小鼠体态观察正常，四肢活动正常，对体重无显著性影响，各组均没有出现死亡情况。解剖仔细观察肝脏、肾脏和脾脏，均无肉眼可见病变。
2.2各组小白鼠的器官指数
表6 BLCC2-0069菌粉对各组小鼠器官指数的影响
Figure BDA0002658687180000162
注：不同小写字母表示结果差异显著(P＜0.05)，相同字母或无字母表示结果差异不显著(P＞0.05)。
由表6可知，BLCC2-0069菌粉对各试验组小白鼠的脾脏指数和肝体比没有显著性影响。
综上，本发明制备的BLCC2-0069菌粉使用安全，无毒副作用。
实施例6：不同乳酸菌发酵豆粕产苯乳酸能力比较
1材料与方法
1.1材料
1.1.1国产去皮豆粕(43％蛋白)：市场购买。黄色，无霉变，无结块，无异味，粉碎后过筛。
1.1.2菌种：本发明实施例1筛选得到的植物乳杆菌BLCC2-0069。BLCC2-0021和BLCC2-0410均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院菌种资源保藏中心分离保存。
1.2方法
1.2.1发酵液制备：从超低温冰箱(-80℃)保存的BLCC2-0069、BLCC2-0021和BLCC2-0410冻干粉菌种接种于MRS固体斜面培养基上，37℃培养24h；将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环挑取一环接种至15mLMRS培养基的15mL西林瓶中，于37℃静置培养24h，取样镜检无杂菌污染。按照2％接种量接种至250mL MRS培养基的250mL盐水瓶中，于37℃静置培养24h，取样镜检无杂菌污染备用；
1.2.2配料：准确称取一定量的国产去皮豆粕，按照0.15％加入苯丙酮酸，料水比为1:0.45(g:mL)，装量200g/袋，压实。按2％接种量分别接入培养好的BLCC2-0069、BLCC2-0021和BLCC2-0410种子液，以不接种任何菌株的空白料为对照组，每组设3个平行，均置于37℃培养箱进行厌氧固体发酵，分别于发酵72h取样，测定发酵料中微生物活菌数、乳酸含量、总酸含量和苯乳酸含量，结果如表所示。
上述指标的测定方法如下：
(1)微生物活菌数的测定
准确称取发酵豆粕10.0g至90mL灭菌后的生理盐水中，搅拌均匀后，用生理盐水10倍递增稀释，采用平板菌落计数法测定发酵料中菌群数量。乳酸杆菌采用LBS培养基，37℃培养48h；霉菌采用孟加拉红培养基30℃培养48h；大肠杆菌采用尹红美蓝培养基，37℃培养24h。根据菌落数计算样品中乳酸菌、霉菌和大肠杆菌活菌数，结果用cfu/g发酵料表示。
(2)乳酸含量的测定
准确称取发酵料3.000g，加85％无水乙醇12mL，将样品混合均匀后，75℃水浴锅水浴30min。待样品冷却后经4000r/min离心5min，取上清至25mL刻度试管，加85％无水乙醇7mL，混匀后经4000r/min离心5min，取上清至25mL刻度试管，再加85％无水乙醇7mL，混匀后经4000r/min离心5min，取上清至25mL刻度试管，将25mL刻度试管定容。取定容后10mL上清液至蒸发皿中，微热条件下蒸干，加2mL超纯水溶解，10000r/min，离心5min，经0.22μm滤膜过滤进行高效液相色谱测定发酵豆粕中乳酸含量。采用岛津LC-20A高效液相色谱，SPD-20A岛津检测器进行分析。参考《GB 5009.157-2016食品安全国家标准食品中有机酸的测定》，色谱柱：InertSustainAQ-C185 um 4.6×250mm，柱温箱：28℃，进样量：20uL，流动相：20mmol/L的磷酸盐溶液，流速：0.8mL/min，检测波长：检测波长210nm。
(3)苯乳酸含量的测定
准确称取发酵料5.000g，加无水甲醇10mL，将样品混合均匀后4℃静止4h，超声30min，混匀后经4000r/min离心5min，取上清至20mL刻度试管，再加无水甲醇10mL，混匀后经4000r/min离心5min，取上清至20mL刻度试管，将20mL刻度试管定容。取定容好的上清液10000r/min，离心5min取上清，经0.22μm滤膜过滤后作为待测样品，采用高效液相色谱法测定苯乳酸含量。
高效液相色谱检测方法同本发明实施例1中苯乳酸检测方法。
(4)总酸含量的检测
采用酸碱滴定法测定样品中总酸含量。参照国标GB/T 12456-2008，食品中总酸的测定，即根据酸碱中和原理，用碱液滴定试液中的酸，以酚酞为指示剂确定滴定终点，按碱液的消耗量计算食品中的总酸含量。
2结果
2.1不同乳酸菌发酵豆粕对pH值、乳酸菌、霉菌和大肠杆菌活菌数的影响
表7不同乳酸菌发酵豆粕对pH值、乳酸菌、霉菌和大肠杆菌活菌数的影响(cfu/g)
Figure BDA0002658687180000191
注：不同小写字母表示结果差异显著(P＜0.05)，相同字母或无字母表示结果差异不显著(P＞0.05)。下表同。
由表7可知，3株乳酸菌发酵72h后pH值均显著低于空白对照组(P<0.05)，其中BLCC2-0069发酵时pH值最低，为4.53；经3株乳酸菌发酵后乳酸菌活菌数均达到109水平，显著高于空白对照组两个数量级(P<0.05)，其中BLCC2-0069发酵时活菌数最高，达到2.15×109CFU/g发酵料；抑制霉菌方面，72h时空白对照组霉菌数量为4.35×104CFU/g发酵料，BLCC2-0021发酵时霉菌数量为0.95×103CFU/g发酵料，BLCC2-0069和BLCC2-0410两菌株发酵时霉菌数量均≤10CFU/g发酵料，说明菌株BLCC2-0069和BLCC2-0410发酵豆粕具有较好的抑制霉菌生长的作用。大肠杆菌均未检出。
2.2不同乳酸菌发酵豆粕对苯乳酸含量、总酸和乳酸含量的影响
表8不同乳酸菌发酵豆粕对苯乳酸含量、总酸和乳酸含量的影响
Figure BDA0002658687180000192
由表8可知，苯乳酸含量方面，与空白对照组相比，BLCC2-0021、BLCC2-0069和BLCC2-0410发酵豆粕72h后均能够显著提高苯乳酸含量(P<0.05)，分别是空白对照组的21.90倍、25.53倍和19.78倍，其中以BLCC2-0069发酵时产苯乳酸能力最强，为424.02mg/kg发酵料；总酸含量方面，与空白对照组相比，BLCC2-0021、BLCC2-0069和BLCC2-0410发酵豆粕72h后均能够显著提高总酸含量(P<0.05)，其中BLCC2-0069发酵时含量最高，显著高于对照组140.60％，其次是BLCC2-0410，两者差异不显著；乳酸含量方面，与空白对照组相比，三个益生菌发酵组均能够显著提高乳酸含量，以BLCC2-0069发酵时乳酸含量最高，均显著高于其余各发酵组(P<0.05)。结合苯乳酸含量、总酸含量和乳酸含量可知，BLCC2-0069发酵豆粕72h可以显著提高发酵料中苯乳酸含量、总酸含量和乳酸含量，改善豆粕品质。
实施例7：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069在发酵豆粕产苯乳酸能力中的应用
从超低温冰箱(-80℃)保存的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BLCC2-0069冻干粉菌种接种于MRS固体斜面培养基上，37℃培养24h；将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环挑取一环接种至15mL MRS培养基的15mL西林瓶中，于37℃静置培养24h，取样镜检无杂菌污染。按照2％接种量接种至250mL MRS培养基的250mL盐水瓶中，于37℃静置培养24h，取样镜检无杂菌污染备用；
配料：准确称取一定量的国产去皮豆粕，料水比为1:0.45(g:mL)，装量200g/袋，压实。试验1组按2％接种量接入培养好的BLCC2-0069种子液；试验2组按豆粕的0.15％加入苯丙酮酸，同时按2％接种量接入培养好的BLCC2-0069种子液；试验3组按豆粕的1.0％和3.0％分别加入中性蛋白酶和糖蜜，同时按2％接种量接入培养好的BLCC2-0069种子液；试验4组按豆粕的0.15％、1.0％和3.0％分别加入苯丙酮酸、中性蛋白酶和糖蜜，同时按2％接种量接入培养好的BLCC2-0069种子液；以不接种任何菌株的空白料为对照组，每组设3个平行，均置于37℃培养箱进行厌氧固体发酵72h，测定发酵料苯乳酸含量，并对发酵料置于室温(20℃左右)干燥处7d，检测发酵料中霉菌和大肠杆菌的变化情况。
1、不同组方发酵豆粕对苯乳酸含量的影响
表9不同组方发酵豆粕对苯乳酸含量的影响(mg/kg)
Figure BDA0002658687180000211
由表9可知，与空白对照组相比，菌液单独发酵豆粕(试验1组)可以显著提高苯乳酸含量，高达218.604mg/kg，是空白对照组的14.28倍；以苯丙酮酸为底物时(试验2组)苯乳酸含量高达426.035mg/kg，是菌液发酵时的1.95倍，差异显著(P＜0.05)；与试验1组菌液发酵相比，添加中性蛋白酶和糖蜜(试验3组)苯乳酸含量显著提高(P＜0.05)，高达513.891mg/kg，是试验1组苯乳酸含量的2.35倍；各试验组间相比，以试验4组苯乳酸含量最高，高达624.499mg/kg。
2、不同组方发酵豆粕室温放置7d对霉菌和大肠杆菌活菌数的影响
表10不同组方发酵豆粕室温放置7d对霉菌和大肠杆菌活菌数的影响(cfu/g)
Figure BDA0002658687180000212
由表10可知，室温放置7d后大肠杆菌未检出。霉菌数量，空白对照组生长至2.1×105水平，菌液单独发酵(试验1组)霉菌为1.5×102，其余三个试验组霉菌未检出，有效抑制了霉菌的生长。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司
<120> 一株高产苯乳酸的植物乳杆菌及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1468
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌BLCC2-0069 16S rDNA
<400> 1
cgtggcgggg tccctataca tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc 60
atgatttaca tttgagtgag tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa 120
gcgggggata acacctggaa acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc 180
cgagcttgaa agatggcttc ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga 240
tggtggggta acggctcacc atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gcaatcggcc 300
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 360
aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa 420
actctgttgt taaagaagaa catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa 480
ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc 600
ttcggctcaa ccgaagaagt gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt 660
ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 720
ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga 780
taccctggta gtccataccg taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc 840
agtgctgcag ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc 1020
ggggacatgg atacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg 1140
tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag 1260
taagctaatc tcttaaagcc attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga 1320
agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt 1440
taggaaccag ccgcctaaag tggaacct 1468
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agagttgatc ctggctcag 19

Claims (9)

1.一株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069，该菌株已于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020388。
2.一种菌剂，其包含权利要求1所述的植物乳杆菌。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备发酵剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵剂是乳制品发酵剂、果蔬制品发酵剂或豆制品发酵剂；
其中，所述乳制品包括酸奶、酸奶油、干酪；
所述豆制品包括豆豉、豆酱、豆粕；
所述果蔬制品中果蔬包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述豆制品为豆粕。
6.一种发酵豆粕的制备方法，其特征在于，所述方法包括豆粕中加入水、糖蜜、中性蛋白酶以及苯丙酮酸，得到发酵原料；再在发酵原料中接入权利要求1所述植物乳杆菌菌液，进行发酵，得到富含苯乳酸的发酵豆粕。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，植物乳杆菌接种量控制为0.5～5％；苯丙酮酸、中性蛋白酶和糖蜜的加入量，按豆粕计，分别为豆粕的0.1～0.5％，0.5～2.0％，2.0～5.0％。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，植物乳杆菌接种量控制为2％。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，苯丙酮酸、中性蛋白酶和糖蜜的加入量，按豆粕计，分别为豆粕的0.15％，1.0％和3.0％。
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