CN116904371B - 一种促生长的丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌后生元复合物及其制备方法 - Google Patents

一种促生长的丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌后生元复合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促生长的丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌后生元复合物及其制备方法，属于饲料添加剂技术领域。本发明公开了一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，所述罗伊氏乳杆菌在2023年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.27852。本发明还提供一种后生元复合物，由罗伊氏乳杆菌后生元和丁酸梭菌后生元复配而成。饲喂1‰丁酸梭菌‑罗伊氏乳杆菌后生元复合物后，昆明小鼠盲肠中微生物群落的多样性显著升高，有害菌的丰度显著降低。

Description

一种促生长的丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌后生元复合物及其制 备方法
技术领域
本发明涉及饲料添加剂技术领域，特别是涉及一种促生长的丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌后生元复合物及其制备方法。
背景技术
随着我国畜牧业全面进入“后抗生素时代”，“营养替抗”成为动保行业最新热点。益生菌作为抗生素替代品之一，已被广泛应用于动物生产中，其具有促进营养物质的消化吸收、改善肠道健康和提高畜禽生长性能等多种益生作用。后生元(Postbiotics)是近几年为弥补益生菌在应用过程中出现的一些不足之处而提出的新概念，是指对宿主健康有益的无生命的微生物和/或其成分(比如细胞壁中肽聚糖、壁磷壁酸、脂磷壁酸和细胞壁多糖以及细胞表面蛋白等)的制剂，也可以包括微生物的代谢产物(比如短链脂肪酸、有机酸、酶和抗菌肽等)。研究表明后生元的生物活性不仅能够与“活”的益生菌效果媲美，而且其副作用甚微，其主要通过抗氧化、抗炎、调节免疫与胃肠道功能以及保护肝脏等作用促进动物生长，从而提高畜牧与水产养殖效益。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是国际上公认的益生乳酸菌之一，属于革兰氏阳性菌，不形成芽孢，兼性厌氧，最适生长温度为37-42℃，最适pH为6.5左右。据报道，罗伊氏乳杆菌几乎天然存在于所有脊椎动物肠道内，是人和动物肠道微生物的主要成员。尤其是，罗伊氏乳杆菌是目前乳酸杆菌属中唯一被证实与所有宿主都存在共生关系的菌种。并且，从不同宿主分离的所有罗伊氏乳杆菌菌株对宿主均具有益生作用。罗伊氏乳杆菌发酵产生的乳酸和细菌素(罗伊菌素Reuterin、Reutericin、Reutericyclin以及AP48-MapA)均具有直接的抑菌和杀菌活性。此外，罗伊氏乳杆菌代谢产生的吲哚-3-乙醛及其菌体表面的表面蛋白、磷壁酸以及胞外多糖均具有免疫调节作用(侯成立:罗伊氏乳杆菌全基因组序列分析及其调节仔猪肠黏膜免疫功能的研究[D].中国农业大学图书馆.中国农业大学2015)。2013年，我国农业部公告第2045号批准了罗伊氏乳杆菌作为养殖动物的饲料添加剂品种。
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌，是芽孢杆菌科、梭菌属中一种产丁酸的革兰氏阳性厌氧细菌。丁酸梭菌的代谢产物中包含有短链脂肪酸(丁酸和乙酸)、抗菌肽、各种酶、维生素和氢气等多种有益物质。其中丁酸是肠道上皮细胞的主要供能物质，对于肠道上皮组织的再生和修复具有重耍的作用，特别对于结肠细胞更为重要，丁酸是其最重要的能量来源。此外，丁酸也被证明能够上调抗氧化谷胱甘肽水平，从而提高宿主对氧化应激的耐受性。维生素是参与动物生长发育和代谢必须的有机物质，丁酸梭菌代谢过程中可以产生多种B族维生素、维生素K、烟酸和泛酸等，而B族维生素和维生素K在补充宿主营养的同时可以促进维生素E的吸收。丁酸梭菌MIYAIRI 588在37℃厌氧培养24h后，其上清液中叶酸浓度达8mmol/L，维生素B2含量达111ng/mL，维生素B12含量为93pg/mL(王腾浩:新型丁酸梭菌筛选及其对断奶仔猪生长性能和肠道功能影响的研究[D].浙江大学图书馆.浙江大学2015)。我国农业农村部于2009年7月批准丁酸梭菌为适用于断奶仔猪和肉仔鸡的新饲料添加剂品种。
众所周知，乳酸菌作为动物消化道正常微生物区系中的优势菌群，是动物生产中应用最早和最广泛的益生菌。但其不耐高温以及活菌常温保存时间短，经80℃处理5min，活菌数损失率高达75％左右，从而限制了乳酸菌作为饲料添加剂在动物生产中的应用和应用效果。此外，芽孢虽然抗逆性强，但是随着常温存储时间的延长，部分芽孢类产品中芽孢存活率也会显著降低。目前，市面上已有灭活罗伊氏乳杆菌固体饮料或冻干活菌粉，但是由于价格昂贵或者需要低温保存，均未应用于畜牧与水产行业。丁酸梭菌芽孢和丁酸梭菌浸膏在水产中已有广泛应用，但其在畜牧业中应用较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种促生长的丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌后生元复合物及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，所述罗伊氏乳杆菌在2023年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27852。
本发明提供一种罗伊氏乳杆菌后生元，由所述罗伊氏乳杆菌发酵制备而成。
本发明提供一种所述罗伊氏乳杆菌后生元的制备方法，将罗伊氏乳杆菌种子液接种于发酵培养基中发酵培养，随后高温灭活。
进一步的，所述罗伊氏乳杆菌种子液的接种量为3-7％(v/v)；所述发酵培养基组分为：4-12％蔗糖、5-15％酵母浸粉、5-20％鱼蛋白胨、0.05-0.2％ MgSO4·7H2O、0.005-0.02％MnSO4·H2O、1-3mL/L吐温-80，pH 6.5；发酵培养条件为37℃静置发酵16-24h。
本发明提供一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，所述丁酸梭菌在2023年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27853。
本发明提供一种丁酸梭菌后生元，由所述丁酸梭菌发酵制备而成。
本发明提供一种所述丁酸梭菌后生元的制备方法，其特征在于，将丁酸梭菌种子液接种于发酵培养基中发酵培养，随后高温灭活。
进一步的，所述丁酸梭菌种子液的接种量为3-9％(v/v)；所述发酵培养基组分为：0.5-2％葡萄糖、0.5-2％酵母浸粉、1-4％鱼蛋白胨、0.4-1.2％柠檬酸钠、0.05-0.2％磷酸二氢钾、0.1-0.4％磷酸氢二钾、0.02-0.06％ MgSO4·7H2O、0.005-0.02％ MnSO4·H2O、0.1-0.15％半胱氨酸盐酸盐、0.5-2mL/L吐温-80，pH 7.0；发酵培养条件为37℃静置发酵16-24h。
本发明还提供一种后生元复合物，所述后生元复合物由所述的罗伊氏乳杆菌后生元和所述的丁酸梭菌后生元复配而成。
进一步的，所述罗伊氏乳杆菌后生元与所述丁酸梭菌后生元的复配比例为体积比1:1-3:1。
本发明还提供一种促进动物生长的饲料，所述饲料中包括1-5wt.‰所述的后生元复合物、25-50％麦芽糊精(w/v)和2-4％轻质碳酸钙(w/v)。
本发明公开了以下技术效果：
本发明所述丁酸梭菌HADIG-CB004和罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003均为分离于健康三元猪中育肥猪的新鲜粪便，分别具有产丁酸和产乳酸能力强的特性，从而为其能够调节宿主肠道菌群结构提供理论支撑；本发明将丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌及其代谢产物进行复配，既可以使后生元产品营养更丰富，也可以使各菌株代谢产物，比如丁酸、乙酸、乳酸、细菌素和吲哚-3-乙醛，起到协同抑菌调肠和增强免疫的作用，从而为后生元有效发挥“营养替抗”作用奠定理论基础。
1.采用本专利所述方法制备的丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元具有较好的抗氧化能力，当其终浓度达5mg/mL以上时，对羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基均具有显著清除作用。
2.饲喂9天后，相对空白对照组，5‰(w/w)后生元组昆明小鼠体重增加了13.27％(p<0.05)。饲喂13天后，相对空白对照组，5‰后生元组昆明小鼠体重增加了11.53％(p<0.05)，平均日采食量增加了15.23％，平均日增重增加了16.78％，料重比降低1.34％，说明本发明所述后生元复合物具有显著促进动物生长的应用潜力。
3.分析肠道菌群测序结果表明，饲喂1‰丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物后，昆明小鼠盲肠中微生物群落的多样性显著升高，并且Muribaculumintestinale(p<0.001)、Helicobacter typhlonius(p<0.05)和Odoribacter splanchnicus(p<0.05)等有害菌的丰度显著降低，从而为本发明所述后生元复合物饲料添加剂能够改善动物肠道健康提供了理论支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为猪源罗伊氏乳杆菌的特异性筛选；(A)采用特异性引物对罗伊氏乳杆菌选择性培养基和镜检初筛的单菌落进行菌落PCR鉴定图谱，泳道M为DL1000 Plus DNA Marker，泳道1-5：采用L-reu1/L-reu4引物对鉴定编号为HADIG-LR001-005罗伊氏乳杆菌的菌落PCR产物；(B)16S rDNA菌种鉴定复筛罗伊氏乳杆菌的琼脂糖凝胶电泳图谱，泳道M为DL2000Plus DNA Marker，泳道1-5：采用细菌16S rDNA通用鉴定引物对27F/1492R扩增编号为HADIG-LR001-005罗伊氏乳杆菌的PCR产物；
图2为猪源罗伊氏乳杆菌的形态与分子鉴定；(A)罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003的单菌落图谱，37℃厌氧培养24h；(B)显微镜观察HADIG-LR003的菌体形态图(100×)；(C)HADIG-LR003基于16S rDNA基因序列的系统发育树；
图3为丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物(PB)和抗坏血酸(Vc)的体外抗氧化活性评价；(A、E)PB和Vc的还原能力(Reducing power)；(B、F)PB和Vc对羟基自由基(Hydroxyl radical)的清除能力；(C、G)PB和Vc对DPPH自由基的清除能力；(D、H)PB和Vc对超氧阴离子自由基(Superoxide radical)的清除活性；
图4为饲粮中添加梯度浓度丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物(PB)对昆明小鼠盲肠内容物中微生物群落组成α多样性和β多样性的影响；(A-D)α多样性的箱型图；(A)Chao1指数组间差异箱线图；(B)Faith’s Phylogenetic Diversity(PD)组间差异箱线图；(C)Simpson指数组间差异箱线图；(D)Shannon指数组间差异箱线图；(E-F)不同处理样品的PCoA(E)和NMDS(F)图；其中在NMDS点图中，当Stress<0.2时，说明NMDS可以准确反映样本间的差异程度；NC(Normal control)表示日粮中未添加PB的正常对照组，1‰PB表示日粮中添加1‰浓度丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物的实验组，5‰PB表示日粮中添加5‰浓度丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物的实验组；
图5为饲粮中添加梯度浓度丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物(PB)对昆明小鼠盲肠内容物中微生物群落组成的影响；门(A)、属(B)和种(C)水平肠道菌群组成；横坐标为组名，纵坐标为相对丰度，不同颜色代表不同的类群，Others表示排名为20以外的所有种以及没有注释信息的种的相对丰度之和；(D)丰度排名前50的种在每组中的丰度信息热图；
图6为差异物种分析柱状图(种水平)；(A-I)相对空白对照组，在饲粮中添加梯度浓度丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物(PB)的昆明小鼠盲肠内容物中，丰度排名前50的种中具有统计学差异的物种；*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001；
图7为饲喂和未饲喂梯度浓度丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物(PB)的昆明小鼠盲肠内容物中微生物组成的差异物种分析(LEfse分析)；(A)显著差异物种LDA值分布柱状图；(B)物种分支进化图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.一株高产乳酸猪源罗伊氏乳杆菌的筛选
1.1实验方法：
1.1.1配制罗伊氏乳杆菌选择性培养基(L.reuteriisolation medium,LRIM)
称取15.0g/L棉子糖、10.0g/L蛋白胨、5.0g/L酵母提取物、0.57g/L硫酸镁、0.12g/L硫酸锰、0.003g/L硫酸亚铁、15.0g/L乙酸钠、2.0g/L醋酸铵、6.0g/L磷酸二氢钾、1.32mL/L冰醋酸、1.0mL/L吐温80，加去离子水定容至1L，固体培养基需加入15-20g琼脂，调pH至6.5，121℃高压灭菌15min。当培养基不烫手时，倒平板前在培养基中加入50μg/mL的万古霉素(vancomycin)用于富集罗伊氏乳杆菌。
1.1.2LRIM平板初筛罗伊氏乳杆菌
称取健康三元猪中育肥猪的新鲜粪便1g，加入9mL生理盐水，振荡混匀后，用无菌生理盐水稀释至10-3、10-4、10-5共3个梯度，分别取100μL粪便稀释液涂布于LRIM平板上。然后将平板倒置于厌氧罐中，45℃恒温培养24h。最后挑取多个单菌落接种至商品化的MRS培养基(购买于青岛海博生物)中，37℃培养24h，并结合菌落形态和显微镜观察选取疑似菌株。
1.1.3特异性引物复筛罗伊氏乳杆菌
采用特异性鉴定罗伊氏乳杆菌的引物对L-reu1/L-reu4(引物序列如SEQ IDNO.1-2所示)对初筛的疑似罗伊氏乳杆菌进行菌落PCR鉴定。然后将PCR产物大小正确的菌株进行10倍系列稀释后涂布到MRS培养基进行厌氧培养，直到获得罗伊氏乳杆菌的纯培养物。
表1鉴定罗伊氏乳杆菌的引物对
1.1.4罗伊氏乳杆菌的16S rDNA鉴定
离心收集培养至对数生长期的分离株纯培养物，采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的FastPure Microbiome DNA Isolation Kit提取基因组DNA，以其为模板，采用细菌通用鉴定引物(引物序列如SEQ ID NO.3-4所示)对5株罗伊氏乳杆菌的16S rDNA进行PCR扩增。然后将PCR产物送至华大基因测序。最后利用NCBI数据库中的BLAST工具分别将测序结果进行同源性分析，得到与待测物种序列相似性最大的10条同源序列，并利用MEGA 7.0软件中的邻接(neighbor-joining，NJ)法构建系统发育树确定菌株种属关系。
表2细菌通用鉴定引物
SEQ ID NO.3 agagtttgat cctggctcag
SEQ ID NO.4 ggctaccttg ttacgactt
1.1.5产酸性能比较
分别将命名为HADIG-LR001-LR005的5株罗伊氏乳杆菌的种子液，按5％接种量接种至25mL MRS培养基中，37℃静置培养至OD600值为2.5左右。然后取1mL发酵液，6000rpm离心8min，取上清液。最后采用北京索莱宝公司的L-乳酸(L-LA)含量检测试剂盒检测5个上清液样品中乳酸含量，并用OD600值进行校正。
1.2实验结果：
如图1中A所示，采用特异性引物鉴定初筛罗伊氏乳杆菌均获得大小约为250bp的PCR产物，说明5个菌种均为罗伊氏乳杆菌。如图1中B所示，采用细菌16S rDNA通用鉴定引物扩增5株罗伊氏乳杆菌，获得的PCR产物大小均为1500bp左右。将这些PCR产物送至华大基因测序，BLAST比对测序结果进一步证明五个菌株均为罗伊氏乳杆菌。其中HADIG-LR003菌株的单菌落形态图谱、菌体形态图及其基于16S rDNA基因序列的系统发育树，如图2所示。
如表3所示，本发明筛选到的5株罗伊氏乳杆菌中，以HADIG-LR003菌株的产乳酸能力最强，达8.43g/L。因此，本发明选用HADIG-LR003菌株进行后续研究，其菌种鉴定测序所得16S rRNA序列在GenBank数据库中登记号为OP984131(序列如SEQ ID NO.5所示)。
SEQ ID NO.5:
agtcgtacgcactggcccaactgattgatggtgcttgcacctgattgacgatggatcaccagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgccccggagcgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcataacaacaaaagccacatggcttttgtttgaaagatggctttggctatcactctgggatggacctgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatggaactgagacacggtccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttggagaagaacgtgcgtgagagtaactgttcacgcagtgacggtatccaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttgcttaggtctgatgtgaaagccttcggcttaaccgaagaagtgcatcggaaaccgggcgacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccggagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttgcgctaaccttagagataaggcgttcccttcggggacgcaatgacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttactagttgccagcattaagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcagatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcgcaagctcgcgagagtaagctaatctcttaaagccgttctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgtaacgcccaaagtcggtggcctaacca。
罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003在2023年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.27852。
表3对比分析五株罗伊氏乳杆菌的产乳酸能力
2.丁酸梭菌HADIG-CB004的筛选分离方法参考专利CN116286480A，丁酸梭菌HADIG-CB004在2023年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27853。
实施例2丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物的制备
2.1实验方法：
2.1.1制备由灭活丁酸梭菌HADIG-CB004及其代谢产物组成的后生元
丁酸梭菌的种子液培养基采用商品化的强化梭菌培养基(RCM)(海博生物)。其发酵培养基配方为：2％葡萄糖、2％酵母浸粉、4％鱼蛋白胨、1.2％柠檬酸钠、0.2％磷酸二氢钾、0.4％磷酸氢二钾、0.06％ MgSO4·7H2O、0.02％ MnSO4·H2O、0.15％半胱氨酸盐酸盐、2mL/L吐温-80，pH 7.0。丁酸梭菌种子液的接种量为5％，37℃静置发酵24h。然后100℃灭活1h。
2.1.2由灭活罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003及其代谢产物组成后生元的制备
罗伊氏乳杆菌的种子液采用商品化的MRS培养基(海博生物)，其发酵培养基配方为：12％蔗糖、15％酵母浸粉、20％鱼蛋白胨、0.2％ MgSO4·7H2O、0.02％MnSO4·H2O、3mL/L吐温-80，pH 6.5。罗伊氏乳杆菌种子液的接种量为5％，37℃静置发酵24h。然后100℃灭活1h。
2.1.3由灭活丁酸梭菌HADIG-CB004与罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003及其代谢产物组成后生元的制备
首先将灭活的丁酸梭菌发酵液与罗伊氏乳杆菌发酵液按2:1的比例复配，并分别加入40％麦芽糊精(w/v)和3％轻质碳酸钙(w/v)，混匀之后放入-80℃冰箱冻存过夜。然后放入低温真空冷冻干燥仪中充分干燥(-80℃预冻过夜，真空度为4.9Pa，干燥温度为-56℃、干燥时间为72h)。最后将冻干粉粉碎(粉碎细度为200目，主轴转速为1000r/min)、混匀(筒体转速为10r/min，混合时间为10-20min)、分装、抽真空与包装。
2.2实验结果：
复配后发酵液中丁酸梭菌含菌量为5×108CFU/mL，罗伊氏乳杆菌含菌量为3×109CFU/mL。实施例3丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物的抗氧化性能评价
3.1实验方法：
3.1.1样品溶液配制
丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元溶液的配制：将后生元用超纯水配制成质量浓度为20mg/mL的母液，并稀释成不同的浓度梯度：0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL，共7个剂量组。
抗坏血酸(Vc)溶液的配制：将Vc分别用超纯水配制成质量浓度为4mg/mL的母液，并稀释成不同的浓度梯度：0.03125mg/mL、0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，共8个剂量组。
3.1.2还原力测定
取不同浓度的样品溶液0.2mL，加入pH 6.6的0.2moL/L磷酸盐缓冲液0.5mL、1％铁氰化钾溶液0.2mL，混合均匀，50℃水浴锅中反应30min，取出流水迅速冷却，然后加入0.5mL10％的三氯乙酸溶液，混合均匀，3000r/min离心分离10min，移取上清液1mL于试管中，加超纯水1mL、0.1％三氯化铁溶液0.5mL，室温反应5min，以蒸馏水调零，于分光光度计700nm波长下测定其吸光值A，平行实验三次。以Vc为阳性对照。
3.1.3DPPH自由基清除活性测定
取不同浓度的样品溶液0.4mL，加入60μmoL/L的DPPH溶液(以50％乙醇溶液配制)1.2mL，混合均匀，室温下避光静置反应30min，于517nm波长处测定吸光度值A1，平行实验三次。以Vc为阳性对照。按以下公式计算DPPH自由基清除率：
式中，A0代表未加样品溶液的吸光度值；A1代表加入样品溶液的吸光度值；A2代表以乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度值。
3.1.4羟基自由基清除活性测定
本实验采用水杨酸显色法测定丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元对羟基自由基的清除效果。在反应体系中依次加入9mmoL/L FeSO4溶液0.4mL和9mmoL/L水杨酸溶液(无水乙醇配制)0.4mL，再加入不同浓度的待测样品溶液0.4mL，最后加入8.8mmoL/L双氧水0.4mL启动整个反应，37℃水浴恒温反应30min。以超纯水为参比液，在510nm波长处测定各反应液吸光度值A1，平行实验三次。以Vc为阳性对照。按以下公式计算羟自由基清除率：
式中，A0代表未加样品溶液的吸光度值；A1代表加入样品溶液的吸光度值；A2代表以超纯水代替水杨酸的吸光度值。
3.1.5超氧阴离子自由基清除活性测定
本实验参考邻苯三酚自氧化法并略作修改测定丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元清除超氧阴离子自由基的活性。取不同浓度的待测样品溶液0.5mL，pH 8.2的0.1mol/LTris-HCl缓冲液(内含2mmol/L EDTA)2.25mL以及超纯水1.6mL，于比色管中，37℃水浴10min，其后加入37℃预热的25mmol/L邻苯三酚溶液0.2mL，振荡混匀，精确反应5min，立即用0.5mL浓HCl溶液终止反应，测320nm处吸光度值，平行实验三次。以Vc为阳性对照。按以下公式计算超氧阴离子自由基清除率：
式中，ΔA0为未加样品溶液的自氧化速率；ΔA1为加入样品溶液的自氧化速率。
3.2实验结果：
如图3中A、E所示，2.5mg/mL浓度以上丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元具有一定的还原力(Reducing power)，且存在浓度依赖性。其中15mg/mL丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元与0.125mg/mL Vc的还原力相当；如图3中B、F所示，5mg/mL浓度以上丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元对羟基自由基(Hydroxyl radical)具有显著清除作用，其中10mg/mL丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元与0.25mg/mL Vc对羟基自由基的清除力相当，15mg/mL浓度丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元对羟基自由基的清除率达50％以上；如图3中C、G所示，1.25mg/mL浓度以上丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元对DPPH自由基具有显著清除活性，其中5mg/mL浓度以上丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元对DPPH自由基的清除率达50％以上；如图3中D、H所示，2.5mg/mL浓度以上丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元对超氧阴离子自由基(Superoxideradical)具有显著清除活性，其中15mg/mL浓度以上丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元对超氧阴离子自由基的清除率达30％以上。综上所述，当本专利所述丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元终浓度达5mg/mL以上时，对肠道自由基具有显著清除作用。
实施例4基础日粮添加丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物对昆明小鼠肠道菌群结构及其生长性能的影响
4.1实验方法：
4.1.1实验动物：
昆明雄性小鼠(2周龄)，体质量10g左右，18只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物饲养环境为12h昼夜交替，室内温度27℃左右，所有动物均能自由采食和饮水。本研究方案经湖南湘农动物药业有限公司动物管理伦理委员会批准，所有动物均严格按照动物伦理程序和规范处理。
4.1.2动物分组及处理：
将小鼠基础日粮用粉碎机打碎之后，加入丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元至终含量为1‰和5‰(w/w)，并加入10％(v/w)含量的无菌水，用搅拌机混匀。空白组基础日粮加入等体积的无菌水。然后采用20mL无菌注射器将搅拌后的粉料做成10cm长度左右的紧实饲料条，并放入65℃烘箱中烘烤过夜，室温储存用于饲喂小鼠。然后将实验用小鼠随机分为空白对照组(NC)、1‰后生元组和5‰后生元组，每组6只，分盒分开饲养。连续饲喂13天，每隔四天对小鼠体重、采食量以及饮水量进行准时记录。
4.1.3肠道菌群样品的获取：
在饲养期间，禁食12h后，在第13天解剖采集对照组和实验组小鼠的盲肠内容物样品，放入一次性使用采样器中保存，并寄送至成都罗宁生物科技有限公司进行三代测序与结果分析。
4.2实验结果：
4.2.1丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物添加剂对昆明小鼠生长性能的影响
如表4所示，饲喂13天后，虽然料重比未见明显改善，但是相对空白对照组，饲喂9天的5‰后生元组昆明小鼠体重增加了13.27％(p<0.05)；饲喂13天后，相对空白对照组，5‰后生元组昆明小鼠体重增加了11.53％(p<0.05)，平均日采食量增加了15.23％，平均日增重增加了16.78％，料重比降低1.34％。以上结果说明，本发明所述后生元复合物具有作为显著促进动物生长饲料添加剂的应用潜力。
表4饲喂丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物对昆明小鼠生长性能的影响
备注：表中数值均为means±SD(n＝6)，a,b表示同一行内携带不同字母上标的两组数据之间具有显著差异(p<0.05)。
4.2.2肠道菌群多样性结果分析
在获得OTU丰度矩阵后，对两组昆明小鼠肠道菌群进行α与β多样性分析，使用Chao1指数衡量物种丰度，使用PD、Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性。如图4中A-D所示，饲喂1-5‰PB能够明显增加昆明小鼠肠道菌群的物种丰度及其多样性，其中1‰PB组的香农-维纳指数(Shannon-Wiener index)显著高于NC组(p<0.05)(图4D)，说明饲喂丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元的昆明小鼠肠道中微生物群落多样性显著升高。
此外，分别使用Bray-Curtis距离与Unweighted UniFrac算法进行PCoA分析和NMDS统计，如图4中E-F所示，PCo1占总方差的28.8％，PCo2占总方差的17.4％，丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元组与空白组样品距离明显分开，说明两组样品菌群结构主成分具有显著差异。在非度量多维尺度分析(Non-metric Multi-Dimensional Scaling,NMDS)中，应力值(Stress)＝0.16，小于0.2，说明分组与抽样方法可靠。
4.2.3肠道菌群组成及其优势菌群相对丰度分析
为了得到各分类水平上各个类群的丰度信息，基于OTU丰度表和注释后的分类信息表，本专利在各个分类水平如Phylum(门)、Genus(属)和Species(种)，对数据进行转换，得到各个样本在各个分类水平上的相对丰度表。并且为了直观地展示每组样本高丰度类群(Top20)的平均丰度，对成组的数据求平均并使用柱状图展示(如图5所示)。
其中如图5中A所示，昆明小鼠饲喂丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元13天后，在门水平分类上，1‰PB组和空白组比较，变形菌门(Proteobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)和软壁菌门(Tenericutes)丰度百分比上调了近38.29％、808.20％(p<0.05)和89.69％，而拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)丰度百分比分别下调了近26.79％、99.25％和60％(p<0.05)。5‰PB组和空白组比较，拟杆菌门(Bacteroidetes)、软壁菌门(Tenericutes)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)丰度百分比上调了近37.50％、110.31％和272.22％，而疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和嗜热丝菌门(Caldiserica)丰度百分比分别下调了近99.25％、31.89％(p<0.05)、87.5％(p<0.05)和90％(p<0.05)。因此，以上研究结果表明，在门水平上，饲喂丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元提高了软壁菌门的丰度，降低了芽单胞菌门、疣微菌门、放线菌门、酸杆菌门和嗜热丝菌门的丰度。
如图5中B所示，在属水平上，1‰PB组和空白组比较，葡萄球菌属(Staphylococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)和克雷白氏杆菌属(Klebsiella)所占丰度百分比分别上调了近1191.27％(p<0.001)、230.85％和48.24％，而螺杆菌属(Helicobacter)、Muribaculum、拟杆菌属(Bacteroides)、Lachnoclostridium、普氏菌属(Prevotella)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)分别下调了近46.82％、63.09％(p<0.001)、37.63％、37.66％、43.29％和54.55％(p<0.05)；5‰PB组和空白组比较，葡萄球菌属(Staphylococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、Parabacteroides和Croceibacter丰度百分比上调了近602.23％(p<0.01)、44.28％、95.91％和150.51％，而产碱杆菌属(Alcaligenes)、Lachnoclostridium和布劳特氏菌属(Blautia)丰度百分比分别下调了近55.38％、33.78％和20.58％。因此，以上研究结果表明，在属水平上，饲喂丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元显著提高了葡萄球菌属的丰度，显著降低了Muribaculum和瘤胃球菌属的丰度。
如图5中C所示，在种水平分类上，相对空白组，在1‰PB组中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、气味类香菌(Myroidesodoratus)和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)丰度百分比分别上调了近954.18％(p<0.05)、134.13％、561.19％(p<0.05)和2309.38％(p<0.001)，而Muribaculumintestinale、肝螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus)、脲酶阴性螺旋杆菌(Helicobactertyphlonius)和Odoribacter splanchnicus丰度百分比分别下调了近63.09％(p<0.001)、64.04％、92.24％(p<0.05)和73.7％(p<0.05)；5‰PB组和空白组比较，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Croceibacter atlanticus、Alkalitalea saponilacus、Bacteroides cellulosilyticus、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、气味类香菌(Myroides odoratus)丰度百分比上调了近462.91％(p<0.01)、150.51％、120.32％、77.61％、1868.75％(p<0.001)和190.3％(p<0.05)，而肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、Helicobacter apodemus、Helicobacter typhlonius和粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)丰度百分比分别下调了近14.91％、27.96％、30.15％和59.9％。
此外，本申请也展示了丰度排名前50的种在每组中的丰度信息热图(如图5中D所示)。并且如图6所示，将其中存在统计学差异的种均展示为柱状图。如图6中A-C所示，相对空白组，在1‰PB组中，Muribaculumintestinale、Helicobacter typhlonius和Odoribacter splanchnicus等有害菌的丰度显著降低；在1‰PB和5‰PB组中，Butyrivibrio hungatei菌的丰度均显著降低，Myroides odoratus(数据未展示)和Staphylococcus xylosus(数据未展示)菌的丰度均显著升高；相对5‰PB组，在1‰PB组中，Bacteroides salanitronis、Bacteroides ovatus和Barnesiella viscericola(数据未展示)菌的丰度显著降低，Alcaligenes faecalis(数据未展示)菌的丰度显著升高。不容忽视的是，相对空白组，在1‰PB和5‰PB组中，葡萄球菌属中Staphylococcus aureus、Staphylococcus lugdunensis和Staphylococcus stepanovicii等有害菌的丰度均会显著升高，并且1‰PB组的上升趋势会更加明显。
综上所述，饲喂丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元可以改善动物肠道健康以及显著促进其生长，其中1‰PB相对5‰PB能够更显著提升昆明小鼠盲肠内容物中微生物群落多样性。相对空白组，5‰PB组昆明小鼠的体重显著增加。
4.2.4差异物种分析
为了找到重要的并且在组之间差异显著的物种，本申请采用LEfSe分析筛选浓度梯度PB组和空白组之间具有统计学差异的物种(LDA值<5)。如图7所示，共有47个物种对三组间差异贡献大，且具有统计学意义，其中21个物种在空白组显著富集，主要是Muribaculaceae、Porphyromonadaceae和Lactobacillaceae科、Muribaculum、Porphyromonas和Lactobacillus属等；7个物种在5‰PB组显著富集，包括Bacteroidales目，Odoribacter、Olleya和Jeotgalicoccus属；19个物种在1‰PB组显著富集，主要是Bacilli和Betaproteobacteria纲，Staphylococcus、Alcaligenes、Paenalcaligenes、Proteus和Pseudomonas属。因此，以上结果提示饲喂丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元可以显著调节昆明小鼠肠道菌群结构。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种后生元复合物，其特征在于，所述后生元复合物由罗伊氏乳杆菌后生元和丁酸梭菌后生元复配而成；
所述罗伊氏乳杆菌后生元由罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）HADIG-LR003发酵制备而成，所述罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003在2023年07月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27852；
所述罗伊氏乳杆菌后生元的制备方法为：将罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003种子液接种于发酵培养基中发酵培养，随后高温灭活；所述罗伊氏乳杆菌HADIG-LR003种子液的接种量为3-7%（v/v）；其发酵培养基组分为：4-12%蔗糖、5-15%酵母浸粉、5-20%鱼蛋白胨、0.05-0.2%MgSO4·7H2O、0.005-0.02% MnSO4·H2O、1-3 mL/L吐温-80，余量为水，pH 6.5；发酵培养条件为37℃静置发酵16-24 h；
所述丁酸梭菌后生元由丁酸梭菌（Clostridium butyricum）HADIG-CB004发酵制备而成，所述丁酸梭菌HADIG-CB004在2023年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.27853；
所述丁酸梭菌后生元的制备方法为：将丁酸梭菌HADIG-CB004种子液接种于发酵培养基中发酵培养，随后高温灭活；所述丁酸梭菌HADIG-CB004种子液的接种量为3-9%（v/v）；其发酵培养基组分为：0.5-2%葡萄糖、0.5-2%酵母浸粉、1-4%鱼蛋白胨、0.4-1.2%柠檬酸钠、0.05-0.2%磷酸二氢钾、0.1-0.4%磷酸氢二钾、0.02-0.06% MgSO4·7H2O、0.005-0.02%MnSO4·H2O、0.1-0.15%半胱氨酸盐酸盐、0.5-2 mL/L吐温-80，余量为水，pH 7.0；发酵培养条件为37℃静置发酵16-24 h。
2.根据权利要求1所述的后生元复合物，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌后生元与所述丁酸梭菌后生元的复配比例为体积比1:1~3:1。
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