CN110628669A - 枯草芽孢杆菌ly-5、菌剂及其应用和应用其的产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌LY‑5、菌剂及其应用和应用其的产品，涉及微生物技术领域。枯草芽孢杆菌LY‑5分离自健康驴的消化道，具有如SEQ ID NO.1所示的16S rRNA基因序列。枯草芽孢杆菌LY‑5具有多种酶的活性，能够以碳源为底物发酵产酸，还具有促进牲畜增重，提高牲畜饲料的消化率，提高牲畜肠道菌群丰度和改善肠道健康的有益效果，可以应用于制备菌剂、饲料添加剂、饲料以及其他用于改善牲畜健康的产品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种枯草芽孢杆菌LY-5、菌剂及其应用和应用其的产品。
背景技术
驴具有耐粗饲、抗病力强、用途广等特点。作为特色畜牧业，驴产业在促进我国部分地区农民增收、带动脱贫致富等方面起到了重要的作用。随产业发展，养殖规模不断扩大，但与之相应的饲养管理、疾病防控、新饲料资源的开发利用并未跟上产业快速发展步伐，由此产生的犊驴营养代谢问题频发，给产业造成严重的经济损失。由于犊驴免疫系统和消化器官发育不成熟，抵抗力差，易患由消化功能紊乱导致的各类疾病。研究表明幼龄犊驴发病率为31.8％，死亡率高达12.4％。同时由于幼龄时期抗生素的大量使用，出现的负面效应也日益增加，主要表现为病原微生物产生耐药性和药物在畜体中残留，对动物健康及生产产生不利影响。
随着饲料中全面禁用抗生素的实施，微生态制剂尤其是益生菌的研究越来越受到产业的关注。微生态制剂作为新型饲料添加剂，能调节肠道微生态平衡，促进营养物质消化，提高机体的抗病力，促进动物生长。然而微生态制剂在犊驴上的应用鲜有报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的第一目的在于提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5，该株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018939。
本发明的目的第二目的在于提供包含上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5的菌剂。
本发明的目的第三目的在于提供上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5，于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2018939。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包含所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种发酵方法，包括使用上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5或上述菌剂发酵底物。
优选地，所述底物包括：甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、糖原和D-松二糖中的至少一种。
优选地，所述底物包括：甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁苷、七叶灵、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、棉子糖和D-松二糖中的至少一种。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LY-5、上述菌剂或上述发酵方法在制备饲料添加剂中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种饲料添加剂，包括上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5、上述菌剂和采用上述发酵方法制备得到的发酵产物中的至少一种。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LY-5、上述菌剂、上述发酵方法或上述饲料添加剂在制备饲料中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种饲料，包括上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5、上述菌剂、上述发酵方法制备得到的发酵产物和上述饲料添加剂中的至少一种；
优选地，所述饲料中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5的活菌数为0.1×1011～2×1011CFU/kg。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LY-5、上述菌剂、上述发酵方法、上述饲料添加剂或上述饲料在制备(a1)～(a3)中至少一种的应用：
(a1)用于促进犊驴生长的产品；
(a2)用于促进犊驴脂肪消化率的产品；
(a3)用于提高犊驴肠道微生物多样性的产品；
优选地，所述提高犊驴肠道微生物多样性包括上调拟杆菌门丰度和下调变形菌门丰度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的分离自健康驴的消化道的枯草芽孢杆菌LY-5，具有如SEQ ID NO.1所示的16S rRNA基因序列。枯草芽孢杆菌LY-5具有多种酶的活性，能够以碳源为底物发酵产酸，还具有促进牲畜增重，提高牲畜饲料的消化率，提高牲畜肠道菌群丰度和改善肠道健康的有益效果，可以应用于制备菌剂、饲料添加剂、饲料以及其他用于改善牲畜健康的产品。
本发明通过实验发现，犊驴食用枯草芽孢杆菌LY-5后，可显著提高犊驴的平均日增重，对断奶早期犊驴具有显著的促生长作用；同时还能够显著提高断奶犊驴脂肪表观消化率。进一步的，犊驴食用枯草芽孢杆菌LY-5后，相比于未食用的对照组，枯草芽孢杆菌LY-5可提高犊驴直肠微生物多样性，优化犊驴肠道菌群结构，促进有益菌的增殖，减少有害菌的数量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为断奶犊驴直肠内容物细菌门水平丰度图；
图2为断奶犊驴直肠内容物细菌属水平丰度图；
图3为断奶犊驴直肠内容物PCoA图中主坐标轴分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5，本发明的菌株的保藏日期为2018年12月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018939。分类命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；邮编：430072。
本发明提供的枯草芽孢杆菌LY-5，其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。经实验发现，枯草芽孢杆菌LY-5具有多种酶活性，包括但不限于具有β-半乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶和明胶酶的酶活性；枯草芽孢杆菌LY-5还具有利用柠檬酸盐作为唯一碳源的能力，且VP实验呈阳性。
本发明经实验还发现，枯草芽孢杆菌LY-5还具有利用碳源产酸的能力，枯草芽孢杆菌LY-5可利用的碳源包括但不限于甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、糖原和D-松二糖。
将枯草芽孢杆菌LY-5添加至断奶犊驴饲料中发现，枯草芽孢杆菌LY-5有利于提高断奶早期犊驴日增重、提高脂类物质消化率，提高生产性能，同时还具有提高肠道菌群丰度，改善肠道健康的作用。
综上，本发明分离自健康驴消化道的枯草芽孢杆菌LY-5具有多种酶的活性，能够以碳源为底物发酵产酸，还具有促进牲畜增重，提高牲畜饲料中脂类物质的消化率，提高牲畜肠道菌群丰度和改善肠道健康的有益效果，可以应用于制备菌剂、饲料添加剂、饲料以及其他用于改善牲畜健康的产品。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种菌剂，该菌剂包含上述枯草芽孢杆菌LY-5。在一些可选的实施方式中，所述菌剂只以枯草芽孢杆菌LY-5作为菌剂的活性物质。在另一些可选的实施方式中，所述菌剂还可以包括其他种类的微生物，以和枯草芽孢杆菌LY-5共同使用，作为菌剂的活性物质。
在一些可选的实施方式中，所述菌剂还可以包括本领域可接受的任选地辅料，所述“可接受的”指的是这些辅料不影响菌剂中的微生物的生理生化活性，同时能够改善菌剂性能的成分；所述“任选的”指的是菌剂中可以添加辅料、也可以不添加辅料。所述辅料包括但不限于pH调节剂、润湿剂、分散剂、填充剂、抗氧化剂和干燥剂中的一种或多种；所述辅料还可以包括用于为菌剂中的微生物提供碳源、氮源、盐类和各种微量元素的物质，包括但不限于牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、维生素、氨基酸和矿物质等物质；所述辅料还可以包括载体，所述载体包括但不限于为沙粒、蒙脱石、碳酸钙、沸石、稻壳、石粉、硅藻土、海藻酸盐、卡拉胶、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚氨酯、羧甲基纤维素、多孔陶瓷和活性炭中的一种或多种。
将枯草芽孢杆菌LY-5制成菌剂可以改善微生物的性能，例如通过将枯草芽孢杆菌LY-5吸附于载体和添加分散剂，增强微生物的分散性；通过添加为枯草芽孢杆菌LY-5提供的营养物质，增强活菌的存活期；通过添加pH调节剂，扩大枯草芽孢杆菌LY-5的适用范围等。
根据本发明提供的枯草芽孢杆菌LY-5含有多种酶活性，并且能够利用多种碳源作为底物，本发明还提供了一种发酵方法，该发酵方法包括利用枯草芽孢杆菌LY-5，或利用包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂发酵底物，以得到发酵产物。
在一些可选的实施方式中，所述底物包括甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、糖原和D-松二糖中的至少一种。可选地，所述底物可以包括上述各组分中的任意一种；可选地，所述底物包括含有上述各组分中的任意一种的物质；可选地，将上述各组分中的其中几种联合使用作为底物；可选地，所述底物包括同时含有上述几种组分的物质。在一些具体的实施方式中，以包括甘油和葡萄糖的物质作为底物；在一些具体的实施方式中，以包括L-阿拉伯糖和蜜二糖的物质作为底物；在一些具体的实施方式中，以D-木糖、葡萄糖、淀粉和甘露糖的物质作为底物。
在一些优选的实施方式中，通过实验发现，枯草芽孢杆菌LY-5发酵下述底物的效果更佳：甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁苷、七叶灵、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、棉子糖和D-松二糖。
根据本发明提供的枯草芽孢杆菌LY-5含有多种酶活性，以及其促进牲畜增重，提高牲畜饲料的消化率和提高牲畜肠道菌群丰度的作用，本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂或上述发酵方法在制备饲料添加剂中的应用。可选地，可以在制备饲料添加剂时，直接加入枯草芽孢杆菌LY-5。可选地，在制备饲料添加剂时直接加入含有枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂，以增强活菌在饲料添加剂中的稳定性、分散性和保质期等性能。可选地，将上述发酵方法直接用于制备饲料添加剂，采用枯草芽孢杆菌LY-5或包含其的菌剂发酵底物，将发酵产物作为饲料添加剂。可选地，也可以直接将上述发酵方法的发酵产物作为饲料添加剂的原料之一，以制备饲料添加剂。
需要说明的是，本发明所述的饲料添加剂可以和饲料混合使用，也可以不和饲料混合使用，即作为一种可以单独施与牲畜的营养补充剂，本发明对此不做限制。本发明所述的发酵产物可以包括采用枯草芽孢杆菌LY-5或包含其的菌剂发酵底物后直接获得的产物，也可以包括采用枯草芽孢杆菌LY-5或包含其的菌剂发酵底物后直接获得的产物经本领域常规的加工操作，例如但不限于灭菌、干燥或造粒等操作，获得的产物。下述饲料添加剂和发酵产物应做相同的理解。
基于上述应用，本发明还提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包括上述枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂或上述发酵方法制备得到的发酵产物中的至少一种。可选地，所述饲料添加剂中包括上述枯草芽孢杆菌LY-5；可选地，所述饲料添加剂中包括包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂；可选地，所述饲料添加剂中包括上述发酵方法制备得到的发酵产物；可选地，所述饲料添加剂中包括上述发酵方法制备得到的发酵产物和包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂。所述饲料添加剂还可以包括其他任选的活性成分和任选的辅料。所述活性成分包括但不限于具有其他功能的微生物制剂、药物活性成分和营养补充成分中的一种或多种；所述辅料包括但不限于微量元素、调味剂、酸化剂、防霉剂、抗氧化剂和干燥剂中的一种或多种。
基于枯草芽孢杆菌LY-5的生理特征和对牲畜的有益作用，本发明还提供了枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂、上述发酵方法或上述饲料添加剂在制备饲料中的应用。可选地，所述枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂、上述发酵方法制备得到的发酵产物或上述饲料添加剂可以分别的作为饲料的制备原料单独使用；可选地，也可以将其中多种联合作为原料使用；可选地，还可以采用上述发酵方法发酵底物以制备发酵饲料，以丰富饲料中可吸收的小分子物质。
基于上述应用，本发明还提供了一种饲料，该饲料包括上述枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂、上述发酵方法制备得到的发酵产物或上述饲料添加剂中的至少一种。可选地，所述饲料包括枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂或上述饲料添加剂，以使饲料具有枯草芽孢杆菌LY-5特定的生理功能，补充饲料中益生菌的含量；可选地，所述饲料包括枯草芽孢杆菌LY-5和上述发酵方法制备得到的发酵产物，以增强饲料中利于动物吸收的小分子物质。所述饲料还可以包括常规的基础组分，以为牲畜提供淀粉、脂肪、蛋白质、矿物质和微量元素等成分，所述基础组分包括但不限于玉米、豆粕、棉籽粕、酒糟、秸秆、青贮、干草、鱼粉和油脂等。
在一些优选的实施方式中，所述饲料中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5的活菌数为0.1×1011～2×1011 CFU/kg，例如可以为但不限于为0.1×1011CFU/kg、0.5×1011CFU/kg、1×1011CFU/kg、1.5×1011CFU/kg或2×1011CFU/kg，优选为0.5×1011～1.5×1011CFU/kg，更优选为1×1011CFU/kg。
需要说明的是，本发明中所述的饲料添加剂和饲料不限制其施用的牲畜的种类。由于本发明提供的枯草芽孢杆菌LY-5分离自健康驴的消化道，因此所述饲料添加剂和饲料更适用于马属动物，尤其是更适用于驴。
本发明通过实验发现，犊驴食用枯草芽孢杆菌LY-5后，可显著提高犊驴的平均日增重，对断奶早期犊驴具有显著的促生长作用；同时还能够显著提高断奶犊驴脂肪表观消化率。进一步的，犊驴食用枯草芽孢杆菌LY-5后，相比于未食用的对照组，Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数均高于对照组，表明枯草芽孢杆菌LY-5可提高犊驴直肠微生物多样性，尤其是显著提高肠道中拟杆菌门丰度，同时下调变形菌门中不动杆菌属丰度。拟杆菌门是碳水化合物和蛋白质的重要降解菌，可促进胃肠道免疫系统的发育，而变形菌门的异常扩增可作为肠道微生物失调的微生物信号。枯草芽孢杆菌LY-5上调拟杆菌门丰度、下调变形菌门丰度说明枯草芽孢杆菌LY-5优化了犊驴肠道菌群结构，促进了有益菌的增殖，减少了有害菌的数量。
因此本发明提供的枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂、上述发酵方法、上述饲料添加剂或上述饲料还可以用于制备如下产品：(a1)用于促进断奶犊驴生长的产品；(a2)用于促进断奶犊驴脂肪消化率的产品；(a3)用于提高断奶犊驴肠道微生物多样性的产品。
在一些可选的实施方式中，本发明提供的枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂、上述发酵方法、上述饲料添加剂或上述饲料只用于制备(a1)、(a2)或(a3)中的一种。
在一些可选的实施方式中，发明提供的枯草芽孢杆菌LY-5、包含枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂、上述发酵方法、上述饲料添加剂或上述饲料用于制备(a1)、(a2)和(a3)中多种产品，需要说明的是，当用于制备多种产品时，例如制备用于促进断奶犊驴生长的产品和制备用于促进断奶犊驴脂肪消化率的产品时，所述产品可以为分别独立的产品，也可以为一种兼具促进断奶犊驴脂肪消化率和促进断奶犊驴生长的产品；可选地，所述产品为一种兼具促进断奶犊驴生长、促进断奶犊驴脂肪消化率和提高断奶犊驴肠道微生物多样性的产品。
下面结合优选实施例进一步说明本申请的技术方案和有益效果。
实施例1
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5的分离纯化及生化特性：
(Ⅰ)分离用培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，培养基成分如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃灭菌30min。
(Ⅱ)分离方法：
(1)样品的采集与微生物分离：选择东阿县黑毛驴饲养基地的健康成年黑毛驴，采取大肠内容物，迅速放入装有液体培养基的灭菌螺口具盖试管中，带回实验室后立即进行梯度稀释，每梯度三个平板，倾注法分离培养，于37℃倒置培养。
(2)分离纯化：取以上长有各种细菌的平板，选取枯草芽孢杆菌单菌落，采用连续划线法进行分离纯化。将有不同菌落形态的单菌落均进行纯化。重复3-4次，镜检，直至获得纯种。
(3)观察菌落特征，利用革兰氏染色、镜检，观察细菌形态。经培养24小时以上时，在培养基表面形成白色或灰白色，不透明，边缘形状不规则，中间隆起，表面干燥的单个菌落。细胞成杆状，革兰氏染色阳性，内生孢子。
(4)DNA提取按照大连宝生物公司DNA提取试剂盒(akaRa 2.0)说明书方法提取细菌DNA，利用芽孢杆菌的通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(如SEQ ID NO.2所示)；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′(如SEQ ID NO.3所示)：对所获得芽孢杆菌保守序列进行扩增并测序，引物合成及测序送检上海生工生物工程技术服务有限公司完成，对16S rRNA序列进行同源性比较。16S rDNA的扩增体系如下，扩增体系的总体积为50μl：
PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min 30s，25个循环，72℃延伸8-10min，4℃保存。
实施例2
枯草芽孢杆菌LY-5的酶活和碳源氧化实验结果如表1所示：以无菌操作分别吸取50μL-100μL菌悬液接种至相关酶活及碳源氧化鉴定管中，空白对照中不接种，置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h观察结果。
表1枯草芽孢杆菌LY-5的酶活和碳源氧化实验结果
其中，“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。
实施例3
枯草芽孢杆菌LY-5的利用碳源产酸的实验结果如表2所示：以无菌操作分别吸取50μL-100μL菌悬液接种至糖发酵管中，空白对照中不接种，置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h观察结果。
表2枯草芽孢杆菌LY-5的利用碳源产酸的实验结果
其中，“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应；“W”表示弱阳性反应。
实施例4含有枯草芽孢杆菌LY-5的菌剂
(1)取枯草芽孢杆菌LY-5接种到LB液体培养基中，37℃发酵培养24～48h，4000rpm/min离心10分钟，取菌泥，活菌数5.71×1010-11cfu/ml。
(2)取受试菌株接种到LB液体培养基中，37℃发酵培养24～48h，取发酵液，活菌数6.12×108-9cfu/ml。
(3)取受试菌株接种到LB液体培养基中，37℃发酵培养24～48h，4000rpm/min离心10分钟，取菌泥，加入碳酸钙或石粉作为载体，70℃烘干、沸腾干燥、粉碎、得到菌粉，活菌数3.56×1010-12cfu/克。
实施例5枯草芽孢杆菌LY-5对断奶犊驴生长性能的影响
实验材料和方法：
取受试菌株接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养48h，4000rpm/min离心10分钟，取菌泥。
试验动物与饲养管理：选择10头雌性断奶犊驴(平均体重为113.4±17.52kg)，随机分成2组，每组5头，分别饲喂以下饲粮：1)基础饲粮(A组)，2)基础饲粮+枯草芽孢杆菌LY-5(B组)，枯草芽孢杆菌LY-5按1011CFU/kg添加于精饲料中，精饲料按照犊驴体重的1.3％定量饲喂，其中预饲期为7d，试验期为60d。
试验动物由专人进行饲养，每天早晚饲喂两次，自由采食粗饲料并保证充足的饮水。以正试期开始时空腹重做为始重，之后每隔15d称重一次，以计算平均日增重。准确记录每头犊驴每天精饲料和粗饲料投食量和剩食量，以计算平均日采食量。
以玉米、豆粕、棉籽粕、花生粕、干酒糟及其可溶物(DDGS)为主要原料，同时添加由矿物质、维生素等组成的营养性添加剂制成基础日粮(见表1)，以豆杆、干草等为粗饲料，精饲料组成见表3，饲料营养水平见表4。
表3精饲料组成
| 项目 | 含量(％) |
| 玉米 | 48.00 |
| 豆粕 | 10.00 |
| 玉米胚芽 | 4.00 |
| 干酒糟及其可溶物 | 8.00 |
| 花生仁粕 | 11.00 |
| 棉籽粕 | 10.00 |
| 石粉 | 4.00 |
| 预混料<sup>a</sup> | 5.00 |
| 合计 | 100.00 |
a每千克预混料含有:MgO 0.076g，ZnSO4·H2O 0.036g，MnSO4·H2O 0.043g，FeSO4·H2O 0.053g，NaSeO3 0.031g，VA 484IU，VD3 496.8IU，VE 0.828IU，VK3 0.23mg，VB10.092mg，VB2 0.69mg，VB12 0.00138mg，叶酸0.023mg，烟酸1.62mg，泛酸钙1.15mg，CaHPO45.17g，CaCO3 4.57g。
表4饲料营养水平(风干基础)
数据统计与分析：试验结果以平均值±标准差表示，数据用Excel进行整理并用SAS 8.0软件中的GLM程序进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
由表5可知，1～30d时，饲粮添加枯草芽孢杆菌LY-5可显著提高断奶犊驴平均日增重(P<0.05)，30～60d和1～60d时，两组犊驴各项生产性能指标差异不显著(P＞0.05)。由研究结果可知，1～30d时，饲粮添加枯草芽孢杆菌LY-5可显著提高犊驴的平均日增重。这可能是由于枯草芽孢杆菌LY-5在犊驴肠道中增殖，消耗氧气，抑制了肠道中某些需氧有害菌的繁殖，促进乳酸菌等有益厌氧菌的生长，辅助动物建立健康的消化道微生物菌群。同时，枯草芽孢杆菌LY-5可以产生多种酶类，有利于饲粮中营养物质的吸收和利用，从而提高生长性能。但30～60d时，饲粮中添加枯草芽孢杆菌LY-5对犊驴生长性能无显著性影响，可能原因是犊驴生长后期自身消化系统已愈加完善，在无外源枯草芽孢杆菌的辅助下即可获得良好的生长性能。该结果说明，枯草芽孢杆菌LY-5对断奶早期犊驴具有显著的促生长作用。
表5枯草芽孢杆菌对断奶犊驴生长性能的影响
实施例6枯草芽孢杆菌LY-5对断奶犊驴营养物质消化率的影响
实验材料与方法同实施例5。
样品采集方法如下：消化代谢试验于2017年11月21日至11月23日进行，采用内源指示剂2N酸不溶灰分法(D.Bergero，2006)连续3d收集部分犊驴鲜粪。按收集鲜粪重的5％加入10％硫酸溶液进行固氮，65℃烘干24-48h至恒重，粉碎过40目筛，制成待测样品。在试验第45d，采用直肠取样法采集每只犊驴直肠内容物于10mL冻存管，-80℃保存，备粪便样品中微生物基因组DNA提取。
测定精、粗饲料中干物质、粗蛋白质、粗脂肪、有机物、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、钙、磷含量，粪样中干物质、粗蛋白质、粗脂肪含量、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量。
干物质含量采用105℃烘干法测定，参照GB 6435—86；粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，参照GB/T 6432—94；粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，参照GB/T 6433—94；酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)含量采用范氏(Van Soest)洗涤纤维分析法测定，参照GB/T 20806—2006。钙含量采用EDTA络合滴定法测定，参照GB/T 6436—92；磷含量采用钒钼酸铵比色法测定，参照GB/T 6437—92。
由表6可知，添加枯草芽孢杆菌LY-5可显著提高断奶犊驴脂肪表观消化率(P＜0.05)，干物质表观消化率、蛋白质表观消化率、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维两组之间差异不显著(P＞0.05)，但均有增加的趋势。饲粮添加枯草芽孢杆菌LY-5可显著提高断奶犊驴脂肪消化率。这主要是由于枯草芽孢杆菌LY-5在生长过程中可合成脂肪酶等生物活性物质，与动物体消化道内的消化酶共同发挥作用，提高饲料消化率。
表6枯草芽孢杆菌对断奶犊驴营养物质消化率的影响
实施例7枯草芽孢杆菌LY-5对断奶犊驴直肠内容物菌群多样性影响
实验材料与方法，以及样品采集方法均同实施例5。
粪便样品中微生物基因组DNA提取按照Fast DNA SPIN as Kit for Feces说明书进行。提取的基因组DNA经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电压120V，电泳23min，Marker为λⅢDNA Maker，DNA产物在14 000bp左右，并且DNA条带亮度较高，无明显降解、无杂质，可进行下一步试验。
将目的DNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司，测序平台为Illumina Miseq。微生物测序结果通过Flash软件(FLASH v1.2.7)融合双末端序列。采用prinseq软件(PRINSEQ-lite0.19.5)截掉质量低的数据，按照97％相似性将序列聚类为(operationaltax onomic units OTU)。OTU聚类采用的软件为uclust版本(uclust v1.1.579)，采用软件RDP classifier进行物种分类。通过QIIME 1.9.0计算菌群ɑ多样性指数(ACE，Chao1，Simpson，Shannon)(Li等2015)。
饲粮添加枯草芽孢杆菌LY-5对断奶犊驴直肠内容物菌群多样性影响如表7，两组Coverage指数均高于0.995，说明测序深度足够，结果可呈现99.5％以上的菌群组成。B组的Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数均高于A组，差异不显著(P＞0.05)，但饲粮添加枯草芽孢杆菌LY-5具有提高断奶犊驴直肠微生物多样性的趋势。
表7枯草芽孢杆菌对断奶犊驴直肠内容物菌群α多样性影响
添加枯草芽孢杆菌LY-5对断奶犊驴直肠微生物组成门水平丰度影响如图1所示，两组中丰度较高的前三种细菌门分别为厚壁菌门(Fimicutes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。其中，B组拟杆菌门丰度显著高于A组(P＜0.05)，而A组中两头犊驴变形菌门含量高(36.46％～48.45％)，这表明添加枯草芽孢杆菌LY-5会提高犊驴拟杆菌门丰度，可能会抑制变形菌门的含量。
两组细菌组成属水平丰度图中(参见图2)，A组中两头变形菌门含量较高的犊驴，其不动杆菌属(Acinetobacter)含量较高，达到(34.35％～48.12％)。两组中其他丰度较高的细菌分别为Solibacillus、Streptococcus、unidentified_Clostridiales、unidentified_Ruminococcaceae。在细菌属水平上，两组并无显著差异(P＞0.05)。
PCoA图显示(参见图3)，两坐标轴相加已解释77.33％的变量组成。A组与B组部分样本细菌组成类似，但仍有部分相异，这说明添加枯草芽孢杆菌LY-5可对断奶犊驴直肠内容物细菌组成发生影响。
在本实施例的Alpha多样性分析中，Ace指数和Chaol指数越高，表明物种的丰富度越高，而Simpson指数和Shannon指数可以兼顾丰富度和均勾度表达菌群多样性，添加枯草芽孢杆菌LY-5组Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数均高于对照组，表明饲粮添加枯草芽孢杆菌LY-5可提高断奶犊驴直肠微生物多样性。两组试验驴直肠内容物微生物中丰度较高的前三种细菌门分别为厚壁菌门(Fimicutes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。拟杆菌门是饲料碳水化合物和蛋白质的重要降解菌，可促进胃肠道免疫系统的发育。变形菌的异常扩增可作为肠道微生物失调的微生物信号。本试验结果发现与A组相比，B组拟杆菌门丰度显著上升而变形菌门中不动杆菌属丰度略有下降，说明饲粮添加枯草芽孢杆菌LY-5优化了犊驴肠道菌群结构，可能促进了有益菌的增殖，减少了有害菌的数量。
结论，饲粮中添加枯草芽孢杆菌LY-5有利于提高断奶早期犊驴日增重、提高脂类物质消化率提高生产性能，同时还具有提高肠道菌群丰度，改善肠道健康的作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院特产研究所
东阿阿胶股份有限公司
<120> 枯草芽孢杆菌LY-5、菌剂及其应用和应用其的产品
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcaa cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420
gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720
gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080
ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200
caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag cca 1413
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22
Claims (10)
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5，于2018年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018939。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LY-5。
3.发酵方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LY-5或权利要求2所述的菌剂发酵底物。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述底物包括：甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、淀粉、糖原和D-松二糖中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述底物包括：甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁苷、七叶灵、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、棉子糖和D-松二糖中的至少一种。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5、权利要求2所述的菌剂或权利要求3-5任一项所述的发酵方法在制备饲料添加剂中的应用。
7.饲料添加剂，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LY-5、权利要求2所述的菌剂和采用权利要求3-5任一项所述的发酵方法制备得到的发酵产物中的至少一种。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5、权利要求2所述的菌剂、权利要求3-5任一项所述的发酵方法或权利要求7所述的饲料添加剂在制备饲料中的应用。
9.饲料，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5、权利要求2所述的菌剂、采用权利要求3-5任一项所述的发酵方法制备得到的发酵产物和权利要求7所述的饲料添加剂中的至少一种；
优选地，所述饲料中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5的活菌数为0.1×1011～2×1011CFU/kg。
10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LY-5、权利要求2所述的菌剂、权利要求3-5任一项所述的发酵方法、权利要求7所述的饲料添加剂或权利要求9所述的饲料在制备(a1)～(a3)中至少一种的应用：
(a1)用于促进犊驴生长的产品；
(a2)用于促进犊驴脂肪消化率的产品；
(a3)用于提高犊驴肠道微生物多样性的产品；
优选地，所述提高犊驴肠道微生物多样性包括上调拟杆菌门丰度和下调变形菌门丰度。
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