CN116286514A - 多功能菌剂及其所含的罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多功能菌剂及其所含的罗伊氏乳杆菌及其应用，涉及饲用功能微生物技术领域。该罗伊氏乳杆菌为Limosilactobacllusreuteri，其菌株号为LYS03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为62940。本发明的罗伊氏乳杆菌对生长条件具有广泛的适应性，而且具备淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等产酶特性，且对大肠杆菌有一定的抑制作用，具备非常好的抗氧化活性，非常适合作为功能微生态制剂产品应用于畜禽及水产养殖，减抗、替抗，改善动物健康。
Description
技术领域
本发明属于饲用功能微生物技术领域，涉及一株乳杆菌及其用途，特别涉及一株健康哺乳母猪肠道来源的罗伊氏乳杆菌及其应用。
背景技术
抗生素(antibiotics)作为微生物(包括细菌、真菌和放线菌属)在生长过程中所产生的具有抑菌或杀菌作用的一类次级代谢产物或其人工合成的类似物，不仅挽救了数百万人的生命，而且被广泛用作牲畜的生长补充剂，改善动物的整体健康状况，提高产量和质量，在实现畜牧业快速发展方面也做出了巨大贡献。然而，抗生素的过度使用也引发了系列问题，特别是各类快速出现的细菌耐药性威胁着人类的健康，引发全球性危机，也反映了全球范围内抗生素的过度使用以及缺乏开发新抗生素面临的巨大危机与挑战。开展动物肠源性益生菌的研究，以功能益生菌作为构筑健康肠道、研发新型高效抗生素替代品的重要突破口。通过收集、筛选肠源性的功能微生物，充分挖掘微生物自身(益生菌)及代谢产物功能属性(后生元)，优化肠道微生态，构建和维护动物肠道健康，建立一条有效保障动物肠道健康的生物学途径，为“饲料禁抗、养殖减抗和食品无抗”的防治提供新的思路。
乳酸菌类作为我国饲料添加剂目录(2021版)中允许使用的微生物饲料添加剂中的主要微生物种类，也是动物肠道有益微生物群的重要属类。其中乳酸杆菌属作为乳酸菌的重要属类，动物肠道中的优势菌群，已作为微生态制剂广泛应用于畜牧养殖，在维护动物肠道菌群稳态、免疫正常和提高抗氧化水平方面发挥重要作用。其中，罗伊氏乳杆菌作为乳杆菌的重要成员，是国家卫生部批准的食品可添加菌种之一，广泛存在于健康动物消化道及口腔环境，具备较好过胃及在肠道定殖能力，并通过产生乳酸、乳酸菌素等抑制肠道内的有害菌，并且产生胞外多糖多种抗氧化分子，增强肠道屏障抗氧作用，提高动物的抗病能力。但是由于不同来源的罗伊氏乳杆菌的定植能力、代谢产物功能以及产生的抗氧化活性成分差异大，大大影响了其在生产实践中的应用，也限制了其该类菌株益生功能的发挥。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种增强动物肠道屏障抗氧化作用的菌剂。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了解决以上技术问题，本发明首先提供了一种菌剂，所述菌剂含有罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌为Limosilactobacllus reuteri，其菌株号为LYS03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCC No.62940。
本文中，所述代谢物可从罗伊氏乳杆菌的发酵液中获得。所述罗伊氏乳杆菌的代谢物可为罗伊氏乳杆菌的无菌代谢物或罗伊氏乳杆菌的含菌代谢物。罗伊氏乳杆菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养罗伊氏乳杆菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的罗伊氏乳杆菌即得到罗伊氏乳杆菌的无菌代谢物。罗伊氏乳杆菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养罗伊氏乳杆菌，收集发酵液(含有罗伊氏乳杆菌和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为罗伊氏乳杆菌的含菌代谢物。
上述菌剂的活性成分可为罗伊氏乳杆菌或/和罗伊氏乳杆菌的代谢物或/和上述培养物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
上述菌剂中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。
所述固体载体可为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料可为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，罗伊氏乳杆菌或/和罗伊氏乳杆菌的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
进一步地，所述菌剂具有下述一种功能：
F1)、提高动物胃肠道功能，
F2)、抗氧化，
F3)、抑制大肠杆菌，
F4)、产蛋白酶，
F5)、产淀粉酶，
F6)、产脂肪酶。
本发明还提供了一种罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌为Limosilactobacllusreuteri，其菌株号为LYS03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCCNo.62940。
本发明还提供了一种前述罗伊氏乳杆菌的培养物，是将前述的罗伊氏乳杆菌在微生物培养基中培养得到的物质。
上述培养物中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。
术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质即发酵产物)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物和/或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。
本发明还提供了一种前述罗伊氏乳杆菌、前述罗伊氏乳杆菌的代谢物、前述菌剂、前述培养物的下述任一种应用：
A1)、制备提高动物胃肠道功能的产品；
A2)、制备抗氧化产品；
A3)、制备抑制大肠杆菌的产品；
A4)、生产蛋白酶；
A5)、制备生产蛋白酶的产品；
A6)、生产淀粉酶；
A7)、制备生产淀粉酶的产品；
A8)、生产脂肪酶；
A9)、制备生产脂肪酶的产品；
A10)、制备用于畜禽或水产动物的减抗剂；
A11)、制备用于畜禽或水产动物的替抗剂。
本发明还提供了一种饲料，所述饲料含有前述的菌剂。
本发明还提供了另一种饲料，所述饲料含有前述的培养物或/和前述的唾液联合乳杆菌。
本文中，所述饲料除含有唾液联合乳杆菌或菌剂或含有唾液联合乳杆菌培养物外，还可与谷实、糠麸、薯、草籽、树实、大豆粕、棉籽粕、玉米胚芽粕、肉骨粉、菜籽粕、花生粕和葵粕等所述多种原料制备成各种动物的不同生长期需要的饲料。
此外，还可以在前述饲料中再加入防腐剂、着色剂、调味剂、药物保健剂、生长促进剂等非营养性添加剂。
所述动物包括猪、牛、羊、马、鸡、鸭、鹅和水产动物。
所述谷实可为玉米和麦麸。
所述蛋白质饲料为大豆粕、棉籽粕、玉米胚芽粕和肉骨粉。
本发明所提供的菌剂，含有罗伊氏乳杆菌，简称罗伊乳杆菌GDMCC 62940，该菌剂具有非常好的抗氧化活性，非常适合作为功能微生态制剂产品应用于畜禽及水产养殖，减抗、替抗，改善动物健康。
保藏说明
罗伊氏乳杆菌拉丁名：Limosilactobacllus reuteri
菌株编号：Limosilactobacllus reuteri LYS03
保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心
保藏机构简称：GDMCC
地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
保藏日期：2022年11月2日
保藏中心登记入册编号：GDMCC 62940。
附图说明
图1为罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacllus reuteri)LYS03的系统发育进化树。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MRS固体培养基配方及制备方法：K2HPO42.0 g，无水乙酸钠5.0g，酵母粉5.0g，MgSO40.2 g，牛肉膏10.0g，柠檬酸铵2.0g，胰蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，硫酸锰0.05g，吐温80 10.0g，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000mL，pH值6.4±0.2。121℃灭菌15min。
MRS液体培养基配方及制备方法：K2HPO42.0 g，无水乙酸钠5.0g，酵母粉5.0g，MgSO40.2 g，牛肉膏10.0g，柠檬酸铵2.0g，胰蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，硫酸锰0.05g，吐温80 10.0g，蒸馏水1000mL，pH值6.4±0.2。121℃灭菌15min。
实施例1、罗伊氏乳杆菌GDMCC 62940的发酵应用
本实施例所用的罗伊乳杆菌GDMCC 62940甘油菌的具体分离和鉴定过程见实施例2。
1、种子培养
(1)菌株活化
首先，接种罗伊氏乳杆菌GDMCC 62940甘油菌至含有MRS固体培养基的斜面(18×180mm)，培养箱中于37℃培养48h，此即为F1代。
然后，再用5ml无菌生理盐水洗下斜面菌株，制备菌悬液，转接于含有MRS固体培养基的茄瓶培养，将茄瓶于培养箱中37℃培养24h，此即为F2代活化菌株。
(2)摇瓶种子培养
将活化培养的茄瓶菌种(即F2代活化菌株)，加入20ml无菌水洗脱制备菌悬液，转接于装有1000mL的MRS液体培养基的5L的摇瓶中，于恒温振荡培养器，100r/min，37℃振荡培养12h，然后再37℃静置培养12h，进一步提高菌落总数，同时强化菌株活力。
(3)种子扩大培养
采用种子罐进行步骤(2)中得到的摇瓶种子的扩大培养，按10％接种量将种子摇瓶中的菌液移接至含有种子培养基的种子罐，控制工艺如下：罐压：0.06Mpa，罐温：37℃，初搅拌：100r/min，溶氧自然下降，培养6h，然后停止搅拌，保持罐体正压，继续37℃静置培养12h，移种标准为菌落数＞1.0×109cfu/mL。
上述的种子培养基包括：麦芽糖浆4.5％，甘蔗糖蜜1.0％，酵母膏1.0％，乙酸钠0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，轻质碳酸钙0.6％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，吐温80 0.1％，豆油0.1％，其余为水。调pH值为6.0-6.5，121℃高压灭菌20min。
2、发酵培养
将种子罐培养好的种子移种(移种标准为菌落数＞1×109cfu/mL)至发酵罐的过程，移种量为20％。在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为150mL/min，搅拌控制为100rpm，温度控制在37℃，初始还原糖的浓度控制在50g/L(即发酵液体系中的还原糖的含量)，溶氧控制自然。全过程通过控制流加70％的葡萄糖水溶液(葡萄糖水溶液呈流动状态，所加入的葡萄糖水溶液为重量百分数为70％的葡萄糖水溶液)，维持发酵罐中的葡萄糖含量为0.5g/100mL。好氧发酵周期为24h，24h之后关闭搅拌，维持发酵罐内正压，进行厌氧发酵12h后停止发酵。发酵结束时发酵液的菌落数在5.0×1010CFU/mL，该发酵液(名称为LYS03发酵液)即为LYS03的培养物。
上述发酵罐中的液体培养基按照称量体积计为：麦芽糖浆4.5％，脱脂奶粉1.5％，甘蔗糖蜜1.5％，酵母膏1.0％，柠檬酸氢二铵0.2％，磷酸二氢钾0.15％，吐温80 0.1ml/100ml，乙酸钠0.5％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，加自来水至100％。
3、菌剂的制备
向LYS03发酵液中加入碳酸钙和豆粕粉，得到液体菌剂，液体菌剂中碳酸钙的含量为5.0g/100mL，豆粕粉的含量为10g/100mL。将液体菌剂进行低温喷雾干燥(出口温度约85℃)，得到的固体为LYS03固体菌剂(含有抗氧化活性物质等代谢产物以及LYS03活菌的微生态产品)按如下方法测定LYS03固体菌剂的活菌数和抗氧化性能。
(1)水分含量测定
采用直接干燥法，参考《GB/T 6435-2014饲料中水分的测定》中的方法。
(2)活菌数检测
按照CFU平板计数操作规范测定发酵液中的活菌数。实验设3次重复。
(3)总抗氧化性能(DPPH清除率)测定
通过总抗氧化能力检测试剂盒(DPPH法)(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799295)利用比色法检测DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(％)＝(A空白515nm-A测定515nm)÷A空白515nm×100％。实验设3次重复。A空白515nm为未接种菌株的原始培养基清液与试剂一反应后的吸光值，A测定515nm为培养结束后的上清液与试剂一反应后的吸光值。
(4)羟自由基清除率
参照羟自由基清除能力检测试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799277)说明书所示方法检测羟自由基清除能力。羟自由基清除率D％(A测536nm-A对536nm)÷(A空536nm-A对536nm)×100％。实验设3次重复。A测536nm为含有培养液和试剂四的样品反应管吸光值，A对536nm为不含培养液的反应管(即试剂四的对照)的吸光值，A空536nm为不含培养液和试剂四的反应管吸光值。
(5)SOD酶活测定
参照超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799593)说明书所示方法检测SOD酶活。SOD酶活(U/g或U/mL)＝[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷V样×F。实验设3次重复。抑制百分率＝(ΔA空白-ΔA测定)÷ΔA空白×100％，具体表示如下所示：
表1羟自由基清除率和超氧化物歧化酶(SOD)检测参考
V反总为反应体系总体积，1mL，V样为加入反应体系中培养液的体积，0.09mL，F为培养液的稀释倍数。
(6)GPX酶活测定
参照谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799617)说明书所示方法检测GPX酶活。GPX酶活(U/g或U/mL)＝200×ΔA测定412nm÷ΔA标准412nm。实验设3次重复。ΔA测定412nm为培养液反应前与反应后在412nm吸光值的差值，ΔA标准412nm为标准液与不含标准液的稀释液在412nm吸光值的差值。
测定结果如下：LYS03微生态制剂产品中水分含量为5.0％，LYS03菌株的活菌数为2.5×109cfu/g，总抗氧化性能(DPPH清除率)34.5％，羟自由基清除率65.5％，SOD酶活31.0U/g，GPX酶活32.0U/g。
而且，取10g的LYS03微生态制剂产品溶解并用无菌水定容至100mL，充分摇匀，并超声处理溶解10min，5000转/分钟离心15min，取上清采用琼脂扩散法检测抑菌活性。检菌为大肠杆菌，50μL上清液其抑菌圈直径达到22.5mm。
总的来说，分离获得的菌株生长速度快，对生长条件具有广泛的适应性，而且具备淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等产酶特性，且对大肠杆菌有一定的抑制作用，具备非常好的抗氧化活性，非常适合作为功能微生态制剂产品应用于畜禽及水产养殖，减抗、替抗，改善动物健康。
实施例2、罗伊氏乳杆菌GDMCC 62940的分离和鉴定
一、菌株LYS03的分离和筛选
1、菌株LYS03的分离
取不同时间段的健康哺乳母猪的粪便混合物10g，加入盛有50mL无菌生理盐水(无菌生理盐水由3mol/L的盐酸预先调整pH至2.5)的三角瓶中，充分涡旋振荡，并在37℃静置30min，然后用四层灭菌纱布过滤，得处理液。
健康哺乳母猪的粪便是指采食量大、生长、泌乳性能良好，无任何病兆的长白猪种的粪便混合物，样品采集后封装于灭菌的离心管中，并存于冻存盒中，在4小时内带回实验室进行下一步的工作。
为了特异性筛选具备一定产酸、耐胆盐和耐胃酸能力的菌株，将处理液采用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至105，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度稀释液，取稀释液涂布于含有1.5％的碳酸钙和0.5％的猪胆盐的分离培养基平板，37℃培养48h以上，至有单菌落长出。
其中，分离培养基为MRS固体培养基中添加1.5％碳酸钙和0.5％的猪胆盐，组成包括：15g无水碳酸钙，5.0g猪胆盐，K2HPO42.0 g，无水乙酸钠5.0g，酵母粉5.0g，MgSO40.2g，牛肉膏10.0g，柠檬酸铵2.0g，胰蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 10.0g，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000mL，pH值6.4±0.2。121℃灭菌15min。
2、菌株LYS03的筛选
(1)选择性初筛
在前述有单菌落长出的分离培养基平板上挑取菌落较大、呈乳黄色至乳白色、表面有凸起、湿润无褶皱、有明显溶钙圈、且革兰氏染色为阳性的菌株112株，并重复划线于MRS固体培养基，37℃培养，进行菌株纯化，保存。
同时，挑取纯化菌株分别点植于脱脂奶粉培养基(用于筛选蛋白酶)、淀粉培养基(用于筛选淀粉酶)和脂肪酶筛选培养基(用于筛选脂肪酶)，分别37℃培养48h，观察菌落的生长与产生的酶解圈的情况，并记录菌株透明圈直径(H)和菌落直径(C)的比值。
脱脂奶粉培养基：由MRS固体培养基和脱脂奶粉组成的固体培养基，该脱脂奶粉培养基中脱脂奶粉的含量为2.5g/100mL；
淀粉培养基：由MRS固体培养基和可溶性淀粉组成的固体培养基，该淀粉培养基中可溶性淀粉的含量为2.0g/100mL；
脂肪酶筛选培养基：由MRS固体培养基和橄榄油乳化液组成的固体培养基，该脂肪酶筛选培养基中橄榄油乳化液的含量为1.5g/100mL。
其中，上述的橄榄油乳化液是通过如下方法配置的：首先，配置4％的聚乙烯醇溶液，即取4.0g聚乙烯醇边搅拌边加入蒸馏水中，加热溶解，冷却后定容100mL。然后，将橄榄油与4％的聚乙烯醇溶液按体积比1：3混合，并在高速组织匀浆机上进行混匀乳化3分钟，即得到橄榄油乳化液。
根据不同的菌株产酶能力的差异，挑取能够对多种底物形成明显酶解圈的菌，并对它们形成酶解圈直径与菌落直径的比值做产酶能力(H/C)的初步排序，比值越大，酶活性越强。筛选结果如表2所示。
表2、不同菌株的产酶能力
| 菌株编号 | 蛋白酶H/C | 淀粉酶H/C | 脂肪酶H/C |
| 03 | 3.8 | 1.3 | 1.8 |
| 08 | 3.6 | 1.4 | - |
| 11 | 4.6 | 2.2 | 3.2 |
| 21 | 3.7 | 1.7 | - |
| 28 | 3.6 | 1.6 | - |
| 37 | 4.0 | - | 1.5 |
| 53 | 4.1 | 1.9 | - |
| 69 | 3.4 | 3.8 | 2.5 |
| 76 | 2.6 | - | 1.3 |
| 91 | 4.2 | 2.2 | - |
产酶能力的筛选结果显示：112株菌株均具备蛋白酶产生能力，其中具备两种以上酶学特性的菌株有81株。112株菌株有68株能够水解利用淀粉形成透明圈，具备淀粉酶产生能力，有16株能够水解橄榄油形成透明圈，具备脂肪酶的产生能力，仅有3株菌编号分别为03、11以及69的菌株同时具备蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，其中编号11的菌株蛋白酶和脂肪酶活性最好，编号69的菌株淀粉酶活性最强。
(2)96孔板筛选
用牙签蘸取上述具备产两种以上产酶特性的菌株接种于含有MRS液体培养基的96孔培养板中，150rpm，37℃培养48h。培养结束后，3000rpm离心15min，收集上清液。并通过总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(DPPH法)(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799295)的操作比较不同菌株上清液的DPPH自由基清除率，清除率越高，则表明总抗氧化能力越强。另外，采用琼脂扩散法比较不同上清液对检菌大肠杆菌CMCC44103的抑制能力，并记录抑菌圈直径(mm)，直径越大，抑菌能力越强。结果如表3所示。
表3、不同菌株培养上清液的DPPH自由基清除率和抑菌圈直径
结果显示，总抗氧化能力与抑菌圈的直径相关性较好，而且不同菌株的DPPH自由基清除率差别明显，其中DPPH自由基清除率排名前三的依次为编号11的菌株，编号69号的菌株和编号03的菌株，而且这三个菌株的抑菌圈直径也是最大的，都达到20.0mm以上。
(3)摇瓶发酵复筛
在112株菌株中取总抗氧化能力(即DPPH自由基清除率/％)排名前10的菌株转接至试管斜面(MRS固体培养基，18×180mm试管)，37℃培养24h，然后加入5mL无菌生理盐水洗脱，制备菌悬液(控制菌浓约为1×108cfu/mL)，最后将菌悬液按2％(v/v)的接种量转接至含有MRS液体培养基的摇瓶，进行发酵培养，其中摇瓶发酵条件为：250mL三角瓶中装量100mL摇瓶发酵培养基，37℃，150rpm培养24h。培养结束后，5000rpm，离心10min收集上清液，分别通过总抗氧化能力检测试剂盒(DPPH法)比色法检测DPPH自由基清除率(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799295)，通过羟自由基清除能力检测试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799277，羟自由基清除能力D％＝(A测536nm-A对536nm)÷(A空536nm-A对536nm)×100％)检测羟自由基清除能力，通过超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799593)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为D799617，GPX酶活(U/g或U/mL)＝200×ΔA测定412nm÷ΔA标准412nm)分别检测SOD酶活和GPX酶活。
表4、不同菌株上清液的DPPH自由基、羟自由基清除率以及抗氧化酶类的活性
摇瓶发酵复筛结果显示：相较其它菌株来说，总抗氧化能力、羟自由基清除率、SOD酶活及GPX酶活较好的为编号11、69和03的菌株，其中最好的为编号11的菌株，其次为编号69号的菌株，再次为编号03号的菌株。说明这些菌株的培养上清液都具备较强的抗氧化能力，而且其抗氧化能力可能与其相关抗氧化酶的表达量有关。将11号、69号和03号菌株进保存备用。将其中的03号菌株命名为LYS03或菌株LYS03。
3、分子鉴定
首先利用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自于生工生物工程(上海)股份有限公司)提取上述分离、筛选到的抗氧化能力较强的LYS03菌株的基因组，并采用通用引物27F和1492R扩增其16S rDNA部分序列，27F和1492R序列信息如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。
PCR反应体系如下：Pre-mix Ex Taq(Takara公司)25.0μL，27F引物(10μmol/L)2μL，1492R引物(10μmol/L)2μL，基因组DNA 1.0μL，超纯水20μL。PCR条件：95℃预变性5min；94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸1min30s，进行30个循环管，最后72℃延伸10min，并在4℃保存。将得到的特异性扩增产物采用PCR回收试剂盒(购自于购自于生工生物工程(上海)股份有限公司)回收目的片段，送样至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。菌株LYS03的测序结果(1482bp)如下：
SEQ ID No.1：
GGGATGGGCGTTGCTAATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCAAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATTACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTAACGCCCAAAGTCGGTGGCCTAACCTTTATGGAGGGAGCCGCCTAAGGCGACCAGTGTG
将前述LYS03的16S rDNA序列通过NCBI BLAST比对分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，选取具有较高相似度的同源菌株16S rDNA序列进行系统发育分析，采用MEGA5.0中的N-J法(Neighbor-Joining method)构建系统发育进化树，结果如图1所示(图1中LYS03表示菌株LYS03)，菌株LYS03与乳酸杆菌属的菌株聚为一大类，而且与罗伊氏乳杆菌分支进化距离最近，表明菌株LYS03与罗伊氏乳杆菌在进化上属于近缘物种(与Limosilactobacllus reuteri DSM 20016(NR 075036.1)同一性达到99.73％)。结合其菌落与菌体形态特征，确定菌株LYS03为罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacllus reuteri)，并将其编号为Limosilactobacllus reuteri LYS03，简称为罗伊氏乳杆菌LYS03或LYS03。
4、菌株保藏
鉴于上述形态特征分析、筛选结果和16S rDNA基因分析结果，将菌株LYS03鉴定为罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacllus reuteri)。于2022年11月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC；地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510075)，保藏编号为GDMCC No:62940，简称罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacllus reuteri)LYS03或菌株LYS03或LYS03。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (7)
1.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有罗伊氏乳杆菌，所述罗伊氏乳杆菌为Limosilactobacllus reuteri，其菌株号为LYS03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCC No.62940。
2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述一种功能：
F1)、提高动物胃肠道功能，
F2)、抗氧化，
F3)、抑制大肠杆菌，
F4)、产蛋白酶，
F5)、产淀粉酶，
F6)、产脂肪酶。
3.权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌的培养物，是将权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌在微生物培养基中培养得到的物质。
4.罗伊氏乳杆菌，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌为Limosilactobacllus reuteri，其菌株号为LYS03，其在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCC No.62940。
5.权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌、权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌的代谢物、权利要求1或2所述的菌剂、权利要求3所述的培养物的下述任一种应用：
A1)、制备提高动物胃肠道功能的产品；
A2)、制备抗氧化产品；
A3)、制备抑制大肠杆菌的产品；
A4)、生产蛋白酶；
A5)、制备生产蛋白酶的产品；
A6)、生产淀粉酶；
A7)、制备生产淀粉酶的产品；
A8)、生产脂肪酶；
A9)、制备生产脂肪酶的产品；
A10)、制备用于畜禽或水产动物的减抗剂；
A11)、制备用于畜禽或水产动物的替抗剂。
6.饲料，其特征在于：所述饲料含有权利要求1或2所述的菌剂。
7.饲料，其特征在于：所述饲料含有权利要求3所述的培养物或/和权利要求4所述的唾液联合乳杆菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310201955.2A CN116286514A (zh) | 2023-03-03 | 2023-03-03 | 多功能菌剂及其所含的罗伊氏乳杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310201955.2A CN116286514A (zh) | 2023-03-03 | 2023-03-03 | 多功能菌剂及其所含的罗伊氏乳杆菌及其应用 |
Publications (1)
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| CN116286514A true CN116286514A (zh) | 2023-06-23 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2023
- 2023-03-03 CN CN202310201955.2A patent/CN116286514A/zh active Pending
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN116814503A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-09-29 | 山东奈思健康科技有限责任公司 | 一种促补钙护骨的后生元制品及其制备方法和应用 |
| CN116814503B (zh) * | 2023-07-27 | 2024-01-30 | 山东奈思健康科技有限责任公司 | 一种促补钙护骨的后生元制品及其制备方法和应用 |
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