CN113897312B

CN113897312B - 一种动物饲喂菌剂制备及其应用

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Publication number: CN113897312B
Application number: CN202111175309.0A
Authority: CN
Inventors: 闫志英; 刘杨; 秦维; 吕青阳; 许力山; 姬高升; 王茄灵
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2021-10-09
Filing date: 2021-10-09
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2041-10-09
Also published as: CN113897312A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种动物饲喂菌剂制备及其应用。具体技术方案为：一株植物乳杆菌，于2021年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种名称：20765植物乳杆菌，Lactobacillus plantarum，保藏编号为：CGMCC No.22946。本发明所提供的一种动物饲喂菌剂作为动物饲料的添加剂能够有效的促进动物生长和预防动物疾病。

Description

一种动物饲喂菌剂制备及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种动物饲喂菌剂制备及其应用。

背景技术

动物肠道健康与其生长发育息息相关，而肠道微生物则是影响两者最关键的因素。动物肠道的微生物与宿主之间保持着微妙的动态平衡，这种微生态的平衡对于动物的健康极为重要。当动物肠道中有益微生物占优时，对微生物群落结构进行调控，形成一种利于动物健康的平衡状态，反之，当有益微生物处于劣势时，动物健康容易受到致病菌和有害物质的威胁，从而影响动物健康。因此控制动物肠道益生菌生态占位将直接调节动物的生长。

现报道最常见的益生菌主要是乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌等微生物，它们能产生乳酸、乙酸等小分子酸，还能产生促进动物采食欲望的酸香味以及分泌多种促进营养物质吸收的胞外酶(如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等)，最为关键的是它们均满足饲料添加目录里面的要求，对动物安全、无害。

目前，这些益生菌多出现在青贮发酵的过程中，大部分为自然中存在的，且报道多出于对反刍动物的健康影响，对其他动物的影响如何却极为少见。同时也很少报道将益生菌进行规模生产成为菌剂对动物进行饲喂，尤其是多种益生菌组合而成的菌剂是否更好、对多种动物进行饲喂是否有促进作用以及是否具备除促进动物生长外的其他功能。综上所述，研发益生菌组合而成的复合型菌剂以及验证其对不同动物的影响变得较为重要，对养殖业存在极强的应用价值和现实意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种动物饲喂菌剂制备及其应用，其能够有效的促进动物生长和预防动物疾病等。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明公开了一株植物乳杆菌，于2021年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种名称：20765植物乳杆菌，Lactobacillusplantarum，保藏编号为：CGMCCC No.22946。

相应的，一株植物乳杆菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

相应的，一种动物饲喂菌剂，包括植物乳杆菌、乳酸片球菌、酵母菌、光合细菌、枯草芽孢杆菌。

优选的，所述酵母菌包括酿酒酵母和产朊假丝酵母菌，所述光合细菌为红假单胞菌；所述酿酒酵母于2021年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22945，所述酿酒酵母的18S rDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

相应的，一种动物饲喂菌剂的制备，将乳酸菌、酵母菌、光合细菌和枯草芽孢杆菌利用发酵装置分别制备成菌液，将菌液混合后制成菌剂；所述乳酸菌、酵母菌、光合细菌和枯草芽孢杆菌菌液的体积比为6～8：1～2：0.5～1：0.5～2，所述乳酸菌包括乳酸片球菌和植物乳杆菌。

优选的，述酵母菌包括酿酒酵母和产朊假丝酵母菌，所述光合细菌为红假单胞菌；所述乳酸片球菌和植物乳杆菌菌液的体积比为1:1，所述酿酒酵母和产朊假丝酵母菌菌液的体积比为1:1。

相应的，动物饲喂菌剂作为添加剂在饲料中的应用。

相应的，一种发酵装置，包括带有顶盖的发酵罐，所述发酵罐的中心处竖直设置有混合筒，所述混合筒内设置有顶端伸出混合筒顶部、底端可开合的量筒，所述混合筒的周向上通过连接杆连接有培养器固定机构，所述固定机构包括限位环，所述限位环的底部设置有支撑筒，所述支撑筒内、位于限位环的下方设置有支撑件。

优选的，所述支撑件包括数个弧形板，所述弧形板与支撑筒的内底部铰接，所述弧形板的侧壁上通过弹簧与支撑筒的内壁连接，数个所述弧形板合并在一起后形成两端开口内部中空的圆台，且圆台的小径端朝向限位环设置。

优选的，所述混合筒的内壁上设置有支撑板，所述支撑板上开设有环形凹槽，所述环形凹槽朝向混合筒内壁的侧壁上设置有若干个与支撑板底部连通的孔道，所述量筒的底端的内壁上设置有一圈环形槽，所述量筒的底端与环形凹槽相适配。

本发明具备以下有益效果：

1.本发明提供了一种用于动物饲喂的菌剂，菌剂由乳酸菌、酵母菌、光合细菌、枯草芽孢杆菌组成，所有菌株均属于中国农业部批准的饲料添加目录中的微生物，可直接用于动物饲喂，用法简单，效果明显。

2.本发明提供的菌剂主要菌株为乳酸菌，其也是动物肠道健康的关键微生物，能产生乳酸、短链脂肪酸等小分子有机酸物质，这些物质能被动物肠道快速吸收，从而促进动物生长、发育，同时也能具有促进动物体内B族维生素合成、抑制动物肠道中沙门氏菌的定植、繁殖以及有毒有害物质合成等作用，对动物健康起到重要作用。

3.本发明提供的菌剂中包含酵母菌，其可在厌氧条件下进行发酵产生小分子物质，对动物营养吸收起到促进作用，同时可产生酯类物质，增加菌剂的芳香味，促进动物的采食欲望，增加动物的摄食量，从而促进动物的生长。

4.本发明提供的菌剂中还包含枯草芽孢杆菌和光合菌，其中枯草芽孢杆菌可分泌脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等物质，具有促进动物对饲料中营养物质的吸收、提高饲料的转化效率、预防动物疾病等作用。光合细菌可在厌氧条件下可利用动物肠道产生的H₂S等恶臭物质，改善动物肠道的健康，减少臭气的排放，减少畜禽养殖环境保护压力。

5.本发明提供的菌剂能适用常见畜禽、鱼类养殖，投入成本相对较低、收益成本更高，具有较好的应用和推广价值。

附图说明

图1为乳酸菌和酵母菌系统发育树；

图2为植物乳杆菌和酿酒酵母的电镜图；

图3为本发明发酵装置结构示意图；

图4为图3中A局部放大图；

图5为图3中B局部放大图；

图6为图3中发酵罐去掉顶盖后的俯视图；

图7为支撑板结构示意图；

图8为量筒结构示意图；

图9为支撑件结构示意图；

图10为支撑筒的俯视图(即图3/图4中支撑筒设置方向的俯视图)；

图11为插入件结构示意图；

图12为锥形瓶设置在固定机构上的状态图；

图13为培养皿设置在固定机构上的状态图；

图中：顶盖1、发酵罐2、混合筒3、量筒4、连接杆5、限位环6、支撑筒7、弧形板8、弹簧9、支撑板10、环形凹槽11、孔道12、集液斗13、通孔14、盖板15、橡胶垫16、铰接槽17、固定轴18、连接块19、防滑层20、插入块21、固定套22、限位孔23、防撞环24、出液管25、固定板26、导向柱27、环形槽28。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

若未特别指明，实施举例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

一、发酵益生菌的分离和筛选

发酵益生菌为乳酸菌和酵母菌，从青贮饲料中获得。具体为：取1.00g青贮饲料，加入9.00mL灭菌水稀释，即为10^-1梯度，再从稀释液中吸取1.00mL液体加入9.00mL灭菌水(10^-2梯度)，再重复以上步骤，直至稀释至10^-8梯度，按从低到高于各梯度稀释液中取100.00mL于相应筛选培养基平皿中，每个梯度涂布3个平行，于培养箱中培养2～3d。培养后的平皿取出，挑出乳酸菌培养基上呈现明显透明圈的菌落和在酵母菌培养基上生长迅速的单菌落进行纯化，经显微镜镜检后，用平板划线进行分离和纯化，纯化后用相应斜面培养基保存于4℃冰箱。

将筛选得到的乳酸菌和酵母菌接种至相应的培养基中，培养24h。根据乳酸产量、产香能力筛选得到最佳发酵乳酸菌株和酵母菌株。

其中，乳酸产量通过高效液相进行检测，具体方法为C₁₈柱、流动相：0.005mol/LH₂SO₄、流速：1.0mL/min、检测波长：210nm、柱温：35℃、进样量：20uL。产香能力则通过不同实验人员对发酵完成后的酵母菌液进行扇闻，再与青贮饲料的酸香味进行对比，通过两者评比，判断菌株产香能力强弱。

乳酸菌培养基(MRS)：蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、葡萄糖20.00g、吐温801.00mL、乙酸钠5.00g、磷酸氢二钾2.00g、硫酸镁0.50g、硫酸镁0.25g、碳酸钙20.00g、琼脂18.00g、水1000.00mL、调节pH6.50～6.80；转速180rpm，35℃恒温培养(该培养条件为罐式发酵或摇瓶培养时采用的条件，一般平皿培养时静置恒温即可)。注：在不加琼脂的情况下，该培养基为液体培养基。

酵母菌培养基(YPED)：酵母膏10.00g、蛋白胨20.00g、葡萄糖20.00g、麦芽浸粉2.00g、琼脂18.00g、3.33％孟加拉红溶液1.00mL、水1000.00mL、pH7.20～7.40，转速120rpm，28℃恒温培养。注：在不加琼脂的情况下，该培养基为液体培养基。

二、发酵益生菌的鉴定

1.分子鉴定

使用TIANGEN试剂盒分别提取乳酸菌、酵母菌(经液氮研磨后菌体)菌株DNA，分别用引物1492R和27F扩增乳酸菌序列和用引物NS1和S8扩增酵母菌序列，引物序列如下：

1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

NS1：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'

S8：5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'

将扩增后的产物送至上海生工公司进行16SrDNA和18SrDNA测序，测序结果在NCBI中BLAST区块中进行核酸比对，下载与测序结果相近的菌株序列，以Mega 5.0软件分析和构建系统发育树，结果如图1所示。

经鉴定，图1中，A为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，命名为20765植物乳杆菌，于2021年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.22946，其16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

B为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，命名为1421酿酒酵母，于2021年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.22945，其18S rDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

2.生理生化特征

20765植物乳杆菌在MRS培养基上白色带点微黄色，菌落直径2～3mm，味道微酸。最适pH值为6.0，培养的最适温度为33℃，厌氧条件下也能迅速生长。

1421酿酒酵母在YPED培养基上呈白色蜡状，菌落直径3～4mm，表面光滑，边缘整齐，味道酒香味浓厚。最适pH值为6.0，培养的最适温度为28℃。

三、发酵益生菌的电镜观察

按照接种量为5％(v/w)，分别在乳酸菌液体培养基和酵母菌液体培养基中接种对应的菌株，其中，植物乳杆菌在35℃，180rpm条件下恒温培养；酿酒酵母在28℃，120rpm条件下恒温培养。收集培养24h的新鲜菌体，用0.9％NaCl漂洗样品3～5次，每次10min，4000rpm离心3min，弃上清液，再加入2.5％的戊二醛溶液1.00mL，轻摇混匀后4℃过夜，再4000rpm离心3min弃上清液，加入0.9％NaCl漂洗3次，每次15min，漂洗后的菌体加入0.50mL、1％的锇酸，摇匀后静置固定1～2h，再次漂洗3次，利用20％、50％、80％、100％的乙醇溶液脱水，每种浓度处理10min，5000rpm离心3min，加入200.00uL丙酮，4℃静置20min，4000rpm离心3min，再次加入200.00uL丙酮，自然风干后于电子显微镜下进行观察和拍照。20765植物乳杆菌(A)和1421酿酒酵母(B)形态如图2所示。

四、本发明公开了一种动物饲喂菌剂，包括植物乳杆菌、乳酸片球菌、酵母菌、光合细菌、枯草芽孢杆菌。其中，酵母菌包括酿酒酵母和产朊假丝酵母菌Candidautilis，光合细菌为红假单胞菌。

乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)可购自中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.17117。

产朊假丝酵母菌(Candida utilis)可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1769。

红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)可购自中国微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.11874。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)市售购买获得。

五、本发明公开了一种动物饲喂菌剂的制备，将乳酸菌、酵母菌、光合细菌和枯草芽孢杆菌利用发酵装置分别制备成菌液，将菌液混合后制成菌剂；乳酸菌、酵母菌、光合细菌和枯草芽孢杆菌菌液的体积比为6～8：1～2：0.5～1：0.5～2，优选为乳酸菌、酵母菌、光合细菌和枯草芽孢杆菌菌液的体积比为6：2：1：1。

其中，乳酸菌包括乳酸片球菌和植物乳杆菌，酵母菌包括酿酒酵母和产朊假丝酵母菌，光合细菌为红假单胞菌；乳酸片球菌和植物乳杆菌菌液的体积比为1:1，酿酒酵母和产朊假丝酵母菌菌液的体积比为1:1。乳酸片球菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母菌、红假单胞菌和枯草芽孢杆菌菌液中活菌量分别为10⁸～10⁹cfu/mL。

本发明所制备的菌剂包括液体菌剂和固体菌剂，液体菌剂的制备过程为：按照上述比例将菌液按照乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、光合细菌的顺序依次混合在一起，混合完成后，然后按照0.02g/L加入柠檬酸，用于饲喂菌剂的保存，最后在通风阴凉干燥处保存。

固体菌剂(有两种形式)的制备过程为：

(1)按照上述比例将菌液按照乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、光合细菌的顺序依次混合在一起，混合完成后，然后按照0.02g/L加入柠檬酸，用于饲喂菌剂的保存，再将混合液按质量比为1:2的比例与麸皮混合均匀，于干净、干燥、通风处晾晒，至混合物水分低于30％即可，最终密封包装，通风阴凉干燥处保存。

(2)按照上述比例将菌液按照乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、光合细菌的顺序依次混合在一起，混合完成后，采用喷雾干燥机对菌液进行浓缩，得到的菌粉密封包装，通风阴凉干燥处保存。

3.本发明公开了上述饲喂菌剂作为添加剂在饲料中的应用。具体的应用方法为：将获得的液体菌剂和按照方式(1)获得的固体菌剂按质量比为1:1000进行添加至动物饲料中，混合后直接饲喂。将获得的液体菌剂和按照方式(2)获得的固体菌剂按质量比1:100000进行添加，使用时，按比例取出部分菌粉，用少量自来水混合后再添加至动物饲料中。

4.本发明还公开了一种发酵装置，在该发酵装置中可以同时实现多种菌株的复苏，以及同时实现多种菌株的发酵；并且，发酵后的菌液也能通过该发酵装置进行混合，尽可能的做到了一物多用。同时，也可以使用该发酵装置进行多组平行试验，有效的节约了时间，避免菌株培育失败后，需要重新进行培育。

下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1益生菌的复苏和发酵

一、该实施例所涉及的培养基如下，上述已经公开的培养基在此不再赘述：

1.光合细菌培养基：氯化铵1.0g，磷酸氢二钾0.5g，氯化镁0.2g，氯化钠0.1g，醋酸钠0.5g，酵母膏0.2g，水1000mL，转速80rpm，25℃恒温培养。

2.芽孢杆菌培养基：葡萄糖10.00g，磷酸钙5.00g，硫酸铵0.50g，氯化钾0.20g，七水硫酸镁0.10g，硫酸锰0.0001g，硫酸亚铁0.0001g，酵母提取物0.50g琼脂20.0g、pH值7.00±0.20、转速180rpm，35℃恒温培养。

二、益生菌的复苏和发酵

益生菌为乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、光合细菌，从相应的菌株冻存管中取出相应菌，静置至室温。对于上述筛选得到的植物乳杆菌和酿酒酵母则直接使用。然后，取少量含菌粉末，加入无菌水中，用移液枪缓慢吹打均匀，再取100uL此液体于含有相应固体培养基的培养皿中，使用涂布器涂布均匀，同一菌株设置多组培养皿进行同时培养，将涂布有相同菌株的培养皿放入到固定机构中，再将发酵罐放入到恒温培养箱中培养。整个培养过程中，根据菌株的最适温度调节不同温度进行培养。

待培养基上长出群落后，通过显微镜观察是否存在杂菌。确认无杂菌后，用接种环接种菌株至相应的培养基中(即固体培养基中不加琼脂，呈液态，后续称液体培养基)，液体培养基可盛放在培养皿中或锥形瓶中，然后放入固定机构中，随后将发酵罐放置于恒温摇床中培养，调节摇床温度为菌株最适温度，培养好的种子培养液取出，最终得到相应的菌液。菌液的混合在混合筒中进行。

实施例2动物饲喂毒性检测

根据上述方式3制备的动物饲料进行毒性试验，该试验按照标准GB15193.3-2014进行，其结果见下表1所示。

表1饲喂菌剂毒性经口实验

从表1中的结果显示，实验动物在饲喂14d内未出现任何中毒症状和死亡，且雌雄动物的体重未发生异常变化。对饲喂完成后的受试动物进行解剖，其内部脏器未出现任何异常变化。动物饲喂菌剂对ICR小鼠的急性经口半数致死量LD₅₀＞5000mg/kg，根据急性毒性分级，属于无毒级别。综上结果可知，动物饲喂菌剂安全。

实施例3动物饲喂菌剂对不同动物的影响

1.饲喂山羊

以健康、生长状态相近，大小均一的简阳大耳朵杂交羊为受试动物。市售饲料为配合营养饲料，购于邳州市小河科技发展有限公司；玉米粉购置于当地农户，花生苗购置于河南正阳县碧海牧草有限公司。饲喂菌剂为固体菌剂(1)，按比例添加至市售饲料中，饲喂方式为羊场日常饲喂方式，未添加饲喂菌剂的山羊作空白组，添加饲喂菌剂的山羊为实验组，每组30只，饲喂周期为90天。

1.1对山羊血液生化的影响

血液生化指标能反映动物的生产潜力和健康状况，可作为大规模饲养的重要参考。据此，采集山羊饲喂前后的血样，检测血液生化指标变化，进行比较分析，以确定动物饲喂菌剂对山羊健康的影响。取对照组和实验组山羊全血进行生化分析，生化检测结果见下表2所示。

表2生化检测结果

从表2的结果显示，饲喂前后空白组山羊的血液生化指标几乎无显著性变化，而实验组中仅ALT、TP、AST、Ca、Glu有显著性变化。实验过程中实验组山羊血液中两者ALT从21.24IU/L降低至14.64IU/L；AST从76.38IU/L降低至53.88IU/L，浓度虽然显著降低，但仍在正常范围内。TP显著下降，从63.88mg/L降低至47.40mg/L(＜65.28mg/L)，山羊蛋白质代谢正常、机体健康。山羊血液中Ca浓度从2.17mmol/L降低至1.75mmol/L，但仍处于正常范围内。血液中Glu从3.23mmol/L降低至1.80mmol/L，但并不影响山羊血糖的代谢。尽管实验组中ALT、TP、AST、Ca、Glu存在显著变化，但通过与现有文献报道对比，发现这种变化均在山羊血液生化正常范围内，综上可知，添加饲喂菌剂对山羊血液生物影响不大，对山羊是无害、安全的。

1.2山羊采食和增重变化

为了解含有饲喂菌剂的饲料对山羊生长的影响，测定山羊的日采食量、月增重变化，结果如表3和4所示。

表3山羊采食变化[kg/(只·天)]

由表3可知，整个饲喂实验期间，饲喂饲料组山羊日采食量1.32kg/(只·天)显著高于空白组1.14kg/(只·天)(P＜0.05)，说明含有饲喂菌剂的饲料具有增强适口性、摄食欲望的作用。

表4山羊增重变化(Kg/只)

饲喂天数	空白组	实验组	SEM	P
					0～30d	3.79±0.80	4.78±1.27	0.53	0.08
30～60d	5.04±1.22	5.77±1.28	0.63	0.27
					60～90d	3.71±1.13	4.56±1.55	0.68	0.23
总增重变化	12.54±2.23b	15.11±2.15a	1.10	0.03

由表4可知，0～30d、30～60d、60～90d实验组和空白组山羊的月增重不存在显著性差异(P＞0.05)。计算0～90d总增重时，空白山羊总增重12.54kg/只，而实验组山羊总增重达15.11kg/只，多增2.57kg/只(P<0.05)。综上可知，添加饲喂菌剂能促进山羊的采食量，从而增强山羊的增重。

2.饲喂家兔

以生长状态相近、大小均一、机体健康的家兔为受试动物。饲料为配合营养饲料，辅以苜蓿干草进行饲喂。饲喂菌剂为固体菌剂(1)，按比例添加至市售饲料中，饲喂方式为日常饲喂方式，未添加饲喂菌剂的家兔作空白组，添加饲喂菌剂的家兔为实验组，每组20只，饲喂周期为20天，观察饲喂菌剂对家兔采食和增重的影响。

表5家兔饲喂前后变化

实验组别	空白组	实验组
			饲喂前采食/g	108.22±0.34	110.15±0.18
饲喂后采食/g	125.41±0.29b	167.77±0.72a
			饲喂前日均增重/g	20.88±0.17	21.22±0.41
饲喂后日均增重/g	26.23±0.33b	33.48±0.52a
			饲喂期间死亡数量/只	0	0

从表5中可知，饲喂完成后，实验组家兔日采食量达到167.77g/只，而空白组家兔仅为125.41g/只；实验组家兔日均增重达到33.48g/只，而空白组家兔仅为26.23g/只，这说明饲喂菌剂能显著的增加家兔的日采食量和增重。

3.饲喂肉牛

以生长状态相近、大小均一、机体健康的西门塔尔牛为受试动物。饲料为配合营养饲料，辅以青贮饲料进行饲喂。饲喂菌剂为固体菌剂(2)，按比例添加至市售饲料中，饲喂方式为牛场日常饲喂方式，未添加饲喂菌剂的肉牛作空白组，添加饲喂菌剂的肉牛为实验组，每组10头，饲喂周期为60天，观察饲喂菌剂对肉牛采食和增重的影响。

表6肉牛饲喂前后变化

从表6中可知，饲喂完成后，实验组肉牛日采食量达到18.75Kg/头，而空白组肉牛仅为12.94Kg/头；实验组肉牛日均增重达到117.3Kg/头，而空白组肉牛仅为77.78Kg/头，这说明饲喂菌剂能显著的增加肉牛的日采食量和增重。

4.饲喂仔猪

以生长状态相近、大小均一、存在腹泻、厌食现象的三元杂交仔猪为受试动物。市售饲料为配合营养饲料，购于东莞市双胞胎饲料有限公司，玉米粉购置于当地农户。饲喂菌剂为固体菌剂(1)，按比例添加至市售饲料中，饲喂方式为日常饲喂方式，未添加饲喂菌剂的仔猪作空白组，添加饲喂菌剂的仔猪为实验组，每组10只，饲喂周期为20天，观察饲喂菌剂对仔猪腹泻、厌食的影响。

表7仔猪饲喂前后变化

实验组别	空白组	实验组
			饲喂前日采食/Kg	0.67±0.12	0.62±0.21
饲喂期间日采食/Kg	0.92±0.23b	1.51±0.22a
			饲喂前均重/Kg	25.33±1.22	25.21±0.89
饲喂后均重/Kg	29.54±0.77b	33.01±1.02a
			饲喂前腹泻数量/只	10	10
饲喂后腹泻数量/只	2	0
			饲喂期间死亡数量/只	3	0

从表7可知，实验组仔猪日采食量达到1.51kg/只，而空白组仔猪仅为0.92kg/只；实验组仔猪总增重达到7.80kg/只，而空白组仔猪仅为4.21kg/只，这说明饲喂菌剂能显著的增加仔猪的日采食量和增重。通过对比饲喂前后腹泻和死亡仔猪数量可知，饲喂菌剂能改善仔猪的腹泻症状，避免仔猪的死亡。

5.饲喂蛋鸡

以生长状态相近、大小均一的18周大小的蛋鸡为受试动物。市售饲料为配合营养饲料，购于杭州宝积生物科技有限公司，饮水方式为自由饮水。饲喂菌剂为固体菌剂(1)，按比例添加至市售饲料中，饲喂方式为日常饲喂方式，未添加饲喂菌剂的蛋鸡作空白组，添加饲喂菌剂的蛋鸡为实验组，每组100只，饲喂周期为20天，观察饲喂菌剂对蛋鸡采食和粪便臭味的影响。

表8蛋鸡饲喂前后变化

实验组别	空白组	实验组
			饲喂前采食/g	115.22±2.27	114.27±3.12
饲喂后采食/g	138.01±4.41	171.04±5.24
			饲喂前均重/g	1471.52±5.32	1469.22±6.85
饲喂后均重/g	1788.68±11.32	1992.48±10.22
			饲喂前日产蛋总数/个	8	9
饲喂后日产蛋总数/个	37	62
			饲喂前鸡粪恶臭状态	+++	+++
饲喂后鸡粪恶臭状态	+++	+
			饲喂期间死亡数量/只	0	0

从表8可知，实验组蛋鸡日采食量达到171.04kg/只，而空白组蛋鸡仅为138.01kg/只；实验组蛋鸡总增重达到523.26kg/只，而空白组蛋鸡仅为317.16kg/只，这说明饲喂菌剂能显著的增加蛋鸡的日采食量和增重。通过对比饲喂前后蛋鸡产蛋总数、鸡粪恶臭状态和死亡蛋鸡数量可知，饲喂菌剂能明显改善蛋鸡的生长状态，促进蛋鸡的产蛋效率，降低鸡粪恶臭的程度。

6.饲喂鱼类

以生长状态相近、大小均一的鲢鱼、草鱼为受试动物。市售饲料为配合营养饲料，购于山东昊诺思达饲料厂。饲喂菌剂为液体菌剂，按比例添加至市售饲料中，饲喂方式为日常饲喂方式，未添加饲喂菌剂的鱼塘作空白组，添加饲喂菌剂的鲢鱼、草鱼的鱼塘为实验组，每组的区域各为100m²，饲喂周期为30天，观察饲喂菌剂对鱼的安全性，同时监测鱼塘水质生化指标变化。

表9鱼类饲喂前后变化

从表9可知，添加饲喂菌剂后，未出现鱼死亡的现象。同时鱼塘水质中各指标均升高，其中氨氮和COD提高，可能是菌剂中的功能菌释放饲料中的营养，但也是因为菌剂增加了溶氧和浮游动植物的含量，为鱼类提供了更好的生长环境。

实施例4发酵装置

参考图3-图13所示，本发明所公开的一种发酵装置，包括带有顶盖1的发酵罐2，从而为微生物的培养提供相对密闭的环境，顶盖1和发酵罐2活动连接，在发酵罐2的中心处竖直设置有混合筒3，混合筒3内设置有顶端伸出混合筒3顶部、底端可开合的量筒4，在量筒4的顶端设置有集液斗13，从而便于将菌液倒入量筒4内。混合筒3的内壁上设置有支撑板10，混合筒3的底端抵紧在支撑板10上，从而对量筒4的底端进行封闭。

而为了增加量筒4底端的密封性，在支撑板10的板面上开设有环形凹槽11，量筒4的底端的内壁上设置有一圈环形槽28，量筒4的底端与环形凹槽11相适配。具体为：量筒4的底端卡进环形凹槽11内，而环形槽28则卡在支撑板10中心处形成的圆台边缘上，从而避免菌液从量筒与支撑板之间的缝隙处漏出，导致体积测量不准。同时，为了便于观察，在量筒的侧壁上设置有刻度线，和/或,在混合筒3的侧壁上设置有刻度线，该刻度线与量筒的对应。而为了使菌液漏至混合筒3的底部，在环形凹槽11朝向混合筒3内壁的侧壁上设置有若干个与支撑板10底部连通的孔道12；同时，为了加快菌液下漏的速度，在支撑板10上围绕环形凹槽11设置有数个通孔14。而支撑板10的板面为朝向支撑板中心处圆台倾斜的斜面，避免菌液滞留在支撑板10上。

进一步的，为了增加量筒与支撑板之间的稳定性，在量筒4的侧壁上设置有盖板15，盖板15位于混合筒3的顶端，并与混合筒3的顶端相抵。具体的：盖板15可直接与混合筒3的顶部接触，也可在盖板15与混合筒3相接触的接触面上分别设置有磁片，使盖板15与混合筒3通过磁片固定，避免量筒3晃动，从而使量筒4的底端与支撑板10之间出现缝隙，从而无法测量菌液。同时，可在混合筒3的内壁上且位于支撑板10的上方固定有橡胶垫16，量筒4贯穿橡胶垫16并与其固定，从而加强量筒4的稳定。

进一步的，在混合筒3的周向上通过连接杆5连接有培养器固定机构，培养器指的是培养微生物的器皿，包括但不限于培养皿、锥形瓶。固定机构包括横向设置的限位环6，限位环6的底部设置有顶部开口的支撑筒7，支撑筒7内、位于限位环6的下方设置有支撑件。支撑件用于支撑和固定培养器。具体的：支撑件包括数个弧形板8，弧形板8与支撑筒7的内底部铰接，即在支撑筒7的内底部设置有铰接槽17，在铰接槽17内设置有固定轴18，而弧形板8的底部设置有与固定轴18适配的连接块19，从而使弧形板18绕着固定轴18在一定角度内转动。

进一步的，为了使弧形板8在转动后能够进行复位，弧形板8的侧壁上通过弹簧9与支撑筒7的内壁连接，弹簧9的数量不限，可根据实际需求设置多个。在未使用时，数个弧形板8合并在一起。而合并后，支撑件的顶部可用于支撑培养皿，而由多个弧形板8组合后形成的内部空间则用于固定锥形瓶。而为了使弧形板8合并后的形成的内部空间与锥形瓶适配，弧形板8的侧面为斜面，使数个弧形板8合并在一起后形成两端开口内部中空的圆台状，且圆台的小径端朝向限位环6设置。弧形板8的内壁面能够很好的与锥形瓶的侧壁相抵，从而对锥形瓶进行固定。同时，为了增加弧形板8与锥形瓶之间的摩擦力，在弧形板8的内壁上可设置有防滑层20，防滑层20可由橡胶制成，当然，也可以是其他材质。

进一步的，由于锥形瓶的底部直径大于弧形板8合并后的顶部内径，因此，锥形瓶不易进入到弧形板8围成的区域内。因此，可在锥形瓶的底部套设一个插入件，插入件的底部为圆台形或圆锥形的插入块21，在插入块21的大直径面或底面设置有固定套22，固定套22用于将锥形瓶的底部进行包裹固定，固定套22为橡胶材质，具有一定的延展性，从而使锥形瓶的底部成功套进固定套内。而插入块21可以是表面光滑的硬质塑料制成，也可以是金属材料制成。

当锥形瓶固定在支撑件内时，插入块21的小径端或尖端会伸进由弧形板8围成区域的顶端，在锥形瓶逐渐向下运动的过程中，弧形板8逐渐被挤开，弹簧9被压缩，弧形板8围绕固定轴18转动，直至锥形瓶的底部位于支撑筒7的内底部，而由于插入件的存在，因此，需要在支撑筒7的底部设置限位孔23，限位孔23的孔径小于固定套22的最大直径，从而使锥形瓶能够固定在支撑筒7内。本发明的设置是：当插入件卡进限位孔23内时，锥形瓶的侧壁与防滑层20接触，从而实现对锥形瓶的固定，锥形瓶固定后的状态图见图10。

如果需要在固定机构上放置培养皿，则需要使弧形板8合并后的顶部直径小于培养皿的直径，避免培养皿穿过弧形板8围成的区域，进而掉落。由于限位环6的内径大于培养皿的外径，因此，在移动的过程中，培养皿可能在限位环6内晃动并与限位环的内壁相撞。因此，在限位环6的内侧壁上设置有防撞环24，防撞环24由橡胶制成，具有一定的弹性，能够有效的缓解培养皿的撞击。防撞环24的内径大于培养皿的直径，同时，大于锥形瓶的底部直径。培养皿放置在固定机构上的状态图见图11。

进一步的，混合筒3的一端伸出发酵罐2的底部并与发酵罐2通过轴承固定，而混合筒3伸出发酵罐2的一端的端面上设置有与混合筒3相通的出液管25，即在混合筒3的底部设置有出液孔，出液管25上设置有阀门。同时，混合筒3的内底部为朝向出液孔倾斜的斜面，避免菌液滞留在混合筒3内。为了能够对多种菌液进行混合，在发酵罐2内设置有电机(图中未示出)，电机与混合筒3之间可通过皮带传动或齿轮传动，从而驱动混合筒3转动。

进一步的，为了增加混合筒转动过程中的稳定性，在发酵罐2的内壁上设置有固定板26，混合筒3贯穿固定板26、与固定板26通过轴承固定。同时，在支撑筒7的外侧壁上设置有导向柱27，在发酵罐2的内壁上设置有与导向柱27适配的导向槽，从而保证固定机构在随着混合筒3转动过程中的稳定性。

本发明中，固定机构的数量根据实际情况进行设置即可。使用该发酵装置对不同的菌株进行发酵培养菌液，将培养好的菌液按照规定的顺序依次倒入到量筒4内，并倒入指定体积，然后，向上提起量筒4，使盖板15与混合筒3的端面脱离，同时，量筒4与支撑板10脱离一定的距离，从而使量筒内的菌液通过孔道12和通孔14流入混合筒3的底部。然后向下按压量筒4，使量筒与支撑板配合在一起，以及盖板15与混合筒3的端面磁性固定。然后，按照上述操作加入其它菌液。当菌液加入完成后，启动电机，使混合筒转动，混合筒转动的速度较慢，优选为40～100r/min，避免菌液通过通孔进入到支撑板的上方。因此，使用本发明所公开的发酵装置可使菌株在不同培养基(液体或固体培养基)上进行发酵培养以及不同菌液的混合。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种动物饲喂菌剂制备及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1469

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 1

ctggcagcgc tatgatgcag tcgaacgaac tctggtattg attggtgctt gcatcatgat 60

ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc cagaagcggg 120

ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca tggtccgagt 180

ttgaaagatg gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag ctagatggtg 240

aggtaacggc tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg agagggtaat cggccacatt 300

gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg 360

acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct 420

gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta tttaaccaga 480

aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540

gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg 600

ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac 660

tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg 720

tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga ttagataccc 780

tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc 840

tgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag 900

gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag 960

aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa atctaagaga ttagacgttc ccttcgggga 1020

catggataca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080

ccgcaacgag cgcaaccctt attatcagtt gccagcatta agttgggcac tctggtgaga 1140

ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200

ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaacgagtt gcgaactcgc gagagtaagc 1260

taatctctta aagccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg 1320

gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380

accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac acccaaagtc ggtggggtaa ccttttagga 1440

accagccgcc taagggacag atgctctcc 1469

<210> 2

<211> 1662

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

agcatttata cagtgaactg cgaatggctc attaaatcag ttatcgttta tttgatagtt 60

cctttactac atggtataac tgtggtaatt ctagagctaa tacatgctta aaatctcgac 120

cctttggaag agatgtattt attagataaa aaatcaatgt cttcggactc tttgatgatt 180

cataataact tttcgaatcg catggccttg tgctggcgat ggttcattca aatttctgcc 240

ctatcaactt tcgatggtag gatagtggcc taccatggtt tcaacgggta acggggaata 300

agggttcgat tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg aaggcagcag 360

gcgcgcaaat tacccaatcc taattcaggg aggtagtgac aataaataac gatacagggc 420

ccattcgggt cttgtaattg gaatgagtac aatgtaaata ccttaacgag gaacaattgg 480

agggcaagtc tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tattaaagtt 540

gttgcagtta aaaagctcgt agttgaactt tgggcccggt tggccggtcc gattttttcg 600

tgtactggat ttccaacggg gcctttcctt ctggctaacc ttgagtcctt gtggctcttg 660

gcgaaccagg acttttactt tgaaaaaatt agagtgttca aagcaggcgt attgctcgaa 720

tatattagca tggaataata gaataggacg tttggttcta ttttgttggt ttctaggacc 780

atcgtaatga ttaataggga cggtcggggg catcagtatt caattgtcag aggtgaaatt 840

cttggattta ttgaagacta actactgcga aagcatttgc caaggacgtt ttcattaatc 900

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ttggtaatct tgtgaaactc cgtcgtgctg gggatagagc attgtaatta ttgctcttca 1500

acgaggaatt cctagtaagc gcaagtcatc agcttgcgtt gattacgtcc ctgccctttg 1560

tacacaccgc ccgtcgctag taccgattga atggcttagt gaggcctcag gatctgctta 1620

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Claims

1.一种动物饲喂菌剂的制备方法，其特征在于：将乳酸菌、酵母菌、光合细菌和枯草芽孢杆菌利用发酵装置分别制备成菌液，将菌液混合后制成菌剂；所述乳酸菌、酵母菌、光合细菌和枯草芽孢杆菌菌液的体积比为6～8：1～2：0.5～1：0.5～2，所述乳酸菌为乳酸片球菌和植物乳杆菌；所述酵母菌为酿酒酵母和产朊假丝酵母菌，所述光合细菌为红假单胞菌；

所述植物乳杆菌于2021年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种名称：20765植物乳杆菌，Lactobacillus plantarum，保藏编号为：CGMCCNo.22946；乳酸片球菌购自中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCCNo.17117；产朊假丝酵母菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1769；红假单胞菌购自中国微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCCNo.11874；

所述乳酸片球菌和植物乳杆菌菌液的体积比为1:1，所述酿酒酵母和产朊假丝酵母菌菌液的体积比为1:1，乳酸片球菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母菌、红假单胞菌和枯草芽孢杆菌菌液中活菌量分别为10⁸～10⁹cfu/mL；所述酿酒酵母于2021年07月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22945。