CN104106726A

CN104106726A - 一种新的益生菌及用其制备的益生菌发酵饲料

Info

Publication number: CN104106726A
Application number: CN201410060315.5A
Authority: CN
Inventors: 王志全; 倪学勤; 谭文坤
Original assignee: SICHUAN ZHENGDONG AGRICULTURE AND ANIMAL GROUP CO Ltd; Sichuan Agricultural University
Current assignee: SICHUAN ZHENGDONG AGRICULTURE AND ANIMAL GROUP CO Ltd; Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2014-10-22

Abstract

本发明公开了一种益生菌，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)。本发明还公开了前述益生菌的用途，以及用前述益生菌发酵制备的饲料。本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)具有降脂、降胆固醇和抑菌的作用，是一种益生菌，对酸性环境和高胆盐环境有良好的耐受力。采用本发明保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10制备的饲料，可以有效促进猪的生长，提高猪的抗病力，还可以提高猪肉品质，应用前景良好。

Description

一种新的益生菌及用其制备的益生菌发酵饲料

技术领域

本发明涉及一株新的益生菌及用起制备的益生菌发酵饲料。

背景技术

近年来畜牧业得到了迅猛发展，增强生猪抗病能力，提高生长性能改善肉质是畜牧业发展的重要课题。自上世纪50年代开始，在动物日粮中添加抗生素显著促进了动物生产，并对集约化畜牧业的发展做出了重大贡献。然而随着时间的推移,饲料中添加抗生素的危害日益显现，并受到社会的广泛关注。2004年，WTO、联合国粮农组织(FAO)和世界动物卫生组织(OIE)联合召开专题讨论会，讨论了非人用抗生素的使用和抗生素的耐药性问题。欧盟自2006年1月起全面禁止在畜禽饲料中添加抗生素。在生猪等饲养中不得添加抗生素目前已经是国际公认的食品安全标准。人们开始纷纷寻求其它的替代品和替代技术，以保证畜牧业生产的效率与效益不受影响。益生菌发酵饲料技术是新近成长起来的具有许多优点的新型饲料技术，饲料经益生菌发酵后含有更多的活性益生菌菌体、各种酶、各级代谢产物、多种维生素、蛋白质分解产物、活性小肽、氨基酸、抑菌物质、免疫增强因子、促生长因子等，起到促进生长，维持动物肠道的菌群平衡作用，是一种生态健康型饲料生产技术。

益生菌种类繁多，美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)公布了可作为直接添加饲料微生物有40余种。我国农业部2008年发布的饲料添加剂品种目录中有益微生物有16种，包括：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌，保加利亚乳杆菌。

植物乳杆菌属于乳杆菌，其为革兰氏阳性菌，不产芽胞圆端直杆，单个、成对或短链状，可产生D型、L型两种乳酸，可在10℃生长，在45℃不生长，最适生长温度范围为30～35℃，兼性厌氧。在pH值4.5～9.5生长，最适pH值在6.5左右。植物乳杆菌最早是从唾液中分离得到的，其分布十分广泛，常见于发酵食品中，尤其是以植物材料为原料的发酵食品中较为常见。目前，发现植物乳杆菌可以降解低聚半乳糖，可以拮抗致病菌，致病性非常低，安全。刘金萍，“植物乳杆菌A6（lactobacillus plantarum A6）生物学特性及在发酵饲料中应用的研究”，广西大学2004，公开了一种植物乳杆菌A6及其发酵制备的饲料，但是，实验结果表明，与采用基础饲料相比，采用植物乳杆菌A6 发酵后的饲料饲喂猪，猪平均日增重和降低料重比无明显变化，说明其难以有效促进猪的生长。

发明内容

本发明提供了一种新的植物乳杆菌益生菌，还提供了用前述益生菌制备的发酵饲料。

本发明新的益生菌，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC M2012487的植物BS10(Lactobacillus plantarum BS10)。

本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，于2012年11月28日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其地址为：中国·武汉·武汉大学，保藏号为CCTCC M2012487。

它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)。

本发明还提供了保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)在制备具有降脂、降胆固醇、抑菌作用的药品、保健品或者饲料添加剂中的用途。

所述药品、保健品或者饲料添加剂中，保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10的含量为2×10⁶～2×10¹⁰CFU/ml。进一步优选地，所述药品、保健品或者饲料添加剂中，保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10的含量为2×10⁶～2×10⁸CFU/ml。

本发明益生菌发酵饲料的制备方法，步骤如下：在玉米—豆粕型饲料中，接种保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，接种量为0.5～1.5×10⁶CFU/g，调节含水量为25～45%（w/w），在15～35℃条件下，密闭发酵1～10d，即可；

所述米—豆粕型饲料由如下重量配比的成分组成：玉米60～67份豆粕10～16份麦麸12～18份米糠4～6份瑞珠牌复合预混料3～5份。

密闭发酵：在发酵罐或者发酵袋中密封进行的发酵。

优选地，所述米—豆粕型饲料由如下重量配比的成分组成：玉米63份豆粕13份麦麸15份米糠5份瑞珠牌复合预混料4份。

瑞珠牌复合预混料，是指瑞珠牌4%仔猪复合预混料、瑞珠牌4%中猪复合预混料或瑞珠牌4%大猪复合预混料。

仔猪：指体重20～40kg的猪；

中猪：指体重40～60kg的猪；

大猪：指体重60kg以上的猪。

优选地，所述接种量为1×10⁶CFU/g。

优选地，所述含水量为30～45%。进一步优选地，所述含水量为30～35%。

优选地，所述发酵的温度为30℃或常温。

常温：也叫一般温度或者室温，通常为15～25℃。

优选地，所述发酵的时间为3～10天。进一步优选地，所述发酵的时间为5～10天。

本发明还提供了前述方法制备得到的饲料。

本发明保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，具有降脂、降胆固醇和抑菌的作用，是一种益生菌，对酸性环境和高胆盐环境有良好的耐受力，可用于制备具有降脂、降胆固醇、抑菌作用的药品、保健品或者饲料添加剂。采用本发明保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10制备的发酵饲料，可以有效促进猪的生长，提高猪的抗病力，还可以提高猪肉品质，其制备方法简单，成本低廉，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)的胆固醇脱除率结果图

具体实施方式

实验材料：

产品名称	批准文号	销售企业名称
			瑞珠牌4%仔猪复合预混料	川饲预字(2008)302002	四川正东农牧集团有限责任公司
瑞珠牌4%中猪复合预混料	川饲预字(2008)302003	四川正东农牧集团有限责任公司
			瑞珠牌4%大猪复合预混料	川饲预字(2008)302004	四川正东农牧集团有限责任公司

其余原料均为市售品。

实施例1本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)的鉴定特征

1、鉴定方法

将从猪肠道和发酵饲料的混合样品中分离得到的本发明菌株，进行如下形态学和分子生物学鉴定。

（1）形态特征鉴定

利用显微镜及肉眼观察细胞及固体平板上的菌落形态。

（2）分子生物学鉴定

将本发明菌株总DNA经PCR扩增l6S rDNA基因后，送上海生工有限公司测序，应用Chromas2软件对测定序列进行编辑，在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)数据库中进行比对分析。

2、鉴定结果

（1）形态特征

菌体呈短杆状，无鞭毛，无荚膜，革兰氏染色呈阳性。

（2）16S rDNA序列及分析

PCR获得了本发明菌株的16S rDNA序列长度为835bp，序列如下：

GCGATTCCTATACTGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCCG

利用BLAST软件将该序列与GenBank中收录的DNA序列进行比对，并与相关菌种构建进化树。结果显示，发明分离菌株与植物乳杆菌的相似性达98%，表明其为植物乳杆菌。

结合形态特征和分子生物学鉴定结果，将本发明分离菌株鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，并于2012年11月28日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M2012487。

实施例2本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)的特性检测

一、耐酸耐胆盐特性

1、实验方法

将活化3代的本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)菌液按2%分别接种于pH3.0和pH6.4的MRS液体培养基，37℃培养12小时后观察菌的生长情况，并记录。同时按2%接种于含0.3g/100ml牛胆盐的MRS液体培养基，37℃培养12小时后对各菌株进行活菌计数。试验重复3次取平均值。

MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏4g，葡萄糖20g，吐温-801ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三氨0.2g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.2g，硫酸锰（MnSO₄·4H₂O）0.05g，水1000ml。

2、实验结果

检测结果如表1所示：

表1对PHp.0酸性环境和0.3g/100ml胆盐环境的耐受力

注：“+++”表示生长优良；“++”表示生长良好；“+”表示生长一般；“+/－”表示略有生长；“－”表示生长不好。

实验结果表明，本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)在酸性环境和高胆盐环境下生长良好，表明其具有良好的酸性环境和高胆盐环境的耐受力。

二、降胆固醇特性

1、实验方法

将活化3代的本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)菌液，按2%接种于MRS-CHOL培养基（MRS-CHOL培养基：含胆固醇100mg/L和0.3g/100mL牛胆盐的MRS液体培养基）中，37℃培养24小时后用邻苯二甲醛法测定菌液上清液、洗涤液、菌体破碎液中胆固醇的质量分数，以未接种乳酸菌的MRS-CHOL培养基作为空白，并根据上清液中胆固醇的质量分数计算培养基中胆固醇的脱除率，试验重复3次取平均值。

上清液：菌株在MRS-CHOL培养基中培养24小时后于5000r/min离心20min后的液相部分；

洗涤液：在倾出上清液的菌体细胞中加入10ml（0.1mol/L，pH7.0）PBS缓冲生理盐水，洗涤2次后5000r/min离心20min所得的液体；

破碎液：倾出菌体洗涤液，再加入5.0ml PBS缓冲液，置冰浴中，超声波细胞粉碎机功率为600W下破碎10min后，4000r/min离心10min所得液体。

邻苯二甲醛法检测上清液、洗涤液、菌体破碎液中胆固醇的量：

①分别取1ml悬液加入1mlKOH（质量分数33%）和2ml无水乙醇振荡1min充分混匀后37℃加热15min。②冷却后加入2ml蒸馏水和3ml正己烷振荡1min充分混匀，静置分层。③取1ml正己烷层移入玻璃管，将玻璃管放入60℃水浴锅中干燥。④烘干后将残渣立即溶解在2ml的邻苯二甲醛试剂中，充分混匀后加入0.5ml浓硫酸振荡1min混匀。⑤静置10min后在550nm下测定OD值。

2、实验结果

实验结果如图1所示：采用本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)处理后，培养基中胆固醇的含量仅44.99%，说明本发明植物乳杆菌BS10可以有效降低胆固醇含量，可以减少心血管疾病的发病几率。

三、抑菌作用

1、实验方法

将致病菌：大肠杆菌CVCC2060、沙门氏菌339、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌活化3代，过夜培养物稀释至10⁵CFU/ml，分别取0.1ml涂布营养琼脂平板，将牛津杯均匀放置在平板上；向其中加入200ul活化3代后的本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)菌液；37℃培养24h，测定抑菌圈直径。

重复试验3次取平均值。

2、实验结果

实验结果如表2所示：

表2菌结果（抑菌圈直径）

沙门氏菌(mm)	金黄色葡萄球菌(mm)	大肠杆菌(mm)	绿脓杆菌(mm)
				10.83	10.80	10.90	17.00

如表2所示，本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)对常见致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有较强的抑制作用，其中，对绿脓杆菌的抑制作用最强。

四、体内降脂和调节肠道菌群的作用

1、试验方法

（1）高脂饲料的准备

高脂饲料：普通饲料（每100g普通饲料包括50g玉米、20g麸皮、15g 黄豆、10g面粉和5g鱼粉）80%、胆固醇0.5%、猪油6.3%、蛋黄粉13%、胆酸盐0.2%。混匀后用制粒机制粒，至于通风干燥处风干。

MRS培养液：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏4g，葡萄糖20g，吐温-801ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三氨0.2g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.2g，硫酸锰（MnSO₄·4H₂O）0.05g，水1000ml，pH6.2±0.2。

（2）灌胃菌液的制备

取本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，活化，将活化3代后的菌液按2%的接种量用MRS培养液进行增菌培养，培养36小时后，用点样法进行活菌计数。将增菌后的MRS培养液用PBS缓冲液（磷酸缓冲生理盐水PH7.4）浓缩或稀释成高、中、低浓度菌液，分别为2×10¹⁰、2×10⁸、2×10⁶CFU/ml，将浓缩或稀释好的菌液分装到15ml离心管中并储存在-20℃冰箱中备用，每周制备一次菌液。菌液放置在25℃温水中融化后使用。

（3）动物分组和检测

将48只SD大鼠（雄性，130g左右）随机分成5组，每组6只大鼠：基础对照组，肥胖模型组，BS10Ⅰ组（2×10⁶CBS10U/ml）、BS10Ⅱ组（2×10⁸CBS10U/ml）、BS10Ⅲ组（2×10¹⁰CBS10U/ml）。

每笼饲养6只大鼠，保持恒温23℃，前七天饲喂基础饲料，使其适应环境。七天后，基础对照组饲喂普通饲料并灌胃PBS缓冲液；肥胖模型组和试验组组饲喂高脂饲料分别灌胃PBS缓冲液和不同浓度菌液，剂量为0.5ml/100gbw·d。自由进食饮水，每周称一次体重。

试验8周后，禁食12小时，不禁水。用乙醚麻醉大鼠，眼球取血，静止30min后，4000r/min离心10分钟,取血清，分别测定TG、TC含量；摘取肝脏组织、腹部脂肪、肾周脂肪垫及附睾脂肪垫称重，计算体指数（组织器官重/体重）；盲肠内容物混合均匀后分装与离心管中，-70℃保存。

2、实验结果

（1）、对脂肪沉淀的影响

实验结果如表3所示：

表3对脂肪沉积相关指标的影响

与高脂组相比，^**p<0.01,^*p<0.05。

如表3所示：

与正常对照组相比，高脂组的体重、肝脏体指数、腹脂体指数、肾周脂肪垫体指数、附睾脂肪垫体指数、TG、TC均明显升高（p<0.01或p<0.05），说明高脂模型造模成功。

与高脂组相比，本发明BS10Ⅰ、BS10Ⅱ和BS10Ⅲ均可以有效降低体重、肝脏体指数、腹脂体指数、肾周脂肪垫体指数、附睾脂肪垫体指数、TG、TC均显著降低，其中，BS10Ⅰ组和BS10Ⅱ的各项指标与高脂组均存在显著差异（P<0.05或P<0.01），BS10Ⅲ组的腹脂体指数、TG、TC与高脂组均存在显著差异（P<0.05或P<0.01）。

实验结果说明，本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum BS10)有明显的降脂作用，其中，菌体浓度为2×10⁶～2×10⁸CBS10U/ml时效果较优，浓度为2×10⁶CBS10U/ml时效果最优。

（2）对消化道细菌数量的影响

表4对大鼠盲肠内容物细菌数量的影响

与高脂组相比，*表示差异显著P＜0.05，**表示差异极显著，P＜0.01。

如表4所示，与对照组相比，高脂饲料会引起肠道中除需氧菌外其他细菌的降低，且乳酸菌和双歧杆菌降低显著（P<0.05），肠道中大肠杆菌和肠球菌比例升高，需氧菌/厌氧菌相对比例升高。

灌胃本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)后，与高脂组相比，肠道内大肠杆菌、肠球菌和需氧总菌数变化不明显，但乳酸杆菌、双歧杆菌和厌氧菌总菌数升高，且BS10Ⅰ组和BS10Ⅱ的变化显著（P<0.05或P<0.01）。

实验结果说明，本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)可以提高益生菌数量，降低有害菌比例，其中，菌体浓度为2×10⁶～2×10⁸CFU/ml时效果较优，浓度为2×10⁶CFU/ml时效果最优。

综上，本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)具有降脂、降胆固醇和抑菌的作用，其中，菌体浓度为2×10⁶～2×10¹⁰CFU/ml时效果较优，浓度为2×10⁶CFU/ml时效果最优，对酸性环境和高胆盐环境有良好的耐受力，可用于制备具有降脂、降胆固醇、抑菌作用的药品、保健品或者饲料添加剂。

实施例3采用本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)制备饲料

1、实验材料

发酵基料：玉米—豆粕型饲料。

玉米—豆粕型饲料包括3种：

仔猪玉米—豆粕型饲料（100g）：玉米63g、豆粕13g、麦麸15g、米糠5g、瑞珠牌4%仔猪复合预混料4g。

中猪玉米—豆粕型饲料（100g）：玉米63g、豆粕13g、麦麸15g、米糠5g、瑞珠牌4%中猪复合预混料4g。

大猪玉米—豆粕型饲料（100g）：玉米63g、豆粕13g、麦麸15g、米糠5g、瑞珠牌4%大猪复合预混料4g。

发酵菌种：本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，活菌数为1×10⁹CFU/ml。

2、实验方法

在玉米—豆粕型饲料中添加本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，添加量为1×10⁶CFU/g饲料，以蒸馏水调节水分，试验共设A、B、C、D和E共5个处理，含水率分别为25%、30%、35%、40%和45%，混合均匀后用密闭发酵袋分装发酵，30℃培养箱静置培养。每个处理3个重复。

测定指标及方法：

①样品pH值测定用蒸馏水调节样品含水率为80%，搅拌均匀后直接测定。

②乳酸含量测定采用羟基联苯比色法测定发酵饲料中乳酸含量(参照罗建等,“微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析”，饲料博览,2012年05期公开的方法测定)。

③干物质回收率(DMR)测定发酵饲料配制后立即称重，此后在发酵第1、3、5、7、10d采样，105℃烘干称重。计算发酵饲料干物质回收率(DMR)。

④乳酸杆菌数量测定准确称取发酵饲料10.0g，用生理盐水10倍递增稀释到10-7，取适当稀释度的样品滴种到MRS培养基中，37℃厌氧培养24-36h，根据菌落数计算样品中乳酸杆菌数量。

3、实验结果

（1）、水分对发酵饲料pH值变化的影响

实验结果如表5所示：

表5水分对发酵饲料pH值变化的影响

注：同行数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。

从表5可知，在发酵的各个时间点，A组和B组pH值均显著高于其余各组(P＜0.01)。发酵第1d，各组发酵饲料pH值都迅速降低至5.0左右，且水分含量越高，降低越明显；在第3d，pH值进一步降低，且各组之间差异均极显著(P＜0.01)。到第5d，pH值下降速率明显减缓，D组pH值最低，为4.52，极显著低于其余各组(P＜0.01)。第7d和第10d，各组pH值基本稳定在4.5左右，D组显著低于C组和E组(P＜0.05)。

（2）水分对发酵饲料乳酸含量变化的影响

实验结果如表6所示：

表6水分对发酵饲料乳酸含量变化的影响(m mol/g)

由表6可知，随着发酵时间的延长，各组乳酸含量先升高，5d后达峰值，之后缓慢降低。在第1d和第3d，C组和D组乳酸含量均极显著高于A组和B组(P＜0.01)，C组和D组与E组以及E组与A组和B组之间差异均不显著(P＞0.05)。5d～10d，C组和D组乳酸含量显著高于A组(P＜0.05)，但与B组和E组差异不显著(P＞0.05)。

因此，优选发酵时间为3～10天，进一步优选为5～7天；优选水分为30～45%，进一步优选为35%。

（3）水分对发酵饲料DMR含量变化的影响

实验结果如表7所示：

表7水分对发酵饲料DMR的影响

由表7可知，随着发酵时间的延长，各组DMR都逐渐降低。且降低量与水分含量呈正相关。在第1d，E组DMR显著低于A组和B组(P＜0.05)，而与C组和D组差异不显著(P＞0.05)。在第3d和第5d，B组DMR显著低于Ａ组(P＜0.05)，C、D和E组均极显著低于A组(P＜0.01)，D、E组显著低于C、D组(P＜0.05)。到第7d，A组与B组DMR差异不显著(P＞0.05)，C、D和E组均极显著低于A组(P＜0.01)。D和E组显著低于C组(P＜0.05)，极显著低于B组(P＜0.01)。到第10d，相邻两组间差异均不显著(P＞0.05)，不相邻两组间差异均极显著(P＜0.01)。

（4）水分对发酵饲料乳酸杆菌数量变化的影响

实验结果如表8所示：

由表8可知，各组乳酸杆菌数量在发酵前3d逐渐增加，之后开始缓慢减少。在第1d，C和D组乳酸杆菌数量极显著高于A、B和E组(P＜0.01)。在第3d，D组极显著高于A、B和E组(P＜0.01)，C组显著高于B组和E组(P＜0.05)。第5d时，B组和C组极显著高于A组(P＜0.01)，D组和E组极显著高于A、B和C组(P＜0.01)。到第7d时，B、C和D组极显著高于A组和E组(P＜0.01)，E组显著高于A组(P＜0.05)，B、C和D组间差异不显著(P＞0.05)。到第10d，各组乳酸杆菌数量都下降至10⁸CFU/g数量级。B、C、D和E组均极显著高于A组(P＜0.01)，B、C和D组极显著高于E组，B、C和D组间差异不显著(P＞0.05)。

因此，优选水分为30～45%，进一步优选为30～35%。

综上，采用本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)发酵制备发酵饲料时，原料的含水量可以为25～45%，优选为30～45%，进一步优选为30～35%；发酵的时间可以为1～10天，优选为3～10天，进一步优选为5～10天。

以下通过实验例的方式来说明本发明有益效果：

实验例1采用本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)制备发酵饲料对猪生长的影响

一、实验方法

1、试验设计与试验日粮

试验共设2个处理，每个处理4个重复，每个重复3头猪。

处理1为对照组，饲喂玉米—豆粕型饲料（包括仔猪玉米—豆粕型饲料、中猪玉米—豆粕型饲料和大猪玉米—豆粕型饲料，配方详见实施例3）；

处理2为BS10组，饲喂0.1%植物乳杆菌BS10发酵饲料，饲料的制备方法：在玉米—豆粕型饲料（包括仔猪玉米—豆粕型饲料、中猪玉米—豆粕型饲料和大猪玉米—豆粕型饲料，配方详见实施例3）中添加本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，添加量为1×10⁶CFU/g饲料，以蒸馏水调节水分至含水率为35%，混合均匀后用密闭发酵袋分装发酵，常温发酵7天，分别得本发明仔猪、中猪和大猪饲料。

2、饲养管理

试验在四川省资阳市雁江区鑫博猪场进行。预期7d，正试期136d，从2012年3月至2012年7月。试验按照猪场常规饲养管理进行，每日8:00、14:00、20:00饲喂，自由饮水。实验猪，平均体重20kg的仔猪。

仔猪阶段（体重20～40kg）分别饲喂2种仔猪饲料，中猪阶段（体重40～60kg）分别饲喂2种中猪饲料，大猪阶段（体重60kg以上）分别饲喂2种大猪饲料，仔猪的饲喂量为1.10kg/头/天，中猪的饲喂量为1.9kg/头/天，大猪的饲喂量为2.25kg/头/天。

3、测定指标

（1）生长性能指标

试验分为2个阶段：生长期20～50kg和肥育期50～100kg。当平均体重分别达到50kg和100kg左右时空腹称重，计算生长期、肥育期及全期的平均日采食量（ADBS10I）、日增重（ADG）和饲料增重比（BS10/G）。

计算方法如下：平均日增重（ADG）＝（末重－初重）／试验天数；平均日采食量（ADBS10I）＝（试验期内供料量－试验期内剩料量）／试验天数；料重比（BS10/G）＝ADG／ADBS10I。

（2）肉质指标

饲喂试验结束后，每组选体重接近平均水平的猪各4头进行屠宰，检测肉质指标。用丹麦产肉色分析仪和pH测定仪分别于屠宰后45min和24h测定肉色和pH值。滴水损失和剪切力测定方法参照中华人民共和国农业行业标准NY/T821—2004《猪肌肉品质测定技术规范》。

（3）血清生化指标

采用全自动血液生化分析仪测定血清葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、血清尿氮（BUN）、血清总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）和血清球蛋白（GLB）的含量。

（4）血清抗氧化指标

SOD、CAT、GSH-Px和MDA测定试剂盒均购自南京建成生物研究所，按试剂盒说明进行操作。

二、试验结果

（1）乳酸杆菌发酵饲料对猪生长性能的影响

表9发酵饲料对猪生长性能的影响

由表9可知：

在生长期，各组ADG、ADFI和F/G差异均不显著（P＞0.05）。

在育肥期，与对照组相比，本发明BS10组的ADG（平均日增重）提高了7.26%，F/G（料重比）降低了13%，差异均达到显著水平（P＜0.01和P＜0.05），ADFI无明显变化（P＞0.05）。

在整个实验期，与对照组相比，本发明BS10组的ADG（平均日增重）提高了9.00%，F/G（料重比）降低了9.30%，差异均达到极显著水平（P＜0.01）。

实验结果说明，采用本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)发酵制备的饲料可以有效地提高猪的平均日增重，降低料重比，促进猪的生长，降低生产成本。

（2）乳酸杆菌发酵饲料对猪肉质性能的影响

表10发酵饲料对猪肉品质的影响

由表10可知：

两组的pH和滴水损失均在标准范围内。

与对照组相比，本发明BS10组的亮度更高，剪切力更低，差异显著（P＜0.05），红度、黄度与对照组相当。

实验结果说明，采用本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)制备的饲料可以提高猪肉亮度，降低其剪切力，提高猪肉嫩度。

（3）乳酸杆菌发酵饲料对猪血清生化指标的影响

表11发酵饲料对猪血清生化指标的影响

由表11可以看出：

与阴性对照组相比，本发明BS10组的葡萄糖、高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯降低。

同时，经检测，与阴性对照相比，本发明BS10组的猪肌内脂肪含量降低了2.5%，多不饱和脂肪酸含量降低了2.1%。

实验结果说明，本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)发酵制备的饲料，可以有效降低猪肉的脂肪比例，提高猪肉的市场竞争力。

（4）乳酸杆菌发酵饲料对猪血清抗氧化性能的影响

表12发酵饲料对猪血清抗氧化性能的影响

项目	对照组	BS10组（乳酸杆菌B10）
			SOD（U·mL^-1）	105.20±9.19^a	121.36±6.41^b
MDA（nmol·mL^-1）	7.02±0.44^Aa	4.50±0.22^Bb
			GSH-Px（U·mL^-1）	253.22±21.38^a	288.39±9.47^ab

由表12可知：

与阴性对照组相比，本发明BS10组的SOD值和GSH-Px值明显提高（P＜0.05），MDA值明显降低（P＜0.05）。

同时，经检测，与阴性对照相比，生猪减少腹泻等肠道疾病80%。

实验结果说明，本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10) 可以有效提高猪的抗病力。

本发明BS10组与对照组相比，猪的日增重提高了9.00%，料肉比降低了9.30%，节约饲料成本8%，生猪减少腹泻等肠道疾病80%，每只猪节约用药支出16元；猪肉亮度显著高于对照组，滴水损失比对照组降低了12.2%，嫩度提高了13.5%，猪肌内脂肪含量降低了2.5%，多不饱和脂肪酸含量降低了2.1%，猪肉品质显著改善，市场销售时，对照组的猪肉价格为16元/kg，本发明BS10组的价格可达18-20元/kg，提高直接经济效益12-25%，取得了商业上的成功。

采用本发明植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)制备饲料，可以有效提高猪的平均日增重，降低料重比，增加猪肉亮度，降低猪肉剪切力，提高猪肉嫩度，改善猪生长性能和猪肉品质，还可以有效提高猪的抗病力。

综上，本发明保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，具有降脂、降胆固醇和抑菌的作用，对酸性环境和高胆盐环境有良好的耐受力，可用于制备具有降脂、降胆固醇、抑菌作用的药品、保健品或者饲料添加剂。采用本发明保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10制备的饲料，可以促进猪生长，改善猪肉品质，还可以有效提高猪的抗病力，并且，制备方法简单，成本低廉，应用前景良好。

Claims

1.一种益生菌，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)。

2.保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillusplantarum BS10)在制备具有降脂、降胆固醇、抑菌作用的药品、保健品或者饲料添加剂中的用途。

3.根据权利要求2所述的药品、保健品或者饲料添加剂中的用途，其特征在于：所述药品、保健品或者饲料添加剂中，保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10的含量为2×10⁶～2×10¹⁰CFU/ml；

优选地，所述药品、保健品或者饲料添加剂中，保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10的含量为2×10⁶～2×10⁸CFU/ml。

4.一种益生菌发酵饲料的制备方法，其特征在于：步骤如下：在玉米—豆粕型饲料中，接种保藏号：CCTCC M2012487的植物乳杆菌BS10(Lactobacillus plantarum BS10)，接种量为0.5～1.5×10⁶CFU/g，调节含水量为25～45%（w/w），在15～35℃条件下，密闭发酵1～10d，即可；

所述玉米—豆粕型饲料由如下重量配比的成分组成：玉米60～68份、豆粕10～16份、麦麸12～18份、米糠4～6份、瑞珠牌复合预混料3～5份。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述玉米—豆粕型饲料由如下重量配比的成分组成：玉米64份、豆粕13份、麦麸15份、米糠5份、瑞珠牌复合预混料4份。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述接种量为1×10⁶CFU/g。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述含水量为30～45%（w/w）；优选地，所述含水量为30～35%（w/w）。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述发酵的温度为30℃或常温。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述发酵的时间为3～10天；优选地，所述发酵的时间为5～7天。

10.权利要求4～9任意一项所述方法制备得到的发酵饲料。