CN105505813A - 一株强抑菌植物乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有很强抑菌能力的植物乳杆菌WLPL04保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC?NO:M2015501。本发明植物乳杆菌分离于健康妇女母乳,为革兰氏阳性菌,有优异的抑菌能力,优秀的耐酸耐胆盐性,能在胃肠液中保持较高的存活率,并能抑制食源性致病菌的对小肠上皮细胞的粘附,改善宿主胃肠道健康。同时,在酸奶制备中也可抑制酵母菌霉菌的污染,从而保证酸奶的质量。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域,公开一种新型的抑菌性很好的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是一类厌氧,不产孢子的革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状,在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色不透明,圆形,光滑的菌落。植物乳杆菌与人类的生活密切相关,被广泛用于乳制品、肉类、蔬菜以及果汁中,能通过胃肠道并定植于肠道发挥益生作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑菌性能优良的植物乳杆菌。
本发明从健康的妇女母乳中分离出植物乳杆菌,具有良好的益生性能,极强的抑菌性,良好的耐酸耐胆盐性,耐胃肠液和抗药性;同时可以抑制致病菌对小肠结肠细胞的粘附,从而使致病菌无法在小肠内定殖,减少肠炎疾病的发生,促进肠道健康,发挥益生菌的优良性能。
本发明抑菌植物乳杆菌WLPL04(LactobacillusplantarumWLPL04),于2015年8月31日保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心,编号:CCTCCNO:M2015501。
本发明抑菌植物乳杆菌WLPL04可以在MRS琼脂平板培养基上生长,为革兰氏阳性杆菌,属于兼性厌氧生长,不产芽孢。为维持时间稳定地保存本发明植物乳杆菌的优良性能,将其保存在含有15%甘油的混合保存液中,于-80℃冻存,或将其保存在20%的脱脂乳中进行冻干保存。
为了对微生物进行鉴定和分类,对本发明所述用植物乳杆菌进行了16SrRNA碱基序列分析,结果为,与植物乳杆菌标准菌株(LactobacillusplantarumstrainWCFS1)显示出最高的同源性(99%),显示出与植物乳杆菌最高的分子系统学上的亲缘关系。因此,将此微生物鉴定为植物乳杆菌,并命名为植物乳杆菌WLPL04。于2015年8月31日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCCNO:M2015501。植物乳杆菌WLPL04的测序结果显示的碱基序列如下:
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCT。
本发明的植物乳杆菌WLPL04作为益生菌,不仅具有极强抑菌性,且有良好的耐酸耐胆盐性,能抑制致病菌在肠道上的定殖,促进宿主健康。是一株性能优良的菌种。因此具有很高的研究价值和应用价值。
进一步的,本发明公开了:
酸奶发酵剂,其特征在于包括植物乳杆菌WLPL04;所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在在中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCCNO:M2015501。
所述酸奶发酵剂,还包括保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌;按质量比植物乳杆菌WLPL04:保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1:2:3。
利用本发明发酵剂制备酸奶,能改善酸奶的口感,抑制酵母和霉菌的生长,从而延缓酸奶的变质。
一种酸奶的制备方法,包括如下步骤:
水化:将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合,在40-50℃下水化45min;杀菌:在65℃预热5min,然后在98℃下热处理10min;冷却:室温下冷却至45℃;接种:接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉;所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉,两者质量比例为2:3;所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCCNO:M2015501;发酵:置于38℃发酵10小时。
益生菌风味酸奶的制备工艺,包括如下步骤:
1)将100g红枣汁或核桃汁或水蜜桃汁或草莓汁或花生乳与100g鲜牛奶混匀,加入14g的白砂糖进行调配、混匀;
2)杀菌:将混合液加热至90℃-100℃,维持5-10min,杀死其中的有害微生物;
3)接种:灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃,在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌:嗜热乳杆菌:植物乳杆菌WLPL04=2:3:1),混合均匀;所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCCNO:M2015501;
4)发酵:将装好的酸奶放入恒温箱,42℃下发酵7h,酸奶完全凝固时终止发酵;
5)后熟:将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h即得终产品。
所述红枣汁的制备:红枣预先煮好清洗干净去核,按质量红枣:水=1:1的比例投入到榨汁机中榨汁,之后用纱布过滤,除去杂质和纤维素,红枣汁冷藏备用。
所述核桃汁的制备:选择质量较好的核桃仁放入150℃的烘箱中烘烤15-30min至呈现暗红色、去除生异味、散发出焦香气为止,然后在7%氢氧化钠溶液中煮沸15min除去核桃仁上的褐色皮层后待用;核桃仁放入榨汁机中,放入五倍质量的水,制备核桃汁。
所述水蜜桃汁的制备:选择质量好的水蜜桃清洗干净去核,按质量水蜜桃:水=1:1的比例投入到榨汁机中榨汁,之后用纱布过滤,除去杂质和纤维素,水蜜桃汁冷藏备用。
所述草莓汁的制备:选择质量好的草莓清洗干净,按质量草莓:水=1:1的比例投入到榨汁机中榨汁,之后用纱布过滤,除去杂质和纤维素,草莓汁冷藏备用。
所述花生乳的制备:选择子粒饱满,新鲜的花生仁,剔除霉烂变质及其它杂质。置于120℃烘箱,烘烤20min,产生花生香味并去皮。将去皮的花生仁在0.1%的NaHCO3溶液中浸泡1h~2h,以去除有害成分和软化组织,加水磨浆(花生与水的质量比例为1:10),过滤制得花生乳。
进一步的,利用本发明酸奶可以制成酸奶饮料:
一种芒果果粒酸奶饮料的制备方法,包括如下步骤:
(1)水化:将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合,在40-50℃下水化45min;
(2)杀菌:在65℃预热5min,然后在98℃下热处理10min;
(3)冷却:室温下冷却至45℃;
(4)接种:接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉;所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉,两者质量比例为2:3;所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCCNO:M2015501;
(5)发酵:置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶;
(6)芒果果粒的制备:选择质量好的芒果清洗干净,芒果去皮破碎成4-6mm的果块,冷藏备用;
(7)发酵奶的处理:将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳,均质压力为15-18Mpa),最后称取100g发酵奶液,备用;
(8)胶液的配制:量取300mL、70-80℃的纯净水,然后加入21g的白砂糖,0.09g的山梨酸钾,0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂,混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分,然后立即冷却至30℃以下,备用;
(9)酸化:称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀,加入120g的芒果果粒混匀,然后加入300mL、35℃纯净水,再用柠檬酸调pH值;
(10)均质:将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL,调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃);
(11)杀菌:将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86~88℃、15分钟);
(12)冷却,成品:使产品冷却至容器中心温度40℃以下,冷藏备用。
步骤(9)用柠檬酸调pH值,充分搅拌,将整个溶液的调整为3.8-4.2。
一种胡萝卜汁酸奶饮料的制备方法,包括如下步骤:
(1)水化:将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合,在40-50℃下水化45min;
(2)杀菌:在65℃预热5min,然后在98℃下热处理10min;
(3)冷却:室温下冷却至45℃;
(4)接种:接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉;所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉,两者质量比例为2:3;所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCCNO:M2015501;
(5)发酵:置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶;
(6)胡萝卜汁的制备:选择新鲜的胡萝卜切去根须及蒂把,以清水去掉泥沙,用4%磷酸钠、0.5%磷酸氢二钠与0.5%焦磷酸钠组成复合磷酸盐去皮液在沸腾条件下热烫胡萝卜2min-3min,再经快速流动的冷水冲洗,完全脱去胡萝卜表皮;胡萝卜汁中-胡萝卜素的含量是影响产品质量的重要因素,为提高胡萝卜中-胡萝卜素的溶出率,将脱皮后的胡萝卜切成1cm2-1.5cm2的小块,放入84℃质量分数为1.4%柠檬酸溶液中,热烫18min;将煮制好的胡萝卜放入一定比例的水中,打浆,胡萝卜浆经过60目筛过滤后备用;
(7)发酵奶的处理:将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳,均质压力为15-18Mpa),最后称取100g发酵奶液,备用;
(8)胶液的配制:量取300mL、70-80℃的纯净水,然后加入21g的白砂糖,0.09g的山梨酸钾,0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂,混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分,然后立即冷却至30℃以下,备用;
(9)酸化:称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀,加入120g的胡萝卜汁混匀,然后加入300mL、35℃纯净水,再用柠檬酸调pH值;
(10)均质:将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL,调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃);
(11)杀菌:将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86~88℃、15分钟);
(12)冷却,成品:使产品冷却至容器中心温度40℃以下,冷藏备用。
步骤(9)用柠檬酸调pH值,充分搅拌,将整个溶液的调整为3.8-4.2。
一种猕猴桃果粒酸奶饮料的制备方法,包括如下步骤:
(1)水化:将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合,在40-50℃下水化45min;
(2)杀菌:在65℃预热5min,然后在98℃下热处理10min;
(3)冷却:室温下冷却至45℃;
(4)接种:接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉;所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉,两者质量比例为2:3;所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCCNO:M2015501;
(5)发酵:置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶;
(6)猕猴桃果粒的制备:选择质量好的猕猴桃清洗干净,去皮破碎成4-6mm的果块,冷藏备用;
(7)发酵奶的处理:将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳,均质压力为15-18Mpa),最后称取100g发酵奶液,备用;
(8)胶液的配制:量取300mL、70-80℃的纯净水,然后加入21g的白砂糖,0.09g的山梨酸钾,0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂,混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分,然后立即冷却至30℃以下,备用;
(9)酸化:称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀,加入120g的猕猴桃果粒混匀,然后加入300mL、35℃纯净水,再用柠檬酸调pH值;
(10)均质:将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL,调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃);
(11)杀菌:将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86~88℃、15分钟);
(12)冷却,成品:使产品冷却至容器中心温度40℃以下,冷藏备用。
步骤(9)用柠檬酸调pH值,充分搅拌,将整个溶液的调整为3.8-4.2。
一种草莓果粒酸奶饮料的制备方法,包括如下步骤:
(1)水化:将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合,在40-50℃下水化45min;
(2)杀菌:在65℃预热5min,然后在98℃下热处理10min;
(3)冷却:室温下冷却至45℃;
(4)接种:接种5g酸奶发酵粉+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉;所述酸奶发酵粉中含保加利亚乳杆菌冻干粉和嗜热链球菌冻干粉,两者质量比例为2:3;所述植物乳杆菌WLPL04于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCCNO:M2015501;
(5)发酵:置于38℃发酵10小时得凝固型酸奶;
(6)草莓果粒的制备:选择质量好的草莓清洗干净,草莓去皮破碎成4-6mm的果块,冷藏备用;
(7)发酵奶的处理:将150g凝固型酸奶用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳,均质压力为15-18Mpa),最后称取100g发酵奶液,备用;
(8)胶液的配制:量取300mL、70-80℃的纯净水,然后加入21g的白砂糖,0.09g的山梨酸钾,0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂,混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分,然后立即冷却至30℃以下,备用;
(9)酸化:称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀,加入120g的草莓果粒混匀,然后加入300mL、35℃纯净水,再用柠檬酸调pH值;
(10)均质:将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL,调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃);
(11)杀菌:将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86~88℃、15分钟);
(12)冷却,成品:使产品冷却至容器中心温度40℃以下,冷藏备用。
步骤(9)用柠檬酸调pH值,充分搅拌,将整个溶液的调整为3.8-4.2。
有益效果:本发明植物乳杆菌WLPL04相比常规植物乳杆菌具有极强的体外抑菌性能,良好的耐酸耐胆盐能力,对胃肠液的耐受能力,以及抑制致病菌在肠道定殖的能力。本发明所述植物乳杆菌对抗生素具有一定的耐受性,其生长代谢产物能抑制肠道致病菌的生长。从另一个侧面来说,本发明所述植物乳杆菌可用于制作治疗和预防肠道疾病的组合物,还可以用于食品和饲料的防腐。
附图说明
图1植物乳杆菌WLPL04的生长曲线及产多糖曲线
图2植物乳杆菌WLPL04和植物乳杆菌标准株1.1856发酵上清液对致病菌的抑菌圈直径
图3植物乳杆菌WLPL04体外模拟胃肠道转运后的存活率
图4植物乳杆菌WLPL04对低酸高胆盐耐受性
图5植物乳杆菌WLPL04抑制致病菌对Caco-2细胞的粘附
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明,但实施例仅用于说明本发明,而本发明的应用范围不能以任何方式由这些实施例所限制。
实施例1:植物乳杆菌WLPL04的分离与鉴定
植物乳杆菌WLPL04是从健康妇女的母乳中分离。将母乳以10-1的梯度稀释,涂布于MRS(加溴甲酚紫作为指示剂)琼脂平板上,厌氧培养24h,挑取使培养基变黄的单菌落,在平板上划线分离,反复进行纯化培养,用革兰氏染色法观察菌落形态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培养后,平板培养,用接种环挑取单一的菌落作为模板,进行菌落PCR。将阳性PCR产物送至公司测序。
将16SrRNA碱基序列分析测序碱基序列与数据库进行比对分析,所分离菌菌株的碱基序列与植物乳杆菌标准菌株(LactobaccillusplantarumWCFS1)具有很高的同源性(99%),因此被确认为植物乳杆菌,命名为植物乳杆菌WLPL04,于2015年8月31日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCCNO:M2015501。
如图1生长曲线所示,植物乳杆菌WLPL04具有好的生长性能,生长速度快,10h时进入稳定期,稳定期长,胞外多糖产量高,24h时胞外多糖产量最高。
实施例2:发酵上清液的抑菌能力
将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基,37℃厌氧发酵18h,活化两次。离心得上清液。将牛津杯置于MRS琼脂平板上,加入200uL发酵上清液。厌氧培养24h,用卡尺测定其抑菌圈的直径。
实验结果:
如图2所示植物乳杆菌WLPL04的发酵上清液对七种食源性致病菌都具有抑制作用。对铜绿假单胞菌的抑制效果最明显。抑菌圈直径分别为,铜绿假单胞菌(P.aeruginosa,33.07±0.15mm),单增李斯特菌(L.monocytogenes,27.00±0.10mm),鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium,24.63±0.42mm),大肠杆菌(E.coliO157:H7,17.50±0.40mm),宋内氏志贺氏菌(S.sonnei,22.77±1.16mm),蜡样芽胞杆菌(B.cereus,12.60±0.46mm),和金黄色葡萄球菌(S.aureus,14.30±0.17mm)。植物乳杆菌标准株1.1856的发酵上清液对七种食源性致病菌抑制作用如下:铜绿假单胞菌(P.aeruginosa,15.93±1.04mm),单增李斯特菌(L.monocytogenes,19.03±0.15mm),鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium,10.57±0.49mm),大肠杆菌(E.coliO157:H7,10.63±0.15mm),宋内氏志贺氏菌(S.sonnei,13.03±0.12mm),蜡样芽胞杆菌(B.cereus,9.13±0.06mm),和金黄色葡萄球菌(S.aureus,8.93±0.06mm)。从结果可以看出,植物乳杆菌WLPL04发酵上清比植物乳杆菌标准株1.1856发酵上清的抑菌能力显著更强。
实施例3:耐酸耐胆盐评价
将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基,37℃厌氧发酵18h,活化两次。以1%接种量分别接种于pH为6.5,4.5,3.5和2.5及胆盐浓度为0%,0.15%,0.30%,0.45%的MRS液体培养基中,测定初始活菌数以及随后的3h,6h,12h和24h的活菌数。
实验结果:
如图3所示,植物乳杆菌在pH4.5,3.5MRS中培养3,6,12,or24h后生长良好,但是在pH2.5MRS培养6h后活菌数下降2.34logcfu/mL。胆盐情况下,植物乳杆菌WLPL04的活菌数变化稳定,24h时,活菌数会降到104。这说明植物乳杆菌WLPL04耐酸耐胆盐性良好。
实施例4:体外模拟胃肠液转运
将植物乳杆菌接种于模拟胃液,pH调为3.0,孵育90min,计数活菌数和存活率,将培养液离心用生理盐水洗一次后加入模拟十二指肠液,孵育10min,计数活菌数和存活率,将培养液离心用生理盐水洗一次,离心加入模拟肠液,分别孵育60min和120min,计数活菌数和存活率。
实验结果:
见图4,结果表明,植物乳杆菌WLPL04在经胃液,十二指肠液连续孵育后菌体数量级分别下降了0.40logcfu/mL和1.07logcfu/mL,经肠液孵育2h后,菌体活菌数增加到1.30×108cfu/mL,高于益生菌在胃肠道中定植和发挥益生功能的最低要求溶度(106cfu/mL)。综合耐酸耐胆盐性实例和模拟胃肠转运实例,可得出植物乳杆菌WLPL04具有好的耐受性,在低pH和胆汁中能存活,顺利通过胃和十二指肠,保持足够高的活力到达小肠。
实施例5:抑制致病菌对Caco-2粘附
将瓶中培养好的Caco-2细胞接入到6孔细胞培养板中培养至长成单层细胞,进行试验。采用竞争、排斥和置换试验来研究乳杆菌对病原菌的黏附抑制作用。竞争试验:每孔中加入800μL的DMEM培养液(不含抗生素),同时加入100μL的植物乳杆菌菌悬液(5×107cfu/孔)和100μL的病原菌(5×107cfu/孔);排斥试验:每孔中加入900μL的DMEM培养液,先加入100μL的植物乳杆菌菌悬液(5×107cfu/孔),培养90min后,再100μL的病原菌(5×107cfu/孔)继续培养90min;置换试验:每孔中加入900μL的DMEM培养液,加入100μL的病原菌(5×107cfu/孔),再加入100μL的植物乳杆菌菌悬液(5×107cfu/孔)继续培养90min。试验结束后,计数活菌和抑制粘附率。
实验结果:
见图5,结果表明,竞争实验中植物乳杆菌WLPL04对致病菌金黄葡萄球菌(S.aureusCMCC26003),大肠杆菌(E.coliO157:H7)and鼠伤寒沙门杆菌(S.typhimuriumATCC13311)粘附抑制率分别为40.30%,35.51%和8.10%;抑制试验中,植物乳杆菌WLPL04对致病菌粘附抑制率分别为42.60%,62.50%和59.81%;替代实验中植物乳杆菌WLPL04对致病菌粘附抑制率分别为52.88%,75.23%和39.97%。植物乳杆菌WLPL04能够抑制食源性致病菌对肠细胞的粘附,从而抑制致病菌在小肠的定殖,维持肠道健康。
实施例5:酸奶的制作工艺
水化:将脱脂奶粉(10g)、蔗糖(6g)和水(100ml)混合,在40-50℃下水化45min;
杀菌:在65℃预热5min,然后在98℃下热处理10min;
冷却:室温下冷却至45℃;
接种:接种分为三组,
一组为接种5g酸奶发酵粉(含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干粉,两者质量比例为2:3),不添加植物乳杆菌;
二组为接种5g酸奶发酵粉(含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干粉,两者比例为2:3)+1g植物乳杆菌WLPL04冻干粉;植物乳杆菌WLPL04为抑菌性能好的植物乳杆菌WLPL04,于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心,编号:CCTCCNO:M2015501;
三组为接种5g酸奶发酵粉(含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干粉,两者质量比例为2:3)+1g植物乳杆菌ATCC1.1856冻干粉;
发酵:置于38℃的恒温酸奶机中发酵10小时得凝固型酸奶。
为方便后续检测,将酸奶置于4℃贮存20天;进行理化指标的测定和感官评定。
1)酸度的测定
称取5.00g样品,置于150ml锥形瓶中,加40ml经煮沸放冷的水,混匀,加入2-3滴酚酞指示剂,用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色30秒内不褪色,记录消耗的NaOH体积,乘以20,即为酸乳的酸度(°T)。分别于第1天,第10天和第20天测定酸度的变化,每个样品每次重复测定三次,取平均值。
结果表明,用植物乳杆菌WLPL04发酵酸奶能减缓其贮藏过程酸度的变化速度,增强其在贮藏过程中的稳定性。
2)黏度的测定
将酸奶样品在4℃贮藏,分别于第1天,第10天和第20天测定黏度值的变化。测量时样品先经回温后,再用NDJ-9S黏度计进行测量,采用2号转子,转速6r/min,测定温度18℃--23℃,重复测定3次,取平均值。
结果表明,用植物乳杆菌WLPL04可提高酸奶的粘度。对比酸奶在4℃条件下储存10d和20d后的粘度值,发现在贮藏期间酸奶黏度值均略有下降,但变化并不显著。说明仅从粘度这一指标来看,植物乳杆菌WLPL04对酸奶贮藏特性有积极影响。
3)持水率(WHC)测定
离心管重w0,放入酸奶样品重W1于离心管中,以4000r/min离心10min,静置10min后除去析出乳清(上清液),并称质量记为w2。按下式计算持水率。分别于第10天和第20天测定持水率的变化,每个样品每次重复测定三次,取平均值。
结果表明,用植物乳杆菌WLPL04和植物乳杆菌ATCC1.1856都可提高酸奶的持水性。但是添加了植物乳杆菌WLPL04作为发酵剂的酸奶具有相对更高的持水率。酸奶持水能力对酸奶货架期内的产品质量影响很大,特别是对那些与口感密切相关的质构指标,稳定的持水能力有助于稳定产品质量。
4)感官评定
由10名从事食品行业的专业人员,6名消费者共同从色泽(10分)、组织状态(50分)、风味(40分)三个方面进行评定,并对组织状态中的黏稠度(20分)做单独评定,所给出的评议是在相互隔离的情况下进行,避免了测评人员的相互影响,如表1。
表1感官评定和粘稠度评定评分参考表
如表2所示,植物乳杆菌WLPL04和植物乳杆菌ATCC1.1856都可以明显提高酸奶的感官品质,其中组织状态变化显著,风味略有变化,色泽保持不变。植物乳杆菌WLPL04的添加量为1%(1g:100ml)时,酸奶的组织细腻、凝块细小、均匀滑爽,无气泡、无乳清析出,酸甜适度、发酵香味和奶香味浓厚,感官品质最好,对比于传统酸奶发酵剂或植物乳杆菌ATCC1.1856,添加植物乳杆菌WLPL04作为辅助发酵剂,不仅能够改善酸奶的风味质构,还能提高酸奶的贮存特性。
表2感官评价结果
实例6:WLPL04在酸奶发酵过程中对酵母及霉菌的抑制作用
称取25g发酵酸奶样品至盛225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中,充分振摇,即为1:10稀释液。或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中,用拍击式均质器拍打2min,制成1:10的样品匀液。
1、液体样品:以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。取1ml1:10稀释液注入含有9ml无菌水的试管中,另换一支1ml无菌吸管反复吹吸,此液为1:100稀释液按上部操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1ml无菌吸管。
2、根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1ml样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1ml样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。
3、及时将15ml~20ml冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
4、培养待琼脂凝固后,将平板倒置,28℃±1℃培养5d,并在观察期内记录霉菌及酵母菌数。
5、菌落计数肉眼观察,必要时可用放大镜,记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位(colonyformingunits,CFU)表示。选取菌落数在10CFU~150CFU的平板,根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。
实验结果表明,与添加商业生物保鲜菌(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)比WLPL04对酵母的抑制率分别为4.76%,4.94%,6.85%,添加WLPL04能明显抑制酵母生长且抑制效果优于商业生物保鲜菌酸奶。添加WLPL04可抑制43.67%霉菌,高于商业添加菌的抑制率(38.67%)。以上实验结果表明,植物乳杆菌WLPL04可以改善酸奶的口感,抑制酵母和霉菌的生长,从而延缓酸奶的变质。
实施例7益生菌风味红枣酸奶的制备工艺
取实施例5所优化的菌种组合(第二组:按冻干粉质量比植物乳杆菌WLPL04:保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1:2:3)进行酸奶发酵,步骤如下:
1、红枣汁的制备:红枣预先煮好清洗干净去核,按质量红枣:水=1:1的比例投入到榨汁机中榨汁,之后用纱布过滤,除去杂质和纤维素,红枣汁冷藏备用。
2、将制得的100g红枣汁与100g鲜牛奶混匀,加入14g的白砂糖进行调配、混匀。
3、杀菌:将混合液加热至90℃-100℃,维持5-10min,杀死其中的有害微生物。
4、接种:灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃,在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌:嗜热乳杆菌:植物乳杆菌WLPL04=2:3:1),混合均匀。
5、发酵:将装好的酸奶放入恒温箱,42℃下发酵7h,酸奶完全凝固时终止发酵。
6、后熟:将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h,待酸奶进一步生成,香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。
实施例8益生菌风味核桃酸奶的制备工艺
取实施例5所优化的菌种组合(第二组:按冻干粉质量比植物乳杆菌WLPL04:保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1:2:3)进行酸奶发酵,步骤如下:
1、核桃汁的制备:选择质量较好的核桃仁放入150℃的烘箱中烘烤15-30min至呈现暗红色、去除生异味、散发出焦香气为止,然后在7%氢氧化钠溶液中煮沸15min除去核桃仁上的褐色皮层后待用。核桃仁放入榨汁机中,放入五倍质量的水,制备核桃汁。
2、将制得的100g核桃汁与100g鲜牛奶混匀,加入14g的白砂糖进行调配、混匀。
3、杀菌:将混合液加热至90℃-100℃,维持5-10min,杀死其中的有害微生物。
4、接种:灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃,在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌:嗜热乳杆菌:植物乳杆菌WLPL04=2:3:1),混合均匀。
5、发酵:将装好的酸奶放入恒温箱,42℃下发酵7h,酸奶完全凝固时终止发酵。
6、后熟:将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h,待酸奶进一步生成,香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。
实施例9益生菌风味水蜜桃酸奶的制备工艺
取实施例5所优化的菌种组合(第二组:按冻干粉质量比植物乳杆菌WLPL04:保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1:2:3)进行酸奶发酵,步骤如下:
1、水蜜桃汁的制备:选择质量好的水蜜桃清洗干净去核,按质量水蜜桃:水=1:1的比例投入到榨汁机中榨汁,之后用纱布过滤,除去杂质和纤维素,水蜜桃汁冷藏备用。
2、将制得的100g水蜜桃汁与100g鲜牛奶混匀,加入14g的白砂糖进行调配、混匀。
3、杀菌:将混合液加热至90℃-100℃,维持5-10min,杀死其中的有害微生物。
4、接种:灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃,在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌:嗜热乳杆菌:植物乳杆菌WLPL04=2:3:1),混合均匀。
5、发酵:将装好的酸奶放入恒温箱,42℃下发酵7h,酸奶完全凝固时终止发酵。
6、后熟:将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h,待酸奶进一步生成,香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。
实施例10益生菌风味草莓酸奶的制备工艺
取实施例5所优化的菌种组合(第二组:按冻干粉质量比植物乳杆菌WLPL04:保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1:2:3)进行酸奶发酵,步骤如下:
1、草莓汁的制备:选择质量好的草莓清洗干净,按质量草莓:水=1:1的比例投入到榨汁机中榨汁,之后用纱布过滤,除去杂质和纤维素,草莓汁冷藏备用。
2、将制得的100g草莓汁与100g鲜牛奶混匀,加入14g的白砂糖进行调配、混匀。
3、杀菌:将混合液加热至90℃-100℃,维持5-10min,杀死其中的有害微生物。
4、接种:灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃,在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌:嗜热乳杆菌:植物乳杆菌WLPL04=2:3:1),混合均匀。
5、发酵:将装好的酸奶放入恒温箱,42℃下发酵7h,酸奶完全凝固时终止发酵。
6、后熟:将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h,待酸奶进一步生成,香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。
实施例11益生菌风味花生乳酸奶的制备工艺
取实施例5所优化的菌种组合进行酸奶发酵,步骤如下:
1、花生乳的制备:选择子粒饱满,新鲜的花生仁,剔除霉烂变质及其它杂质。置于120℃烘箱,烘烤20min,产生花生香味并去皮。将去皮的花生仁在0.1%的NaHCO3溶液中浸泡1h~2h,以去除有害成分和软化组织,加水磨浆(花生与水的质量比例为1:10),过滤制得花生乳。
2、将制得的100g花生乳与100g鲜牛奶混匀,加入14g的白砂糖进行调配、混匀。
3、杀菌:将混合液加热至90℃-100℃,维持5-10min,杀死其中的有害微生物。
4、接种:灭菌后的混合液冷却至40℃-45℃,在无菌条件下按10g的菌种(按质量冻干粉保加利亚乳杆菌:嗜热乳杆菌:植物乳杆菌WLPL04=2:3:1),混合均匀。
5、发酵:将装好的酸奶放入恒温箱,42℃下发酵7h,酸奶完全凝固时终止发酵。
6、后熟:将发酵好的酸奶置于0℃-4℃环境中储藏24h,待酸奶进一步生成,香气和风味适宜即可使用。可以延缓酸奶的变质。
实施例12芒果果粒酸奶饮料的制备工艺
取实施例5所制得的凝固型酸奶(第二组)进一步做成饮料,步骤如下:
1、芒果果粒的制备:选择质量好的芒果清洗干净,芒果去皮破碎成4-6mm的果块,冷藏备用。
2、发酵奶的处理:将实施例5所制得的150g凝固型酸奶(第二组)用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳,均质压力为15-18Mpa),最后称取100g发酵奶液,备用。
3、胶液的配制:量取300mL、70-80℃的纯净水,然后加入21g的白砂糖,0.09g的山梨酸钾,0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂,混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分,然后立即冷却至30℃以下,备用。
4、酸化:称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀,加入120g的芒果果粒混匀,然后加入300mL、35℃纯净水,再用柠檬酸调pH值,充分搅拌,将整个溶液的调整为3.8-4.2。(加酸温度不宜过高或过低,一般以30℃以下较为适宜)。
5、均质:将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL,调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)。
6、杀菌:将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(温度86~88℃、15分钟)。
7、冷却,成品:使产品冷却至容器中心温度40℃以下,冷藏备用。
实施例13胡萝卜汁酸奶饮料的制备工艺
取实施例5所制得的凝固型酸奶(第二组)进一步做成饮料,步骤如下:
1、胡萝卜汁的制备:选择新鲜的胡萝卜切去根须及蒂把,以清水去掉泥沙,用4%磷酸钠、0.5%磷酸氢二钠与0.5%焦磷酸钠组成复合磷酸盐去皮液在沸腾条件下热烫胡萝卜2min-3min,再经快速流动的冷水冲洗,完全脱去胡萝卜表皮。胡萝卜汁中-胡萝卜素的含量是影响产品质量的重要因素,为提高胡萝卜中-胡萝卜素的溶出率,将脱皮后的胡萝卜切成1cm2-1.5cm2的小块,放入84℃质量分数为1.4%柠檬酸溶液中,热烫18min。将煮制好的胡萝卜放入一定比例的水中,打浆,胡萝卜浆经过60目筛过滤后备用。
2、发酵奶的处理:将实施例5所制得的150g凝固型酸奶(第二组)用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳,均质压力为15-18Mpa),最后称取100g发酵奶液,备用。
3、胶液的配制:量取300mL、70-80℃的纯净水,然后加入21g的白砂糖,0.09g的山梨酸钾,0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂,混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分,然后立即冷却至30℃以下,备用。
4、酸化:称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀,加入120g的胡萝卜汁混匀,然后加入300mL、35℃纯净水,再用柠檬酸调pH值,充分搅拌,将整个溶液的调整为3.8-4.2。(加酸温度不宜过高或过低,一般以30℃以下较为适宜)。
5、均质:将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL,调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)。
6、杀菌:将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(中心温度86~88℃、15分钟)。
7、冷却,成品:使产品冷却至容器中心温度40℃以下,冷藏备用。
实施例14猕猴桃果粒酸奶饮料的制备工艺
取实施例5所制得的凝固型酸奶(第二组)进一步做成饮料,步骤如下:
1、猕猴桃果粒的制备:选择质量好的猕猴桃清洗干净,去皮破碎成4-6mm的果块,冷藏备用。
2、发酵奶的处理:将实施例5所制得的150g凝固型酸奶(第二组)用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳,均质压力为15-18Mpa),最后称取100g发酵奶液,备用。
3、胶液的配制:量取300mL、70-80℃的纯净水,然后加入21g的白砂糖,0.09g的山梨酸钾,0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂,混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分,然后立即冷却至30℃以下,备用。
4、酸化:称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀,加入120g的猕猴桃果粒混匀,然后加入300mL、35℃纯净水,再用柠檬酸调pH值,充分搅拌,将整个溶液的调整为3.8-4.2。(加酸温度不宜过高或过低,一般以30℃以下较为适宜)。
5、均质:将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL,调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)。
6、杀菌:将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(中心温度86~88℃、15分钟)。
7、冷却,成品:使产品冷却至容器中心温度40℃以下,冷藏备用。
实施例15草莓果粒酸奶饮料的制备工艺
取实施例5所制得的凝固型酸奶(第二组)进一步做成饮料,步骤如下:
1、草莓果粒的制备:选择质量好的草莓清洗干净,草莓去皮破碎成4-6mm的果块,冷藏备用。
2、发酵奶的处理:将实施例5所制得的150g凝固型酸奶(第二组)用高速搅拌器搅拌破乳10分钟(或通过均质破乳,均质压力为15-18Mpa),最后称取100g发酵奶液,备用。
3、胶液的配制:量取300mL、70-80℃的纯净水,然后加入21g的白砂糖,0.09g的山梨酸钾,0.3g的甜赛糖和2.1g的稳定剂,混合均匀搅拌15-20分钟使胶体溶解充分,然后立即冷却至30℃以下,备用。
4、酸化:称取100g发酵奶液和300g胶液混合均匀,加入120g的草莓果粒混匀,然后加入300mL、35℃纯净水,再用柠檬酸调pH值,充分搅拌,将整个溶液的调整为3.8-4.2。(加酸温度不宜过高或过低,一般以30℃以下较为适宜)。
5、均质:将300mL料液用40℃纯净水定容至1000mL,调香后进行均质(25Mpa/5-10Mpa、60-65℃)。
6、杀菌:将均质后的料液先灌装再进行巴氏杀菌(中心温度86~88℃、15分钟)。
7、冷却,成品:使产品冷却至容器中心温度40℃以下,冷藏备用。
Claims (1)
1.强抑菌植物乳杆菌WLPL04,于2015年8月31日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏藏编号:CCTCCNO:M2015501。
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CN201510770227.9A CN105505813A (zh) | 2015-11-12 | 2015-11-12 | 一株强抑菌植物乳杆菌 |
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