CN102113556A - 羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法 - Google Patents

羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法 Download PDF

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张富新
雷长鹏
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Abstract

一种羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法，由乳酸菌的分离纯化、乳酸菌的增殖培养、乳酸菌的离心分离、菌泥冷冻、混合菌泥的冷冻、混合菌泥的真空冷冻干燥步骤组成，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。采用本发明制备的羊奶酸奶专用发酵剂，用于生产羊奶酸奶，羊奶酸奶凝乳状态光滑细腻、风味独特，无明显的羊奶膻味，达到GB 2746-1999酸牛奶和GB 19302-2010食品安全国家标准发酵乳的要求，可用于生产羊奶酸奶。

Description

羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法
技术领域
本发明属于乳制品技术领域，具体涉及一种羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法。
背景技术
酸奶具有丰富的营养价值和良好的保健功能。近年来，酸奶产销量以平均每年25％的速度迅猛增长，已成为我国第一大发酵乳制品。随着消费者对酸奶的营养保健作用认识的逐步增强，酸奶仍有较大的发展空间。目前，在我国酸奶生产中，大约80％以上的发酵剂是购自国外一些公司的冷冻干燥发酵剂，由于国外发酵剂销售价格较高，影响产品的最终成本。因此，研究开发新型的酸奶冷冻干燥发酵剂对促进我国乳制品工业的健康发展具有重要的现实意义。
羊奶营养丰富，具有酪蛋白胶粒和乳脂肪球较小的特点，有利于人体的吸收利用，被认为是奶中精品，是现代人类健康的营养佳品。但是羊奶的化学组成和发酵特性与牛奶具有一定的差别，用发酵牛奶酸奶的发酵剂生产羊奶酸奶时，易出现凝固性差、凝乳时间长、乳清易析出等质量缺陷，从而影响羊奶酸奶的品质。一些专家认为，牛奶酸奶发酵剂并不适用在羊奶酸奶中应用。因此，研究开发适宜羊奶酸奶生产的发酵剂，对促进羊奶产品的开发利用，促进奶山羊产业的发展具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述生产羊奶酸奶用发酵剂存在的缺点，提供一种使酸奶凝乳状态光滑细腻、风味独特，无明显的羊奶膻味的羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、乳酸菌的分离纯化
用平板划线法从商品牛奶酸奶中分离纯化保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，分离纯化的方法为：用脱脂奶粉和水配制成质量分数为12％的脱脂乳，经115℃灭菌20分钟，将商品牛奶酸奶接入灭菌后的脱脂乳中，商品牛奶酸奶接入量为12％的脱脂乳的2％，37℃下发酵至凝乳；在无菌操作条件下，分别将凝乳在MRS固体培养基和M17固体培养基上划线，MRS固体培养基放在厌氧条件下37℃培养2～3天，M17固体培养基在大气环境下37℃培养2～3天，挑选形态相同、数量最多的单个菌落，经革兰氏染色，在油镜下观察菌体特征，将具有杆菌特征的菌落在MRS固体培养基上培养，具有球菌特征的菌落在M17固体培养基上培养，直至染色镜检的视野中无杂菌为止，视为分离纯化完毕；从分离纯化的乳酸菌中筛选出2株乳酸菌，经微生物形态和生理生化鉴定，确定1株为保加利亚乳杆菌，命名为Lb-1，另1株为嗜热链球菌，命名为St-2。
2、乳酸菌的增殖培养
取新鲜胡萝卜，洗净、切碎，加入与其等质量的蒸馏水，煮沸15分钟，用榨汁机捣碎，3层纱布过滤，制备成胡萝卜汁；取新鲜番茄，加入与其等质量的蒸馏水，煮沸15分钟，用榨汁机捣碎，3层纱布过滤，制备成番茄汁。
在MRS液体培养基中添加其体积7.5％～12.5％的胡萝卜汁、7.5％～12.5％的番茄汁以及其质量0.3％～0.7％的碳酸钙，121℃灭菌处理10分钟，在无菌条件下，加入步骤1中分离纯化的保加利亚乳杆菌Lb-1菌株，每毫升MRS液体培养基中接入保加利亚乳杆菌Lb-1菌株106cfu，43℃增殖培养12小时；在M17液体培养基中添加其体积7.5％～12.5％的胡萝卜汁、7.5％～12.5％的番茄汁以及其质量0.3％～0.7％的碳酸钙，121℃灭菌处理10分钟，在无菌条件下，加入步骤1中分离纯化的嗜热链球菌St-2菌株，每毫升M17液体培养基中接入嗜热链球菌St-2菌株106cfu，43℃增殖培养12小时。
3、乳酸菌的离心分离
将乳酸菌的增殖培养步骤2中保加利亚乳杆菌Lb-1菌株增殖培养后的MRS液体培养基和嗜热链球菌St-2菌株增殖培养后的M17液体培养基分别在6000转/分钟离心分离10分钟，倾去上层清液，得到含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥。
4、菌泥冷冻
将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。
上述的冷冻保护剂为蔗糖、葡萄糖、脱脂乳、麦芽糊精、甘油中的任意一种或几种的混合物；使用单一冷冻保护剂时，蔗糖用量为混合菌泥质量的3％，葡萄糖用量为混合菌泥质量的3％，脱脂乳用量为混合菌泥质量的8％，麦芽糊精用量为混合菌泥质量的10％，甘油用量为混合菌泥质量的10％；使用2种组分的混合物冷冻保护剂时，脱脂乳用量为混合菌泥质量的8％、甘油用量为混合菌泥质量的2％；使用3种组分的混合物冷冻保护剂时，脱脂乳用量为混合菌泥质量的8％、甘油用量为混合菌泥质量的2％、麦芽糊精用量为混合菌泥质量的0.5％；使用4种组分的混合物冷冻保护剂时，脱脂乳用量为混合菌泥质量的8％、甘油用量为混合菌泥质量的5％、蔗糖用量为混合菌泥质量的3％、麦芽糊精用量为混合菌泥质量的1％。
5、混合菌泥的冷冻
将添加冷冻保护剂后的混合菌泥，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。
6、混合菌泥的真空冷冻干燥
将步骤5冷冻后的混合菌泥放入真空冷冻干燥机中，冷阱温度为-50℃、真空度为100Pa冷冻干燥12～18小时，至干燥后菌粉中水分含量小于2％，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
在本发明的乳酸菌的增殖培养步骤2中，在MRS液体培养基中添加其最佳体积7.5％的胡萝卜汁、7.5％的番茄汁以及其质量0.3％的碳酸钙，121℃灭菌处理10分钟，在无菌条件下，加入步骤1中分离纯化的保加利亚乳杆菌Lb-1菌株，每毫升MRS液体培养基中接入保加利亚乳杆菌Lb-1菌株106cfu，43℃增殖培养12小时。在M17液体培养基中添加其最佳体积10％的胡萝卜汁、12.5％的番茄汁以及其质量0.3％的碳酸钙，121℃灭菌处理10分钟，在无菌条件下，加入步骤1中分离纯化的嗜热链球菌St-2菌株，每毫升M17液体培养基中接入嗜热链球菌St-2菌株106cfu，43℃增殖培养12小时。
在本发明的乳酸菌的冷冻步骤4中，最佳添加混合菌泥质量8％的脱脂乳、5％的甘油、3％的蔗糖、1％的麦芽糊精的混合物作为冷冻保护剂。
本发明以从商品牛奶酸奶中分离纯化的保加利亚乳杆菌Lb-1菌株和嗜热链球菌St-2菌株为菌种，通过对其进行增殖培养、离心分离、冷冻及真空冷冻干燥，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。将本发明用于生产羊奶酸奶，酸奶凝乳状态光滑细腻、风味独特，无明显的羊奶膻味，达到GB 2746-1999酸牛奶和GB 19302-2010食品安全国家标准发酵乳的要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
1、乳酸菌的分离纯化
用平板划线法从商品牛奶酸奶中分离纯化保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，分离纯化的方法为：用脱脂奶粉和水配制成质量分数为12％的脱脂乳，经115℃灭菌20分钟，将商品牛奶酸奶接入灭菌后的脱脂乳中，商品牛奶酸奶接入量为12％的脱脂乳的2％，37℃下发酵至凝乳；在无菌操作条件下，分别将凝乳在MRS固体培养基和M17固体培养基上划线，MRS固体培养基放在厌氧条件下37℃培养2～3天，M17固体培养基在大气环境下37℃培养2～3天，挑选形态相同、数量最多的单个菌落，经革兰氏染色，在油镜下观察菌体特征，将具有杆菌特征的菌落在MRS固体培养基上培养，具有球菌特征的菌落在M17固体培养基上培养，反复多次直至染色镜检的视野中无杂菌为止，视为分离纯化完毕；从分离纯化的乳酸菌中筛选出2株乳酸菌，经微生物形态和生理生化鉴定，确定1株为保加利亚乳杆菌，命名为Lb-1，另1株为嗜热链球菌，命名为St-2。
2、乳酸菌的增殖培养
取新鲜胡萝卜200g，洗净、切碎，加入200g蒸馏水，煮沸15分钟，用榨汁机捣碎，用3层纱布过滤，制备成胡萝卜汁；取新鲜番茄200g，加入200g蒸馏水，煮沸15分钟，用榨汁机捣碎，用3层纱布过滤，制备成番茄汁。
在MRS液体培养基中添加胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙，胡萝卜汁和番茄汁的添加量均为MRS液体培养基体积的7.5％，碳酸钙的添加量为MRS液体培养基质量的0.3％，121℃灭菌处理10分钟，在无菌操作条件下，加入步骤1中分离纯化的保加利亚乳杆菌Lb-1菌株，每毫升MRS液体培养基中接入保加利亚乳杆菌Lb-1菌株106cfu，43℃增殖培养12小时。
在M17液体培养基中添加胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙，胡萝卜汁的添加量为M17液体培养基体积的10％，番茄汁的添加量为M17液体培养基体积的12.5％，碳酸钙的添加量为M17液体培养基质量的0.3％，121℃灭菌处理10分钟，在无菌操作条件下，加入步骤1中分离纯化的嗜热链球菌St-2菌株，每毫升M17液体培养基中接入嗜热链球菌St-2菌株106cfu，43℃增殖培养12小时。
3、乳酸菌的离心分离
将步骤2中保加利亚乳杆菌Lb-1菌株增殖培养后的MRS液体培养基和嗜热链球菌St-2菌株增殖培养后的M17液体培养基分别在6000转/分钟离心分离10分钟，倾去上层清液，分别得到含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥。
4、菌泥的冷冻
将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量8％的脱脂乳、5％的甘油、3％的蔗糖、1％的麦芽糊精的混合物作为冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。
5、混合菌泥的冷冻
将添加冷冻保护剂后的混合菌泥，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。
6、混合菌泥的真空冷冻干燥
将步骤5中冷冻后的混合菌泥放入真空冷冻干燥机中，冷阱温度为-50℃、真空度为100Pa冷冻干燥12～18小时，至干燥后菌粉中水分含量小于2％，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例2
本实施例的乳酸菌的增殖培养步骤2中，在MRS液体培养基中添加胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙，胡萝卜汁的添加量为MRS液体培养基体积的10％，番茄汁的添加量为MRS液体培养基体积的12.5％，碳酸钙的添加量为MRS液体培养基质量的0.5％；在M17液体培养基中添加胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙，胡萝卜汁、番茄汁的添加量均为M17液体培养基体积的7.5％，碳酸钙的添加量为M17液体培养基质量的0.7％，该步骤的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与实施例1相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例3
本实施例的乳酸菌的增殖培养步骤2中，在MRS液体培养基中添加胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙，胡萝卜汁的添加量为MRS液体培养基体积的12.5％，番茄汁的添加量为MRS液体培养基体积的10％，碳酸钙的添加量为MRS液体培养基质量的0.7％；在M17液体培养基中添加胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙，胡萝卜汁的添加量为M17液体培养基体积的12.5％，番茄汁的添加量为M17液体培养基体积的10％，碳酸钙的添加量为M17液体培养基质量的0.5％，该步骤的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与实施例1相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例4
在实施例1～3的乳酸菌的冷冻步骤4中，将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量3％的蔗糖作为冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。其他步骤与相应实施例相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例5
在实施例1～3的乳酸菌的冷冻步骤4中，将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量3％的葡萄糖作为冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。其他步骤与相应实施例相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例6
在实施例1～3的乳酸菌的冷冻步骤4中，将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量8％的脱脂乳作为冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。其他步骤与相应实施例相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例7
在实施例1～3的乳酸菌的冷冻步骤4中，将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量10％的麦芽糊精作为冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。其他步骤与相应实施例相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例8
在实施例1～3的乳酸菌的冷冻步骤4中，将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量10％的甘油作为冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。其他步骤与相应实施例相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例9
在实施例1～3的乳酸菌的冷冻步骤4中，将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量8％的脱脂乳与2％的甘油的混合物作为冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。其他步骤与相应实施例相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
实施例10
在实施例1～3的乳酸菌的冷冻步骤4中，将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量8％的脱脂乳与2％的甘油、0.5％的酵母膏的混合物作为冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时。其他步骤与相应实施例相同，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
为了确定本发明的最佳工艺步骤，发明人进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下：
检测方法：(1)乳酸菌的检测：按照国际乳品联合会标准IDF117：1983。在无菌操作条件下，将融化的培养基倒入灭菌培养皿中，冷却后形成培养平板。将酸奶样品充分搅拌均匀，依次用无菌生理盐水做10倍递增稀释至适当稀释度，吸取1mL稀释液在培养平板上涂布均匀。保加利亚乳杆菌菌株接入MRS培养基平板后，再倒入一层冷却至50℃的MRS培养基形成双层平板，将培养皿放入烛缸，在37℃恒温培养箱中培养72h；嗜热链球菌菌株接入M17培养基平板，在37℃恒温培养箱中培养48h。然后记录培养基平板中的菌落数，以cfu/mL表示。
(2)酸度测定：取10mL羊奶酸奶，注入150mL三角瓶中，用20mL蒸馏水稀释，加入质量分数为1％的酚酞指示剂2滴，用物质的量浓度为0.1mol/L的NaOH标准溶液滴定，待出现微红色在30s内不消失为止，记录消耗的NaOH的毫升数，计算其酸度，以°T表示。
(3)粘度测定：采用NDJ-79型旋转式粘度计测定。根据粘度范围，选用二单元1×10转子，在20℃下测试，在第30s时记录数据，取三次测量数据的平均值，粘度单位为mPa·s。
(4)凝乳时间的测定：将乳酸菌发酵剂以2％的接种量接入质量分数为12％的灭菌复原羊奶中，在43℃发酵至羊奶凝固，记录从发酵开始至羊奶的凝乳时间即为凝乳时间。
(5)乳酸菌存活率
冷冻存活率(％)＝(冷冻后活菌数/冷冻前活菌数)×100
真空冷冻干燥存活率(％)＝(冷冻干燥后活菌数/冷冻干燥前活菌数)×100
(6)酸奶组织状态及风味评定：按GB 2746-1999酸牛奶中感官评定方法。
1、乳酸菌的分离纯化
从12种商品牛奶酸奶中采用平板划线法分离纯化乳酸菌。分离纯化的方法为：用脱脂奶粉和水配制成质量分数为12％的脱脂乳，经115℃灭菌20分钟，将商品牛奶酸奶接入灭菌后的脱脂乳中，商品牛奶酸奶接入量为12％的脱脂乳的2％，37℃下发酵至凝乳；在无菌操作条件下，分别将凝乳在MRS固体培养基和M17固体培养基上划线，MRS固体培养基放在厌氧条件下37℃培养2～3天，M17固体培养基在大气环境下37℃培养2～3天，培养结束后挑选形态相同、数量最多的单个菌落，经革兰氏染色后，在油镜下观察菌体特征。具有杆菌特征的菌落继续在MRS固体培养基上培养；具有球菌特征菌落继续在M17固体培养基上培养。反复进行培养直至染色镜检的视野中无杂菌为止，视为分离纯化完毕。从分离纯化的乳酸菌中筛选出8种产粘特性、产酸特性和凝乳特性较高的乳酸菌，经微生物形态和生理生化鉴定，确定4株为保加利亚乳杆菌，分别命名为Lb-1、Lb-2、Lb-3、Lb-4；4株为嗜热链球菌，分别命名为St-1、St-2、St-3、St-4。
2、乳酸菌在羊奶中发酵特性
(1)单菌株在羊奶中发酵特性
将分离纯化的4株保加利亚乳杆菌Lb-1、Lb-2、Lb-3、Lb-4和4株嗜热链球菌St-1、St-2、St-3、St-4分别接入经115℃灭菌20分钟的质量分数为12％的复原羊奶中制作发酵剂，再将制作的发酵剂以2％的接种量接入质量分数为12％的灭菌复原羊奶中，43℃发酵至凝乳，分别测定其凝乳时间及凝乳时酸奶的酸度和粘度，并对酸奶的组织状态进行评价，结果见表1。
表1  乳酸菌菌株在羊奶中的发酵特性
  菌株   酸度(°T)   粘度(mPa.s)  凝乳时间(h)   组织状态及风味
  Lb-1   120   68   5.5   细腻，无膻味
  Lb-2   112   55   7.0   较粗糙，无膻味
Lb-3 118 63 6.1 光滑细腻，无膻味
  Lb-4   110   45   7.2   较粗糙，稍有膻味
  St-1   88   123   6.0   光滑细腻，无膻味
  St-2   90   162   5.5   光滑细腻，无膻味
  St-3   85   141   6.5   光滑细腻，稍有膻味
  St-4   82   133   6.3   光滑细腻，稍有膻味
注：表中数据为3次测定的平均值。
由表1可见，8株乳酸菌在羊奶酸奶发酵过程中，4株保加利亚乳杆菌的发酵酸度较高，但其发酵粘度较差；4株嗜热链球菌的产粘效果较好，但发酵酸度较低。从8株乳酸菌的凝乳时间和酸奶的组织状态及风味来看，保加利亚乳杆菌Lb-1和Lb-3菌株及嗜热链球菌St-1和St-2菌株的凝乳时间较短，酸奶的组织状态光滑细腻，且无明显的膻味。由此可见，分离纯化的8株乳酸菌中，保加利亚乳杆菌Lb-1和Lb-3菌株及嗜热链球菌St-1和St-2菌株具有较高的产酸、产粘特性及较好的凝乳特性，但单独使用时，凝乳时间还较长。
(2)乳酸菌配比在羊奶中发酵特性
将分离纯化的保加利亚乳杆菌Lb-1、Lb-3菌株及嗜热链球菌St-1、St-2菌株分别以杆菌和球菌的菌数比为1∶1混合制作混合发酵剂，混合发酵剂接入经115℃灭菌20分钟的质量分数为12％的复原羊奶中，混合发酵剂的接种量是质量分数为12％的灭菌复原羊奶的2％，43℃发酵至凝乳，分别测定其凝乳时间及凝乳时酸奶的酸度、粘度，并对酸奶的组织状态进行评价，结果见表2。
表2  乳酸菌菌株配比存羊奶中的发酵特性
  菌株   酸度(°T)   粘度(mPa.s)   凝乳时间(h)   组织状态及风味
  Lb-1+St-1   123   121   5.0   光滑细腻，无膻味
  Lb-1+St-2   125   153   3.8   光滑细腻，无膻味
  Lb-3+St-1   112   105   4.1   光滑细腻，无膻味
  Lb-3+St-2   98   110   4.3   光滑细腻，无膻味
注：表中数据为3次测定的平均值。
由表2可见，杆菌和球菌混合发酵羊奶时，酸奶凝乳时的酸度、粘度都比单独使用杆菌或球菌时明显提高，特别是在凝乳时间方面，无论是杆菌还是球菌在单独使用时，其凝乳时间均较长，而杆菌和球菌混合发酵时，凝乳时间明显缩短，且酸奶的组织状态光滑细腻，无乳清析出，也无明显羊奶膻味，尤其是保加利亚乳杆菌Lb-1菌株和嗜热链球菌St-2菌株按菌数比1∶1混合制作的发酵剂生产羊奶酸奶效果最好，是适宜生产羊奶酸奶的优良菌种。
3、乳酸菌的增殖培养
胡萝卜汁、番茄汁的制备：取新鲜胡萝卜200g，洗净、切碎，加入200g蒸馏水煮沸15分钟，用榨汁机捣碎，用3层纱布过滤，制备成胡萝卜汁；取新鲜番茄200g，洗净、切碎，放入锥形瓶，置于4℃冰箱8～12小时，取出，用3层纱布过滤，制备成番茄汁。
在乳酸菌培养过程中，为了提高单位体积乳酸菌菌体的浓度，通常在培养基中添加一些促进乳酸菌生长繁殖的物质。本发明选用胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙为乳酸菌的增殖因子。分别在MRS液体培养基或M17液体培养基中添加胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙进行正交试验。胡萝卜汁的添加量按液体培养基体积分数设定7.5％、10％和12.5％三个水平；番茄汁的添加量按液体培养基体积分数设定7.5％、10％和12.5％三个水平；碳酸钙的添加量按液体培养基质量分数设定0.3％、0.5％和0.7％三个水平。在添加增殖因子后，培养基经121℃灭菌处理10分钟，然后在无菌操作条件下，按每毫升MRS液体培养基中接入保加利亚乳杆菌Lb-1菌株106cfu，每毫升M17液体培养基接入嗜热链球菌St-2菌株106cfu，43℃培养12小时进行增殖培养，培养结束后分别测定培养基中乳酸菌活菌数。结果见表3和表4。
由表3可见，增殖因子对保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的增殖效果有重要的影响。胡萝卜汁极差最大，为1.00，碳酸钙极差最小，为0.37，但三个因素的极差均大于空列项(0.07)。方差分析表明，胡萝卜汁达到极显著水平(P＜0.01)，番茄汁和碳酸钙两因素均达到显著水平(P＜0.05)，表明在试验范围内胡萝卜汁是影响菌株Lb-1增殖效果的主要因素，番茄汁和碳酸钙也有重要影响。本发明的最佳组合为在MRS液体培养基中添加其体积分数7.5％的胡萝卜汁和7.5％的番茄汁、添加其质量分数0.3％的碳酸钙，在此条件下，MRS液体培养基中活菌数可达7.2×109cfu/mL。
表3  增殖因子对保加利亚乳杆菌Lb-1菌株增殖效果
  处理号   胡萝卜汁(％)A   番茄汁(％)B   碳酸钙(％)C   空列   活菌数(×109cfu/mL)
  1   1(7.5)   1(7.5)   1(0.3)   1   7.2
  2   1(7.5)   2(10)   2(0.5)   2   6.5
  3   1(7.5)   3(12.5)   3(0.7)   3   6.4
  4   2(10)   1(7.5)   2(0.5)   3   6.2
  5   2(10)   2(10)   3(0.7)   1   5.7
  6   2(10)   3(12.5)   1(0.3)   2   6.1
  7   3(12.5)   1(7.5)   3(0.7)   2   5.9
  8   3(12.5)   2(10)   1(0.3)   3   5.8
  9   3(12.5)   3(12.5)   2(0.5)   1   5.4
  K1   6.70   6.43   6.37   6.10
  K2   6.00   6.00   6.03   6.17
  K3   5.70   5.97   6.00   6.13
  优水平   A1   B1   C1
  Rj   1.00   0.47   0.37   0.07
  主次顺序   A1B1C1
表4  增殖因子对嗜热链球菌St-2菌株增殖效果
  处理号   胡萝卜汁(％)A   番茄汁(％)B   碳酸钙(％)C   第4列   活菌数(×109cfu/mL)
  1   1(7.5)   1(7.5)   1(0.3)   1(7.5)   1.80
  2   1(7.5)   2(10)   2(0.5)   1(7.5)   1.67
  3   1(7.5)   3(12.5)   3(0.7)   1(7.5)   1.73
  4   2(10)   1(7.5)   2(0.5)   2(10)   2.04
5   2(10)   2(10)   3(0.7)   2(10)   1.86
  6   2(10)   3(12.5)   1(0.3)   2(10)   2.25
  7   3(12.5)   1(7.5)   3(0.7)   3(12.5)   1.85
  8   3(12.5)   2(10)   1(0.3)   3(12.5)   1.91
  9   3(12.5)   3(12.5)   2(0.5)   3(12.5)   2.00
  K1   1.73   1.90   1.99   1.88
  K2   2.05   1.81   1.90   1.92
  K3   1.92   1.99   1.81   1.89
优水平 A2 B3 C1
  Rj   0.29   0.16   0.15   0.03
  主次顺序   A2B3C1
由表4可见，增殖因子对嗜热链球菌St-2菌株的增殖效果有重要的影响。胡萝卜汁极差最大，为0.29，碳酸钙极差最小，为0.15，三个因素的极差均大于空列项(0.03)。方差分析表明，胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙3个因素均达到显著水平(P＜0.05)，表明在试验范围内胡萝卜汁、番茄汁和碳酸钙对菌株St-2增殖效果均有重要影响。本发明的最佳组合为在M17液体培养基中添加其体积分数10％的胡萝卜汁和12.5％的番茄汁、添加其质量分数0.3％的碳酸钙，在此条件下，M17液体培养基中活菌数可达2.25×109cfu/mL。
4、乳酸菌冷冻保护剂的筛选
将经过MRS液体培养基增殖培养的保加利亚乳杆菌Lb-1菌株和经过M17液体培养基增殖培养的嗜热链球菌St-2菌株，分别用离心机6000转/分钟离心10分钟，倾去上层清液，得到含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥。分别取两种菌泥各9份，1份作为空白对照，其中5份分别添加菌泥质量3％的蔗糖、3％的葡萄糖、8％的脱脂乳、10％的麦芽糊精、10％的甘油作为冷冻保护剂；1份添加菌泥质量8％的脱脂乳、2％的甘油的混合物作为冷冻保护剂；1份添加菌泥质量8％的脱脂乳、2％的甘油、0.5％的麦芽糊精的混合物作为冷冻保护剂；1份添加菌泥质量菌泥质量8％的脱脂乳、5％的甘油、3％的蔗糖、1％的麦芽糊精的混合物作为冷冻保护剂，混合均匀，分别在-40℃的冰箱中冷冻12小时，测定冷冻前后的活菌数及冷冻存活率，结果见表5和表6。
表5  冷冻保护剂对保加利亚乳杆菌Lb-1菌株保护效果
Figure BSA00000440481600121
表6  冷冻保护剂对嗜热链球菌St-2菌株保护效果
Figure BSA00000440481600131
由表5和表6可见，无论是保加利亚乳杆菌Lb-1菌株还是嗜热链球菌St-2菌株，在加入冷冻保护剂之后，其存活率明显高于对照组，说明添加冷冻保护剂可有效降低乳酸菌冷冻过程中的死亡率。同时可以看出，单一保护剂的保护效果不如混合型保护剂效果好，而在混合型保护剂中，以菌泥质量8％脱脂乳、5％的甘油、3％的蔗糖、1％的麦芽糊精的组合物对乳酸菌菌体的保护效果最好，可将保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的存活率从8.5％提高到66％，将嗜热链球菌St-2菌株的存活率从14.3％提高到76.2％。故本发明最佳选择添加混合菌泥质量8％的脱脂乳、5％的甘油、3％的蔗糖、1％的麦芽糊精的混合物作为冷冻保护剂。
5、乳酸菌真空冷冻干燥
将增殖培养的保加利亚乳杆菌Lb-1菌株和增殖培养的嗜热链球菌St-2菌株在6000转/分钟离心10分钟后得到的含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加混合菌泥质量8％的脱脂乳、5％的甘油、3％的蔗糖、1％的麦芽糊精的混合物，混合均匀，取5g添加保护剂后的菌泥装于无菌小瓶中，-40℃的冰箱中冷冻12小时，放入真空冷冻干燥机中，冷阱温度为-50℃、真空度为100Pa干燥至菌粉中水分含量小于2％，分别测定真空冷冻前和真空冷冻干燥后乳酸菌的活菌数，计算其真空冷冻干燥存活率。结果见表7。
表7  乳酸菌真空冷冻干燥过程中的存活率
Figure BSA00000440481600141
由表7可见，真空冷冻干燥过程对乳酸菌的存活率有重要的影响，真空冷冻干前乳酸菌活菌数为20.5×1010cfu，真空冷冻干后乳酸菌活菌数14.0×1010cfu，真空冷冻干燥后干粉活菌数为4.5×1010cfu/g，说明真空冷冻干燥过程会对乳酸菌造成损伤，但是空冷冻干燥后的干粉中乳酸菌的活菌数还是较高，能够满足生产酸奶的需要。
6、本发明发酵剂在羊奶酸奶中的应用效果
将实施例1制备的羊奶酸奶专用发酵剂接入经115℃灭菌20分钟的质量分数为12％的复原羊奶中，羊奶酸奶专用发酵剂接入量为质量分数为12％的复原羊奶的万分之一，在43℃发酵至凝乳，记录凝乳时间，观察凝乳状态，评价羊奶酸奶的组织状态及风味，进行活菌计数，结果见表8。
表8  羊奶酸奶专用发酵剂制作的羊奶酸奶品质分析
Figure BSA00000440481600142
由表8可见，用实施例1制备的羊奶酸奶专用发酵剂生产羊奶酸奶时，在发酵4小时时即可凝乳，酸奶中的总菌数达到7.5×108cfu/mL，超过国家标准1×106cfu/mL(GB 2746-1999酸牛奶和GB 19302-2010食品安全国家标准发酵乳)，其中保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的活菌数为3.2×108cfu/mL，嗜热链球菌St-2菌株的活菌数为4.3×108cfu/mL，2株乳酸菌活菌数的比例接近1∶1，是较为理想的搭配比例。感官评价表明，酸奶凝乳状态光滑细腻、风味独特，无明显的羊奶膻味。由此可见，本发明的羊奶酸奶专用发酵剂能够较好地应用于羊奶酸奶的生产。

Claims (3)

1.一种羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法，其特征在于由下述步骤组成：
(1)乳酸菌的分离纯化
用平板划线法从商品牛奶酸奶中分离纯化保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，分离纯化的方法为：用脱脂奶粉和水配制成质量分数为12％的脱脂乳，经115℃灭菌20分钟，将商品牛奶酸奶接入灭菌后的脱脂乳中，商品牛奶酸奶接入量为12％的脱脂乳的2％，37℃下发酵至凝乳；在无菌操作条件下，分别将凝乳在MRS固体培养基和M17固体培养基上划线，MRS固体培养基放在厌氧条件下37℃培养2～3天，M17固体培养基在大气环境下37℃培养2～3天，挑选形态相同、数量最多的单个菌落，经革兰氏染色，在油镜下观察菌体特征，将具有杆菌特征的菌落在MRS固体培养基上培养，具有球菌特征的菌落在M17固体培养基上培养，直至染色镜检的视野中无杂菌为止，视为分离纯化完毕；从分离纯化的乳酸菌中筛选出2株乳酸菌，经微生物形态和生理生化鉴定，确定1株为保加利亚乳杆菌，命名为Lb-1，另1株为嗜热链球菌，命名为St-2；
(2)乳酸菌的增殖培养
取新鲜胡萝卜，洗净、切碎，加入与其等质量的蒸馏水，煮沸15分钟，用榨汁机捣碎，3层纱布过滤，制备成胡萝卜汁；取新鲜番茄，加入与其等质量的蒸馏水，煮沸15分钟，用榨汁机捣碎，3层纱布过滤，制备成番茄汁；
在MRS液体培养基中添加其体积7.5％～12.5％的胡萝卜汁、7.5％～12.5％的番茄汁以及其质量0.3％～0.7％的碳酸钙，121℃灭菌处理10分钟，在无菌条件下，加入步骤(1)中分离纯化的保加利亚乳杆菌Lb-1菌株，每毫升MRS液体培养基中接入保加利亚乳杆菌Lb-1菌株106cfu，43℃增殖培养12小时；
在M17液体培养基中添加其体积7.5％～12.5％的胡萝卜汁、7.5％～12.5％的番茄汁以及其质量0.3％～0.7％的碳酸钙，121℃灭菌处理10分钟，在无菌条件下，加入步骤(1)中分离纯化的嗜热链球菌St-2菌株，每毫升M17液体培养基中接入嗜热链球菌St-2菌株106cfu，43℃增殖培养12小时；
(3)乳酸菌的离心分离
将乳酸菌的增殖培养步骤(2)中保加利亚乳杆菌Lb-1菌株增殖培养后的MRS液体培养基和嗜热链球菌St-2菌株增殖培养后的M17液体培养基分别在6000转/分钟离心分离10分钟，倾去上层清液，得到含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥；
(4)菌泥冷冻
将含保加利亚乳杆菌Lb-1菌株的菌泥和含嗜热链球菌St-2菌株的菌泥按质量比为1∶1混合成混合菌泥，添加冷冻保护剂，混合均匀，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时；
上述的冷冻保护剂为蔗糖、葡萄糖、脱脂乳、麦芽糊精、甘油中的任意一种或几种的混合物；使用单一冷冻保护剂时，蔗糖用量为混合菌泥质量的3％，葡萄糖用量为混合菌泥质量的3％，脱脂乳用量为混合菌泥质量的8％，麦芽糊精用量为混合菌泥质量的10％，甘油用量为混合菌泥质量的10％；使用2种组分的混合物冷冻保扩剂时，脱脂乳用量为混合菌泥质量的8％、甘油用量为混合菌泥质量的2％；使用3种组分的混合物冷冻保护剂时，脱脂乳用量为混合菌泥质量的8％、甘油用量为混合菌泥质量的2％、麦芽糊精用量为混合菌泥质量的0.5％；使用4种组分的混合物冷冻保护剂时，脱脂乳用量为混合菌泥质量的8％、甘油用量为混合菌泥质量的5％、蔗糖用量为混合菌泥质量的3％、麦芽糊精用量为混合菌泥质量的1％；
(5)混合菌泥的冷冻
将添加冷冻保护剂后的混合菌泥，分装于经灭菌后的小瓶中，在-40℃的冰箱中冷冻12小时；
(6)混合菌泥的真空冷冻干燥
将步骤(5)冷冻后的混合菌泥放入真空冷冻干燥机中，冷阱温度为-50℃、真空度为100Pa冷冻干燥12～18小时，至干燥后菌粉中水分含量小于2％，制备成羊奶酸奶专用发酵剂。
2.根据权利要求1所述的羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法，其特征在于：在乳酸菌的增殖培养步骤(2)中，在MRS液体培养基中添加其体积7.5％的胡萝卜汁、7.5％的番茄汁以及其质量0.3％的碳酸钙，121℃灭菌处理10分钟，在无菌条件下，加入步骤(1)中分离纯化的保加利亚乳杆菌Lb-1菌株，每毫升MRS液体培养基中接入保加利亚乳杆菌Lb-1菌株106cfu，43℃增殖培养12小时；在M17液体培养基中添加其体积10％的胡萝卜汁、12.5％的番茄汁以及其质量0.3％的碳酸钙，121℃灭菌处理10分钟，在无菌条件下，加入步骤(1)中分离纯化的嗜热链球菌St-2菌株，每毫升M17液体培养基中接入嗜热链球菌St-2菌株106cfu，43℃增殖培养12小时。
3.根据权利要求1所述的羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法，其特征在于：在乳酸菌的冷冻步骤(4)中，添加混合菌泥质量8％的脱脂乳、5％的甘油、3％的蔗糖、1％的麦芽糊精的混合物作为冷冻保护剂。
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