CN102465108B - 一种嗜热链球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)MN-ZLW-002及其应用。本发明的嗜热链球菌在调节肠道菌群平衡、降低胆固醇和抑制病原菌等方面具有较好的效果。本发明还涉及嗜热链球菌MN-ZLW-002在制备乳制品中的应用及含有其益生产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物及其应用,特别是涉及一种嗜热链球菌及其应用。
背景技术
已知胆固醇与冠心病、高血脂等心血管疾病间的关系。国内外大量临床实验证实,服用乳酸菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量,降低心血管疾病发病率的功效。发酵乳制品是人们摄入外源乳酸菌的一条重要渠道。嗜热链球菌是乳酸发酵过程中最常见的乳酸发酵菌种之一。嗜热链球菌为健康人肠道正常菌群,可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌,调整肠道菌群平衡,抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。嗜热链球菌活菌真正对人体起作用的是其乳发酵产物和底物。这些物质进入人体内,可以促进体内有益菌的增殖,抑制有害菌的繁殖,起到整肠及抗菌作用,也正因为如此,有关嗜热链球菌优良菌株、生理功能及应用等相关研究已成为人类研究的热点。
CN 101328469A公开了一种具有酒精性肝损伤保护功能的嗜热链球菌及其用途;CN 101384701A公开了一种提供在奶制品中改良质地的乳酸菌。但还未见有降胆固醇和抑菌功能性嗜热链球菌的报道和现有技术。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种具有调节肠道菌群平衡、降低胆固醇和抑制病原菌功能的嗜热链球菌,并且经过本发明嗜热链球菌制备的系列产品都具有对人体十分有益的效果。
本发明人经过长期的筛选和培育,得到了本发明的嗜热链球菌。
因此,本发明提供一株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002。本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002,保藏日期2010年5月7日,保藏地点中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院,中科院微生物研究所)。保藏号:CGMCC No.3817。
此外,本发明提供本发明嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002的应用。具体说,本发明一方面提供含有本发明的嗜热链球菌MN-ZLW-002的益生产品,所说的益生产品包括嗜热链球菌片剂、嗜热链球菌冲剂、嗜热链球菌口服液和嗜热链球菌发酵果蔬汁。
本发明另一方面提供本发明的嗜热链球菌MN-ZLW-002在制备乳制品中的应用。所说的应用包括在制备嗜热链球菌酸乳中的应用,将本发明的嗜热链球菌MN-ZLW-002作为发酵剂,通过常规方法制备酸乳。在制备嗜热链球菌奶酪中的应用,将本发明的嗜热链球菌MN-ZLW-002作为发酵剂,通过常规方法制备奶酪。
经过实验,本发明的嗜热链球菌 MN-ZLW-002是一种功能性乳酸菌,其具有调节肠道菌群平衡、降低胆固醇和抑制病原菌等功能。利用本发明的嗜热链球菌MN-ZLW-002,所得的乳制品也具有调节肠道菌群平衡、降低胆固醇和抑制病原菌产生的效果。
具体实施方式
1、本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002的分离和鉴定:
(1)菌株的筛选
经无菌离心管采集回来的甘肃省甘南县传统发酵乳制品,及时移入超净工作台,以无菌枪头吸取25mL,溶解于225mL的生理盐水中,振荡均匀,得到10-1的菌悬液。
用移液枪吸取1mL此菌悬液注入9mL的生理盐水管中,得到稀释度为10-2,的菌悬液,厌氧条件下逐级稀释,直到10-6。
每个稀释度分别取1mL,接种到M17琼脂培养基中, 37℃恒温厌氧培养。培养48h后取出观察。
待菌落形成后,用接种环或接种针挑取菌落,接种于M17液体中,置于37℃条件下,培养24h-48h。待菌株生长良好后,再次划线接种于M17琼脂培养基中,置于37℃条件下,培养24h-48h,仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征。将革兰氏阳性链球菌暂定为嗜热链球菌进一步纯化培养,并采用冷藏-85℃冻结保存或低温真空冷冻保存。
将从传统发酵乳制品中分离的链球菌菌株,经生理生化学试验、乳酸旋光性测定等一系列试验分析鉴定,并将鉴定后的菌株分别制成供试菌液。
吸取菌悬液,以2%接菌量接种于200mL 12%脱脂乳中。置于43℃条件下进行18小时过夜培养,在4℃条件下打冷5-8小时,打冷后对各样品进行检测。
用流变仪测定各样品的流变特性以及黏度大小;利用苯酚硫酸法测定各样品的胞外多糖产量。
(2)嗜热链球菌的鉴定
分离纯化的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002)经生理生化学特性分析和16SrDNA序列分析的方法鉴定。嗜热链球菌Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002的生物学特性如下所示:
嗜热链球菌Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002生物学特性
经测定,嗜热链球菌Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002的16SrDNA序列为:
2、含有本发明嗜热链球菌的益生产品
本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)MN-ZLW-002可以制备成各种具有益生特性的益生产品,包括片剂、冲剂、口服液和发酵果蔬汁。但本发明的益生产品不限于此,还包括本领域常见的其他产品形式,例如胶囊剂等等。本发明的含有本发明嗜热链球菌的片剂、冲剂、口服液可以通过将本发明的嗜热链球菌菌粉,按照本领域常规的方法,以常规的比例与常规的辅料制成。
(1)嗜热链球菌片剂
目前片剂也是嗜热链球菌制品的一大类,它是用本发明的嗜热链球菌粉加本领域常用的片剂辅料,例如,葡萄糖、乳糖、微晶纤维素、脱脂奶粉及硬脂酸镁,通过常规的制剂技术制成的片状制剂。片剂具有剂量准确,质量稳定(与光、空气、水分等接触面减小之故),服用和携带方便,便于识别以及成本低廉等优点。本发明的片剂制备是按常规的方法,将菌粉与常规的辅料按照常规的比例混合均匀,使其具有良好的流动性和可压性,然后通过压片机机械压成片。原料的流动性是为了使混合物顺利而以准确的剂量流入模孔,使片剂大小一致。压片时可在适度的压力下压成硬度符合要求的片剂。
(2)嗜热链球菌冲剂
冲剂也是嗜热链球菌制品的一大类。冲剂生产工艺简单,不需要复杂的设备,携带和服用方便。冲剂以菌粉、填充剂、稳定剂和调味剂等组成。冲剂可分为可溶性冲剂和混悬性冲剂,嗜热链球菌冲剂多为后者。本发明的嗜热链球菌冲剂主料为本发明的嗜热链球菌干燥菌粉,辅料为奶粉以及淀粉,根据产品要求还可加入一些常规的甜味剂、香精等调味剂,有的还加入一些营养强化剂如维生素等。按照常规的比例,经过常规的冲剂制备方法充分混合制成颗粒或粉剂,用复合铝膜真空包装,按所含菌数有不同规格,每克含菌数从几亿到百亿。
(3)嗜热链球菌口服液
嗜热链球菌口服液的生产工艺取决于口服液的类型。第一类口服液工艺可以按照常规的一般液态发酵工艺制备,只不过是在发酵结束后增加灌装工艺,灌装要求在无菌条件下进行,因此,发酵罐通过管道与灌装设备密封连接,灌装车间要求有一定的洁净度,避免污染。第二类产品则按照常规方法:将嗜热链球菌进行培养;然后按照常规配方配制口服液基料,然后将二者按要求混合,再行灌装。
(4)嗜热链球菌发酵果蔬汁
嗜热链球菌发酵果蔬汁是一类新型制剂,它是利用营养价值高的某些精制果蔬汁,经合适的嗜热链球菌发酵而制成的液态产品,其优点是兼有嗜热链球菌和代谢物以及果蔬汁高营养的有益作用,可以不添加任何人工成分,达到全天然的要求。
本发明嗜热链球菌发酵果蔬汁的基本工艺流程是:甜味剂6~15%、果蔬汁5~10%、稳定剂0.25~0.6%,柠檬酸0.2~0.5%及其他辅料,用50~80℃去离子水混合料液,充分分散后加热溶解,20MPa压力下均质,在80~90℃温度下加热杀菌10~30分钟,冷却到37 ℃;加入本发明嗜热链球菌,在35~37℃下培养,使其pH值为4.2~4.5,使活菌数达到5×107cfu/mL。培养后的混合料应立即冷却,直到使用时为止保持温度在10℃以下。
果蔬汁可以是任何可食用的果蔬汁,可以直接购买或者直接榨汁获得。嗜热链球菌发酵剂的添加量,按菌种、菌数、活力等各异,通常5%以内已足够。如果发酵剂的添加量过多,则产生酪蛋白沉淀,降低商品价值。
4、本发明嗜热链球菌在制备乳制品中的应用
本发明的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)MN-ZLW-002可以在制备乳制品中使用,乳制品包括酸奶、乳饮料、奶酪、冰淇淋。但本发明的乳制品不限于此,还包括其他形式的乳制品。本发明的各种乳制品可以通过将本发明的嗜热链球菌菌粉作为发酵剂,按照本领域常规的方法,以常规的比例与常规的原料制成。
(1)制备嗜热链球菌酸奶
混合料、均质、杀菌、冷却,然后加入香料,灌装、培养、冷却得到凝固型酸牛奶;
混合料、均质、杀菌、冷却,然后加入发酵剂,加入发酵罐培养、搅拌、冷却,再加入果料、香料、灌装,得到搅拌型酸牛奶。
鲜奶10~15%,甜味剂(砂糖、葡萄糖等)6~8%,稳定剂0.05~0.3%。
原料乳与甜味剂混合,预热至60~65℃,再加入稳定剂溶解,20MPa压力下均质,在90~95℃温度下加热杀菌10~30分钟,或135~137℃温度下杀菌2~4秒,迅速冷却到43 ℃;然后在其中添加科汉森公司发酵剂0.00125%和本发明嗜热链球菌发酵剂0.002~0.003%,在41~44℃下培养,使pH值达到4.5。一般培养时间3~4小时,这时活菌数达到5×108cfu/mL。培养后的混合料应立即冷却,直到使用时为止保持温度在10℃以下。
(2)制备嗜热链球菌乳饮料
a. 液体酸牛乳型活性嗜热链球菌饮料
发酵混合料是用鲜奶或浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳,必要时添加葡萄糖等促进乳酸菌发育的物质进行配置。
另外,将作为辅料的砂糖、稳定剂等溶解配成糖浆,经80~90℃加热杀菌10~30分钟后冷却到10℃以下.稳定剂用少量的水溶解,同时用机械强力搅拌,充分分散后加热溶解。将发酵乳与糖浆混合,必要时添加柠檬酸调节酸度,加一定量的冷却水定容,用9.8~14.72兆帕的压力均质,最后把3~5℃的制品灌装于容器中冷藏,其产品活菌数为1×108cfu/mL。
b. 液体酸牛乳型非活性嗜热链球菌饮料
酸牛乳发酵液,按配方含量将砂糖、稳定剂、柠檬酸等加入发酵液中混合,经125~135℃杀菌2~5秒,冷却,灌装。
(3)制备嗜热链球菌奶酪
鲜乳(符合国家标准)100kg,嗜热发酵剂(MN-ZLW-002):1.4kg,凝乳酶:16g。
鲜乳在75℃,15s条件下进行杀菌,迅速冷却至32℃,待温度稳定后添加发酵剂1.4%,加入凝乳酶0.016%(m/v),静置培养后,凝乳切割,入膜和排乳清,翻转,进行盐渍,喷洒白青梅发酵剂,进行后熟(7.2℃,RH95/25-30d)。
(4)制备嗜热链球菌冰激凌
用常规的方法得到冰激凌,加入本发明活性嗜热链球菌菌粉或本发明嗜热链球菌活性发酵液,搅拌后即得到嗜热链球菌冰激凌。
实施例
下列实施例用于说明本发明需要说明的是,下面的实施例仅仅是为了对本发明进行举例说明,并不代表对本发明范围的限制,因此本发明列举了一些具有代表性的实例。
下列实施例中的试验方法,如无特别说明,均为常规方法。
下列实施例中的百分含量,如无特别说明,均为质量百分含量。
实施例1、嗜热链球菌乳饮料
鲜奶或浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳10~15%,
糖液:甜味剂(砂糖或葡萄糖或其他常用甜味剂)22~26%,柠檬酸0.05~0.1%,稳定剂(本领域任何常用的用于乳制品的稳定剂)0.1~0.6%
发酵液、糖液与水比例为1:2:1。
将鲜奶或浓缩脱脂乳或脱脂乳粉强化的脱脂乳和甜味剂用40~50℃去离子水混合料液,充分溶解后用200目筛网过滤,预热至60~65℃,20MPa压力下均质,在90~95℃温度下加热杀菌10~30分钟,冷却到37 ℃;然后在其中添加科汉森公司发酵剂0.00125%和本发明嗜热链球菌发酵剂0.002~0.003%,在35~37℃下培养,使其pH值为4.2~4.5,这时活菌数达到108cfu/mL以上。培养后的混合料应立即冷却,直到使用时为止保持温度在10℃以下。
另外,将作为辅料的甜味剂、稳定剂、色素等,用60~80℃去离子水溶解配成糖浆,用200目筛网过滤,经80~90℃加热杀菌10~30分钟后冷却到10℃以下.稳定剂用少量的水溶解,同时用机械强力搅拌,充分分散后加热溶解。
将发酵乳与糖浆混合,必要时添加柠檬酸调节酸度;添加香料后,加一定量的冷却水定容,用9.8~14.72兆帕的压力均质,最后把3~5℃的制品灌装于容器中冷藏,其产品活菌数为1×108cfu/mL。
实施例2、嗜热链球菌酸乳
将鲜乳加热至50℃以上,加入6.5%白砂糖搅拌至完全溶解,预热至60~65℃,20Mpa压力均质,90~95℃左右杀菌10~30分钟,冷却至42-45℃,接种科汉森发酵剂0.0125%和本发明嗜热链球菌0.002~0.003%。40~42℃发酵至pH 4.2~4.5,冷却、冷藏,制成凝固型酸乳。
实施例3、嗜热链球菌冰淇淋
制备1000kg冰淇淋,使用白砂糖75kg,全脂奶粉66kg,奶油32kg,椰子油23kg,糖浆26.5kg,稳定剂6kg,本发明嗜热链球菌菌粉0.002%,将除菌粉外的其他物料混合,预热至60~65℃,20Mpa下均质,70~85℃下杀菌10~30分钟,冷却至40-50℃,加入本发明嗜热链球菌菌粉,20~30Mpa下进行均质,在2~4℃下放置6小时,经凝冻硬化制成冰淇淋。
实施例4 嗜热链球菌发酵果蔬汁
胡萝卜、番茄、橙等果蔬均可用本发明的嗜热链球菌发酵,制成嗜热链球菌发酵果蔬汁。
嗜热链球菌果蔬汁发酵是在发酵罐内进行。发酵过程中需定时取样检测发酵液的pH值和活菌数,以及时了解发酵情况。发酵终点的判别标准,一是pH值,一般pH值达列4.2~4.5;二是活菌数达到107cfu/mL以上.根据嗜热链球菌产品的特定要求,发酵结束后应立即冷却到室温以下,然后在无菌条件下迅速灌装冷藏。
胡萝卜汁10%,甜味剂15%,稳定剂0.6%,柠檬酸0.5%,色素、香精适量。用60~80℃去离子水混合料液,充分分散后加热溶解,20MPa压力下均质,在80~90℃温度下加热杀菌10~30分钟,冷却到37 ℃;本发明嗜热链球菌发酵剂,在35~37℃下培养,使其pH值为4.2~4.5,这时活菌数达到5×107cfu/mL。培养后的混合料应立即冷却,直到使用时为止保持温度在10℃以下。
番茄汁5%,甜味剂10%,稳定剂0.25%,柠檬酸0.2%,色素、香精适量。用60~80℃去离子水混合料液,充分分散后加热溶解,20MPa压力下均质,在80~90℃温度下加热杀菌10~30分钟,冷却到37 ℃;本发明嗜热链球菌发酵剂,在35~37℃下培养,使其pH值为4.2~4.5,这时活菌数达到5×107cfu/mL。培养后的混合料应立即冷却,直到使用时为止保持温度在10℃以下。
橙汁8%,甜味剂10%,稳定剂0.4%,柠檬酸0.3%,用50~65℃去离子水混合料液,充分分散后加热溶解,20MPa压力下均质,在80~90℃温度下加热杀菌10~30分钟,冷却到37 ℃;本发明嗜热链球菌发酵剂,在35~37℃下培养,使其pH值为4.2~4.5,必要时添加柠檬酸调节酸度,这时活菌数达到5×107cfu/mL。培养后的混合料应立即冷却,直到使用时为止保持温度在10℃以下。
实施例5、 胆固醇试验
以本发明的嗜热链球菌为菌种,制成菌悬液,分别以培养基和发酵乳制品为介质,测得降低胆固醇含量的体外实验。同时,以干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌作为对比。
(一)以培养基上清液为介质测定其胆固醇含量的方法
1.将1.0m1的菌悬液接种到装有10mLMRS液体培养基的试管中,同时用1mL
灭菌生理盐水做对照;
2.加入1. 0mL胆固醇溶液;
3.37℃培养10小时后,4000*g离心10分钟,收集上清;
4.皂化:向一具塞试管中加入0. 1mL上清,0. 3mL 33%KOH, 3mL 95%乙醇,
混匀后60℃水浴15分钟,然后迅速降至室温;
5.萃取:加入5mL正己烷,3mL蒸馏水,混合震荡1分钟。转移1mL正己烷
层到容量瓶中待测.
(二) 以发酵乳制品为介质降低胆固醇含量体外实验
1.将菌悬液1mL接种到100mL均质原料乳中;
2.在43℃培养箱中培养3-4小时;
3.待乳凝固后取出,放入冰箱中冷藏备用;
4.样品处理方法及检测方法:
准确称取5g样品(乳50mL)于皂化瓶中,然后加入25mL 50%KOH溶液和25mL 95%乙醇,连接冷凝管,水浴回流皂化30分钟。迅速冷却皂化液至室温,然后将皂化液全部移至250mL分液漏斗中,加入50mL石油醚,振摇2分钟后萃取,静止分层;放出水相于另一分液漏斗中,再分别用50mL石油醚,按上述方法萃取水相两次;合并有机相,用蒸馏水洗至中性后,再用无水硫酸钠干燥。在旋转蒸发器上将石油醚蒸干,最后用1mL正己烷定容。将萃取后所得的正己烷部分吸取1mL备用,然后用气相色谱进行检测。
气象色谱条件:
仪器型号:VISTA6000GC
检测器:火焰离子化检测器
色谱柱:2m* I. D. 2mm 5%OV-17 on 80/ 100目GCQ玻璃柱,或其它公司
生产的具有相同性能的仪器和色谱柱。
柱温: 285℃
检测器温度:325℃
进样器温度:325℃
氮气流速: 20mL/min
进样体积: 2mL
培养基中
菌株 | 胆固醇脱除率(%) |
嗜热链球菌MN-ZLW-002 | 42.66 |
干酪乳杆菌 | 38.67 |
嗜酸乳杆菌 | 30.09 |
发酵乳中
菌株 | 胆固醇脱除率(%) |
嗜热链球菌MN-ZLW-002 | 53.52 |
干酪乳杆菌 | 49.45 |
嗜酸乳杆菌 | 25.56 |
由此可见,本发明的嗜热链球菌不仅具有降低胆固醇的功能,而且与降胆固醇的性能与同类菌种相比,本发明的嗜热链球菌降胆固醇效果较好。
实施例6、嗜热链球菌对病原菌的作用
将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌活化,取无菌蒸馏水稀释,取0.2mL进行平板涂布。37℃放置30min,使其表面干燥。向每一个平板中放置4个牛津杯,分别加入0.1mL的本发明的嗜热链球菌菌悬液和空白MRS液体培养基。培养后,测量抑菌环直径。以同样方式,使用干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌作为对比。
通过上述实验可知,本发明的嗜热链球菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等病原菌均具有抑制作用,且其抑制直径大于同类的其他乳酸菌。
实施例7、耐酸耐胆盐实验
将活化的菌株以1%接菌量接于人工胃液pH3.0中,同时加入EPS冻干粉0、50、100mg/L,37℃培养4小时,进行平板计数,结果见表1。
将活化的菌株以2%接菌量接于人工胆液(0.3%)中,同时加入EPS冻干粉0、50、100mg/L,37℃培养3小时,进行平板计数,结果见表2。
表1 菌株耐酸试验结果
存活率(%) | |
嗜热链球菌MN-ZLW-002 | 63.34 |
干酪乳杆菌 | 89.93 |
嗜酸乳杆菌 | 91.06 |
嗜热链球菌MN-ZLW-002 +50 mg/L | 79.34 |
嗜热链球菌MN-ZLW-002 +100 mg/L | 88.67 |
表2 菌株耐胆盐实验结果
以上实验证明,本发明的嗜热链球菌具有耐酸耐胆盐性能,在胃液中具有活性,能够起到在人体内降胆固醇和抑制病原菌的作用。
实施例8、调节肠道菌群平衡实验
选用60只雄性昆明种小白鼠随机分成6组,每组10只,其中1组为正常对照组,另5组每天腹腔注射青霉素钠(0.9 mg/g·bw)一次,连续7天,随机选1组为模型组,检验小鼠菌群失调情况(正常组和模型组此时检测);随机选取1组以样品稀释液灌胃,作为自然恢复组;其余3组以嗜热链球菌每天灌胃一次,剂量分别为103个/天(低剂量组)、104个/天(中剂量组)、105个/天(高剂量组),灌胃5天。
给各组小鼠最后一次腹腔注射青霉素钠或灌胃嗜热链球菌24小时后,称重,将小鼠颈椎脱臼处死,无菌采取盲肠内容物0.1克溶于10mL稀释液中,37℃水浴振荡15分钟,再依次10倍梯度稀释,选择合适的稀释度,分别取1mL稀释液加在各培养基上(每种菌每个稀释度重复三个平板),测定粪便中肠杆菌、肠球菌、嗜热链球菌和拟杆菌的变化情况,结合革兰氏染色、细胞显微形态和菌落形态来进行菌种确定。
表1 本发明嗜热链球菌调节腹泻小鼠肠道菌群平衡的实验结果
表2饲喂本发明嗜热链球菌粉后各组小鼠体重变化
实验证明,本发明的嗜热链球具有明显的调节肠道菌群平衡作用,且其功能在同类乳酸菌中效果较佳。
上述实施例说明本发明的嗜热链球MN-ZLW-002确具有相比于现有技术更好的功能。特别是在降低胆固醇含量和抑制病原菌、调节肠道菌群平衡方面具有更好的效果。含有本发明嗜热链球菌MN-ZLW-002的益生产品及生产的乳制品自然也具有调节肠道菌群平衡、降低胆固醇和抑制病原菌产生的效果。
Claims (3)
1.一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) MN-ZLW-002,其特征在于所述嗜热链球菌菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏,保藏号为CGMCC No.3817。
2.含有权利要求1所述嗜热链球菌MN-ZLW-002的益生产品,其特征在于所述的益生产品包括嗜热链球菌片剂、嗜热链球菌冲剂、嗜热链球菌口服液和嗜热链球菌发酵果蔬汁。
3.权利要求1所述的嗜热链球菌MN-ZLW-002在制备乳制品中的应用。
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