CN113197250B - 一种含嗜热链球菌mn002的产品的用途及乳制品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含灭活嗜热链球菌MN002的产品的用途及乳制品,所述含灭活嗜热链球菌MN002的产品的用途包括:改善结肠炎及其特征肠道菌群,或改善便秘及其特征肠道菌群。本发明还提供了一种乳制品,该乳制品中含有灭活的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)MN002,该嗜热链球菌MN002的保藏编号为CGMCC No.3817。本发明的产品具有改善结肠炎及其特征肠道菌群、便秘及其特征肠道菌群的效果。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域,具体涉及一种乳制品,以及该乳制品的用途。
背景技术
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)为兼性厌氧或微好氧的革兰氏阳性菌,以两个卵圆型为一对的球菌连成约0.7到0.9微米的长链,嗜热链球菌在选择性培养基中的菌落呈米色。嗜热链球菌属于益生菌,而归入益生菌的微生物都需要在到达肠道时仍然有活性,为此,这些细菌在通过胃肠道的时候都应该是活的。研究表明:嗜热链球菌能到达小肠的上半部,但并不像双歧杆菌那样可以去到大肠。现有技术中公开的嗜热链球菌的功能作用主要包括以下几种:
(1)活的嗜热链球菌可以产生乳糖酶,因此能帮助乳糖不耐受的人们消化乳糖;(2)改善肠道微环境,通过分泌细菌素抑制病原菌的生长;(3)用人类肠表皮细胞做体外实验表明:嗜热链球菌能明显下调白细胞介素IL-6的产量,但是嗜热链球菌对于白细胞介素IL-8、IL-10、T细胞生长因子TGF-β、肿瘤坏死因子TNF-α的产量却没有调节作用;(4)用鼠脾细胞做体外实验表明:嗜热链球菌能明显上调鼠脾细胞中的白细胞介素IL-12、干扰素INF-γ、肿瘤坏死因子TNF-α的产量,也能上调白细胞介素IL-4的产量;(5)发酵产物可以调节控制血压;(6)生成的多糖、细菌素、乳酸等具有抗肿瘤活性的作用;(7)产生超氧化物歧化酶(SOD)可以清除体内代谢过程中产生的过量超氧阴离子自由基,延缓衰老。
上述功能作用均是基于活菌而言,并且现有技术中并没有公开采用嗜热链球菌能够达到改善结肠炎及其特征肠道菌群或改善便秘及其特征肠道菌群效果的记载。
发明内容
因此,本发明提供一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)MN002的新用途,并提供了包含该嗜热链球菌MN002的乳制品,该乳制品具有改善结肠炎及其特征肠道菌群或改善便秘及其特征肠道菌群效果。
嗜热链球菌MN002在制备以下任一产品中的用途:
A、改善结肠炎及其特征肠道菌群的产品;
B、改善便秘及其特征肠道菌群的产品;
所述嗜热链球菌MN002于2010年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.3817。所述嗜热链球菌MN002又名嗜热链球菌MN-ZLW-002。
进一步的,改善结肠炎特征肠道菌群包括:提升与肠道相关的益生菌的丰度,包括norank_f_Muribaculaceae,Prevotellaceae_UCG-001,Alloprevotella,Ruminococcaceae_UCG-014,Lactobacillus,Muribaculum,Unclassified_f_Ruminococcaceae;降低与肠道相关的有害菌的丰度,包括Lachnospiraceae_NK4A136_group,Alistipes,Bacteroides,Odoribacter,Erysipelatoclostridium。
进一步的,改善便秘特征肠道菌群包括:提升益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌的数量;降低有害菌肠杆菌的数量。
进一步的,还包括提升与便秘相关有益菌的丰度,包括Prevotella_9、Dorea、Anaerostipes、Ruminococcus_2、Blautia、Bifidobacterium、unclassified_f__Lachnospira、[Eubacterium]_hallii_group;还包括降低与便秘相关有害菌的丰度,包括Erysipelotrichaceae_UCG-003、Alistipes、[Ruminococcus]_torques_group、[Ruminococcus]_gnavus_group。
进一步的,嗜热链球菌MN002在制备改善人炎症状态的产品。进一步的,改善人炎症状态包括降低促炎因子分泌和提升抗炎因子分泌,降低促炎因子分泌包括降低TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量,提升抗炎因子分泌包括上调IL-4和IL-10的表达量。
所述产品为乳制品,优选为酸奶制品。
所述嗜热链球菌MN002既可以为活菌,也可以为灭活菌,所述嗜热链球菌MN002为灭活的嗜热链球菌MN002时,所述产品中嗜热链球菌MN002的数量为105~1011个/g;优选的,所述产品中嗜热链球菌MN002的数量为108~1010个/g。
一种乳制品,包含灭活的嗜热链球菌MN002。
所述乳制品为酸奶制品。
所述灭活的嗜热链球菌MN002的数量为105~1011个/g。当灭活的嗜热链球菌MN002的服用剂量达到50亿以上时,即可显效。该灭活的嗜热链球菌MN002还可以与其他具有相同功效的菌株配合,如:灭活的副干酪乳杆菌Lc 19,当与其他菌株配合时,嗜热链球菌MN002剂量可以适当下调,在嗜热链球菌MN002的数量为105个/g时,也可以有效达到相应的效果。当嗜热链球菌MN002的数量为1011个/g以上时,疗效增加不明显,因此,本发明中灭活的嗜热链球菌MN002的数量设置为105~1011个/g。
优选的,所述灭活的嗜热链球菌MN002的数量为108~1010个/g。
进一步,所述乳制品中还包括灭活的副干酪乳杆菌,所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)为副干酪乳杆菌Lc 19,其于2019年05月20保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号是CGMCC NO.17827,保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该副干酪乳杆菌Lc 19的获取过程如下:
(1)称取约0.1g健康广西巴马长寿老人的粪便样品至900μL无菌PBS中混匀,制成粪便菌悬液;
(2)取100μL粪便悬浮液于900μL PBS稀释液中进行梯度稀释,最终稀释度为10-5;
(3)移取100μl稀释度为10-1、10-3、10-5的样品稀释液至MRS培养基中涂布,至平板完全吸收后,在37℃条件下培养48h,根据菌落形态,随机挑选能产生透明钙圈的目标菌株至MRS培养基上进行三次以上纯化,直至获得纯菌株;
(4)挑选MRS培养基上纯化好的菌株至MRS液体培养基中,37℃培养24h,获得纯化菌株Lc19。
上述所述MRS培养基和MRS液体培养基为常规培养基,具体组成在本发明中不再赘述。
该副干酪乳杆菌Lc 19的保存方法如下:
取在MRS液体培养基中24h的菌株培养液750μL,与750μL的40%甘油加入无菌冻存管,保存三管,在冻存管上标记菌株编号、保存时间。
所述副干酪乳杆菌Lc 19的数量为105~1011个/g;优选的,所述副干酪乳杆菌Lc19的数量为108~1010个/g。
所述嗜热链球菌MN002与副干酪乳杆菌Lc 19之间的数量比为(1:10)~(10:1)。
所述嗜热链球菌MN002与副干酪乳杆菌Lc 19之间的数量比为(1:4)~(4:1)
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供了一种嗜热链球菌MN002的新用途,含该嗜热链球菌MN002的产品能达到有效改善结肠炎、结肠炎相关特征肠道菌群、便秘以及便秘相关特征肠道菌群的效果。
2.本发明提供了含灭活后嗜热链球菌MN002的乳制品在改善溃疡性结肠炎及其特征肠道菌群中的应用,通过实验证明:该乳制品不仅可有效保护结肠组织,及改善体内炎症状态,降低促炎因子分泌,提升抗炎因子分泌;而且能靶向性改善结肠炎特征肠道菌群,提升7个与结肠炎相关有益菌丰度,降低4个与结肠炎相关有害菌丰度,恢复肠道菌群的健康化。
3.本发明提供了含灭活后嗜热链球菌MN002的乳制品在改善功能性便秘及其特征肠道菌群中的应用,通过实验证明:该乳制品不仅可显著提高便秘人群的排便次数及改善排便性状;而且还能靶向性改善便秘特征肠道菌群,提升8个与便秘相关有益菌丰度,降低4个与便秘相关有害菌丰度,显著提升肠道菌群代谢产物短链脂肪酸的含量,达到缓解便秘的效果。
4.本发明提供了一种新的乳制品,该乳制品中包含有灭活后的嗜热链球菌MN002,该乳制品不仅仅达到有效改善结肠炎、结肠炎相关特征肠道菌群、便秘以及便秘相关特征肠道菌群的效果;并且还具有以下独特的优势:a、优良的耐热和pH稳定性,易加工,不受食品形式限制;b、含菌量稳定,品质易控制,且不污染生产线;c、不用冷藏,不受生产、运输等外界条件影响;d、不受抗生素影响,且无耐药基因转移风险。
5.本发明中通过嗜热链球菌MN002和副干酪乳杆菌Lc 19配合,可以获得更好的改善溃疡性结肠炎及其特征肠道菌群以及改善功能性便秘及其特征肠道菌群的作用,效果更加显著。
6.本发明的乳制品优选为常温酸奶,具有食用方便、治疗简单、缓解率高、无毒副作用等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实验例1中小鼠结肠组织HE切片图,图中的比例尺度为100μm。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
一种常温酸奶,其中加入有MN 002灭活菌粉,MN 002灭活菌粉中的菌种为灭活的嗜热链球菌MN 002,制备时直接将MN 002灭活菌粉混合到成品酸奶中,混合后酸奶进行分装即可,分装规格为200g/盒,每盒中嗜热链球菌MN 002的数量约为5.0×1010个,检测酸奶中嗜热链球菌MN 002含量约为2.5×108个/g。
所述成品酸奶为常规方法制备得到的酸奶,该酸奶的制备方法如下:将92.53kg生牛乳进行标准化,杀菌后加入羟丙基二淀粉磷酸酯1kg、果胶0.2kg、白砂糖6kg混合,加入发酵菌种接种,依次经发酵、破乳、杀菌,冷却,无菌灌装,即得。
其中,发酵的温度为43℃,时间为6.5h;破乳的转速为25rpm,时间为5min;杀菌为巴氏杀菌,杀菌条件为温度75℃,时间25s;冷却温度为20℃,无菌灌装的条件为温度25℃,氮气浓度99.999%,氮气压力1.5bar,氮气流量1.5slm。
其中,MN 002灭活菌粉的具体制备过程如下:
(1)将发酵菌种嗜热链球菌MN002用MRS液体培养基进行活化培养,37℃条件下静置培养18h,培养至对数期,使活菌数达到109cfu/mL以上;
(2)离心收集湿菌体,加入保护剂,80℃真空干燥,得到MN 002灭活菌粉。
实施例2
一种常温酸奶,其中加入有实施例1中的制备方法制备得到的MN 002灭活菌粉,本实施例中酸奶的分装规格为200g/盒,每盒中嗜热链球菌MN002的数量约为1×1010个,检测酸奶中嗜热链球菌MN 002含量约为0.5×108个/g。
实施例3
本实施例提供了一种含MN 002的酸奶及其制备方法,该酸奶的原料组成包括:生牛乳:92.53kg、羟丙基二淀粉磷酸酯:1kg、果胶:0.2kg、白砂糖:6kg、MN 002菌粉:0.1kg。
本实施例中MN 002菌粉的制备过程如下:向MRS培养基中接种嗜热链球菌MN 002(保藏编号是CGMCC No.3817),接种量为2%,37℃下静置培养16h,培养至对数期,活菌数达到109cfu/mL,转速为6000rpm下离心2.5h,收集湿菌体,加入上述菌体保护剂溶液,菌体保护剂溶液加入质量为湿菌体质量的5倍,得到浓缩菌液,将浓缩菌液在-50℃下冷冻真空干燥24h,得到MN 002菌粉,其中MN 002菌粉的菌数为3×1011cfu/g。
本实施例的酸奶的制备方法包括如下步骤:将生牛乳进行标准化,杀菌后加入羟丙基二淀粉磷酸酯、果胶、白砂糖混合,加入MN 002菌粉接种,依次经发酵、破乳、杀菌,冷却,无菌灌装,即得。检测发酵结束后酸奶中嗜热链球菌MN 002含量为:2.5×108个/g。
其中,发酵的温度为43℃,时间为6.5h;破乳的转速为25rpm,时间为5min;杀菌为巴氏杀菌,杀菌条件为温度75℃,时间25s;冷却温度为20℃,无菌灌装的条件为温度25℃,氮气浓度99.999%,氮气压力1.5bar,氮气流量1.5slm。
实施例4
一种常温酸奶,其中加入有MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉,MN 002灭活菌粉中的菌种为灭活的嗜热链球菌MN 002,Lc 19灭活菌粉中的菌种为灭活的副干酪乳杆菌Lc19,制备时直接将MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉混合到成品酸奶中即可,混合后酸奶进行分装,分装规格为200g/盒。每盒中嗜热链球菌MN 002的数量约为300亿个,副干酪乳杆菌Lc 19的数量约为200亿个。
其中,Lc 19灭活菌粉的具体制备过程如下:
(1)将发酵菌种副干酪乳杆菌Lc 19用MRS液体培养基进行活化培养,37℃条件下静置培养16h,培养至对数期,使活菌数达到109cfu/mL以上;
(2)离心收集湿菌体,加入保护剂,70℃真空干燥,得到Lc 19灭活菌粉。
实施例5
一种常温酸奶,其中加入有MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉,MN 002灭活菌粉中的菌种为灭活的嗜热链球菌MN 002,Lc 19灭活菌粉中的菌种为灭活的副干酪乳杆菌Lc19,制备时直接将MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉混合到成品酸奶中即可,混合后酸奶进行分装,分装规格为200g/盒。每盒中嗜热链球菌MN 002的数量约为60亿个,副干酪乳杆菌Lc 19的数量约为40亿个。
实施例6
一种常温酸奶,其中加入有MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉,MN 002灭活菌粉中的菌种为灭活的嗜热链球菌MN 002,Lc 19灭活菌粉中的菌种为灭活的副干酪乳杆菌Lc19,制备时直接将MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉混合到成品酸奶中即可,混合后酸奶进行分装,分装规格为200g/盒。每盒中嗜热链球菌MN 002的数量约为5×109个,副干酪乳杆菌Lc 19的数量约为5×109个。即常温酸奶中嗜热链球菌MN 002和副干酪乳杆菌Lc19的总数量约为0.5×108个/g。
实施例7
一种酸奶,其中加入有MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉,MN 002灭活菌粉中的菌种为灭活的嗜热链球菌MN 002,Lc 19灭活菌粉中的菌种为灭活的副干酪乳杆菌Lc 19,制备时直接将MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉混合到成品酸奶中即可,混合后酸奶进行分装,分装规格为200g/盒。每盒中嗜热链球菌MN 002的数量约为150亿个,副干酪乳杆菌Lc19的数量约为350亿个。
实施例8
一种酸奶,其中加入有MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉,MN 002灭活菌粉中的菌种为灭活的嗜热链球菌MN 002,Lc 19灭活菌粉中的菌种为灭活的副干酪乳杆菌Lc 19,制备时直接将MN 002灭活菌粉和Lc 19灭活菌粉混合到成品酸奶中即可,混合后酸奶进行分装,分装规格为200g/盒。每盒中嗜热链球菌MN 002的数量约为100亿个,副干酪乳杆菌Lc19的数量约为400亿个。
实验例1-改善结肠炎及特征肠道菌群试验
1、试验设计
8周龄SPF级BALB/c野生型雄性小鼠。适应1周后,自由饮水和采食。适应期结束后将小鼠随机分为6组,每组10只,分别为正常组、模型组(即DSS阳性对照组)、高剂量组、低剂量组、混合1组、混合2组,高剂量组灌胃给予本实施例1的酸奶制品,低剂量组灌胃给予本实施例2的酸奶制品,混合1组灌胃给予本实施例4的酸奶制品,混合2组灌胃给予本实施例5的酸奶制品,每组灌胃量为0.2g,正常组和DSS阳性对照组灌胃给予相同体积的生理盐水,为期7天。从第8天开始,除正常组,DSS阳性对照组灌胃0.2mL生理盐水和同时自由饮用2.5%(w/v)DSS水溶液,自由饮用7天;而试验组(即高剂量组、低剂量组、混合1组和混合2组)均灌胃0.2g产品的同时自由饮用2.5%(w/v)DSS水溶液,自由饮用7天,实验周期共14天。
在实验期间,每日称量小鼠体重、进食量和饮水量;每日观察粪便样品便血和便质情况,并计算疾病活动指数(DAI);第14天收集小鼠新鲜粪便样品,保存于-80℃用于后续菌群测定;在实验第14天处死小鼠后,采集其结肠样品,并对结肠样品进行拍照、称重、长度测量实验。
2、实验方法
(1)对DSS致急性溃疡性结肠炎小鼠的表型影响
通过小鼠粪便便血、便质和体重损失三项指标的疾病活动指数(DAI),对小鼠肠炎严重程度进行评估。
(2)对DSS致急性溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响
对粪便样品进行16S rRNA高通量测序。
(3)组织切片
实验结束时,即在实验第14天处死小鼠,采用颈椎脱臼法处死,迅速取出结肠,纵向切开,PBS清洗,测量结肠长度。取实验小鼠远端结肠组织0.6cm,于PBS中清洗3次,将各组结肠样本依次编号,分别置于1.5ml的离心管中,倒入10%的福尔马林1ml常温放置24h,固定后,采用蒸馏水冲洗2-3次,以此除去渗入到结肠样本中多余的固定液,在50℃的恒温培养箱中,依次使用体积百分数为70%、80%的乙醇水溶液脱水90min,转至95%的乙醇水溶液中脱水1h,最后于无水乙醇中脱水2次,时间均为35min,将脱水后的组织样本移至无水乙醇与二甲苯(1:1)混合液中放置45min后,转至二甲苯中保持20min,直至结肠样本呈半透明状,透明后将切片移入二甲苯与石蜡混合液(1:1)中,60℃放置30min,再在熔化的石蜡中保持3h(每隔1h更换1次石蜡)后;采用镊子将其放置到盛有石蜡的模具,并进行包埋,在40℃的水浴锅中展开6μm厚的结肠组织石蜡包埋切片,贴至洁净的载玻片上,65℃烘箱中烤片1h,连续2次将切片移入二甲苯溶液,保持10min溶去切片上的石蜡。然后依次经由:二甲苯与无水乙醇(1:1)混合液-无水乙醇(2次)-95%乙醇-85%乙醇-70%乙醇各3min后,放入蒸馏水中浸5min,采用苏木素-伊红染液;苏木素8min-自来水冲刷-1%盐酸溶液30s-自来水20min-75%、85%乙醇中各5min-伊红2min-95%、无水乙醇2次各5min-无水乙醇与二甲苯混合液(1:1)、二甲苯3次各5min,然后在光镜下观察炎症浸润情况。
(4)炎症因子检测
采用ELISA法检测血清中TNF-α,IFN-γ,IL-6,IL-4,IL-10水平,试剂盒够自南京建成生物工程研究所。
3、实验结果
(1)各组结肠炎小鼠DAI评分。
试验第14天时对各组小鼠进行DAI定量评估,各组结肠炎小鼠DAI评分如表1所示。
表1
DAI评分结果显示,模型组的评分最高,显著高于正常组和各干预组,本发明酸奶干预后,DAI评分与模型组相比显著降低(p<0.05)。
(2)对结肠炎特征肠道菌群的影响
采用第14天收集的小鼠新鲜粪便样品进行检测,检测本发明酸奶干预对小鼠粪便肠道菌群各有益菌属的相对丰度,如表2所示,各组小鼠粪便肠道菌群各有害菌属的相对丰度,如表3所示。
表2
其中,菌属1为norank_f_Muribaculaceae,菌属2为Prevotellaceae_UCG-001,菌属3为Alloprevotella,菌属4为Ruminococcaceae_UCG-014,菌属5为Lactobacillus,菌属6为Muribaculum,菌属7为Unclassified_f_Ruminococcaceae,菌属8为Akkermansia,最后一列增加数量为:与模型组比有益菌增加的数量。
对相对丰度大于1%的菌属进行分析,各组各个菌属的相对丰度变化情况如表2所示,与结肠炎相关益生菌有8种,与正常组相比,模型组有7种含量降低,与模型组相比,高剂量组和混合1组分别有8种含量增加,而低剂量组和混合2组分别有7种含量增加。
表3
菌属 | 菌属9 | 菌属10 | 菌属11 | 菌属12 | 菌属13 | 减少数量 |
正常组 | 5.08% | 3.15% | 4.17% | 0.14% | 0% | |
模型组 | 8.18% | 4.02% | 18.65% | 5.55% | 1.14% | |
高剂量组 | 1.70% | 1.24%3 | 1.09%3 | 0.37%3 | 0.28%3 | 5 |
低剂量组 | 3.47%3 | 2.83%3 | 2.75%3 | 0.64%3 | 0.51%3 | 5 |
混合1组 | 1.78%3 | 1.29%3 | 2.39%3 | 0.41%3 | 0.19%3 | 5 |
混合2组 | 3.95%3 | 2.51%3 | 3.31%3 | 0.78%3 | 0.67%3 | 5 |
其中,菌属9为Lachnospiraceae_NK4A136_group,菌属10为Alistipes,菌属11为Bacteroides,菌属12为Odoribacter,菌属13为Erysipelatoclostridium,最后一列减少数量为:与模型组比有害菌减少的数量。
通过表3可知:与结肠炎相关有害菌有5种,与正常组相比,模型组有5种含量增加,各干预组分别有5种含量降低。
上述表2和表3中的菌属在以下文件中有相应记载:
[1]Nezar Noor Al-Hebshi,Akram Thabet Nasher,Mohamed Yousef Maryoud,etal.Inflammatory Bacteriome Featuring Fusobacterium Nucleatum and PseudomonasAeruginosa Identified in Association With Oral Squamous Cell Carcinoma[J].SciRep.2017,7(1):1834.
[2]Yi Cui,Hongyun Wei,Fanggen Lu,et al.Different Effects of ThreeSelected Lactobacillus Strains in Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis inBALB/c Mice[J].PLoS One.2016,11(2):e0148241.
[3]Yvonne Konkol,Anniina Keskitalo,Heikki Vuorikoski,et al.ChronicNonbacterial Prostate Inflammation in a Rat Model Is Associated With Changesof Gut Microbiota That Can Be Modified With a Galactoglucomannan-RichHemicellulose Extract in the Diet[J].BJU Int.2019,123(5):899-908.
[4]Chien-Li Chen,Pei-Yu Hsu,Tzu-Ming Pan.Therapeutic Effects ofLactobacillus Paracasei Subsp.Paracasei NTU 101 Powder on Dextran SulfateSodium-Induced Colitis in Mice[J].J Food Drug Anal.2019,27(1):83-92。
(3)结肠组织病理切片分析
所述小鼠结肠组织HE切片如图1所示。通过图1可知:
正常组:小鼠的结肠黏膜结构保持完整,隐窝正常,腺体排列整齐,未见黏膜溃烂,无炎性细胞的浸润。
模型组:黏膜组织结构损伤明显,光镜下可见黏膜严重缺损、出血,腺体、隐窝破坏,炎症细胞浸润严重,深度达整个黏膜层,部分小鼠累及黏膜下层,表明小鼠UC模型造模成功。
高剂量组:组织结构完整,上皮细胞形态正常,未见脱落,肠腺数量丰富,排列紧密,形态正常,肠腔内可见少量脱落的上皮样细胞。
低剂量组:组织黏膜层损伤,局部肠腺结构消失,被增生的结缔组织取代,黏膜层及粘膜下层可见少量炎性细胞浸润,粘膜下层水肿,结缔组织排列疏松,间隙增宽。
混合1组:组织结构完整,上皮细胞形态正常,未见脱落,肠腺数量丰富,排列紧密,形态正常,肠腔内可见少量脱落的上皮样细胞。
混合2组:组织黏膜层损伤,肠腺数量减少,可见少量结缔组织增生,伴有少量炎性细胞浸润,粘膜下层水肿,结缔组织排列疏松,间隙增宽。
(4)炎症因子检测
对处死时获得的小鼠血液进行检测,检测小鼠血清中炎症因子的表达情况,检测结果如表5所示。
表5
通过表5中炎症因子水平可知:与对照相比,模型组中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量显著升高,抗炎因子IL-4和IL-10的表达量显著下降。与模型组相比,各干预组均显著下调了TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量,上调了IL-4和IL-10的表达量。
通过上述检测结果可知:本发明利用含嗜热链球菌MN 002的乳制品,能靶向性改善结肠炎特征肠道菌群,提升7个与结肠炎相关有益菌丰度,降低4个与结肠炎相关有害菌丰度。含嗜热链球菌MN 002的乳制品可有效保护结肠组织,及改善体内炎症状态,降低促炎因子分泌,提升抗炎因子分泌。并且,通过嗜热链球菌MN002和副干酪乳杆菌Lc 19配合,可以获得更好的改善溃疡性结肠炎及其特征肠道菌群的效果,效果十分显著。
实验例2-改善便秘及特征肠道菌群试验
参考《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》设计以下试验。
1、纳入者标准
(1)年龄18-65岁者。
(2)每周大便次数3-4次者。
(3)长期或间歇性便秘、大便不成形者优先。
(4)排便次数不规律者优先。
(5)肠胃敏感或有胃肠道疾病者优先。
2、试验设计
根据实验计划招募240人,分为四组,每组60人,受试者按照便秘症状(排便次数、粪便性状、症状持续时间等)招募,尽可能考虑到影响结果的主要因素如年龄、性别、日常饮食、便秘原因等,每个年龄段人数尽量保持均衡,以保证组内可比性。受试者每组每日分别服用实施例1-实施例2以及实施例3-实施例4中的酸奶2次,每次一盒,口服,服用量为400g/d,其中实施例1为高剂量组,实施例2为低剂量组,实施例4为混合1组,实施例5为混合2组。
3、实验方法:
(1)缓解便秘功效性观察
受试者每日记录服用受试样品的情况。
1.1每日排便次数:受试者记录每日排便次数的变化。
1.2排便状况:根据排便困难程度(腹痛或肛门烧灼感、下坠感、不适感,有否便频但排便困难而量少等症状)分为I~IV级,统计积分值。
I级(0分):排便正常。
II级(1分):仅有下坠感、不适感。
III级(2分):下坠感、不适感明显,或有便频但排便困难而量少,较少出现腹痛或肛门烧灼感。
IV级(3分):经常出现腹痛或肛门烧灼感,影响排便。
1.3粪便性状
根据布里斯托(Bristol)粪便性状分类法将粪便性状分为I~III级。
I级(0分):像香肠或蛇,平滑而且软;像香肠,但在它的表面有裂痕;软的团块,有明显的边缘(容易排出)。
II级(1分):香肠形状,但有团块;松散的块状,边缘粗糙,像泥浆状的粪便。
III级(2分):分离的硬团,像果核(不易排出)。
1.4粪便中短链脂肪酸含量
色谱条件:检测器为FID氢火焰离子检测器;FFAP毛细管色谱柱,60-80目(酸洗、硅烷化)不锈钢柱(25m×0.320mm),填充10%FFAP(硝基对苯二甲酸改性的聚乙二醇)和1%H3PO4;升温程序:80℃保持1min,以10℃/min升至140℃,保持5min,以25℃/min升至240℃,保持4min;载气(N2)压力260kPa;氮气流速为40mL/min,氢气流速为30mL/min,空气流速为400mL/min;进样量1μL;检测温度280℃。N2000色谱工作站收集信号并检测。
1.5调节便秘特征肠道菌群功能
按照《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》检测肠道菌群,对粪便内双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、拟杆菌和产气荚膜梭菌进行计数。
通过16s rDNA测序确定(Illumina Miseq平台高通量基因组测序)和重点分析对便秘肠道菌群的特征性变化。
4、实验结果
(1)排便状况变化
排便次数、排便状况积分、粪便性状积分是能反应便秘状况的有效指标。试食后与试食前比较,排便次数极显著增加(P<0.001),最后一次排便状况积分极显著降低(P<0.01),最后一次粪便性状积分极显著降低(P<0.01)。检测结果见表6。
表6
上述结果表明试食含嗜热链球菌MN 002的酸奶有利于提高排便次数,减少排便不适,形成软便改善粪便的质量。
(2)对便秘特征肠道菌群的影响
检测灭活菌粉对便秘人群粪便中五种细菌的影响,结果如表7所示。
表7
由表7可以看出,便秘人群试食本发明酸奶后,粪便中益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌的数量与试食前相比显著增加(P<0.05),有害菌肠杆菌的数量显著减少(P<0.05),其他细菌的数量与试食前相比没有显著差异(P>0.05)。
检测本发明酸奶对便秘人群优势菌门的影响,结果如表8所示。
表8
便秘人群与健康人群相比,拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度减少、厚壁菌门(Firmicutes)丰度增加、变形菌门丰度减少(Proteobacteria)。由表8所示,食用本发明酸奶后,三种优势菌门均趋于向健康人群转变,减少了便秘人群的厚壁菌门丰度,增加了拟杆菌门和变形菌门的丰度。
选取了与便秘相关的13个菌属,包括8个有益菌属和4个有害菌属。检测实施例1中酸奶对便秘特征菌群的影响,结果如表9所示。
表9
通过表9的检测结果可知:本发明酸奶提升了8个与便秘相关有益菌的丰度,降低了4个与便秘相关有害菌的丰度。结果表明本发明酸奶具有改善便秘特征性肠道菌群的效果。
上述表9中的菌种在以下文件中有相应记载
[1]Huang Lin Sheng,et al(2018).Analysis of fecal microbiota inpatients with functional constipation undergoing treatment withsynbiotics.European Journal of Clinical Microbiology&Infectious DiseasesOfficial Publication of the European Society of Clinical Microbiology 37.3.
[2]ParthasarathyG,Chen J,Chen X et al(2016)Relationship betweenmicrobiota of the colonic mucosa vs feces and symptoms,colonic transit,andmethane production in female patients with chronicconstipation.Gastroenterology 150(2):367–379.
[3]Khalif IL,Quigley EM,Konovitch EA,Maximova ID(2005)Alterations inthe colonic flora and intestinal permeability and evidence of immuneactivation in chronic constipation.Dig Liver Dis 37(11):838–849。
(3)对便秘人群短链脂肪酸的影响
短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)含量是益生菌缓解便秘效果的重要评价指标,SCFAs能通过降低肠道pH值抑制致病菌的生长,促进有益菌的增殖,从而改善肠道微环境,缓解结肠炎症,从而缓解便秘。SCFAs同时也是肠道微生态与慢性便秘关系的重要靶点。在近端结肠端,丁酸能加快结肠长传播频率,抑制短传播频率,乙酸、丙酸均抑制长短传播,而在远端结肠端,丁酸加快结肠推进速度,丙酸减慢结肠推进速度。检测本发明酸奶干预前后,对便秘人群短链脂肪酸的影响,检测结果如表10所示。
表10
通过表10可知:本发明乳制品干预前后,乙酸含量(μg/g)增加36%,丙酸(μg/g)增加47%,丁酸(μg/g)增加23%,总酸(乙酸、丙酸、丁酸含量的总和)增加36%。人群试食前后,乙酸、丙酸、丁酸、总酸含量均上升。
通过上述表5~表10的检测结果可知:本发明的乳制品能靶向性改善便秘特征肠道菌群,提升8个与便秘相关有益菌丰度,降低4个与便秘相关有害菌丰度,显著提升肠道菌群代谢产物短链脂肪酸的含量。同时,本发明的乳制品还能显著提高便秘人群的排便次数及改善排便性状。尤其是,通过嗜热链球菌MN002和副干酪乳杆菌Lc 19配合,可以获得更好的改善功能性便秘及其特征肠道菌群的作用,效果更加显著。
上述实施例3的酸奶在改善结肠炎、结肠炎特征肠道菌群、结肠炎以及便秘的特征肠道菌群的效果上与实施例1的效果基本相当,上述实施例6的酸奶在上述效果上与实施例5的效果基本相当,上述实施例7-8的酸奶在上述效果上与实施例4的效果基本相当。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)MN002在制备以下任一产品中的用途:
A、改善结肠炎及其特征肠道菌群的产品;
B、改善便秘及其特征肠道菌群的产品;
所述嗜热链球菌MN002于2010年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.3817;所述嗜热链球菌MN002为灭活的嗜热链球菌MN002;
所述产品为乳制品。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述产品为酸奶制品。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述产品中嗜热链球菌MN002的数量为105~1011个/g。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述产品中嗜热链球菌MN002的数量为108~1010个/g。
5.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,还包括灭活的副干酪乳杆菌,所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌Lc 19,其于2019年05月20保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号是CGMCC NO.17827。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述副干酪乳杆菌Lc 19的数量为105~1011个/g。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述副干酪乳杆菌Lc 19的数量为108~1010个/g。
8.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述嗜热链球菌MN002与副干酪乳杆菌Lc19之间的数量比为(1:10)~(10:1)。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述嗜热链球菌MN002与副干酪乳杆菌Lc19之间的数量比为(1:4)~(4:1)。
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