CN113197249B - 一种包括副干酪乳杆菌Lc19的酸奶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种包括副干酪乳杆菌Lc19的酸奶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包括副干酪乳杆菌Lc19的酸奶及其制备方法和应用，该酸奶包含副干酪乳杆菌Lc19，其已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号是CGMCC NO.17827，该酸奶不仅对便秘和结肠炎具有显著的疗效，而且能够靶向改善多种便秘和结肠炎特征性的肠道相关菌群，提升多种有益菌丰度，降低多种有害菌丰度，维持肠道菌群的平衡，从根本上恢复肠道菌群的健康化、多样化，具有食用方便、治疗简单、缓解率高、无毒副作用的优点。

Description

一种包括副干酪乳杆菌Lc19的酸奶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于酸奶加工技术领域，具体涉及一种酸奶及其制备方法和应用。
背景技术
酸奶是以乳为原料，杀菌后经乳酸发酵而成，其口味酸甜细滑，营养丰富，其营养价值要好于鲜牛奶和各种奶粉。
炎症性肠病(IBD)是一种世界性流行病，主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病等。便秘(constipation)是多种疾病的一种症状，常见症状是排便次数明显减少，每周排便次数少于3次，粪质干硬，常伴有排便困难感(包括排便费力、排出困难、排便不尽感、排便费时及需手法辅助排便)的病理现象，功能性便秘指非全身疾病或肠道疾病所引起的原发性持续性便秘。肠道菌群紊乱、菌群多样性降低是导致便秘和炎症性肠病发生的主要因素。与正常人的肠道菌群比较，便秘患者肠道菌群的改变主要表现为专性厌氧菌相对减少(如乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌属等)和潜在致病菌相对增多(如铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、腐败梭菌等)。与正常人的肠道菌群比较，IBD患者肠道中的致病菌如肠球菌、拟杆菌类等数量及比例明显增多，而乳杆菌及双歧杆菌等有益菌减少。正常人肠道内厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门占90％以上，结肠炎患者中的肠道菌群多样性下降，导致有益菌多样性和丰度减少，而条件致病菌和有害菌所占比例增大。
传统的便秘治疗和炎症性肠病治疗均无法靶向作用于肠道内与疾病相关的特征菌群，具有安全性低、疗效差、病情易反复等缺陷。因此，提供一种能够靶向作用于肠道内与疾病相关的特征菌群的食品，尤其是酸奶对于改善便秘和结肠炎等与肠道菌群异常的疾病具有重要意义。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中便秘治疗和炎症性肠病治疗无法靶向作用于肠道内与疾病相关的特征菌群而使得其对于肠道菌群多样性的恢复能力低下，导致安全性低、疗效差、病情易反复的问题，从而提供一种酸奶及其制备方法和应用。
本发明提供了一种酸奶，所述酸奶的发酵菌种包括副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)Lc19，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国普通微生物菌种保藏中心)，保藏地址：为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号是CGMCC NO.17827，保藏日期是2019年05月20日。
进一步地，所述酸奶中所述副干酪乳杆菌Lc19的含量为≥10-7个/g。
优选地，所述酸奶中所述副干酪乳杆菌Lc19的含量为5×107-3×109个/g。
更优选地，所述酸奶中所述副干酪乳杆菌Lc19的含量为5×107-3×108个/g。
进一步地，所述酸奶中加入的副干酪杆菌Lc19为活菌微生物制剂，包括但不局限于所述副干酪乳杆菌Lc19的处理物为副干酪乳杆菌Lc19的培养物、浓缩物、干燥物和稀释物中的至少一种。
进一步地，所述酸奶中加入所述副干酪乳杆菌Lc19菌粉；以所述酸奶的总质量计，加入所述副干酪乳杆菌Lc19菌粉的质量百分数≥0.05％。
进一步地，以所述酸奶的总质量计，加入所述副干酪乳杆菌Lc19菌粉的质量百分数为0.05-0.6％。
本发明还提供了上述任一所述的酸奶的制备方法，包括将杀菌后的原料乳降温，接种发酵菌种保温发酵的过程。
进一步地，所述发酵的温度为30-45℃，时间为5-20小时。
本发明还提供了副干酪乳杆菌Lc19在制备促进恢复肠道菌群多样化和/或健康化的发酵乳制品中的应用。
优选地，所述发酵乳制品为上述任一所述的酸奶。
本发明还提供了副干酪乳杆菌Lc19在制备改善便秘和/或改善炎症性肠病的发酵乳制品中的应用，
优选地，所述发酵乳制品为上述任一所述的酸奶。
进一步地，所述便秘为功能性便秘，所述炎症性肠病为结肠炎。
进一步地，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。
本发明相对现有技术具有如下优点：
1.本发明提供的酸奶，所述酸奶的发酵菌种包括副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)Lc19，其已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCCNO.17827，该酸奶不仅对便秘和结肠炎具有显著的疗效，而且能够靶向改善多种便秘和结肠炎特征性的肠道相关菌群，提升多种有益菌丰度，降低多种有害菌丰度，维持肠道菌群的平衡，从根本上极大提高了恢复肠道菌群的健康化、多样化的能力，具有食用方便、治疗简单、缓解率高、无毒副作用的优点。
2.本发明提供的酸奶，包括副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19，其已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCCNO.17827，该酸奶能够靶向提升便秘患者肠道内的多种与排便次数、排便状况及粪便性状相关的有益菌的丰度，抑制多种与排便次数、排便状况及粪便相关的炎症性有害菌的丰度，还能显著提升结肠炎小鼠模型肠道内的多种与结肠炎相关有益菌的丰度，降低多种与结肠炎相关有害菌的丰度，靶向作用于肠道内与疾病相关的特征菌群，极大程度上促进便秘或者结肠炎特征性肠道菌群的健康化、多样化，表明包含副干酪乳杆菌Lc19的酸奶具有显著的改善便秘和结肠炎的作用。
3.本发明提供的酸奶，发酵菌种为副干酪乳杆菌Lc19菌粉，具有优良的耐热性和pH稳定性，易加工，不受食品形式限制，而且含菌量稳定，品质易控制，且不污染生产线；此外还不用冷藏，不受生产、运输等外界条件影响；不受抗生素影响，且无耐药基因转移风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实验例2中正常组小鼠的结肠组织切片的HE染色；
图2为实验例2中模型组小鼠的结肠组织切片的HE染色。
图3为实验例2中低剂量Lc 19酸奶组小鼠的结肠组织切片的HE染色。
图4为实验例2中高剂量Lc 19酸奶组小鼠的结肠组织切片的HE染色。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
其中下述实施例中采用的MRS培养基和菌体保护剂溶液的组成如下：
MRS培养基的组成是：大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、葡萄糖20g、吐温801ml、磷酸二氢钠2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、硫酸锰0.02g、硫酸镁0.1g和蒸馏水1L，调pH至6.2，加入琼脂15g，混合，在121℃下灭菌15min；菌体保护剂溶液的组成是：脱脂乳8g、海藻糖5g、甘油5g、维生素C0.05g、蒸馏水81.95g。
实施例1本发明的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19的分离
称取0.1g健康广西巴马长寿老人的粪便样品至900μl无菌PBS中混匀，制得粪便菌悬液。分别取100μl粪便菌悬液加入到适量PBS溶液中进行稀释，得到稀释度为10-1、10-3、10-5的样品稀释液，分别吸取各样品稀释液涂布于改良MRS培养基平板内，至平板完全吸收后，在37℃条件下培养48h，待菌落形成后，挑选能产生透明钙圈的目标菌株接种至MRS培养基上进行三次以上纯化，直至获得纯菌株。将MRS培养基上纯化好的菌株接种至新的MRS培养基中，在37℃下培养24h，提取菌株基因组DNA通过16S rDNA测序分析，该菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，命名为副干酪乳杆菌Lc19。取MRS菌株培养液750μl，与750μl的40％甘油水溶液加入无菌冻存管冻存，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号是CGMCCNO.17827，保藏日期是2019年05月20日。
实施例2
本实施例提供一种Lc19菌粉的制备方法，具体包括以下步骤：
向MRS培养基中接种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)Lc19(保藏编号是CGMCC NO.17827)，接种量为2％，37℃下静置培养16h，培养至对数期，活菌数达到109cfu/mL，转速为6000rpm下离心2.5h，收集湿菌体，加入上述菌体保护剂溶液，菌体保护剂溶液加入质量为湿菌体质量的5倍，得到浓缩菌液，将浓缩菌液在-50℃下冷冻真空干燥24h，得到Lc19菌粉，其中Lc19菌粉的菌数为3×1011cfu/g。
实施例3含Lc19菌粉的酸奶
本实施例提供了一种含灭活Lc19菌粉的酸奶及其制备方法，该酸奶的原料组成包括：生牛乳：92.53kg、羟丙基二淀粉磷酸酯：1kg、果胶：0.2kg、白砂糖：6kg、实施例2制得的Lc19菌粉：0.1kg。
本实施例的酸奶的制备方法包括如下步骤：将生牛乳进行标准化，杀菌后加入羟丙基二淀粉磷酸酯、果胶、白砂糖混合，加入灭活Lc19菌粉接种，依次经发酵、破乳、杀菌，冷却，无菌灌装，即得。检测发酵结束后酸奶中副干酪乳杆菌Lc19含量为：1.25×108个/g。
其中，发酵的温度为43℃，时间为6.5h；破乳的转速为25rpm，时间为5min；杀菌为巴氏杀菌，杀菌条件为温度75℃，时间25s；冷却温度为20℃，无菌灌装的条件为温度25℃，氮气浓度99.999％，氮气压力1.5bar，氮气流量1.5slm。
实施例4
本实施例提供了一种含灭活Lc19的酸奶及其制备方法，该酸奶的原料组成包括：生牛乳：92.53kg、羟丙基二淀粉磷酸酯1kg、果胶：0.2kg、白砂糖：6kg、实施例2制得的Lc19菌粉：0.05g。
本实施例的酸奶的制备方法包括如下步骤：将生牛乳进行标准化，杀菌后加入羟丙基二淀粉磷酸酯、果胶、白砂糖混合，加入灭活Lc19菌粉和灭活Mn002菌粉接种，依次经发酵、破乳、杀菌，冷却，无菌灌装，即得。检测发酵结束后酸奶中副干酪乳杆菌Lc19含量为5×107个/g。
其中，发酵的温度为43℃，时间为6.5h；破乳的转速为25rpm，时间为5min；杀菌为巴氏杀菌，杀菌条件为温度75℃，时间25s；冷却温度为20℃，无菌灌装的条件为温度25℃，氮气浓度99.999％，氮气压力1.5bar，氮气流量1.5slm。
实施例5
本实施例提供了一种含灭活Lc19的酸奶及其制备方法，该酸奶的原料组成包括：生牛乳：92.53kg、羟丙基二淀粉磷酸酯1kg、果胶：0.2kg、白砂糖：6kg、实施例2制得的Lc19菌粉：0.5g。
本实施例的酸奶的制备方法包括如下步骤：将生牛乳进行标准化，杀菌后加入羟丙基二淀粉磷酸酯、果胶、白砂糖混合，加入灭活Lc19菌粉接种，依次经发酵、破乳、杀菌，冷却，无菌灌装，即得。检测发酵结束后酸奶中副干酪乳杆菌Lc19含量为2.5×108个/g。
其中，发酵的温度为43℃，时间为6.5h；破乳的转速为25rpm，时间为5min；杀菌为巴氏杀菌，杀菌条件为温度75℃，时间25s；冷却温度为20℃，无菌灌装的条件为温度25℃，氮气浓度99.999％，氮气压力1.5bar，氮气流量1.5slm。
实验例1临床实验
1、受试对象
招募患有便秘疾病的受试者160人为研究对象，纳入者标准如下：
(1)年龄18-65岁者；
(2)每周大便次数3-4次者；
(3)长期或间歇性便秘、大便不成形者优先；
(4)排便次数不规律者优先；
(5)肠胃敏感或有胃肠道疾病者优先。每个年龄段人数尽量保持均衡，以保证组内可比性。
2、食用剂量和时间
将受试者随机分为两组，每组80人，分别为低剂量组和高剂量组，其中：低剂量组食用按照实施例4的方法制得的含灭活Lc19菌粉的酸奶(以下简称“含Lc19酸奶”，200g/盒)，其包含副干酪乳杆菌Lc19的菌数为100亿个/盒，高剂量组食用按照实施例5的方法制得的含灭活Lc19菌粉的酸奶(以下简称“含Lc19酸奶”，200g/盒)，其包含副干酪乳杆菌Lc19的菌数为500亿个/盒，两组受试者均采用每日2次，每次1盒，服用量每日400g的方式食用，口服，试验周期21天。
3、实验方法
(1)气相色谱检测法测定受试者粪便中短链脂肪酸含量
分别取食用酸奶之前的受试者的新鲜粪便样品(干预前)和受试者食用酸奶21天后的新鲜粪便样品(干预后)，然后按照下述方法测定粪便样品中短链脂肪酸含量，计算平均值。
短链脂肪酸标准曲线的建立：用容量瓶配制含有5mmol/L乙酸、5mmol/L丙酸、5mmol/L丁酸、5mmol/L庚酸的乙醚溶液，采用倍比稀释的方法，得到分别含有2.5,1.25,0.625,0.312,0.156mmol/L的乙酸、丙酸、丁酸、庚酸的标准溶液。分别移取1μL标准液作气相色谱分析，每个浓度重复测定3次，得到各浓度的峰面积与对应浓度，从而制作标准曲线，并求得回归方程和相关系数。
确定检测粪便样品中SCFA浓度的色谱条件：检测器为FID氢火焰离子检测器；色谱柱为60-80目(酸洗、硅烷化)不锈钢柱(25m×0.320mm)，涂渍填充10％FFAP(硝基对苯二甲酸改性的聚乙二醇)和1％H3PO4；升温程序：50℃保持1min，以10℃/min升至140℃，保持1min，以30℃/min升至240℃，保持2min；载气(N2)压力260kPa；氮气流速为40mL/min，氢气流速为40mL/min，空气流速为400mL/mi；进样量2μL；检测温度230℃。N2000色谱工作站收集信号并检测。
粪便中短链脂肪酸的提取和测定：在1.5mL螺口收集管内加入适量玻璃珠(2～3mm)，加入1mL含有庚酸(浓度为1mmol/L)的乙醚溶液和50μL的盐酸溶液(浓度为1mmol/L)，称重。用镊子向收集管中小心加入粪便样品(约0.1-0.2g)，再称次重，记录加入粪便的重量。配平后用均质机匀浆1min，10000r/min离心2min。转移上清液有内插管的进样瓶中。因乙醚具有强挥发性，上述操作均需在冰浴或低温条件下快速进行。
按照上述气相色谱条件进行测量，计算对应短链脂肪酸的峰面积，采用外标法做出标准曲线，用内标庚酸浓度进行修正，测定上清液中乙酸、丙酸和丁酸浓度，并换算出其在粪便样品中的含量。
(2)靶向改善便秘特征肠道菌群的验证
肠道菌群检测：分别取各组受试者食用Lc19菌粉之前的新鲜粪便样品(干预前)和各组受试者食用Lc19菌粉21天后的新鲜粪便样品(干预后)，按照《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》检测肠道菌群，并委托上海美吉生物DNA测序公司通过16s rDNA测序(Illumina Miseq平台高通量基因组测序)对上述粪便样品进行测试，以确定和重点分析便秘肠道菌群的特征性变化。
(3)排便状况观察
记录受试者每日排便次数和排便状况，并观察粪便性状，并对排便状况和性质按下述方法进行统计积分。
其中，根据排便困难程度(腹痛或肛门烧灼感、下坠感、不适感，有否便频但排便困难而量少等症状)将排便状况分为I-IV级，统计积分值。
I级(0分)：排便正常。
II级(1分)：仅有下坠感、不适感。
III级(2分)：下坠感、不适感明显，或有便频但排便困难而量少，较少出现腹痛或肛门烧灼感。
IV级(3分)：经常出现腹痛或肛门烧灼感，影响排便。
将粪便性状根据根据布里斯托(Bristol)粪便性状分类法分为I-III级，统计积分值。
I级(0分)：像香肠或蛇，平滑而且软；像香肠，但在它的表面有裂痕；软的团块，有明显的边缘(容易排出)。
II级(1分)：香肠形状，但有团块；松散的块状，边缘粗糙，像泥浆状的粪便。
III级(2分)：分离的硬团，像果核(不易排出)。
4、实验结果
(1)对短链脂肪酸的影响
短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)含量是益生菌缓解便秘效果的重要评价指标，SCFAs是肠道微生态与慢性便秘关系的重要靶点。在近端结肠端，丁酸能加快结肠长传播频率，抑制短传播频率，乙酸、丙酸均抑制长短传播，而在远端结肠端，丁酸加快结肠推进速度，丙酸减慢结肠推进速度。
如表1所示，低剂量组干预后，乙酸含量增加36.32％，丙酸增加42.03％，丁酸增加23.91％，总酸(乙酸、丙酸、丁酸含量的总和)增加36.97％，高剂量组干预后，乙酸含量增加42.23％，丙酸增加54.54％，丁酸增加41.86％，总酸(乙酸、丙酸、丁酸含量的总和)增加45.09％。人群试食低剂量组或高剂量组酸奶之后，乙酸、丙酸、丁酸、总酸含量均上升。
表1酸奶对便秘人群短链脂肪酸的影响
(2)对便秘特征肠道菌群的影响
选取与便秘相关的9种有益菌属，便秘人群与健康人群相比，下述9种有益菌属的丰度均有不同程度的降低，从表2可以看出，本发明低剂量组酸奶和高剂量组酸奶均能够提升了9个与排便状况相关有益菌的丰度，8个粪便性状相关有益菌的丰度，提升了8个与排便次数相关有益菌的丰度。
表2含Lc19酸奶对便秘人群粪便中肠道菌群水平的影响
选取与便秘相关的4种有害菌属，便秘人群与健康人群相比，下述4种有害菌属的丰度均有不同程度的提升，从表3可以看出，本发明低剂量酸奶组和高剂量酸奶组均有效降低了4个与排便次数相关的有害菌的丰度，降低了3个与粪便性状相关有害菌的丰度，降低4个与排便状况相关有益菌的丰度。
表3含Lc19酸奶对便秘人群粪便中肠道菌群水平的影响
便秘人群与健康人群相比，拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度减少、厚壁菌门(Firmicutes)丰度增加、变形菌门丰度减少(Proteobacteria)。由表4所示，食用含Lc19酸奶后，三种优势菌门均趋于向健康人群转变，含Lc19酸奶减少了便秘人群的厚壁菌门丰度，增加了拟杆菌门和变形菌门的丰度。
表4含Lc19酸奶对便秘人群优势菌门的影响
本发明中便秘特征肠道菌群的有益菌属和有害菌属可以参照下述文献：Huang,Lin Sheng,et al(2018).Analysis of fecal microbiota in patients withfunctional constipation undergoing treatment with synbiotics.European Journalof Clinical Microbiology&Infectious Diseases Official Publication of theEuropean Society of Clinical Microbiology 37.3.
Khalif IL,Quigley EM,Konovitch EA,Maximova ID(2005)Alterations in thecolonic flora and intestinal permeability and evidence of immune activationin chronic constipation.Dig Liver Dis 37(11):838–849.
(3)对排便状况的影响
如表5所示，含Lc19酸奶干预前后比较，排便次数显著增加，排便状况和粪便性状积分均显著改善(P<0.001)。结果表明含Lc19酸奶可提高便秘人群的排便次数，减少排便不适，形成软便，从而显著改善排便状况。
表5试食前后排便情况比较
综上所述，本发明制得的酸奶能靶向提升与排便状况、排便次数及粪便性状相关的有益菌群的丰度，抑制与排便状况、排便次数及粪便性状相关的炎症性有害菌群丰度，维持肠道菌群的平衡，恢复肠道菌群的健康化，达到显著改善患者便秘情况的效果；而且本发明的酸奶还能够显著提升肠道菌群代谢产物短链脂肪酸的含量，显著改善便秘人群的排便状况。
实验例2动物实验
1、试验方法
(1)实验动物与分组处理
8周龄SPF级BALB/c野生型雄性小鼠，19±1g，自由饮水和采食，适应1周。适应期结束后将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常组、DSS(葡聚糖硫酸钠)阳性对照组、低剂量Lc19酸奶组和高剂量Lc19酸奶组，除正常组外，其他各组按照如下处理，其中，低剂量Lc19酸奶组按小鼠体重灌胃给予实施例4的酸奶0.4g，灌胃体积为0.4ml，高剂量Lc19酸奶组按小鼠体重灌胃给予实施例5的酸奶0.4g，灌胃体积为0.4ml，DSS阳性对照组灌胃给予相同体积的2.5％(w/v)DSS水溶液，为期7天，从第8天开始，除正常组，DSS阳性对照组灌胃0.2mL生理盐水和同时自由饮用2.5％(w/v)DSS水溶液，自由饮用7天；而试验组灌胃0.2mL产品的同时自由饮用2.5％(w/v)DSS水溶液，自由饮用7天，实验周期共14天。
(2)在实验期间，每日称量小鼠体重、进食量和饮水量，每日观察粪便样品便血和便质情况，并通过疾病活动指数(DAI)对各组小鼠实验第14天1的粪便便血、便质和体重下降三项指标定量评分，具体评分标准见下表。
表6结肠炎疾病活动指数
(3)在实验第14天收集各组小鼠的新鲜粪便样品，委托上海美吉生物DNA测序公司对粪便样品进行16SrRNA高通量测序，以测定本发明的酸奶对DSS致急性溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响。
(4)炎症因子检测
实验结束后，对小鼠用乙醚麻醉摘眼球快速采集血液样本，采用TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-4，IL-10ELISA检测试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)并按照试剂盒说明书的方法分别检测血清中TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-4，IL-10水平。
(5)HE染色
在实验第14天处死小鼠，采用颈椎脱臼法处死，迅速取出结肠，纵向切开，PBS清洗，测量结肠长度。取实验小鼠远端结肠组织0.6cm，于PBS中清洗3次，将各组结肠样本依次编号，分别置于1.5ml的离心管中，倒入10％的福尔马林1ml常温放置24h，固定后，采用蒸馏水冲洗2-3次，以此除去渗入到结肠样本中多余的固定液，在50℃的恒温培养箱中，依次使用体积百分数为70％、80％的乙醇水溶液脱水90min，转至95％的乙醇水溶液中脱水1h，最后于无水乙醇中脱水2次，时间均为35min，将脱水后的组织样本移至无水乙醇与二甲苯(1：1)混合液中放置45min后，转至二甲苯中保持20min，直至结肠样本呈半透明状，透明后将切片移入二甲苯与石蜡混合液(1：1)中，60℃放置30min，再在熔化的石蜡中保持3h(每隔1h更换1次石蜡)后；采用镊子将其放置到盛有石蜡的模具，并进行包埋，在40℃的水浴锅中展开6μm厚的结肠组织石蜡包埋切片，贴至洁净的载玻片上，65℃烘箱中烤片1h，连续2次将切片移入二甲苯溶液，保持10min溶去切片上的石蜡。然后依次经由：二甲苯与无水乙醇(1：1)混合液-无水乙醇(2次)-95％乙醇-85％乙醇-70％乙醇各3min后，放入蒸馏水中浸5min，采用苏木素-伊红染液；苏木素8min-自来水冲刷-1％盐酸溶液30s-自来水20min-75％、85％乙醇中各5min-伊红2min-95％、无水乙醇2次各5min-无水乙醇与二甲苯混合液(1：1)、二甲苯3次各5min，然后在光镜下观察炎症浸润情况。
2、试验结果
(1)各组结肠炎小鼠的DAI评分结果
从下表可以看出，模型组小鼠的DAI评分最高，显著高于正常组、低剂量Lc19酸奶组和高剂量Lc19酸奶组，低剂量Lc19酸奶组和高剂量Lc19酸奶组小鼠的DAI评分与模型组相比显著降低，且灭活含Lc19酸奶对小鼠结肠炎的改善效果呈现剂量依赖性。
表7各组结肠炎小鼠DAI评分(n＝9)
分组 DAI(day14)
正常组 0.12±0.16
模型组 2.39±0.25a
低剂量Lc19酸奶组 1.94±0.39b
高剂量Lc19酸奶组 1.69±0.20b
其中，b表示与模型组相比，p<0.05；a表示与正常组组相比，p<0.05。
(2)结肠长度测定
表8各组结肠长度测定
分组 结肠长度(cm)
正常组 11.24±0.37
模型组 9.19±0.21
低剂量Lc19酸奶组 10.02±0.39
高剂量Lc19酸奶组 10.48±0.17
处死小鼠当日观察记录各组小鼠结肠病变情况，解剖之后取出的各组小鼠结肠长度如表8所示，发现正常组小鼠结肠长度最长、肠道组织完好、肠腔内粪便成形；模型组小鼠结肠长度最短，肠壁变薄，肠腔内可见不成形便，部分小鼠肠腔内有暗红色血便；与模型组相比，各干预组的结肠长度显著改善。
(2)对结肠炎特征肠道菌群的影响
表9各组小鼠粪便肠道菌属中的有益菌属的相对丰度(％)
对相对丰度大于0.8％的菌属进行分析，各组各个菌属的相对丰度变化情况如表9所示，与结肠炎相关益生菌有8种，与正常组相比，模型组有7种含量降低，与模型组相比，低剂量Lc19组和高剂量Lc19酸奶组均有6种有益菌丰度升高。
表10各组小鼠粪便肠道菌群中的有害菌属的相对丰度(％)
与结肠炎相关的有害菌有5种，与正常组相比，模型组有5种有害菌的丰度增加，而低剂量Lc19酸奶组和高剂量Lc19酸奶组均有4种有害菌的丰度降低。
本发明中结肠炎特征肠道菌群的有益菌属和有害菌属可以参照下述文献：NezarNoor Al-Hebshi,Akram Thabet Nasher,Mohamed Yousef Maryoud,et al.InflammatoryBacteriome Featuring Fusobacterium Nucleatum and Pseudomonas AeruginosaIdentified in Association With Oral Squamous Cell Carcinoma[J].Sci Rep.2017,7(1):1834.
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(3)对结肠组织切片的HE染色结果
如图1-4所示，正常组小鼠的结肠黏膜结构保持完整，隐窝正常，腺体排列整齐，未见黏膜溃烂，无炎性细胞的浸润。模型组小鼠的结肠黏膜组织结构损伤明显，光镜下可见黏膜严重缺损、出血，腺体、隐窝破坏，炎症细胞浸润严重(见图2箭头处)，深度达整个黏膜层，部分小鼠累及黏膜下层，表明小鼠UC模型造模成功。低剂量Lc19酸奶组小鼠的组织黏膜层损伤，局部肠腺结构消失，被增生的结缔组织取代，伴有少量炎性细胞浸润。高剂量Lc19酸奶组小鼠的组织结构完整，上皮细胞形态正常，未见脱落，肠腺数量丰富，排列紧密，形态正常，肠腔内可见少量脱落的上皮样细胞。
综上，低剂量Lc19和高剂量Lc19均可有效保护结肠组织结构完整性，减少炎症细胞浸入。
(4)对炎症因子表达情况的影响
表11小鼠血清中炎症因子的表达情况
用ELISA法测定了小鼠血清中的的炎症因子水平，与对照相比，模型组中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量显著升高，抗炎因子IL-4和IL-10的表达量显著下降。与模型组相比，低剂量Lc19和高剂量Lc19均显著下调促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量，上调抗炎因子IL-4和IL-10的表达量，从而显著小鼠体内的炎症水平。
综上所述，本发明制得的酸奶中含副干酪乳杆菌Lc19的灭活菌粉，可以靶向性改善结肠炎特征肠道菌群，提升与结肠炎相关有益菌丰度，降低与结肠炎相关有害菌丰度，恢复肠道菌群的健康化，达到显著改善小鼠溃疡性结肠炎(UC)的效果；本发明制得的酸奶中含副干酪乳杆菌Lc19的灭活菌粉，能通过降低促炎因子分泌，提升抗炎因子分泌，改善体内炎症状态；通过上调结肠组织紧密连接蛋白的表达，维持结肠组织的完整性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (12)

1.一种酸奶，其特征在于，所述酸奶的发酵菌种包括灭活副干酪乳杆菌Lc19，所述副干酪乳杆菌Lc19已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号是CGMCC NO.17827，所述酸奶中所述副干酪乳杆菌Lc19的含量为≥107个/g。
2.根据权利要求1所述的酸奶，其特征在于，所述酸奶中所述副干酪乳杆菌Lc19的含量为5×107-3×109个/g。
3.根据权利要求1所述的酸奶，其特征在于，以所述酸奶的总质量计，加入副干酪乳杆菌Lc19菌粉的质量百分数≥0.05％。
4.根据权利要求3所述的酸奶，其特征在于，以所述酸奶的总质量计，加入所述副干酪乳杆菌Lc19菌粉的质量百分数为0.05-0.6％。
5.权利要求1-3中任一所述的酸奶的制备方法，其特征在于，包括将杀菌后的原料乳降温，接种所述发酵菌种保温发酵的过程。
6.根据权利要求5所述的酸奶的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为30-45℃，时间为5-20小时。
7.灭活副干酪乳杆菌Lc19在制备促进恢复肠道菌群多样化和/或健康化的发酵乳制品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述发酵乳制品为权利要求1-3中任一所述的酸奶。
9.灭活副干酪乳杆菌Lc19在制备改善便秘和/或改善炎症性肠病的发酵乳制品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述发酵乳制品为权利要求1-3中任一所述的酸奶。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征在于，所述便秘为功能性便秘，所述炎症性肠病为结肠炎或克罗恩病。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。
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