CN113913346B - 一种副干酪乳杆菌jn-1及其应用 - Google Patents

一种副干酪乳杆菌jn-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种副干酪乳杆菌JN‑1及其应用，本发明的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN‑1，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。本发明的副干酪乳杆菌JN‑1在胃肠液中模拟消化存活率达到82％，且耐胆盐特性强，在胆盐浓度达到0.6％时，ABS能够达到14.08，此外，本发明的副干酪乳杆菌JN‑1在体外具有较强的抑菌性，对金黄色葡萄球菌均呈现出明显的抑菌效应，表现出较好的抑制作用。本发明的副干酪乳杆菌JN‑1具有强的胃肠道消化系统的抗性及对胆盐耐受能力，能够应用于预防和治疗自发性肠炎，具有功能和风味俱佳的效果。

Description

一种副干酪乳杆菌JN-1及其应用
技术领域
本发明涉及一种副干酪乳杆菌JN-1及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
肠炎是一种慢性的，自发性、反复发作的黏膜炎症病变。目前在工业化生活方式的国家中发病率逐年升高，这表明饮食生活习惯对疾病发生具有重要影响。西式饮食中高摄入量的碳水化合物和红肉，以及低含量的膳食纤维摄入已被认为是肠炎发病的重要因素。治疗肠炎的药物主要为氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素等，但药物治疗对人体的副作用大，而且长期的服药会给肝，肾器官增加一定的负担。
乳酸菌常以发酵乳制品，保健品，饮料等形式出现。乳酸菌可以改善风味，还能提供多种功能营养成分。此外，益生菌是天然、安全、有效的胃肠道疾病干预手段，其中乳酸菌在各种胃肠道和炎症疾病中显示出许多有益的作用。通过增加有益细菌的数量，以及由于竞争作用而减少病原菌的数量，从而改善病灶。此外，乳酸杆菌可降低炎症因子的级联反应，可减轻炎症反应。
虽然目前有较多的能够耐受胃酸的乳酸杆菌，但是目前的乳酸杆菌对于胃肠道消化系统，尤其是肠道消化系统的抗性较弱，以及对胆盐的耐受能力较弱，到达肠道后，对肠道中的炎症的治疗效果较差，往往需要复配不同的菌株进行治疗，但是不同菌株之间的复配较为复杂，且受到不同菌株活性效果的影响，导致实际治疗效果并不理想。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种副干酪乳杆菌JN-1及其应用，本发明的副干酪乳杆菌JN-1具有强的胃肠道消化系统的抗性及对胆盐耐受能力，能够应用于预防和治疗自发性肠炎。
本发明的第一个目的是提供一种副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-1，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.22745。
进一步地，所述的副干酪乳杆菌在胃肠液中模拟消化存活率达到82％。
进一步地，所述的副干酪乳杆菌具有较强的胆盐耐受特性。
进一步地，所述的副干酪乳杆菌体外抑菌性较强。
本发明的第二个目的是提供一种所述的副干酪乳杆菌在制备治疗自发性肠炎的产品中的应用。
进一步地，所述的应用是将所述的副干酪乳杆菌制备成含有所述的副干酪乳杆菌的药品。
进一步地，所述的药品为口服制剂。
进一步地，所述的产品为含有所述的副干酪乳杆菌的冻干菌粉。
进一步地，所述的冻干菌粉中，副干酪乳杆菌的活菌数不低于1×108CFU/g。
进一步地，所述的冻干菌粉通过如下方法制备得到：
(1)菌种的活化：将所述的副干酪乳杆菌JN-1接种量接种于MRS固体培养基中，35～38℃培养24～48h，获得菌株单菌落；
(2)初级种子液制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-1单菌落，接种于MRS液体培养基中，35～38℃厌氧培养20～28h，得到初级种子液；
(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以2～4％的接种量接种于液体MRS培养基中，35～38℃厌氧培养20～48h，得到发酵液；
(4)菌体收集：将得到的发酵液2000～6000rpm/min离心5～20min，收集并洗涤菌体，得到副干酪乳杆菌JN-1菌体；
(5)菌体冻干：向收集到的副干酪乳杆菌JN-1菌体进行冷冻干燥，得到所述的冻干菌粉。
进一步地，MRS固体培养基：胰蛋白胨8～12g/L；酵母粉4～6g/L；牛肉膏8～12g/L；葡萄糖15～25g/L；柠檬酸氢二胺1～3g/L；乙酸钠4～6g/L；K2HPO4·3H2O 2.5～2.7g/L；MgSO4·7H2O 0.1～0.3g/L；MnSO4·4H2O 0.04～0.06g/L；吐温80 0.8～1.2mL/L；1.5～2％的琼脂粉。
进一步地，MRS液体培养基：胰蛋白胨8～12g/L；酵母粉4～6g/L；牛肉膏8～12g/L；葡萄糖15～25g/L；柠檬酸氢二胺1～3g/L；乙酸钠4～6g/L；K2HPO4·3H2O 2.5～2.7g/L；MgSO4·7H2O 0.1～0.3g/L；MnSO4·4H2O 0.04～0.06g/L；吐温80 0.8～1.2mL/L。
本发明的第三个目的是提供一种含有所述的副干酪乳杆菌的菌剂。
进一步地，所述的菌剂为固态菌剂。
进一步地，所述的菌剂为液态菌剂。
本发明的有益效果是：
本发明的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-1，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。本发明的副干酪乳杆菌JN-1在胃肠液中模拟消化存活率达到82％，且耐胆盐特性强，在胆盐浓度达到0.6％时，ABS能够达到14.08，此外，本发明的副干酪乳杆菌JN-1在体外具有较强的抑菌性，对金黄色葡萄球菌均呈现出明显的抑菌效应，表现出较好的抑制作用。本发明的副干酪乳杆菌JN-1具有强的胃肠道消化系统的抗性及对胆盐耐受能力，能够应用于预防和治疗自发性肠炎，具有功能和风味俱佳的效果。
生物材料保藏：
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-1，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。
附图说明：
图1为小鼠的疾病活动指数评分，###与正常组比较P＜0.001；***与模型组相比较，P＜0.001；
图2为各组小鼠血清细胞因子TNF-α和iNOS的水平，###与正常组比较P＜0.001；**与正常组比较P＜0.01；*与正常组比较P＜0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
MRS固体培养基：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K2HPO4·3H2O 2.6g；MgSO4·7H2O 0.2g；MnSO4·4H2O 0.05g；吐温801mL；1.5～2％的琼脂粉。pH调节6.8±0.2；定容至1L。
MRS液体培养基：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K2HPO4·3H2O 2.6g；MgSO4·7H2O 0.2g；MnSO4·4H2O 0.05g；吐温80 1mL。pH调节6.8±0.2；定容至1L。
LB培养基的配置：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，超纯1.0L，调节pH至7.4。121℃灭菌15min后备用。
实施例1：菌株的分离与鉴定
1、乳酸菌分离自宁夏银川地区发酵企业周围环境，取样后进行标号，冷藏盒保存。
2、采用稀释梯度涂布平板方法，将样品稀释并涂布MRS平板上，每个浓度涂三个平行，置于37℃的厌氧培养。
3、挑取符合乳酸菌菌落特征的单菌落接入MRS液体培养基进行富集培养。获得的菌株保存于甘油管中并保藏于-80℃的低温环境中。
4、菌种鉴定：取1mL富集好的乳酸菌菌液，进行DNA的提取，获得的DNA利用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增，得到未纯化的DNA序列。对序列进行鉴定，鉴定单位为天霖生物科技(无锡)有限公司。
5、鉴定结果
该菌株被鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，并命名为副干酪乳杆菌JN-1，已于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。
实施例2：菌株的人工胃肠液抗性实验
1、模拟唾液、胃液和肠液的制备：
(1)胃肠储备液的制备(见表1)
表1模拟唾液，胃液和肠液制备
药品 储备液浓度(mol/L) 胃液盐浓度(mmol/L) 肠液盐浓度(mmol/L)
KCl 0.5 6.9 6.8
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.5 0.9 0.8
NaHCO<sub>3</sub> 1 25 85
NaCl 2 47.2 38.4
MgCl<sub>2</sub>(H<sub>2</sub>O)<sub>6</sub> 0.15 0.12 0.33
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 0.5 0.5 -
HCl 6 15.6 8.4
CaCl<sub>2</sub>(H2O)2<sup>a</sup> 0.3 0.15 0.6
a在使用前添加CaCl2(H2O)2
(2)调节pH：利用NaOH溶液或HCl溶液调节SGF溶液pH至3；SIF溶液pH调节至7。
(3)SGF溶液中添加胃蛋白酶溶液和胃脂肪酶溶液，最终混合物的活性分别达到2,000U/mL和60-75U/mL；SIF溶液中添加胰蛋白酶，最终混合物的活性分别达到100U/mL。
(4)在实验过程中保持37℃的温度，不断搅拌，可以用来模拟胃肠的蠕动。
2、胃肠液抗性实验操作
乳酸菌菌液以10％的接种量接种到SGF中，置37℃厌氧培养，分别在0h和3h时，取样测定OD600计算各菌种的存活率(％)。吸取经人工胃液处理3h后的菌液，接种于无菌的SIF中，静置于37℃厌氧培养，在0h，3h取样测定OD600。存活率＝A1/A0×100％
3、按照以上操作步骤对鼠李糖乳杆菌CICC6001，副干酪乳杆菌JN-1，副干酪乳杆菌CICC 6244和植物乳杆菌CICC 21794进行胃肠液抗性实验。结果见表2，菌株JN-1的存活率大大高于其他菌株，显示出更强的胃肠液抗性。
表2乳酸菌落对人工胃肠液的耐受性结果
Figure GDA0003632305090000051
实施例3：菌株的对胆盐的耐受性实验
1、含胆盐的MRS培养基配置：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K2HPO4·3H2O 2.6g；MgSO4·7H2O 0.2g；MnSO4·4H2O 0.05g；吐温801mL，定容至1L。胆盐分别添加0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％和0.6％。
2、耐胆盐实验步骤：将乳酸菌按2％的接种量分别接种于含不同浓度胆盐的MRS液体培养基中，放置于37℃厌氧培养，24h分别测定OD600。以胆盐耐受能力(Ability BileSalts,ABS)作为乳酸菌的胆盐耐受能力的评价指标，ABS用以下公式表示：
Figure GDA0003632305090000054
式中：μmBS为乳酸菌在不同浓度胆盐的培养基中培养24h的OD600值；μm为乳酸菌不含胆盐培养24h的OD600值。
3、耐胆盐实验结果见表3，与其他菌株相比，JN-1展现出更强的耐胆盐特性见表3，与其他菌株相比，JN-1展现出更强的耐胆盐特性。
表3乳酸菌样品ABS测定结果
Figure GDA0003632305090000053
实施例4：体外抑制金黄色葡萄球菌实验
(1)LB培养基的配置：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，超纯1.0L，调节pH至7.4。121℃灭菌15min后备用。
(2)金黄色葡萄球菌菌液的制备：将金黄色葡萄球菌CICC10307按2％的接种量接种于LB液体培养基中，于37℃恒温振荡培养24h，经传代后继续以37℃恒温培养，获得活性较高的菌液。
(3)无细胞上清液的制备：乳酸菌按2％接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃恒温环境培养24h，将菌液通过12,000r/min，离心15min，过滤，获得无细胞上清液，放于-80℃冰箱保藏。
(4)对照组和乳酸菌组分别以LB培养基和无细胞上清液培养金黄色葡萄球菌。空白组不接种金黄色葡萄球菌，实验组按培养基3％的接种量接种金黄色葡萄球菌，每株分离菌株设置三组平行实验。37℃恒温静置培养，分别测定空白组与实验组0h和24h的OD600，计算金黄色葡萄球菌的增长率。
金黄色葡萄球菌的抑菌性实验，结果见表4。空白组的OD600增长率高达84.7％；相较于其他菌株，副干酪乳杆菌JN-1无细胞上清液对金黄色葡萄球菌均呈现出明显的抑菌效应，表现出较好的抑制作用。
表4抑菌性实验结果
Figure GDA0003632305090000061
实施例5：副干酪乳杆菌JN-1应用产品制备
1、副干酪乳杆菌JN-1于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。
2、副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉中副干酪乳杆菌的活菌数为1×109CFU/g。
3、副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌JN-1接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；
(2)初级种子液制备：挑取固体MRS培养基中的副干酪乳杆菌JN-1单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以3％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，得到发酵液；
(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌JN-1的菌泥；
(5)菌体冻干：向收集到的菌体进行冷冻干燥，得到冻干菌粉。
实施例6：副干酪乳杆菌JN-1应用产品制备
1、副干酪乳杆菌JN-1于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。
2、副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉中副干酪乳杆菌的活菌数为1×108CFU/g。
3、副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌JN-1接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；
(2)初级种子液制备：挑取固体MRS培养基中的副干酪乳杆菌JN-1单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以2％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养20h，得到发酵液；
(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌JN-1的菌泥；
(5)菌体冻干：向收集到的菌体进行冷冻干燥，得到冻干菌粉。
实施例7：副干酪乳杆菌JN-1应用产品制备
1、副干酪乳杆菌JN-1于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22745。
2、副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉中副干酪乳杆菌的活菌数为1×1010CFU/g。
3、副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌JN-1接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；
(2)初级种子液制备：挑取固体MRS培养基中的副干酪乳杆菌JN-1单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以4％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养48h，得到发酵液；
(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌JN-1的菌泥；
(5)菌体冻干：向收集到的菌体进行冷冻干燥，得到冻干菌粉。
实施例8：副干酪乳杆菌JN-1制备的产品的应用
动物实验
1实验方案
C57BL/6小鼠和C57BL/6Il-10-/-小鼠，5～6周雄性，分别为10只和40只。实施例5、6、7制得副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉。
正常组为10只正常C57BL/6小鼠，将C57BL/6Il-10-/-小鼠随机分成4组，分别为模型组、给药组1、给药组2和给药组3，每组10只。分组及给药关系如表5所示。
表5分组及给药情况
Figure GDA0003632305090000081
小鼠在第0-7天内自由饮用普通饮用水，适应环境。在第1-30天，小鼠每天自由饮水饮食，给药组组小鼠每天灌胃一次，剂量为0.25g/kg菌剂水溶液，正常组和模型组小鼠每天灌胃一次等体积的生理盐水。在第30天对小鼠进行麻醉后将小鼠脱颈处死，收集小鼠盲肠内容物。检测结肠中细胞因子的水平。
我们统计了各组小鼠体重变化，粪便粘稠度和血便情况，用于评价小鼠的疾病活动指数。如图1所示，结果显示，与模型组相比，给药组降低了自发性肠炎小鼠疾病活动指数升高。以上结果说明实施例5冻干菌粉产品改善了小鼠疾病活动指数。
进一步地，对小鼠结肠组织中细胞因子的表达水平进行分析。模型组小鼠结肠组织中多种细胞炎症因子基因表达上调。如图2所示，与模型组相比，这些细胞炎症因子基因在给药组中显著下降。其中，给药组小鼠的TNF-α和iNOS的mRNA相对表达量显著下调。这表明副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉显著改善了自发性肠炎小鼠的肠道炎症。
为了分析各菌剂对肠道菌群的影响，利用16S rRNA基因高通量测序对小鼠盲肠内容物进行了分析。多样性指数Chao指数、Shannon指数、Simpson指数表征了小鼠肠道微生物的丰度和多样性。如表6所示，给药组可显著提高自发性肠炎小鼠肠道菌群的丰富度。表明副干酪乳杆菌冻干菌粉可以显著缓解自发性肠炎。
表6肠道菌群多样性变化
Figure GDA0003632305090000091
###与正常组比较P＜0.001；***与正常组比较P＜0.001；**与正常组比较P＜0.01；*与正常组比较P＜0.05。
综上可知，副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉能够显著缓解自发性肠炎。其能降低小鼠肠道损伤，显著降低小鼠结肠细胞因子的水平。进一步地，对小鼠肠道微生物进行分析，结果表明副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉显著增加肠道微生物的丰富度和多样性。以上结果说明副干酪乳杆菌JN-1冻干菌粉具有显著缓解自发性肠炎效果，可以作为一种具有缓解自发性肠炎效果的产品。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种副干酪乳杆菌，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）JN-1，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.22745。
2.一种权利要求1所述的副干酪乳杆菌在制备治疗自发性肠炎的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的副干酪乳杆菌制备成含有所述的副干酪乳杆菌的药品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药品为口服制剂。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的产品为含有所述的副干酪乳杆菌的冻干菌粉。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的冻干菌粉中，副干酪乳杆菌的活菌数不低于1×108 CFU/g。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的冻干菌粉通过如下方法制备得到：
（1）将所述的副干酪乳杆菌JN-1接种量接种于MRS固体培养基中，35~38℃培养24~48h，获得菌株单菌落；
（2）挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-1单菌落，接种于MRS液体培养基中，35~38℃厌氧培养20~28 h，得到初级种子液；
（3）将初级种子液以2~4%的接种量接种于液体MRS培养基中，35~38℃厌氧培养20~48h，得到发酵液；
（4）将得到的发酵液2000~6000 rpm/min离心5~20 min，收集并洗涤菌体，得到副干酪乳杆菌JN-1菌体；
（5）向收集到的副干酪乳杆菌JN-1菌体进行冷冻干燥，得到所述的冻干菌粉。
8.一种含有权利要求1所述的副干酪乳杆菌的菌剂。
9.根据权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述的菌剂为固态菌剂。
10.根据权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述的菌剂为液态菌剂。
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