CN110495522B - 一种饲料用中药微生态制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种饲料用中药微生态制剂，它由微生物菌剂和中药发酵产物组成，所述微生物菌剂与中药发酵产物的质量比为1：3～10，所述微生物菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ和A37组成，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ和A37均保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：M2019560和CCTCC NO：M2019559。本发明能改善动物的肠道菌群生物平衡，提高家禽自身免疫能力，减少疾病发生，具有效果确切，性质稳定、安全性好等优点。

Description

一种饲料用中药微生态制剂

技术领域

本发明涉及一种饲料用中药微生态制剂，属于饲料领域。

背景技术

我国是畜禽养殖大国，也是畜产品生产和消费大国。然而，畜禽疫病的高发给我国的养殖生产造成了巨大的经济损失，给食品和公共卫生安全带来了严重威胁。为了预防和治疗畜禽疫病，畜禽养殖生产中大量使用抗生素和化药，但却造成了严重的畜产品安全和质量问题。为了保障畜牧业快速增长，提高动物性食品卫生与安全水平，开发无毒、无残留、效果好的抗生素替代饲料添加剂成为迫切需求。

中药是中华民族的瑰宝，能增强机体内的消化吸收和合成代谢，能促进家禽的生长发育和抗体的产生，提高家禽的繁殖能力，能够刺激干扰素的产生，发挥抗病毒作用，对大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌有抑制作用。而微生物具有非常丰富的酶系统，有强大的分解、转化物质的能。可以改善肠道菌群生物平衡，提高家禽自身免疫能力，减少疾病发生，减少用药，提高饲料利用率及增加养殖效益，被认为是抗生素的最佳替代品之一。但是，现有的饲料微生态制剂存在效果不显著，在动物体内容易被灭活，安全性较低等缺点。

发明内容

本发明的目的是利用益生菌拮抗有害菌、调节菌群平衡及中药辨证施治、提高免疫力、防病治病的原理，结合两者优势，开发科学配比的益生菌-中药双效新型、环保型微生态制剂，以替代预防性抗生素在饲料中的应用。

一种饲料用中药微生态制剂，它由微生物菌剂和中药发酵产物组成，所述微生物菌剂与中药发酵产物的质量比为1：3～10，所述微生物菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)MⅢ和A37组成，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ和A37均保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：M2019560和CCTCC NO：M2019559；所述中药发酵产物是向中药接种黑曲霉发酵而得到的产物，所述中药由五倍子、穿心莲、牛蒡子、甘草、荆芥五味药材组成，它们的质量比为(1～8)：(1～8)：(1～8)：(1～5)：(1～5)。

优选地，所述植物乳杆菌MⅢ与A37的质量比为1～5：1～5。

优选地，所述微生物菌剂中的活菌数为1.0×10¹⁰～1.0×10¹²CFU/g。

优选地，所述中药发酵产物是按以下方法制备的：将所述五味药材加水浸泡，灭菌，然后接种黑曲霉发酵液，于25～35℃恒温发酵60～120h，灭活后将药材烘干，粉碎，即得。

优选地，所述黑曲霉发酵液的接种量为药材质量的5～20％。

优选地，所述黑曲霉发酵液的浓度为1×10⁹～1×10¹¹CFU/mL。

优选地，所述微生物菌剂与中药发酵产物的重量比为1：6。

优选地，所述五倍子、穿心莲、牛蒡子、甘草、荆芥的质量比为3：3：3：1：1。

本发明从鸡的盲肠中筛选获得两株植物乳杆菌可以改善动物的肠道菌群生物平衡，提高家禽自身免疫能力，减少疾病发生，其中一株MⅢ具有很强的抗菌功能，可代替抗生素提高动物低于外来微生物的入侵能力，另一株A37则具有很强的抗逆性能，能够抵御益生菌在动物胃肠道、胆道以及高温条件下的灭活，从而提高制剂的稳定性。两种植物乳杆菌协调配合，相互影响，使益生菌能够稳定、持久地在动物体内发挥作用。

本发明中的中药具有以下功能：五倍子具有敛肺降火、解毒止血、涩肠止泻、收湿敛疮等功效。临床研究发现，五倍子具有止泻、抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗衰老和降血糖等药理作用，此外还有抗癌、抗生育、清除自由基等作用。穿心莲性寒、味苦，具有清热解毒、凉血消肿的功效，被广泛用于治疗细菌性痢疾、急性扁桃体炎、流行性感冒等。甘草味甘、性平；归十二经；具有解毒、祛痰、止痛、解痉功效；生用主治咽喉肿痛，痛疽疮疡。牛蒡子性寒，味辛、苦，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽等作用，主要用于治疗风热感冒、肺热咳嗽、咽喉肿痛、麻疹、丹毒、痈肿疮毒等症。甘草味甘性平，归心肺脾胃经，具有补脾益气、清热解毒、缓急止痛、调和诸药的作用。荆芥味辛、苦，性微温，归肺、肝经。具有解热、抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用、抗炎、镇痛等作用。

体外抗菌试验结果表明：将微生物菌剂与中药发酵产物配伍后，能显著提高对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等常见致病菌的抗菌效果，二者具有很好的协同作用。

动物饲养试验结果表明：本发明能显著提高AA白羽肉鸡的平均体重、平均日增重及料肉比，能促进AA白羽肉鸡的生长发育。

本发明还具有储存稳定性好的优点，另外，两株植物乳杆菌均来源于动物肠道，二者之间不会产生拮抗，且不会产生毒副作用，具有很高的使用安全性。本发明将帮助家禽充分利用饲料中的营养成分，同时提高家禽的免疫功能，对家禽重要疫病起到预防和辅助治疗的作用，具有重要意义。

更详尽内容参见具体实施例。

具体实施方式

实施例1：植物乳杆菌的筛选分离和鉴定

1、菌株的筛选分离

从鸡的盲肠中收集1g内容物，加入至蒸馏水中，旋涡震荡2min，再将其稀释后涂布于乳酸菌选择性培养基MRS培养基上，37℃厌氧培养24h，挑取平板上单菌落，在MRS培养基平板上再次划线，37℃厌氧培养，将得到的菌落多次划线纯化培养，得到纯的菌落。对纯化菌株进行菌落形态观察和革兰氏染色，挑选革兰氏阳性杆菌。

采用牛津杯平板抑菌法和耐酸抗性试验对分离纯化获得的革兰氏阳性杆菌分别进行筛选，获得两株菌株，分别命名为MⅢ和A37，其中MⅢ对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，A37对酸性条件具有抗逆性能。

2、菌株的性能检测

对筛选得到的两株菌株进一步进行检测，具体方法如下：

1)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ的抗菌能力检测

以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ发酵液为抑菌剂，测定其对大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的抗菌能力。

①植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ发酵液的制备：

用移液枪分别吸取10mL的MRS液体培养基至10mL的EP管中，然后用接种环分别挑取活化好的植物乳杆菌MⅢ至EP管中，混匀，放入37℃恒温培养箱中培养24h，活菌数为3.2×10⁹CFU/mL。

所述MRS液体培养基由蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温80 1.0g组成。其中pH值为5.7±0.2。

②指示菌发酵液的制备：

用移液枪分别吸取10mL的NB液体培养基至4支10mL的EP管中，然后用接种环分别挑取活化好的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌至对应的EP管中，混匀，放入37℃恒温培养箱中培养24h。

③牛津杯抑菌实验：

用移液枪分别吸取1mL的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌发酵液至对应的培养基，用涂布棒涂布均匀。将镊子在酒精灯上灼烧，待冷却，然后用其夹取灭菌后的牛津杯，放置于培养基的正中间，用移液枪吸取200μL植物乳杆菌MⅢ发酵液对应的牛津杯中，同时将青霉素药敏纸片置于培养基的正中央盖好培养皿盖子，放入37℃恒温培养箱中培养24h后观察抑菌圈大小，结果见表1。

表1植物乳杆菌MⅢ的抗菌能力

植物乳杆菌	大肠杆菌	沙门氏菌	金黄色葡萄球菌	表皮葡萄球菌
					MⅢ	17.63mm	20.00mm	22.58mm	22.23mm
青霉素	16.36mm	21.98mm	22.03mm	22.55mm

结果表明植物乳杆菌MⅢ对这四种常见的致病菌具有抑菌效果，且效果与青霉素相当。

2)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)A37的抗逆性能

①耐酸性能

用盐酸将MRS液体培养基的pH值调节成pH为1.5、2.0、3.0、4.0四个浓度值，未调过pH值的MRS液体培养基为空白组，取1mL植物乳杆菌A37发酵液至对应pH值的培养基中，37℃恒温处理24h，然后用平板计数法进行活菌计数。另取同批次筛选的植物乳杆菌为对照，结果见表2。

表2植物乳杆菌A37在不同pH值下的耐受性

植物乳杆菌	pH1.5	pH2.0	pH3.0	pH4.0	空白
						A37	1.1×10<sup>9</sup>	1.2×10<sup>9</sup>	1.7×10<sup>9</sup>	2.0×10<sup>9</sup>	2.2×10<sup>9</sup>
A1	4.0×10<sup>8</sup>	7.0×10<sup>8</sup>	9.0×10<sup>8</sup>	1.3×10<sup>9</sup>	1.7×10<sup>9</sup>
						A5	6.0×10<sup>8</sup>	9.0×10<sup>8</sup>	1.0×10<sup>9</sup>	1.4×10<sup>9</sup>	1.6×10<sup>9</sup>
A11	5.0×10<sup>8</sup>	7.0×10<sup>8</sup>	1.0×10<sup>9</sup>	1.5×10<sup>9</sup>	1.8×10<sup>9</sup>
						A19	6.0×10<sup>8</sup>	7.0×10<sup>8</sup>	9.0×10<sup>8</sup>	1.3×10<sup>9</sup>	1.7×10<sup>9</sup>
A21	3.0×10<sup>8</sup>	6.0×10<sup>8</sup>	9.0×10<sup>8</sup>	1.2×10<sup>9</sup>	1.6×10<sup>9</sup>

结果表明植物乳杆菌A37耐酸能力非常突出，而其它植物乳杆菌耐酸能力较差。

②耐胆盐性能

配制胆盐浓度为0.05％、0.10％、0.20％、0.30％、0.40％(W/V)的MRS液体培养基，胆盐浓度为0.00％的MRS液体培养基为空白组，取1mL植物乳杆菌A37发酵液至对应胆盐浓度的培养基中，37℃恒温处理24h，然后用平板计数法进行活菌计数，结果见表3。

表3植物乳杆菌A37在不同胆盐浓度下的耐受性

植物乳杆菌

0.05％

0.10％

0.20％

0.30％

0.40％

空白

A37

2.2×10<sup>9</sup>

2.0×10<sup>9</sup>

1.8×10<sup>9</sup>

1.7×10<sup>9</sup>

1.5×10<sup>9</sup>

2.2×10<sup>9</sup>

A1

2.3×10<sup>9</sup>

2.0×10<sup>9</sup>

1.3×10<sup>9</sup>

5.5×10<sup>8</sup>

6.2×10<sup>7</sup>

2.2×10<sup>9</sup>

A5

2.1×10<sup>9</sup>

1.7×10<sup>9</sup>

8.0×10<sup>8</sup>

1.4×10<sup>8</sup>

6.0×10<sup>7</sup>

2.1×10<sup>9</sup>

A11

2.0×10<sup>9</sup>

1.7×10<sup>9</sup>

1.0×10<sup>9</sup>

5.2×10<sup>8</sup>

8.8×10<sup>7</sup>

2.0×10<sup>9</sup>

A19

2.2×10<sup>9</sup>

1.6×10<sup>9</sup>

1.2×10<sup>9</sup>

3.3×10<sup>8</sup>

1.0×10<sup>8</sup>

2.3×10<sup>9</sup>

A21

2.1×10<sup>9</sup>

1.9×10<sup>9</sup>

1.5×10<sup>9</sup>

6.3×10<sup>8</sup>

2.1×10<sup>7</sup>

2.2×10<sup>9</sup>

结果表明植物乳杆菌A37有很强的耐胆盐能力。

③热稳定性能

将植物乳杆菌A37发酵液分别在室温(25℃)、40℃、50℃、70℃恒温处理30min，然后用平板计数法进行活菌计数，并且检测处理液的抗菌效果，结果见表4。

表4植物乳杆菌A37在不同温度下的耐受性

植物乳杆菌	室温(25℃)	40℃	50℃	70℃
					A37	2.2×10<sup>9</sup>	2.0×10<sup>9</sup>	1.6×10<sup>9</sup>	7.0×10<sup>8</sup>
A1	2.3×10<sup>9</sup>	1.8×10<sup>9</sup>	3.5×10<sup>8</sup>	2.0×10<sup>5</sup>
					A5	2.1×10<sup>9</sup>	1.5×10<sup>9</sup>	9.7×10<sup>7</sup>	3.3×10<sup>6</sup>
A11	2.0×10<sup>9</sup>	1.7×10<sup>9</sup>	6.0×10<sup>8</sup>	0.0×10<sup>9</sup>
					A19	2.2×10<sup>9</sup>	1.6×10<sup>9</sup>	9.9×10<sup>7</sup>	1.2×10<sup>6</sup>
A21	2.1×10<sup>9</sup>	1.5×10<sup>9</sup>	7.2×10<sup>8</sup>	0.0×10<sup>9</sup>

结果表明植物乳杆菌A37在高温环境中有更强的的生存能力。

3、菌株的鉴定

对获得的菌株进行生理生化性能鉴定和16S rDNA鉴定。用微量生化反应管进行生理生化实验(微量生化反应管购买于青岛海博生物技术有限公司)，依据《伯杰细菌鉴定手册》进行结果的比对。菌落正面为微白色，背面为黄色，湿润，边缘整齐，凸起，呈圆形，中等大小，表面光滑，兼性厌氧。该菌株为革兰氏阳性，过氧化氢阴性菌。在MRS培养基上菌落直径1-3mm。利用已发表的16S通用引物(27F和149 2R，引物序列为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对菌株的16SrDNA基因序列进行扩增和测序，PCR扩增产物送至上海生物工程股份有限公司测序，测序序列在NCBI进行blastn比对，并利用MEGA软件中的clusterW构建系统进化发育树，同源性比对结果显示其16SrRNA与植物乳杆菌(JN560843.1)的序列同源性最高，相似性为99.86％。结合生理生化特征和16SrRNA比对结果，确认分离菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

将所述菌株分别命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ和A37，并于2019年7月18日保藏于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：M2019560和CCTCC NO：M2019559。

实施例2：中药微生态制剂的制备

1、菌粉的制备

1)冻干保护剂的制备：称取1.2g海藻糖、1.5g脱脂奶粉、0.3g蔗糖、0.25g明胶，加入至100mL无菌水中，混匀，备用。

2)发酵液的制备：用移液枪分别吸取10mL的MRS液体培养基至2支10mL的EP管中，然后用接种环分别挑取活化好的植物乳杆菌MⅢ和A37至对应的EP管中，混匀，放入37℃恒温培养箱中培养24h，活菌数分别为3.2×10⁹CFU/mL、2.2×10⁹CFU/mL。

3)菌泥的收集：将发酵液在3000rpm、4℃条件下离心，倒掉上清液，即得到菌泥。

4)菌泥的冻干保存：将冻干保护剂加入至菌泥中，混匀，放入-80℃冰箱冻存24h。

5)菌泥的冻干：将冻存24h后的菌泥置于-60℃，8Pa的真空冷冻干燥机内进行冻干24h。

6)冻干菌泥的粉碎：将冻干后的菌泥在无菌环境中粉碎成80目，将两株植物乳杆菌MⅢ和A37菌粉按1:1质量比混合均匀并于-20℃环境保存，其中植物乳杆菌MⅢ和A37的总活菌数达2.7×10¹¹CFU/g。

2、发酵中药的制备

1)中药的处理：将组成所述中药材的各组分于60℃烘干，粉碎，并80目过筛。分别称取五倍子6g，穿心莲6g，牛蒡子6g，甘草2g，荆芥2g，混合，加中药材混合物总质量1倍量二次蒸馏水浸泡，于121℃灭菌30min，待冷却，备用。

2)黑曲霉发酵液的制备：用接种环挑取活化好的黑曲霉菌对应PDB液体培养基中，混匀，放入220rpm，26℃恒温震荡培养箱中培养96h。

所述PDB液体培养基配方由马铃薯提取物4.0g、葡萄糖20.0g组成，pH5.6±0.2。

3)中药的发酵：吸取中药总质量10％的黑曲霉发酵液至灭菌后的中药中，混匀，于26℃恒温培养箱中发酵96h，期间每隔6h用无菌玻璃棒搅拌5min。

4)中药发酵产物中的霉菌灭活：将发酵好的中药于121℃高压灭菌锅中灭菌30min。

5)中药发酵产物的烘干：将发酵产物在60℃下进行烘干5h。

6)发酵产物的粉碎：在无菌条件下，粉碎成80目，于4℃环境保存。

3、中药微生态制剂的制备

将步骤1得到的菌粉与步骤2得到的中药发酵产物按1:6的质量比进行配比混合。

实施例3：中药微生态制剂体外效果评价

用移液枪分别吸取1mL的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌发酵液至对应的培养基，用涂布棒涂布均匀。将镊子在酒精灯上灼烧，待冷却，然后用其夹取灭菌后的牛津杯，放置于培养基的正中间。用移液枪分别吸取200μL各药材提取液及中药微生态制剂处理液及中药霉菌发酵产物至对应的牛津杯中，盖好培养皿盖子，放入37℃恒温培养箱中培养24h后观察抑菌圈大小，结果见表5。

所述药材提取液制备过程：

1)用药材质量6倍量的二次蒸馏水将各中药药材浸泡12h；2)用100℃文火煎煮3h；3)过滤，收集滤液，并想残渣中再次加入6倍量的二次蒸馏水，进行100℃文火煎煮3h；4)过滤，收集滤液，并合并两次所得滤液，即为药材提取液。

所述中药微生态制剂处理液制备过程：称取5g中药微生态制剂，并向其中加入同等量的无菌水，混合均匀即可。

表5中药微生态制剂的抗菌能力

实验结果表明中药微生态制剂的抗菌效果明显优于其它实验组，很好的体现了中药与微生物的协同作用。

实施例4：中药微生态制剂对AA白羽肉鸡的作用

将中药微生态制剂添加在AA白羽肉鸡日粮中，通过对AA白羽肉鸡的生产性能方面来评价中药微生态制剂的替抗效果。选取252只0日龄AA白羽肉鸡，平均分成7组，每组36只，其中7个实验组分别为空白对照组、普通中药组、发酵中药组、发酵中药-菌粉组、普通中药-菌粉组、菌粉组、金霉素组。试验周期为42d，每周对AA白羽肉鸡进行称重，并做好记录，结果见表6。

表6基础日粮中添加中药微生态制剂对21日龄AA白羽肉鸡免疫器官的影响

实验结果表明在日粮中添加中药微生态制剂(发酵中药-菌粉组)，提高了AA白羽肉鸡的脾脏指数和法氏囊指数，增加了免疫器官比重，增强了免疫功能。

基础日粮中添加中药微生态制剂对AA白羽肉鸡生产性能的影响，结果见表7－9。

表7对平均体重的影响(g/只)

表8对平均日增重的影响(g/d)

表9对料肉比的影响

实验结果表明通过比较AA白羽肉鸡的平均体重、平均日增重及料肉比，发现中药微生态制剂(发酵中药-菌粉组)的平均体重、平均日增重及料肉比优于其余各组，能促进AA白羽肉鸡的生长发育。

Claims (8)

1.一种饲料用中药微生态制剂，其特征在于：它由微生物菌剂和中药发酵产物组成，所述微生物菌剂与中药发酵产物的质量比为1：3～10，所述微生物菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ和A37组成，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MⅢ和A37均保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：M2019560和CCTCCNO：M2019559；所述中药发酵产物是向中药接种黑曲霉发酵而得到的产物，所述中药由五倍子、穿心莲、牛蒡子、甘草、荆芥五味药材组成，它们的质量比为(1～8)：(1～8)：(1～8)：(1～5)：(1～5)。

2.如权利要求1所述的饲料用中药微生态制剂，其特征在于：所述植物乳杆菌MⅢ与A37的质量比为1～5：1～5。

3.如权利要求2所述的饲料用中药微生态制剂，其特征在于：所述微生物菌剂中的活菌数为1.0×10¹⁰～1.0×10¹²CFU/g。

4.如权利要求1所述的饲料用中药微生态制剂，其特征在于，所述中药发酵产物是按以下方法制备的：将所述五味药材加水浸泡，灭菌，然后接种黑曲霉发酵液，于25～35℃恒温发酵60～120h，灭活后将药材烘干，粉碎，即得。

5.如权利要求4所述的饲料用中药微生态制剂，其特征在于：所述黑曲霉发酵液的接种量为药材质量的5～20％。

6.如权利要求4所述的饲料用中药微生态制剂，其特征在于：所述黑曲霉发酵液的浓度为1×10⁹～1×10¹¹CFU/mL。

7.如权利要求1所述的饲料用中药微生态制剂，其特征在于：所述微生物菌剂与中药发酵产物的重量比为1：6。

8.如权利要求1所述的饲料用中药微生态制剂，其特征在于：所述五倍子、穿心莲、牛蒡子、甘草、荆芥的质量比为3：3：3：1：1。