CN114276967B - 一株植物乳杆菌hl-16及其应用 - Google Patents
一株植物乳杆菌hl-16及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株植物乳杆菌HL‑16及其应用，属于微生物技术领域。所述植物乳杆菌HL‑16是从鸡粪中分离并筛选得到的，是一种乳杆菌，已进行保藏，保藏编号为CGMCC No.24035。本发明通过对植物乳杆菌HL‑16生物学特性分析显示，该菌具有耐受性好、产酸能力强、产β‑葡萄糖苷酶水平高、生长速度快等优点，可与酿酒酵母及纤维素酶进行菌酶协同发酵，应用于固态发酵中药中，发酵后的中药具有良好的抑菌性能。本发明主要使用具有自主知识产权的菌种，发酵中药，大幅度提高中药中生理活性物质的释放，显著抑制致病菌生长繁殖，从而避免有害代谢产物产生，具有促进动物生长的功能。该植物乳杆菌HL‑16，是一株优异的益生菌。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株乳杆菌及其应用，具体涉及一株发酵特性好，耐受性好、产酸能力强、产β-葡萄糖苷酶水平高、生长速度快，适用于固态发酵中药的植物乳杆菌HL-16。
背景技术
在国家饲料禁抗、养殖减抗的双重政策下，使得畜禽养殖面临诸多问题：生长性能下降、疾病多发、养殖成本提高等。许多养殖户依然不注重对饲养条件的改善和对养殖水平的提高，“有病吃药，无病也吃药”的理念使得养殖户始终将动物健康寄希望于用药上，使得抗生素用量远远超过治疗动物疾病时所需的量，增加了饲养成本的同时，致病菌耐药性也不断增强，疾病最终难以控制，最终也导致了产品品质的降低。况且过量应用抗生素类也会危害人类的健康，过量的抗生素又随粪便、污水流入环境造成环境污染，形成一种“逆循环”。
中药作为我国的一种瑰宝，其种类多、资源丰富，更令人瞩目的是其在新型冠状病毒肺炎治疗过程发挥的重要作用。其炮制工艺历史悠久，因具有天然、绿色、治未病的养生理念而不断传承至今，日益受到市场欢迎。乳酸菌是作为一类能细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。研究发现，益生菌发酵中药可以提高有效成分含量，且益生菌通过其耐受性而定植于肠道中，以达到调节肠道微生物菌群的作用，从而提高机体免疫力。但目前市售产品其益生菌综合性能差，包括耐受性不高、产酸能力较低、产酶水平低等问题，导致产品效果收效甚微。
发明内容
为了解决上述现有技术中的不足，本发明通过分离、筛选、鉴定得到一株耐受性好、产酸能力强、产β-葡萄糖苷酶水平高、生长速度快的乳杆菌菌株HL-16并进行了保藏，将该菌应用于发酵中药中，具有明显的优势。
本发明采用的具体方案如下：
本发明的目的一是提供一株植物乳杆菌HL-16，所述植物乳杆菌HL-16为乳杆菌，分类命名为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC NO.24035 ，保藏日期为2021年12月06日。
本发明的目的二是提供一种微生物菌剂，包含上述的植物乳杆菌HL-16。
本发明的目的三是提供一种利用所述的植物乳杆菌HL-16生产固态发酵中药的方法，包括以下步骤：
（1）、将大茎叶中药、麸皮、豆粕粉碎至40目，备用；
（2）、将步骤（1）按照含水量30%～60%混合，混匀备用；
（3）、向步骤（2）中接入固态发酵中药菌种，接种量为5%～10%；所述固态发酵中药菌种中，植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=4～1：1～4；再加入纤维素酶=0.1～0.3g/100g，混匀，于28℃～32℃，先有氧发酵2～3天，后无氧发酵4～5天即可。
上述生产固态发酵中药的方法，不限场地、操作简单、发酵时间短，利于养殖户或企业大批量生产。
其中，步骤（3）中，所述植物乳杆菌HL-16在接种前经活化和扩大培养，具体步骤如下：
步骤一、斜面固体培养：
将菌种接种在固体斜面培养基上，于30～37℃培养1～2天，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；
所述的固体斜面培养基的配方为：每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2%琼脂粉、余量为水；
步骤二、摇瓶菌种扩大培养：
取步骤一得到的活化菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一只试管加入3～5mL；将菌悬液接种于液体种子扩大培养基中，接种量为液体种子扩大培养基体积的5～10%，培养温度30～37℃，静置培养即可，培养时间1～2天，得到种子液，作为发酵的种子；
所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水。
本发明中，植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=4～1：1～4，更优选为植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=3：2，其固态发酵中药菌种接种量为5%～10%，更优选为7%；纤维素酶=0.1～0.3g/100g，更优选为纤维素酶=0.2g/100g；含水量30%～60%，更优选为含水量40%。
本发明中，大茎叶中药包括：青蒿7～10份、黄芩9～12份、金银花1～3份、艾叶4～6份、鱼腥草1～2份、石韦0.5～2份、连翘叶5～8份、蒲公英2～4份；其与麸皮、豆粕质量比为80～92：4～10：4～10，更优选为90：5：5。
本发明的目的四是提供所述的植物乳杆菌HL-16或所述的微生物菌剂在固态发酵中药中的应用。
本发明相比于现有技术，具有以下有益效果：
1、本发明通过对植物乳杆菌HL-16生物学特性分析显示，该菌具有安全性好、耐受性好、产酸能力强、产β-葡萄糖苷酶水平高、生长速度快等优点，可以与酿酒酵母及纤维素酶进行菌酶协同发酵，应用于固态发酵中药中，发酵后的中药具有良好的抑菌性能。本发明主要使用具有自主知识产权的菌种，发酵中药，大幅度提高中药中生理活性物质的释放，显著抑制致病菌生长繁殖，从而避免有害代谢产物产生，具有促进动物生长的功能。该植物乳杆菌HL-16，是一株优异的益生菌。
2、将植物乳杆菌HL-16应用于发酵中药中，所述菌株随发酵中药进入动物肠胃，在肠胃中快速繁殖并保持大量活菌占据微生态优势，进而抑制致病菌生长繁殖，从而避免有害代谢产物产生，具有促进动物生长的功能。本发明方法简单易行，效果稳定，绿色环保且易于推广大面积使用。
生物材料的保藏：植物乳杆菌HL-16，分类命名为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），保藏编号为CGMCC No.24035，保藏日期为2021年12月06日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是HL-16菌落照片；
图2是HL-16菌体革兰氏染色显微照片（1600倍）；
图3是NJ法构建的HL-16的系统发育树；
图4是选取实施例4（使用植物乳杆菌HL-16发酵实例二）的抑菌结果图；图中，A指示对大肠杆菌的抑制效果，B指示对金黄色葡萄球菌的抑制效果，C指示对猪沙门氏菌的抑制效果，D指示对痢疾志贺菌的抑制效果。
具体实施方式
一、一种产酸能力强、耐受性好的乳杆菌菌株筛选和鉴定，其具体步骤如下：
本发明将取自洛阳某养殖场的鸡粪10g加入90mL无菌水中，摇匀震荡。摇匀后取1mL样品加入到9mL无菌水中，在漩涡混合仪上混匀后，再取1mL样品加入9mL无菌水中，以此类推。选取三个合适的浓度梯度依次涂布固体培养平板(每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2%琼脂粉、1%碳酸钙、余量为水，pH调至7左右)，36℃培养36-48h，选取平板上产生透明圈的菌株，备用。将初筛出的菌株纯化到固体培养基平板（每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2%琼脂粉、1%碳酸钙、余量为水），36°C培养36-48h。
将上述筛选出的每株菌株接种到液体培养基（每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水，pH调至7左右）中，36℃培养箱培养24h，然后按照5%的接种量分别接种到装液量为20mL液体培养基的50mL三角瓶中，36℃静置培养，每4h通过紫外分光光度计（OD600）测定其吸光度值，并通过酸碱滴定法测定其总酸度，测定72h。
将上述筛选出的每株菌株接种到液体培养基（每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水，pH调至7左右，）中，36℃培养箱培养24h，然后按照5%的接种量分别接种到pH为2.0、3.0、4.0和胆盐含量为0.3%、0.5%、0.7%的液体培养基中，36℃静置培养，每2h进行活菌梯度稀释涂布，测定8h，得到不同pH、不同胆盐含量下每株菌株不同时刻的存活率。
经两轮筛选，得到一株耐受性好、产酸能力强、生长速度快的乳杆菌菌株HL-16。将乳杆菌菌株HL-16进行胞外产β-葡萄糖苷酶酶活的测定，该菌β-葡萄糖苷酶酶活为30.68U/mL；最终得到一株耐受性好、产酸能力强、产β-葡萄糖苷酶水平高、生长速度快的乳杆菌菌株HL-16（见图1），该菌革兰氏染色呈阳性（见图2），产酸量为2.3g/100mL，pH为3.0时，2h存活率为149.6%，4h存活率为200.9%，6h存活率为224.4%，呈逐渐升高趋势，并且当pH为2.0时，4h时仍有活菌；胆盐含量为0.3%时，2h存活率为39.8%，4h存活率为41.8%，6h存活率为37.3%，并且当胆盐含量为0.7%时，8h时仍有活菌。
本发明筛选得到的一株耐受性好、产酸能力强、产β-葡萄糖苷酶水平高、生长速度快的乳杆菌菌株HL-16，将菌株送至生工生物（上海）股份有限公司进行测序，采用MEGA7.0软件构建出菌HL-16的系统发育树（见图3）。确定该菌株为Lactiplantibacillus plantarum。16S rDNA碱基序列见序列表SEQ ID NO：01。
二、一种固态发酵中药的发酵工艺方法，其具体步骤如下：
（1）斜面固体培养：
将菌种接种在固体斜面培养基上，于30～37℃培养1～2天，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；
所述的斜面固体培养基的配方为：每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2%琼脂粉、余量为水；
（2）摇瓶菌种扩大培养：
取（1）中得到的活化菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一只试管加入3～5mL；将菌悬液接种于液体种子扩大培养基中，接种量为液体种子扩大培养基体积的5～10%，培养温度30～37℃，静置培养即可，培养时间1～2天，得到种子液，作为发酵的种子。
所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水；
（3）固态发酵中药：
首先将大茎叶中药（青蒿7～10份、黄芩9～12份、金银花1～3份、艾叶4～6份、鱼腥草1～2份、石韦0.5～2份、连翘叶5～8份、蒲公英2～4份）、麸皮、豆粕以质量比为80～90：4～6：4～6的物料粉碎至40目，备用；之后按照含水量30%～60%混合，混匀备用；然后向其中接入接种量为5%～10%的植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=4～1：1～4，及50℃水浴活化后的纤维素酶=0.1～0.3g/100g，混匀；最后，于28℃～32℃，先有氧发酵2～3天，后无氧发酵4～5天即可。
三、活菌数、pH及总酸度的测定：
首先，称取1 g样品加入50 mL蒸馏水中搅拌均匀，放入30℃ 180 r/min 恒温摇床20 min；之后吸取1mL进行梯度稀释、固体平板涂布，2天后进行活菌（菌落）计数；然后将剩余样品混合均匀移入50 mL离心管，用蒸馏水进行配平，放入离心机在6000 r/min离心5min后，吸取30mL上清液于50mL三角瓶中，用pH计进行测量并进行数据记录；最后，向上清液中滴加2～3滴酚酞溶液，并使用NaOH溶液将上清液滴定至pH为8.35左右，记录下使用NaOH溶液的量，计算总酸度。
四、多糖含量的测定：
（1）将样品放入烘箱干燥，待烘干后称取样品1.5 g，加10 mL蒸馏水混合均匀，放入70℃恒温水浴1 h，用蒸馏水配平后在4000 r/min离心机离心15 min，保留上清液，在沉淀物加入10 mL蒸馏水。重复上述操作，水浴浸取三次，将上清液浓缩至30 mL左右；
（2）吸取1.0 mL样品溶液于10.0 mL具塞试管放入冰水浴5 min，空白对照为蒸馏水。加入80%的蒽酮硫酸溶液，震荡摇匀，沸水浴加热15 min，加热完放入冰水浴5 min，摇匀震荡，在波长625 nm下测吸光度，计算出多糖含量。
五、黄酮苷元含量的测定：
（1）将上述四（1）中处理结束后得到的沉淀，用乙酸乙酯萃取。在上述多糖沉淀的离心管中加入10 mL乙酸乙酯进行萃取，每次加入10 mL乙酸乙酯萃取一个小时，萃取结束后收取乙酸乙酯相。取5 mL乙酸乙酯相在50℃的条件下采用旋转蒸发仪将乙酸乙酯去除，得到浸膏；
（2）在浸膏中加入70 %乙醇10 mL并超声清洗器超声5 min使得样品完全溶解放入25 mL具塞试管中，加5% NaNO3 1mL，混匀放置6 min，加入10% Al(NO3)3 1mL，混匀放置6min，加入4 mol/L NaOH 2mL、加70 %的乙醇定容至25mL，混匀放置15min，测定510nm处吸光度，计算出黄酮苷元含量。
六、抑菌试验：
（1）供试菌的制备：
将保藏在-80℃冰箱中的供试菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌、痢疾志贺菌）接种到LB液体培养基（每1000mL培养基中包含胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、余量为水）中，对照品为不加供试菌的LB液体培养基（每1000mL培养基中包含胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、余量为水），都放置38℃、180r/min恒温摇床中培养。每隔四个小时用紫外分光光度计（OD600）测定菌液吸光度，使得菌液的含菌量为106-108 CFU/mL；
（2）抑菌剂的制备：
称取固态样品1.0g，加入10mL无水乙醇混合均匀，用滤纸过滤。吸取1mL的样品用无水乙醇稀释三个梯度10-1、10-2、10-3，备用；
（3）体外抑菌实验：
采用滤纸片法，将LB固体培养基（每1000mL培养基中包含胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、2%琼脂粉、余量为水）倒入培养皿，凝固后，吸取200μL的菌液用涂布棒均匀的涂布在固体培养基表面，晾干后，用镊子夹起滤纸片蘸取抑菌剂并放在固体培养基表面，再蘸取无水乙醇为阴性对照。将培养皿放置35℃恒温培养箱中，培养12h，观察结果。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：说明如何筛选得到植物乳杆菌HL-16。
（1）平板初筛及纯化：将取自洛阳某养殖场的鸡粪10g加入90mL无菌水中，摇匀震荡。摇匀后取1mL样品加入到9mL无菌水中，在漩涡混合仪上混匀后，再取1mL样品加入9mL无菌水中，以此类推。选取三个合适的浓度梯度依次涂布固体培养平板(每1000mL培养基中包含10g蛋白胨、15g酵母粉、20g葡萄糖、3g脱脂奶粉、1.2g Vc、1.8g半胱氨酸、5g牛肉膏、5gCH3COONa、2g柠檬酸三铵、2gKH2PO4、0.25gMnSO4、0.58gMgSO4、1mL吐温80、2%琼脂粉、1%碳酸钙、余量为水，pH调至7左右)，36℃培养36-48h，选取平板上产生透明圈的菌株，备用。将初筛出的菌株纯化到固体培养基平板上（每1000mL培养基中包含10g蛋白胨、15g酵母粉、20g葡萄糖、3g脱脂奶粉、1.2g Vc、1.8g半胱氨酸、5g牛肉膏、5gCH3COONa、2g柠檬酸三铵、2gKH2PO4、0.25gMnSO4、0.58gMgSO4、1mL吐温80、2%琼脂粉、1%碳酸钙、余量为水，pH调至7左右），36°C培养36～48h。
（2）产酸能力的测定：将（1）中筛选出的每株菌株接种到液体培养基（每1000mL培养基中包含10g蛋白胨、15g酵母粉、20g葡萄糖、3g脱脂奶粉、1.2g Vc、1.8g半胱氨酸、5g牛肉膏、5gCH3COONa、2g柠檬酸三铵、2gKH2PO4、0.25gMnSO4、0.58gMgSO4、1mL吐温80、余量为水，pH调至7左右）中，36℃培养箱培养24h，然后按照5%的接种量分别接种到装液量为20mL液体培养基的50mL三角瓶中，36℃静置培养，每4h通过紫外分光光度计（OD600）测定其吸光度值，并通过酸碱滴定法测定其总酸度，测定72h。
（3）耐酸性、耐胆盐能力的测定：将（1）中筛选出的每株菌株接种到液体培养基（每1000mL培养基中包含10g蛋白胨、15g酵母粉、20g葡萄糖、3g脱脂奶粉、1.2g Vc、1.8g半胱氨酸、5g牛肉膏、5gCH3COONa、2g柠檬酸三铵、2gKH2PO4、0.25gMnSO4、0.58gMgSO4、1mL吐温80、余量为水，pH调至7左右）中，36℃培养箱培养24h，然后按照5%的接种量分别接种到pH为2.0、3.0、4.0和胆盐含量为0.3%、0.5%、0.7%的液体培养基中，36℃、静置培养，每2h进行活菌梯度稀释涂布，测定8h，得到不同pH、不同胆盐含量下每株菌株不同时刻的存活率。
经两轮筛选，得到一株耐受性好、产酸能力强、生长速度快的乳杆菌菌株HL-16。将乳杆菌菌株HL-16进行胞外产β-葡萄糖苷酶酶活的测定；最终得到一株耐受性好、产酸能力强、产β-葡萄糖苷酶水平高、生长速度快的乳杆菌菌株HL-16（见图1），该菌革兰氏染色呈阳性（见图2）。
实施例2：说明如何鉴定植物乳杆菌HL-16。
（1）分离纯化出单菌落斜面，送至生工生物（上海）股份有限公司进行测序，结果如菌株HL-16的16S rDNA序列表所示，采用MEGA7.0软件构建出菌HL-16的系统发育树（见图3）。
（2）通过菌株HL-16的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列，确定HL-16为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）。
（3）将鉴定为植物乳杆菌的菌株HL-16进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，CGMCC NO.24035，保藏日期为2021年12月06日。
实施例3：使用植物乳杆菌HL-16发酵实例一。
（1）总质量为100g，将大茎叶中药（青蒿7份、黄芩9份、金银花3份、艾叶4份、鱼腥草2份、石韦2份、连翘叶5份、蒲公英2份）、麸皮、豆粕以质量比92：4：4的比例粉碎至40目，备用。
（2）往（1）中分别加入30%水，并以5%的接种量按照植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=1：4接种，再添加纤维素酶0.1 g/100g，混匀，于30℃，先有氧发酵两天，后无氧发酵五天即可。
实施例4：使用植物乳杆菌HL-16发酵实例二。
（1）总质量为100g，将大茎叶中药（青蒿8份、黄芩10份、金银花2份、艾叶6份、鱼腥草1.5份、石韦1份、连翘叶6份、蒲公英3份）、麸皮、豆粕以质量比90：5：5的比例粉碎至40目，备用。
（2）往（1）中分别加入40%水，并以7%的接种量按照植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=3：2接种，再添加纤维素酶0.2 g/100g，混匀，于30℃，先有氧发酵两天，后无氧发酵五天即可。
实施例5：使用植物乳杆菌HL-16发酵实例三。
（1）总质量为100g，将大茎叶中药（青蒿10份、黄芩12份、金银花1份、艾叶5份、鱼腥草1份、石韦0.5份、连翘叶8份、蒲公英4份）、麸皮、豆粕以质量比84：7：9的比例粉碎至40目，备用。
（2）往（1）中分别加入50%水，并以8%的接种量按照植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=2：3接种，再添加纤维素酶0.2 g/100g，混匀，于30℃，先有氧发酵两天，后无氧发酵五天即可。
实施例6：使用植物乳杆菌HL-16发酵实例四。
（1）总质量为100g，将大茎叶中药（青蒿9份、黄芩11份、金银花2份、艾叶5份、鱼腥草1份、石韦1.5份、连翘叶7份、蒲公英3份）、麸皮、豆粕以质量比80：10：10的比例粉碎至40目，备用。
（2）往（1）中分别加入60%水，并以10%的接种量按照植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=4：1接种，再添加纤维素酶0.3 g/100g，混匀，于30℃，先有氧发酵两天，后无氧发酵五天即可。
对比例3～6均已实施例3～6未发酵中药品为参照。
表一：实施例3～6和对比例3～6的中药品中pH、总酸度、活菌数、多糖、黄酮苷元含量的变化（见下表）。
由表一显示的数据可知：通过对实施例3～6和对比例3～6进行的pH、总酸度、活菌数、多糖、黄酮苷元含量的测定，发现发酵后的含量对比未发酵的含量均有较大程度提升，说明，经过植物乳杆菌HL-16发酵后，大幅度提高中药中生理活性物质的释放，活菌数量提高，有利于益生菌大量定植于动物肠道，改善动物肠胃，进而抑制致病菌生长繁殖，从而避免有害代谢产物产生，具有促进动物生长的功能。
实施例7：选取实施例4（使用植物乳杆菌HL-16发酵实例二）进行抑菌试验。
供试菌的制备：
将保藏在-80℃冰箱中的供试菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌、痢疾志贺菌）接种到液体培养基LB（每1000mL培养基中包含胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、余量为水）中，对照品为不加供试菌的LB液体培养基（每1000mL培养基中包含胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、余量为水），都放置38℃、180r/min恒温摇床中培养。每隔四个小时用紫外分光光度计（OD600）测定菌液吸光度，使得菌液的含菌量为106-108 CFU/mL。
抑菌剂的制备：
称取发酵实例二发酵后的固态样品1.0g，加入10mL无水乙醇混合均匀，用滤纸过滤。吸取1mL的样品用无水乙醇稀释三个梯度10-1、10-2、10-3，备用。
体外抑菌实验：
采用滤纸片法，将LB固体培养基（每1000mL培养基中包含胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、2%琼脂粉、余量为水）倒入直径为9cm的培养皿，凝固后，吸取200μL的菌液用涂布棒均匀的涂布在固体培养基表面，晾干后，用镊子夹起滤纸片蘸取抑菌剂并放在固体培养基表面，再蘸取无水乙醇为阴性对照。将培养皿放置35℃恒温培养箱中，培养12h，结果见表二。
选取实施例4（使用植物乳杆菌HL-16发酵实例二）的抑菌结果（见图4）。
表二为：选取实施例4（使用植物乳杆菌HL-16发酵实例二）的抑菌结果。
注：抑菌圈直径R≥20mm为高敏，用“+++”表示；15mm≤R＜20mm为中敏，用“++”表示；10mm≤R＜15mm为低敏，用“+”表示；R＜10mm为耐药，用“-”表示。
由表二显示的数据可知：通过对选取实施例4（使用植物乳杆菌HL-16发酵实例二）的抑菌结果发现，经过植物乳杆菌HL-16发酵后，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪沙门氏菌、痢疾志贺菌四种致病菌均有较好的抑菌效果。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一株植物乳杆菌HL-16及其应用
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）
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ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgaacgaa ctctggtatt 60
gattggtgct tgcatcatga tttacatttg agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg 120
ggaaacctgc ccagaagcgg gggataacac ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa 180
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tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa 720
caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt 780
agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg 840
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ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atactatgca aatctaagag 1020
attagacgtt cccttcgggg acatggatac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1080
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt 1140
aagttgggca ctctggtgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200
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cggtggggta ccttttagg 1459
Claims (9)
1.一株植物乳杆菌HL-16，所述植物乳杆菌HL-16为乳杆菌属，分类命名为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为CGMCC NO.24035 ，保藏日期为2021年12月06日。
2.一种微生物菌剂，包含权利要求1所述的植物乳杆菌HL-16。
3.利用权利要求1所述的植物乳杆菌HL-16生产固态发酵中药的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、将大茎叶中药、麸皮、豆粕粉碎至40目，备用；
（2）、将步骤（1）按照含水量30%～60%混合，混匀备用；
（3）、向步骤（2）中接入固态发酵中药菌种，接种量为5%～10%；所述固态发酵中药菌种中，植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=4～1：1～4；再加入纤维素酶=0.1～0.3g/100g，混匀，于28℃～32℃，先有氧发酵2～3天，后无氧发酵4～5天即可。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，按重量份数计，所述大茎叶中药包括：青蒿7～10份、黄芩9～12份、金银花1～3份、艾叶4～6份、鱼腥草1～2份、石韦0.5～2份、连翘叶5～8份和蒲公英2～4份；所述大茎叶中药与麸皮、豆粕的质量比为80～92：4～10：4～10。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述大茎叶中药与麸皮、豆粕的质量比为90：5：5。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，含水量40%。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，植物乳杆菌HL-16：酿酒酵母=3：2；所述固态发酵中药菌种的接种量为7%；纤维素酶 =0.2g/100g。
8.根据权利要求3或7所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述植物乳杆菌HL-16在接种前经活化和扩大培养，具体步骤如下：
步骤一、斜面固体培养：
将菌种接种在固体斜面培养基上，于30～37℃培养1～2天，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；
所述的固体斜面培养基的配方为：每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、1.5～2%琼脂粉、余量为水；
步骤二、摇瓶菌种扩大培养：
取步骤一得到的活化菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一只试管加入3～5mL；将菌悬液接种于液体种子扩大培养基中，接种量为液体种子扩大培养基体积的5～10%，培养温度30～37℃，静置培养即可，培养时间1～2天，得到种子液，作为发酵的种子；
所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000 mL培养基中包含8～15g蛋白胨、10～20g酵母粉、18～25g葡萄糖、1.8～3g脱脂奶粉、1.2～2.4g Vc、0.6～2.4g半胱氨酸、3～10g牛肉膏、3～10gCH3COONa、1～3g柠檬酸三铵、1～3gKH2PO4、0.1～1gMnSO4、0.1～1gMgSO4、0.5～2mL吐温80、余量为水。
9.权利要求1所述的植物乳杆菌HL-16或权利要求2所述的微生物菌剂在固态发酵中药中的应用。
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