CN115011507B - 高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用 - Google Patents

高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用 Download PDF

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Abstract

高产β‑葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用,属于微生物技术领域。本发明一方面提供了一株高产β‑葡萄糖苷酶乳酸菌(Lactiplantibacillus plantarum S3),其保藏编号为CGMCC No.24649,另一方面提供了该高产β‑葡萄糖苷酶乳酸菌的用途。该高产β‑葡萄糖苷酶乳酸菌能够高效转化栀子苷为栀子蓝色素,转化效率高,同时保证了转化过程中的安全性。可直接利用发酵方法,利用培养基中的氨基酸成分,在短时间内转化栀子苷成分,生产出高质量环保型的栀子蓝色素,可应用于栀子蓝色素工业生产中。

Description

高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用。
背景技术
天然色素是食品添加剂的一个重要部分。其中,栀子蓝色素是一种天然水溶性色素,耐热、耐光、耐酸碱,pH适应范围广,广泛应用于食品中,如饮料、葡萄酒、甜点等。栀子蓝色素是一种长链的异戊二烯衍生物,是栀子苷在β-葡萄糖苷酶水解栀子苷得到京尼平,再与氨基酸发生聚合反应所生成的产物。β-葡萄糖苷酶是决定色素性质的关键酶。目前为止,利用枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酵母、嗜热菌海栖热袍菌的β-葡萄糖苷酶,或者在大肠杆菌中外源表达β-葡萄糖苷酶的方法转化栀子苷得到栀子蓝色素。然而,这些微生物不是完全安全的微生物,其众多外毒素使其在食品生产方面受到制约,涉及到繁琐、复杂的后续产物提取工艺。同时,目前研究的大多数产β-葡萄糖苷酶的菌株所产的酶量较低,且活性不高,满足不了工业生产的试剂需求。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明的目的在于设计提供一种高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用的技术方案。
本发明具体通过以下技术方案实现:
本发明的一个目的是提供一株高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌,其为植物乳植杆菌S3(Lactiplantibacillus plantarum S3),已于2022年04月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏名称为植物乳植杆菌S3(Lactiplantibacillus plantarum S3),菌种保藏编号为CGMCC No.24649。
本发明的另一个目的是提供该高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌在生产β-葡萄糖苷酶中的应用。
本发明的另一个目的是提供该高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌在栀子苷转化成栀子蓝色素中的应用。
本发明的另一个目的是提供该高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌在栀子苷转化成京尼平中的应用。
本发明利用筛选的高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌能够高效转化栀子苷为栀子蓝色素,转化效率高,同时保证了转化过程中的安全性。可直接利用发酵方法,利用培养基中的氨基酸成分,在短时间内转化栀子苷成分,生产出高质量环保型的栀子蓝色素,可应用于栀子蓝色素工业生产中。
附图说明
图1为高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选图;
图2筛选菌株的系统树;
图3为高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的酶活性、生长曲线图;
图4为高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌水解栀子苷为京尼平的转化能力图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
本发明实施例中所用到的培养基如下:
培养基的配方:
分离高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的培养基:蛋白胨1%,牛肉膏1%,酵母粉0.5%,K2HPO4 0.2%,柠檬酸二铵0.2%,乙酸钠0.5%,葡萄糖2%,吐温80 0.1mL,MgSO4·7H200.058%,MnSO4·4H2O 0.025%,琼脂2%,栀子苷1%。本文中培养基中的“%”含义指100mL培养基中含有某成分多少g。
实施例1:高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选
(1)发酵食品中高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的初筛
选取泡菜、酸奶两种发酵食品,分别吸取100μL泡菜汁、酸奶加入900μL 0.85%NaCl溶液稀释至不同浓度(10-2~10-4),涂布到平板上,做好标记,在37℃培养24h后观察并挑选菌落。结果,在泡菜和酸奶样品生长的培养基上分别挑选10个和8个单独的菌落,编号P1~P10、S1~S8。
(2)高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的复筛
栀子苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成葡萄糖和京尼平,再与氨基酸反应生成栀子蓝色素。因此,在上述分离高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的培养基平板上,划线接种初筛得到的18个菌种的稀释液,在37℃培养48h后观察其是否菌落的周围出现了蓝色物质。
测定结果:如图1所示,S3菌落周围蓝色最明显,说明该菌株的β-葡萄糖苷酶活性高。
实施例2:高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的鉴定
将筛选得到的菌株通过测试16s rRNA测序做菌株的鉴定。测序序列结果与NCBI数据库中进行BLAST同源序列比对,以确定菌株的种属,同源性超过99%即可鉴定至种。与同源性较高的菌株利用软件MEGA-X中的临位相连法构建系统进化树。
测定结果:筛选菌株的16s rRNA测序结果如下。
筛选菌株S3的16s rRNA的基因序列(如SEQ ID NO.1所示):
Figure BDA0003626884820000031
Figure BDA0003626884820000041
如表1所示,筛选菌株S3菌株为Lactiplantibacillus plantarum,与标准菌株Lactobacillus plantarum IMAU98319有99.79%的同源性。
表1高产β-葡萄糖苷酶植物乳植杆菌鉴定结果
Figure BDA0003626884820000051
如图2所示,筛选菌株Lactiplantibacillus plantarum S3与Lb.plantarumIMAU98319的进化距离最小,与其他的Lb.plantarum spp.,Lb.plantarum sourdough,Lb.pentosus的进化距离相对远。
同时,将该菌株Lactiplantibacillus plantarum S3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏名称为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum),保藏时间为:2022年04月06日,菌种保藏编号为CGMCC No.24649。
实施例3:Lactiplantibacillus plantarum S3的生长曲线及β-葡萄糖苷酶活性曲线
pNPG(对硝基苯酚葡萄糖苷)作为底物,测定Lactiplantibacillus plantarum S3的β-葡萄糖苷酶活性及生长曲线。在MRS培养基中培养24h,离心(7000g,15min,4℃)收集细胞,在PBS溶液(50mM,pH 7.0)超声细胞,得到粗酶。将粗酶(0.1mL)添加到1mL底物溶液中(2mM pNPG在PBS缓冲液中,pH 7.0),使用酶标仪在405nm测定O.D值。酶活性定义为每分钟产生1μmol PNP所需的酶量。在600nm测定生长曲线(图3)。
测定结果:Lactiplantibacillus plantarum S3菌株在生长3h后进入对数生长期,菌体急剧增加,12h~24h达到生长稳定期,此时活菌数保持相对稳定。其酶活性在培养大约9h后开始有酶活性,酶活性随着时间增加,最高达到1.01unit/mL。
实施例4:Lactiplantibacillus plantarum S3对49种碳水化合物利用能力
利用API 50CH测定Lactiplantibacillus plantarum S3对碳水化合物的利用能力。菌株在MRS培养基中培养24h活化,制备两个麦氏浊度的悬浮液,然后将悬浮液加到试剂条上的50个微生化管中。当细菌可利用底物中的不同物质为唯一碳源时,如细菌能够利用或生长,颜色就改变,以阳性(+)表示,颜色稍有改变,以(±)表示,如细菌不能利用碳源,颜色没有改变,以阴性(-)表示。
测定结果:Lactiplantibacillus plantarum S3能够利用48种碳水化合物,不能利用葡萄糖酸酯(gluconate)(表2)
表2 Lactiplantibacillusplantarum S3对不同碳水化合物及衍生物的发酵能力
Figure BDA0003626884820000061
实施例5:Lactiplantibacillus plantarum S3对栀子苷的转化能力
将活化好的菌株经过离心(7000g,10min)后将上清液丢弃,用缓冲溶液(50mMphosphate溶液)洗涤,得到活菌(浓度达到50mg/mL)。加入栀子苷进行24h的转化。分别于0、1、2、3、6、12、24h取样2mL,离心后取上清液,0.22μm过滤待用。
高效色谱检测,色谱条件如下:色谱柱:TC-C18(250×4.6mm,5μm);检测器:紫外检测器;检测波长:238nm;流动相:甲醇:水=45:55,流速:0.8mL/min。
对产生的栀子蓝色素,利用色差仪测定色素的色差(a,b,L值)。
测定结果:如图4所示,Lactiplantibacillus plantarum S3菌株24h转化之后,所有的栀子苷转化为京尼平和栀子蓝色素。6h,栀子苷转化率达到64%;12h,栀子苷转化率达到92%;24h,栀子苷的转化率达到100%。产生的栀子蓝色素的色差为:L值44.44;a值-0.25;b值-4.02。
序列表
<110> 浙江科技学院
<120> 高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1462
<212> DNA
<213> 植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)
<400> 1
gcggcctgct atgatgcaag tcgaacgaac tctggtattg attggtgctt gcatcatgat 60
ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc cagaagcggg 120
ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca tggtccgagc 180
ttgaaagatg gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag ctagatggtg 240
gggtaacggc tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg agagggtaat cggccacatt 300
gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg 360
acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct 420
gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta tttaaccaga 480
aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540
gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg 600
ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac 660
tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg 720
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gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380
accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac acccaaagtc ggtggggtaa cctttaggaa 1440
ccagccgcct aaagggtaac gg 1462

Claims (4)

1.产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌,其为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)S3,其保藏编号为:CGMCC No.24649。
2.如权利要求1所述的产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌在生产β-葡萄糖苷酶中的应用。
3.如权利要求1所述的产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌在栀子苷转化成栀子蓝色素中的应用。
4.如权利要求1所述的产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌在栀子苷转化成京尼平中的应用。
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