CN105861331A - 一株高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株及其应用 - Google Patents

一株高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株及其应用，属于天然色素的微生物转化领域。本发明高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株分类命名为小克银汉霉A1 Cunninghamella sp. A1，保藏编号为CCTCC NO：M 2016124，其能高效转化栀子苷为栀子蓝色素、栀子苷酸为栀子红色素。本发明利用微生物所产的β‑葡萄糖苷酶，转化栀子苷为栀子蓝色素、栀子苷酸为栀子红色素，反应过程温和，底物栀子苷和栀子苷酸均为纯天然产物，生物转化过程中的酶是天然催化剂可以再生，整个过程绿色、环保。本发明对栀子蓝色素、栀子红色素的高效、大规模、低成本生产具有重要意义。

Description

一株高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株及其应用
技术领域
本发明属于天然色素的微生物转化领域，具体涉及一株高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株及其应用。
背景技术
化学合成色素，由于其经济，稳定，使用方便等优势，在食品、医药、化妆品等领域广泛使用，但是化学合成色素因安全问题许多被禁用；天然色素绿色，无毒无害，属于功能性天然食用色素。因此，近年来天然色素发展极为迅速，天然色素取代化学合成色素已成为色素行业发展的大趋势。因此开发新品种的食用色素越来越受到人们的重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株及其应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株的筛选方法，包括如下步骤：将筛选样本(如土样)用无菌水制成悬液，悬液稀释后在含有栀子苷/栀子苷酸的固体培养基上涂布，挑取能产生蓝色/红色菌圈的菌株经划线分离，得到单菌落。将单菌落菌株再接种到含有栀子苷/栀子苷酸的液体培养基中培养，发酵液变成蓝色/红色的菌株即为转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株。
一种高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株，通过上述方法筛选得到，本发明命名为A1菌株。A1菌株于2016年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为小克银汉霉A1 Cunninghamella sp.A1，保藏编号为CCTCC NO：M2016124。
所述的A1菌株为高产β-葡萄糖苷酶菌株，能高效转化栀子苷为栀子蓝色素，又能高效转化栀子苷酸为栀子红色素。其可用于栀子蓝色素或栀子红色素的生产中。
本发明具有如下优点和效果：本发明利用了微生物所产的β-葡萄糖苷酶，转化栀子苷为栀子蓝色素，转化栀子苷酸为栀子红色素，反应过程温和，底物栀子苷和栀子苷酸均为纯天然产物，并且生物转化过程中的酶是天然催化剂，可以再生，整个过程绿色，环保。本发明筛选到的A1菌株为小克银汉霉菌属，保证了转化过程的安全性，其转化生成栀子蓝色素、栀子红色素的能力强，对栀子蓝色素、栀子红色素的高效、大规模、低成本生产具有重要意义。
附图说明
图1为转蓝菌株的筛选结果图，左边为没有接种土壤悬液的平板分离培养基，右边为接种土壤悬液后培养5d的平板分离培养基，表明所筛选菌株具有转化栀子苷生成栀子蓝色素的能力。
图2为转红菌株的筛选结果图，右边试管中的栀子红色素溶液是从左边的三角瓶中取出的1mL发酵液稀释30倍而来，说明筛选到的菌株具有转化栀子苷酸生成栀子红色素的能力。
图3为A1菌株的菌落形态图，A1菌株在PDA培养基上28℃培养3d后，菌落呈圆形菌丝体正面白色，背面白色，老后成灰色，质地疏松，中央隆起。
图4为A1菌株番红染色后的显微镜观察图(20×)，A1菌株孢子为球形。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所用到的溶液或培养基如下：
栀子苷溶液、栀子苷酸溶液的制备：
(1)栀子苷溶液的收集
将栀子果粉碎，过40目筛，精确称取40g栀子粉于500mL烧杯中，加入400mL去离子水(料液比1:10)，在60℃的条件下水浴浸提1h，抽滤，滤液即是栀子黄色素粗提液。栀子黄粗提液经大孔树脂AB-8吸附后，分别用4BV水、5BV 20％乙醇以及6.5BV 60％乙醇冲洗，60％乙醇冲洗部分主要含有栀子黄色素，水冲洗和20％乙醇冲洗部分是精制栀子黄色素过程中产生的废液，废液中含有栀子苷。收集水冲洗和20％乙醇冲洗部分并合并，60℃旋转蒸发浓缩10倍得到栀子苷溶液，备用。
(2)栀子苷酸溶液的制备
浓缩后的栀子苷溶液取出一部分，添加占溶液质量10％的氢氧化钠，50℃磁力搅拌加热4h；然后添加占溶液质量25％柠檬酸，搅拌至柠檬酸完全溶解，即得栀子苷酸溶液，4℃冰箱冷藏备用。
培养基的配方：
平板分离培养基：栀子苷溶液8％，谷氨酸钠0.1％，蛋白胨0.5％，KH2PO4 1％，MnSO40.05％，琼脂1.5％。若未特殊说明，本文中培养基或溶液中的“％”含义指100mL培养基或溶液中某成分多少g，比如谷氨酸钠0.1％指100mL平板分离培养基中谷氨酸钠的量为0.1g。
PDA培养基：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂1.5％。
复筛培养基：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，栀子苷溶液10％。
霉菌种子培养基：葡萄糖1％，酵母膏0.5％，NaNO3 0.3％，MnSO4 0.2％，KH2PO4 0.2％。
霉菌发酵培养基：麸皮2％(麸皮加水煮沸经4层纱布过滤得到的滤液)，蛋白胨2％，KH2PO4 0.2％，MnSO4 0.2％。
实施例1栀子蓝色素、栀子红色素转化菌株的筛选
(1)土壤中转蓝菌株的筛选
初筛：称取1g土样加入20mL无菌水充分震荡制成土样悬液。吸取土样悬液作10倍梯度稀释，取不同稀释梯度的土样悬液0.2mL在平板分离培养基上涂布，每个稀释度涂3个平板，置于30℃生化培养箱中培养3-5d后观察。3-5d后若发现平板由透明变成蓝色，如图1所示，则说明土样中可能含有目的菌株。挑取能在平板分离培养基上产生蓝色菌圈的菌株经划线分离，得到单菌落，在PDA斜面培养基上做斜面保藏。
复筛：接种初筛中转蓝效果好的菌株到复筛培养基中进行复筛，30℃、180r/min摇床培养3-5d。取发酵液稀释一定的倍数，测其在590nm下的吸光度，将A590值最大的菌株保藏起来。
(2)转红菌株的筛选
分别挑取3环斜面活化后的复筛霉菌(由后面的实验结果知目的菌株为霉菌)于霉菌种子培养基中，80mL/250mL锥形瓶，29℃、180r/min摇床培养3d后接种到霉菌发酵培养基中，80mL/250mL锥形瓶，29℃、180r/min摇床培养5d。然后分别加入20mL栀子苷酸溶液、5g谷氨酸钠，50℃厌氧培养20h后，沸水浴灭酶0.5h，观察发酵液颜色情况，如图2所示发酵液变成红色，将转红效果最好的菌株保藏起来，该菌株即为本发明高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株，将其命名为A1。
对A1菌株进行形态特征(图3、4)和18S rRNA测序(18S rRNA测序结果如SEQ ID NO.1所示)，鉴定结果显示A1菌株为小克银汉霉菌属。A1菌株于2016年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，其分类命名为小克银汉霉A1Cunninghamella sp.A1，保藏编号为CCTCC NO：M 2016124。
实施例2栀子蓝色素、栀子红色素的转化率
栀子蓝色素的转化体系为：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，栀子苷溶液10％。栀子红色素的转化体系为：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，栀子苷酸溶液10％。
接种3环A1菌株的菌丝或黑曲霉(黑曲霉作为对照)菌丝到转化体系中，立即测转化体系的A238值，记为A0。29℃、180r/min摇床培养7d后再测转化体系的A238值，记为A1，按转化率＝(A0-A1)/A0×100％计算菌株将栀子苷、栀子苷酸转化为栀子蓝色素、栀子红色素的转化率，结果见表1和2。
表1.A1菌株对栀子苷、栀子苷酸的转化率
表2.黑曲霉对栀子苷、栀子苷酸的转化率
实施例3固态发酵转化栀子蓝色素、栀子红色素
1、固态发酵转化栀子蓝色素
(1)麸皮和营养液按照质量比1:1的比例混合，然后添加占固液质量20％的栀子苷溶液、5％的谷氨酸钠，然后接种3环A1菌株或黑曲霉，发酵温度32℃，发酵时间为5d。营养液按照1％硫酸铵、0.4％磷酸二氢钾、0.2％硫酸锰配制，然后调pH为6.0。
(2)栀子蓝色素的浸提：发酵5天后，在40℃下将固态发酵产物与50％乙醇溶液按照料液质量比1:8水浴浸提1h(间歇搅拌)。然后用4层纱布过滤，将滤液8000r/min离心10min，上清液即为栀子蓝色素溶液，测其色价，结果见表3。
色价E＝AV/100m式中，E表示用1cm比色皿、波长为440nm、溶液浓度为1％时的色价，A为溶液吸光度值；V为溶液的体积(mL)，m为质量(g)。
2、固态发酵转化栀子红色素
(1)麸皮和营养液按照质量比1:1的比例混合，然后接种3环A1菌株或黑曲霉，发酵温度32℃，发酵时间为5d。营养液按照1％硫酸铵、0.4％磷酸二氢钾、0.2％硫酸锰配制，然后调pH为6.0。
(2)发酵5天后，往固态发酵产物中添加占固液质量25％的栀子苷酸溶液、5％的谷氨酸钠，50℃厌氧培养20h。
(3)栀子红色素的浸提：20h后，在40℃下将固态发酵产物与60％乙醇溶液按照料液质量比1:5水浴浸提0.5h(间歇搅拌)。然后用4层纱布过滤，将滤液8000r/min离心10min，上清液即为栀子红色素溶液，测其色价，色价表示方式同上，结果见表3。
表3.菌株A1和对照菌株黑曲霉转化生成的栀子蓝色素、栀子红色素的色价
由表3可知，由A1菌株转化生成的栀子蓝色素、栀子红色素色价均比较高，比对照组黑曲霉转化生成的栀子蓝色素、栀子红色素色价分别提高了35.8％和74.5％，具有较高的应用潜能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北工业大学
<120> 一株高效转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1627
<212> DNA
<213> Cunninghamella sp.
<400> 1
gctcattaaa tcagttatga tctacatgac aaatttttta ctactggata accgtggtaa 60
ttctagagct aatacatgca gaaaagccct gacttcggaa ggggtgcact tattaggtaa 120
aaaccatccc acctttaccg gtggttttat ggtgactcat aataattaag ctgatcgcat 180
ggccttgagc cggcgacggt acattcgatt ttctgcccta tcaggcttat gatggtaagg 240
tagtggctta ccatggctat cacgggtaac ggggaattag ggttcgattc cggagaggga 300
gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta cccaataccg 360
acacggtgag gtagtgacaa taaataacaa tgcagggtct ttatggtctt tgcaattgga 420
atgagtacaa tttaaatccc ttaacgagga tcaattggag ggcaagtctg gtgccagcag 480
ccgcggtaat tccagctcca aaagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa acgtccgtag 540
tcgaacttac gccttgtggc tatgcagctg gtcattcatt tggctagatt tgttttagcc 600
cgggtgataa agtttgggta tgatcatgtt ggcttcggtc ggtgtggttc tctgcccaag 660
cgtattacca tgagcaaatc agaatgctca aagtaggcct tcgtgcctga atgtgttagc 720
atggaataat gaaataggac cctagtcttg ttttgttggt atacttgacc ttgggaaatg 780
atgaatagga acggttgggg gcatttgtat ttggtcgcta gaggtgaaat tcttggattg 840
accgaagaca aacaactgcg aaagcatttg acctaggacg tttccattga tcagggacta 900
aagttgaggg atcgaagacg attagatacc gtcgtagtct taaccacaaa ctatgccgac 960
tagcgattgg atcctcgcca ctggcaggat tcagcagctt agcgaaagta aagtttttgg 1020
gttctggggg gagtatggga cgcaaggctg aaacttaaag gaattgacgg aagggcacca 1080
ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg gaaactcacc aggtccagac 1140
ataataagga ttgacagatt gaaagctctt tctagatttt atgggtggtg gtgcatggcc 1200
gttcttagtt cgtggagtga tttgtctggt taattccgat aacgaacgag accttattct 1260
gctaattagc tgggccaact ttttagttgg tagtttctag atttcggtct agccagcttc 1320
ttagagagac tactgaatac aattcagggg aagttttagg caataacagg tctgtgatgc 1380
ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacaaa gtcaacgagt ttattttata 1440
ccttggccgg aaggtctggg gaaacttttg aaactttgtc gtgctgggga tagagcattg 1500
caattattgc tcttcaacga ggaattccta gtaagcgtaa ctcatcaggt tgcgttgatt 1560
acgtccctgc cctttgtaca caccgcccgt cgctactacc gattgaatgg tcatagtgag 1620
catgtgg 1627

Claims (4)

1.一种转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：将筛选样本用无菌水制成悬液，悬液稀释后在含有栀子苷/栀子苷酸的固体培养基上涂布，挑取能产生蓝色/红色菌圈的菌株经划线分离，得到单菌落；将单菌落菌株再接种到含有栀子苷酸/栀子苷的液体培养基中培养，发酵液变成红色/蓝色的菌株即为转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株。
2.一种转化栀子蓝色素、栀子红色素的菌株，其特征在于：保藏编号为CCTCC NO：M2016124。
3.权利要求2所述的菌株在栀子蓝色素生产中的应用。
4.权利要求2所述的菌株在栀子红色素生产中的应用。
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