CN1281761C - 利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其步骤为利用菌株分类为Deinococcus radiodurans的耐辐射球菌，接种于TGY固体培养基活化、传代，将活化的液体种子接入以豆饼粉配制成的豆饼粉培养基进行发酵培养，将培养好的菌体发酵液，离心，水洗，萃取，提取天然类胡萝卜素。用本发明提供的生产工艺，可得类胡萝卜素干品2.27g/L，同时具有生产工艺流程简单、易控、成本低的优点。耐辐射球菌属于原核生物，菌株繁殖快，生产周期更短，适合于大规模的生产。
Description
技术领域
本发明属发酵工艺，主要涉及生产天然类胡萝卜素的发酵工艺，尤其是关于利用耐辐射球菌Deinococcus radiodurans生产天然类胡萝卜素的生产工艺。
背景技术
类胡萝卜素是一类重要的植物色素，在自然界中，广泛存在于各种植物中，在动物及微生物中也有发现。大量的研究证实，除了对眼病的医疗作用外，类胡萝卜素在对心血管疾病、某些肿瘤、衰老、光敏性疾病，白内障的发生发展具有一定的预防、延缓及治疗作用。特别是它还能提高人的免疫功能。近年来类胡萝卜在临床医学、临床药理、食品工业及化妆品工业等方面的应用与研究的迅猛发展，催生了类胡萝卜素的工业化生产。类胡萝卜素作为天然色素，饲料添加剂，具有相当的药用价值。
目前，天然的类胡萝卜素的制备主要有两种来源：①植物(如胡萝卜、盐藻、杜氏藻)来源的天然类胡萝卜素②微生物来源的天然类胡萝卜素。由于利用植物提取天然类胡萝卜素工艺复杂，利用藻类进行的生产不易于控制，且成本都很高，所以利用生长周期短，生产工艺更简单而且成本更低的微生物进行大规模的天然类胡萝卜素生产具有显著的优势。目前已发现能合成类胡萝卜素的主要微生物有瑞士乳杆菌、粘红酵母、布拉克须霉、三孢布拉氏霉等。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，本发明所用的耐辐射球菌的菌株分类为Deinococcusradiodurans，保藏号为：ATCC NO.13939，菌种编号为R1，本发明的生产工艺的步骤为：
(1)菌种的活化、传代：将耐辐射球菌划线接种于蛋白胨酵母提取物葡萄糖(TGY)固体培养基上，30-32℃培养45-48h，挑取单菌落接种于三角瓶培养至对数生长期，TGY固体培养基组成为蛋白胨5g/l，酵母提取物3g/l，葡萄糖1g/l。
(2)发酵培养：将(1)中活化的液体种子接入以豆饼粉配制成的豆饼粉培养基进行发酵培养，pH 6.0～8.0，30℃培养32-36h，豆饼粉培养基的配方主要为豆饼粉、添加碳源和/或添加氮源，豆饼粉优选30g/l，添加碳源主要为葡萄糖、蔗糖，优选葡萄糖1～3g/l，最优选葡萄糖3g/l，蔗糖1～3g/l，添加氮源优选硝酸钠0.5～1.5g/l，最优选硝酸钠1.5g/l。
(3)天然类胡萝卜素的提取：取出(2)中培养好的菌体发酵液，离心，水洗湿菌体，加入一定量的甲醇，室温下振荡，5000rpm离心10分钟，取上清，加入等体积的氯仿和水，进行二次萃取，收集下层有机相，真空干燥即为类胡萝卜素干品。甲醇加入量为菌液∶甲醇(V/V)＝5∶3，在上清液中加入等体积的氯仿和水，比例为氯仿∶水(V/V)＝3∶1。
本发明所述的微生物为耐辐射球菌菌种Deinococcus radiodurans及其变种。
本发明的优点在于：
(1)在由本发明提供的优选天然液体培养基中，经提取可得天然类胡萝卜素干品2.27g/l；
(2)该工艺流程较一般微生物发酵提取更为简单，成本更低；
(3)耐辐射球菌属于原核生物，菌株繁殖快，生产周期更短，适合于大规模的生产。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明作进一步的说明，这些实例应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明中所用的微生物是耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans R1)，一类能忍受紫外线、放射线、干旱等极端环境的原核微生物，该菌的生物学特征是，与其他物种比较，它具有超强的耐辐射能力和DNA修复能力。有学者将这种菌的抗氧化能力归因于其中的类胡萝卜素物质，同时认为它是这种红色菌的颜色来源。本发明利用耐辐射球菌可产天然类胡萝卜素2.27g/l。
实施例1：以豆饼粉30g/l配制成的培养基(PH＝7.0)进行发酵培养提取为例
(1)将耐辐射球菌划线接种于TGY固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/l，酵母提取物3g/l，葡萄糖1g/l，32℃培养48h，挑取单菌落接种于三角瓶培养至对数生长期；
(2)将上述液体种子按体积的2％接种量接入含豆饼粉30g/l的天然培养基(PH＝7.0)，于30℃培养36h，进行发酵培养；
(3)取一定量培养好的菌体发酵液，经5000rpm离心10分钟，然后水洗两次，按发酵液∶甲醇(V/V)＝5∶3的比例，加入一定量的甲醇，室温下振荡0.5h，5000rpm离心10分钟，取上清；按氯仿∶水(V/V)＝3∶1的比例，在上清液中加入等体积的氯仿和水，进行二次萃取，混匀后静置一段时间，收集下层有机相，真空干燥得类胡萝卜素干品1.25g/l，而对照组(经TGY发酵培养)产类胡萝卜素0.80g/l，是对照组的1.56倍。
实施例2：以由豆饼粉30g/l，葡萄糖1g/l配置成的培养基进行发酵培养为例
(1)将耐辐射球菌划线接种于TGY固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/l，酵母提取物3g/l，葡萄糖1g/l，32℃培养48h，挑取单菌落接种于三角瓶培养至对数生长期；
(2)将上述液体种子按体积的2％接种量接入由豆饼粉30g/l，葡萄糖1g/l配制成的培养基(PH＝7.0)，于30℃培养36h，进行发酵培养；
(3)取一定量培养好的菌体发酵液，经5000rpm离心10分钟，然后水洗两次，按发酵液∶甲醇(V/V)＝5∶3的比例，加入一定量的甲醇，室温下振荡0.5h，5000rpm离心10分钟，取上清；按氯仿∶水(V/V)＝3∶1的比例，在上清液中加入等体积的氯仿和水，进行二次萃取，混匀后静置一段时间，收集下层有机相，真空干燥得类胡萝卜素干品1.89g/l，而对照组(经豆饼粉天然培养基培养)产类胡萝卜素1.25g/l，是对照组的1.51倍。
实施例3：以豆饼粉30g/l，蔗糖1g/l配制成的培养基进行发酵培养提取为例
(1)将耐辐射球菌划线接种于TGY固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/l，酵母提取物3g/l，葡萄糖1g/l，32℃培养48h，挑取单菌落接种于三角瓶培养至对数生长期；
(2)将上述液体种子按体积的2％接种量接入由豆饼粉30g/l，蔗糖1g/l配制成的培养基(PH＝7.0)，于30℃培养36h，进行发酵培养；
(3)取一定量培养好的菌体发酵液，经5000rpm离心10分钟，然后水洗两次，按发酵液∶甲醇(V/V)＝5∶3的比例，加入一定量的甲醇，室温下振荡0.5h，5000rpm离心10分钟，取上清；按氯仿∶水(V/V)＝3∶1的比例，在上清液中加入等体积的氯仿和水，进行二次萃取，混匀后静置一段时间，收集下层有机相，真空干燥得类胡萝卜素干品1.74g/l，而对照组(经豆饼粉天然培养基培养)产类胡萝卜素1.25g/l，是对照组的1.39倍。
实施例4：以由豆饼粉30g/l，硝酸钠0.5g/l配置成的培养基(PH＝6.0)进行发酵培养为例
(1)将耐辐射球菌划线接种于TGY固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/l，酵母提取物3g/l，葡萄糖1g/l，32℃培养48h，挑取单菌落接种于三角瓶培养至对数生长期；
(2)将上述液体种子按体积的2％接种量接入由豆饼粉30g/l，硝酸钠0.5g/l配制成的培养基(PH＝7.0)，于30℃培养36h，进行发酵培养；
(3)取一定量培养好的菌体发酵液，经5000rpm离心10分钟，然后水洗两次，按发酵液∶甲醇(V/V)＝5∶3的比例，加入一定量的甲醇，室温下振荡0.5h，5000rpm离心10分钟，取上清；按氯仿∶水(V/V)＝3∶1的比例，在上清液中加入等体积的氯仿和水，进行二次萃取，混匀后静置一段时间，收集下层有机相，真空干燥得类胡萝卜素干品1.30mg/ml，而对照组(经豆饼粉天然培养基培养)产类胡萝卜素1.25g/l，是对照组的1.04倍。
实施例5：以豆饼粉，葡萄糖3g/l，硝酸钠1.5g/l配置成的培养基(PH＝6.0)进行发酵培养提取为例
(1)将耐辐射球菌划线接种于TGY固体培养基上，培养基组成为蛋白胨5g/l，酵母提取物3g/l，葡萄糖1g/l，32℃培养48h，挑取单菌落接种于三角瓶培养至对数生长期；
(2)将上述液体种子按体积的2％接种量接入由豆饼粉，葡萄糖3g/l，硝酸钠1.5g/l配置成的培养基(PH＝6.0)，于30℃培养36h，进行发酵培养；
(3)取一定量培养好的菌体发酵液，经5000rpm离心10分钟，然后水洗两次，按发酵液∶甲醇(V/V)＝5∶3的比例，加入一定量的甲醇，室温下振荡0.5h，5000rpm离心10分钟，取上清；按氯仿∶水(V/V)＝3∶1的比例，在上清液中加入等体积的氯仿和水，进行二次萃取，混匀后静置一段时间，取下层有机相，真空干燥得类胡萝卜素干品2.27g/l，而对照组(经豆饼粉天然培养基培养)产类胡萝卜素1.25g/l，是对照组的1.82倍。
本发明通过以上描述和实施例进行了说明，以上描述为非限制性的，并不限制本发明的权利要求范围。
Claims (9)
1.一种利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，所用耐辐射球菌的菌株分类为Deinococcus radiodurans，保藏号为ATCC NO.13939，菌种编号为R1，其特征是该生产工艺由以下三个步骤组成：
(1)菌种的活化、传代：将耐辐射球菌划线接种于蛋白胨酵母提取物葡萄糖固体培养基上，30-32℃培养45-48h，挑取单菌落接种于三角瓶培养至对数生长期；
(2)发酵培养：将(1)中活化的液体种子按体积的2％接种量接入以豆饼粉配制成的培养基进行发酵培养，pH6.0～8.0，30℃培养32-36h；
(3)天然类胡萝卜素的提取：取出步骤(2)中培养好的菌体发酵液，离心，水洗湿菌体，加入一定量的甲醇，室温下振荡，5000rpm离心10分钟，取上清，加入等体积的氯仿和水，进行二次萃取，收集下层有机相，真空干燥即为类胡萝卜素干品。
2.如权利要求1所述的利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其特征是：步骤(2)中以豆饼粉配制成的培养基组成为豆饼粉、添加碳源和/或添加氮源。
3.如权利要求1或2所述的利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其特征是：以豆饼粉配制成的培养基，添加碳源为葡萄糖或蔗糖。
4.如权利要求1或2所述的利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其特征是：以豆饼粉配制成的培养基，添加氮源为硝酸钠。
5.如权利要求3所述的利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其特征是：添加碳源选用1～3g/l葡萄糖或1～3g/l蔗糖。
6.如权利要求4所述的利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其特征是：添加氮源选用0.5～1.5g/l硝酸钠。
7.如权利要求1或2所述的利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其特征是：以豆饼粉配制成的培养基中选用30g/l豆饼粉。
8.如权利要求1所述的利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其特征是：步骤(3)所述的甲醇加入量选用体积比为发酵液∶甲醇＝5∶3。
9.如权利要求1所述的利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺，其特征是：步骤(3)所述的在上清液中加入氯仿和水，选用体积比为氯仿∶水＝3∶1。
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