CN115029274B - 产类胡萝卜素的奇异球菌属新菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及产类胡萝卜素的奇异球菌属新菌株及其用途。目前，现有报道其他类异球菌产类胡萝卜素很少，还有待进一步开发产类胡萝卜素的新菌种。本发明提供了一种产类胡萝卜素的奇异球菌属新菌株，保藏编号为CGMCC NO.22044。本发明的奇异球菌属新菌株的温度耐受为20‑40℃，乙醇耐受浓度为≤6％，盐度耐受为≤4％，pH耐受范围为5‑10；能够高产类胡萝卜素，产量达到262.5ppm。本发明新菌株为产胡萝卜素提供新的功能微生物菌，丰富了微生物的资源，在医药、食品、化妆等领域具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及产类胡萝卜素的奇异球菌属新菌株及其用途。
背景技术
自然环境中可培养的微生物的种类百分比很低，如海水中为0.1％以下，在土壤中约为0.3％。传统固态白酒中可培养微生物也不例外，通过高通量测序，我们发现大多数不可培养微生物，然而，使用传统的细菌培养方法仅能培养自然环境中的一小部分细菌。应用传统方法培养出的微生物都是已知微生物，尚未发现新的微生物物种。
类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，由植物和某些光合微生物生产的一类呈黄色、橙红色或红色的多烯类化合物。所有类胡萝卜素由8个类异戊二烯单位组成，一般在波长300-600nm之间有吸收峰。类胡萝卜素具有维持细胞正常代谢、延缓衰老等功能，在机体内具有较强的抗氧化活性，可保护机体细胞免受自由基损伤，可以降低肿瘤、癌症、血栓和动脉硬化、代谢综合征、肥胖、心血管疾病等的发病率。类胡萝卜素具有保健、着色、营养等多重功能，可用于医药、食品、化妆品和饲料等工业。产类胡萝卜素的微生物主要有酵母菌、细菌等，其中有报道属于异球菌属的耐辐射球菌能产类胡萝卜素，而关于其他类异球菌产类胡萝卜素的报道很少，因此，还有待进一步开发产类胡萝卜素的新菌种。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：绝大多数新的微生物物种还没培养出来，需要开发；现有产类胡萝卜素的微生物种类较少，需要开发。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了产类胡萝卜素的奇异球菌属新菌株。所述的奇异球菌属新菌株，保藏编号为CGMCC NO. 22044。保藏时间为2021年3月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
其中，上述奇异球菌属新菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO:1 上述奇异球菌属新菌株的16S rDNA核苷酸序列
GAACGCAGTCGCAAGACTGAGTGGCGCACGGGTGAGTAACACGTAACTGACCTACCTCAAAGTTGCGAATAACCAGCCGAAAGGATGGCTAATACGTGATGTGAACATCGGCCATGGCCGATGTTTAAAGACTTGATCGCTTTGAGATGGGGTTGCGTTCCATCAGCTAGATGGTGGGGTAAAGGCCTACCATGGCGACGACGGATAGCCGGCCTGAGAGGGTGGCCGGCCACAGGGGCACTGAGACACGGGTCCCACTCCTACGGGAGGCAGCAGTTAGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCGACGCCGCGTGAGGGAAGAAGGTTCTCGGATCGTAAACCTCTGAACCAACGACGAAAGACCCGACAAGGGGGATGACGGTAGTTGGGTAATAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTACCCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGCGTGTAGGCGGCTTTGTAAGTCTGGTTTTAAAGACCGAGGCTCAACCTCGGGAGTGGACTGGATACTGTGAGGCTTGACCTCTGGAGAGGAAACCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATACCAGGAGGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTTTCTGGACAGAAGGTGACGCTGAGGCGCGAAAGTGTGGGGAGCGAACCGGATTAGATACCCGGGTAGTCCACACCCTAAACAATGTACGTTGGCTTATGGCGGGATGCCGTCATGGGCGAAGCTAACGCGATAAACGTACCGCCTGGGAAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTACGAACCCCTCGGAGATGAGGGGGTGCTCTTCGGAGAGCGTAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTACCTTTAGTTGTCAGCATTGAGTTGGACACTCTAGAGGGACTGCCTATGAAAGTAGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCTAGTCAGCATGGTCCTTACGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCAAGACAACGCGCAGCCAAGTCGCGAGACTGAGCGAATCGCTGAAACTTGGCCCCAGTTCAGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTACGTTGCAGTTGAAACCATCGGGAGCTG。
其中，上述奇异球菌属新菌株的温度耐受为20-40℃，乙醇耐受浓度为≤6%，盐度耐受为≤4%，pH耐受范围为5-10。
其中，上述奇异球菌属新菌株高产类胡萝卜素。
其中，上述奇异球菌属新菌株高产类胡萝卜素，产量达到262.5ppm干菌体。
上述奇异球菌属新菌株的细胞学特征为：菌落呈红色，表面湿润，边缘整齐；细胞形态为：呈球状。
其中，上述奇异球菌属新菌株的生物学特征为：能够利用硝酸钾、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、癸酸、马尿酸盐、七叶灵（柠檬酸铁）、2-萘基-β-D-半乳糖苷、2-萘基磷酸、L-亮氨酸-β-萘胺、淀粉。不能利用丙酮酸钠、吡咯烷酮-2-奈胺、6-溴萘-α-D-半乳糖苷、萘酚-ASB1-β-D 葡萄糖醛酸盐、精氨酸、核糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、菊糖、棉子糖。
本发明还提供了上述奇异球菌属新菌株在微生物发酵中的用途。
本发明还提供了上述的奇异球菌属新菌株在产生类胡萝卜素物质或制备类胡萝卜素的微生物菌剂中的用途。
有益效果：
本发明从浓香型白酒酿造环境中筛选得到了一株新菌株奇异球菌，保藏编号为CGMCC NO. 22044，本发明的奇异球菌属新菌株的温度耐受为20-40℃，乙醇耐受浓度为≤6%，盐度耐受为≤4%，pH耐受范围为5-10；能够高产类胡萝卜素，产量达到262.5ppm，因此，本发明的菌种可以广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。本发明为产类胡萝卜素提供了一种新的微生物，在食品、医药、化妆品领域具有很广阔的应用空间。
本发明的奇异球菌属新菌株于2021年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为：CGMCC NO. 22044。保藏单位为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。分类命名为Deinococcus sp.。
附图说明
图1为本发明奇异球菌属新菌株形态图，其中A：菌落图；B：细胞图；
图2为本发明奇异球菌属新菌株的16S rDNA系统发育树图；
图3为本发明奇异球菌属新菌株的耐受温度图；
图4为本发明奇异球菌属新菌株的耐乙醇能力图；
图5为本发明奇异球菌属新菌株的耐受盐度图；
图6为本发明奇异球菌属新菌株的耐受pH图。
具体实施方式
本发明提供了一株菌株奇异球菌属新菌株，其是在宜宾五粮液股份有限公司酿造环境中筛选得到的，命名为WLY-B-L7。本发明的新菌株已于2021年3月22日进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.22044，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明所述的新菌株奇异球菌WLY-B-L7的温度耐受为20-40℃，乙醇耐受浓度为≤6%，盐度耐受为≤4%，pH耐受范围为5-10。
本发明所述的奇异球菌属新菌株WLY-B-L7产类胡萝卜素，产量为262.5ppm干菌体。
本发明奇异球菌WLY-B-L7为新菌种菌株，补充了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中使用的分离培养基PCA组成包括：胰蛋白胨5份、酵母浸粉2.5份，葡萄糖1份，纳他霉素2份、溶于1000份蒸馏水中，再混合后用NaOH调节pH至7.2。
实施例中使用的培养基NA组成包括：牛肉浸膏3份、蛋白胨5份、葡萄糖2.5份，1000ml蒸馏水，NaOH调节pH至7.0。
实施例中使用的斜面和平板为相应培养基中加入2%的琼脂粉。
实施例中的乙醇浓度为体积浓度。
实施例1 新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的分离、筛选和鉴定
（一）分离、筛选
将取自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间的空气样品，利用PCA培养基筛选细菌。用浮游菌采样器（浙江苏净净化设备有限公司，FKC-I型）采样一分钟（100L空气），采样重复3次。37℃静置培养3天，挑选平板上的菌落进行划线后培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株，斜面保存。菌株命名为WLY-B-L7。
（二）分类、鉴定
1、菌株的形态学特征
分离得到的WLY-B-L7菌株为革兰氏阳性，菌落呈红色，表面湿润，边缘整齐；细胞形态为：呈球状。
2、生理生化特性
上述奇异球菌属新菌株的生物学特征为：能够利用硝酸钾、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、癸酸、马尿酸盐、七叶灵（柠檬酸铁）、2-萘基-β-D-半乳糖苷、2-萘基磷酸、L-亮氨酸-β-萘胺、淀粉。不能利用丙酮酸钠、吡咯烷酮-2-奈胺、6-溴萘-α-D-半乳糖苷、萘酚-ASB1-β-D葡萄糖醛酸盐、精氨酸、核糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、菊糖、棉子糖。
3、16S rDNA鉴定
将菌株WLY-B-L7接种于NA培养基中，37℃静置培养3天，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒（上海生工生物，SK8255）提取基因组DNA，-20℃保藏备用。
利用引物27F和1492R对细菌基因组16S rDNA进行扩增，27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG（SEQ ID NO:2），1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT（SEQ ID NO:3）。
扩增体系（共25μL）：10×PCR buffer 2.5μL，dNTP （2.5mmol/L each） 1μL，DNA10 ng，引物 F（10μmol/L） 0.5μL，引物R （10μmol/L）0.5μL，加双蒸水至25μL。扩增程序:：94 ℃ 4 min; 94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30个循环；72℃ 10 min，4℃终止反应。
16S rDNA序列测定：利用胶回收试剂盒（NO. B110092、上海生工生物）进行PCR扩增产物的纯化；纯化产物的测序工作由中国工业微生物菌种保藏管理中心完成，测定结果得到菌株WLY-B-L7的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
系统发育树构建：将所测定的细菌16S rDNA基因序列分别与GenBank数据库进行BLASTn相似性分析，与实验菌株亲缘关系最近的模式菌株Deinococcus fonticolaFeSDHB5-19T(LT853728)相似度为95.56%，小于临界值98.65%。选取与实验菌株亲缘关系相对较近的标准菌株用Clustalw软件进行序列比对，采用MEGA 7软件进行系统发育分析，构建系统发育树，如图2所示。
综合菌体形态、生理生化特性、16S rDNA基因序列分析，将菌株WLY-B-L7鉴定为奇异球菌（Deinococcus sp.）新菌株。该菌株WLY-B-L7于2021年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC NO.22044。
实施例2新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的耐温度能力试验
将菌株WLY-B-L7接种于液体NA培养基中活化，培养到对数生长期OD600=1.8，按照体积比5%的接种量均接种到50 mL液体NA培养基，分别放置在不同温度(20、25、30、35、40和45℃)的培养箱中培养3天。利用紫外/可见光分光光度计(Eppendorf Bio Spectrometer)测定吸光度OD600。计算培养后与前的OD600差值，结果如图3所示。
由图3可知，菌株WLY-B-L7在20℃和40℃培养后其OD600差值分别为0.95和0.56，而当温度为15℃和45℃时，其OD600差值几乎为0，表明基本不生长。因此菌株WLY-B-L7的温度耐受能力为20-40℃。
实施例3新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的耐乙醇能力试验
将菌株WLY-B-L7接种于液体NA培养基中活化，培养到对数生长期OD600=1.8，按照体积比5%的接种量均接种到含不同浓度乙醇(2%、4%、6%、8%和10%)的100 mL液体NA培养基，37℃培养3天。利用紫外/可见光分光光度计(Eppendorf Bio Spectrometer)测定吸光度OD600。计算培养后与前的OD600差值，结果如图4所示。
由图4可知，菌株WLY-B-L7在乙醇浓度为6%的NA培养基中培养后其OD600差值为0.51，而当乙醇浓度为8%时，其OD600差值几乎为0，表明基本不生长。因此菌株WLY-B-L7的乙醇耐受能力为6%。
实施例4新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的耐盐能力
将菌株WLY-B-L7接种于液体NA培养基中活化，培养到对数生长期OD600=1.8，按照体积比5%的接种量均接种到含不同NaCl (0%、2%、4%和6%)的100 mL液体NA培养基，37℃培养3天。利用紫外/可见光分光光度计(Eppendorf Bio Spectrometer)测定吸光度OD600。计算培养后与前的OD600差值，结果如图5所示。
由图5可知，菌株WLY-B-L7在NaCl为4%的NA培养基中培养后其OD600差值为0.23，而当NaCl浓度为6%时，其OD600差值几乎为0，表明不生长。因此菌株WLY-B-L7的NaCl耐受能力为4%。
实施例5新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的耐酸能力
将菌株WLY-B-L7接种于液体NA培养基中活化，培养到对数生长期OD600=1.8，按照体积比5%的接种量均接种到含不同pH(4、5、6、7、8、9、10和11)的100 mL液体NA培养基，37℃培养3天。利用紫外/可见光分光光度计(EppendorfBioSpectrometer)测定吸光度OD600。计算培养后与前的OD600差值，结果如图6所示。
由图6可知，菌株WLY-B-L7在pH为5和10的NA培养基中培养后其OD600差值为1.96和0.28，而当pH为4和11时，其OD600差值几乎为0，表明不生长。因此，菌株WLY-B-L7的pH耐受范围为5-10。
实施例6新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的产类胡萝卜试验
1、类胡萝卜素提取
将菌株WLY-B-L7接种于液体NA培养基中活化，培养到对数生长期OD600=1.8，按照体积比5%的接种量均接种到含250mLNA培养基中，37℃摇床培养3天，转速为180rpm。菌液培养好后，将发酵液分装在50mL离心管中，10000rpm条件下离心5min，弃上清，收集细胞，用无菌水洗2次后，过夜冷冻菌体，再进行真空冷冻干燥。准确称取0.1g干燥的菌体，加入2.5ml甲醇溶液溶解菌体，室温避光振荡30min，在10000rpm条件下离心5min，收集液体，重复提取2次至菌体呈无色，-20℃保存提取液。
2、类胡萝卜素HPLC定性分析
将上述提取液用0.22μm滤膜过滤后作为待测样品。利用HPLC测定发酵液中类胡萝卜素，进行定性分析。色谱程序为：柱温30℃；流动相：甲醇：乙腈：异丙醇=5:4:1（v:v:v）；流速：1mL/min。检测波长：486 nm。结果显示有类胡萝卜素的特征吸收峰，保留时间为2.85min。另外还有几个产物峰，说明其类胡萝卜素组成复杂。
3、类胡萝卜素总含量测定
为了测定总类胡萝卜素含量，按照文献报道（孔维宝,杨洋,陈冬,汪洋,达文燕,牛世全.1株类胡萝卜素产生菌的鉴定及其发酵培养基的优化[J].食品科学,2018,39(24):108-115.），按公式计算类胡萝卜素含量：
类胡萝卜素含量=(A*D*V)/(0.16*W)
式中：A为提取液在最大吸收波长处的吸光度；D为稀释的倍数；V溶剂的体积／mL；W为菌粉的质量；0.16为类胡萝卜素摩尔消光系数。
最终测得新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的产类胡萝卜含量为262.5ppm。有报道掷孢酵母产类胡萝卜素含量达到150ppm，胶红酵母产类胡萝卜素含量达到180ppm。因此新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7为产胡萝卜素提供新的功能微生物菌种，丰富了微生物的资源，在医药、食品、化妆等领域具有很好的应用价值。
实施例7新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的产类胡萝卜试验
1、类胡萝卜素提取
同实施例6。
2、类胡萝卜素含量测定
按照上海酶联生物科技有限公司的类胡萝卜素酶联免疫分析试剂盒，将类胡萝卜素提取液稀释至10-4，按照说明书进行操作，最终利用Thermoscientific酶标仪测定空白孔、标准孔和样品孔在，450nm波长下的吸光度（OD值）。
测得标准曲线方程为y=0.02144x-0.0113、R2=0.9936，x代表浓度，y代表OD值，样品测试平均值为0.031，计算最终新菌种菌株奇异球菌WLY-B-L7的产类胡萝卜含量为248.8ppm。结果与实施例6接近。
序列表
<110> 宜宾五粮液股份有限公司
<120> 产类胡萝卜素的奇异球菌属新菌株及其用途
<130> A220377K（序）
<141> 2022-06-23
<150> 202111411023.8
<151> 2021-11-25
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1352
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacgcagtc gcaagactga gtggcgcacg ggtgagtaac acgtaactga cctacctcaa 60
agttgcgaat aaccagccga aaggatggct aatacgtgat gtgaacatcg gccatggccg 120
atgtttaaag acttgatcgc tttgagatgg ggttgcgttc catcagctag atggtggggt 180
aaaggcctac catggcgacg acggatagcc ggcctgagag ggtggccggc cacaggggca 240
ctgagacacg ggtcccactc ctacgggagg cagcagttag gaatcttcca caatgggcgc 300
aagcctgatg gagcgacgcc gcgtgaggga agaaggttct cggatcgtaa acctctgaac 360
caacgacgaa agacccgaca agggggatga cggtagttgg gtaatagcac cggctaactc 420
cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta cccggaatca ctgggcgtaa 480
agggcgtgta ggcggctttg taagtctggt tttaaagacc gaggctcaac ctcgggagtg 540
gactggatac tgtgaggctt gacctctgga gaggaaaccg gaattcctgg tgtagcggtg 600
gaatgcgtag ataccaggag gaacaccaat ggcgaaggca ggtttctgga cagaaggtga 660
cgctgaggcg cgaaagtgtg gggagcgaac cggattagat acccgggtag tccacaccct 720
aaacaatgta cgttggctta tggcgggatg ccgtcatggg cgaagctaac gcgataaacg 780
taccgcctgg gaagtacggc cgcaaggttg aaactcaaag aaattgacgg gggcccgcac 840
aagcggtgga gtatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 900
tcctacgaac ccctcggaga tgagggggtg ctcttcggag agcgtagaga caggtgctgc 960
atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1020
ctacctttag ttgtcagcat tgagttggac actctagagg gactgcctat gaaagtagga 1080
ggaaggcggg gatgacgtct agtcagcatg gtccttacga cctgggctac acacgtacta 1140
caatggccaa gacaacgcgc agccaagtcg cgagactgag cgaatcgctg aaacttggcc 1200
ccagttcaga tcggagtctg caactcgact ccgtgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcag 1260
gtcagcatac tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1320
gagtacgttg cagttgaaac catcgggagc tg 1352
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtttgatcm tggctcag 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (3)
1.奇异球菌属新菌株，其特征在于：分类命名为Deinococcus sp.，保藏编号为CGMCCNO.22044。
2.权利要求1所述奇异球菌属新菌株在微生物发酵中的用途。
3.权利要求1所述奇异球菌属新菌株在产生类胡萝卜素物质或制备类胡萝卜素的微生物菌剂中的用途。
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