CN106995789B - 一株白藜芦醇发酵菌及其应用 - Google Patents

一株白藜芦醇发酵菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株白藜芦醇发酵菌及其应用，菌株的分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13129，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年10月21日，还提供一种白藜芦醇发酵菌在发酵白藜芦醇中的应用。本方法利用微生物转化法直接将虎杖粗药材中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，方法简单，转化过程容易控制，转化反应专一性和特异性较强，便于产品的分离和纯化，可有效提高白藜芦醇产品的收率和质量，提高产品的附加值。

Description

一株白藜芦醇发酵菌及其应用
技术领域
本发明属于工业微生物应用领域，具体涉及一株白藜芦醇发酵菌及其应用。
技术背景
白藜芦醇(Resveratrol)(C14H12O3)是一种植物抗毒素(phytoalexin)，属非黄酮类多酚化合物，存在于花生、葡萄、虎杖、桑椹等多种植物中。白藜芦醇具有抗癌、抗氧化、防治冠心病、高血脂、免疫调节、抗肿瘤、保护心血管系统、外涂美白、通过活化Shh(sonichedgehog)信号促进神经干细胞的存活和增殖、抗抑郁及神经保护等功能。
植物提取法提取效率低、且原料来源受限、成本高；化学合成法合成路线长、成本高、污染环境；一些其他的生物技术工业化应用少，且目前处于试验阶段。相比之下，微生物转化法和酶法转化法条件温和，操作简单，成本低廉，环境友好。
发明内容
本发明的目的在于提供一株白藜芦醇发酵菌及其应用，该菌株可转化虎杖苷生产白藜芦醇。
本发明实现目的的技术方案如下：
一株白藜芦醇发酵菌，菌株的分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13129，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年10月21日。
而且，所述菌株的发酵培养基为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，30～70％纯度的虎杖苷1～3g/L，pH自然，接种量1～5％，180～220r/min，摇瓶培养12-24h。
白藜芦醇发酵菌在发酵白藜芦醇中的应用。
而且，在37℃条件下发酵36h能够有效水解虎杖苷，30～70％纯度的虎杖苷添加量为1～3g/L时，生成白藜芦醇，转化率可达80～90％。
本发明的优点和积极效果如下：
本发明菌株的发酵液中，在37℃条件下发酵36h能够有效水解虎杖苷，30～70％纯度的虎杖苷添加量为1～3g/L时，生成白藜芦醇，转化率可达80～90％，可用于白藜芦醇的工业生产。
本发明筛选的沙福芽孢菌株具有营养要求简单、生长迅速、安全无毒等优点，在白藜芦醇的工业生产方面具有广阔的应用前景。
本方法利用微生物转化法直接将虎杖粗药材中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，方法简单，转化过程容易控制，转化反应专一性和特异性较强，便于产品的分离和纯化，可有效提高白藜芦醇产品的收率和质量，提高产品的附加值。
附图说明
图1为菌株在初筛平板上的生长情况；
图2为本发明菌株个体形态图；
图3为本发明菌株系统进化树；
图4为本发明虎杖苷水解前后发酵液的变化图；图4-a:转化前虎杖苷是可溶的；图4-b:转化后形成的白藜芦醇不溶于水；
图5为在培养基①中接种量、底物浓度与转化率的关系。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明提供一株白藜芦醇发酵菌，菌株的分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13129，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年10月21日。
本发明所述的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株通过以下方法分离、筛选得到：
⑴用100mL的生理盐水冲洗取自湖北省随州市广水市的新鲜虎杖根，浸泡摇匀后，取1mL加入到装有50mL/250mL富集培养基的三角瓶中，33～37℃，180～220r/min，摇瓶培养1～2d；其中所述富集培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L；
⑵初筛：将上述步骤⑴制备的富集培养液梯度稀释后涂布于初筛平板上，37℃培养箱中培养大约24h。观察菌落生长情况，选取菌落处蓝色较深，且蓝色部分面积较大的菌落，转接到初筛平板，编号记录。
其中，所述初筛培养基：栀子苷2g/L，精氨酸2g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，pH自然。
⑶复筛：挑取步骤⑵中蓝色较深，且蓝色部分面积较大的菌落，接到50mL/250mL种子培养基中，摇瓶培养8～12h，再按照1～5％的接种量接种到50mL/250mL的复筛培养基中，33～37℃，180～220r/min，摇瓶培养12-36h。
其中，所述种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，纤维二糖1～3g/L，pH自然；复筛培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，30～70％纯度的虎杖苷1～3g/L，pH自然。
⑷在4℃条件下，12000r/min离心步骤⑶得到的发酵液8min，弃去上清液，用20ml甲醇溶解沉淀，在4℃条件下，12000r/min离心后，取上清液，过膜，利用HPLC检测，选择转化率较高的菌株。
⑸16SrDNA基因序列测定和分析，测序得到16SrDNA序列长度为1373bp，将该基因序列登陆NCBI，通过BLAST程序与NCBI中核酸数据进行对比分析，BLAST结果表明其与芽孢杆菌属的多个沙福芽孢杆菌达到99％以上的同源性。经BLAST同源序列比较后，随机抽取其中的若干个序列构建系统进化树，结果见图4。
⑹经Biolog微生物自动分析系统，并且结合16SrDNA基因序列分析，鉴定本发明的菌株为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)。
本发明所用培养基如下：
富集培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，pH自然；
初筛培养基：纯度为30～70％的栀子苷1～3g/L，精氨酸2g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，pH自然；
复筛培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，纯度为30～70％的虎杖苷1～3g/L，pH自然；
种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，纤维二糖1～3g/L，pH自然；
发酵培养基：①牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，纯度为30～70％的虎杖苷1～3g/L，pH自然。②麸皮10g/L，蛋白胨2.5g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO47H2O 0.4g/L，纯度为30～70％的虎杖苷1～3g/L，pH 7.0。
HPLC检测方法如下：
流动相：乙腈﹕水﹕磷酸＝40﹕59.82﹕0.18
色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)
流速：1.0mLmin-1
检测波长：303nm
柱温：35℃
进样量：10μL
具体筛选实施例1
菌株的筛选、分离、鉴定
⑴菌株的筛选、分离
本发明筛选菌株所用的新鲜虎杖根采集自湖北省随州市广水市。
①富集培养：用100mL的生理盐水冲洗取自湖北省随州市广水市的新鲜虎杖根，浸泡摇匀后，取1mL加入到装有50mL/250mL富集培养基的三角瓶中，180～220r/min，33～37℃摇瓶培养1～2d；富集培养基同上。
②初筛：将步骤①制备的富集培养液梯度稀释后涂布于初筛平板上，37℃培养箱中培养大约24h。观察菌落生长情况，选取菌落处蓝色较深，且蓝色部分面积较大的菌落，转接到初筛平板，编号记录。其中初筛培养基同上；
③复筛：挑取上述步骤②中蓝色较深，且蓝色部分面积较大的菌落，接到50mL/250mL种子培养基中，摇瓶培养8～12h，再按照1～5％的接种量接种到50mL/250mL的复筛培养基中，33～37℃，180～220r/min，摇瓶培养24～48h。在4℃条件下，12000r/min离心8min后，弃去上清液，用20ml甲醇溶解沉淀，再次12000r/min离心8min后，取上清液，过膜，利用高效液相仪进行检测，选择转化率较高的菌株；所述种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，纤维二糖1g/L，pH自然；
④菌种保存：将筛选得到的菌株不断的纯化，直到平板上长出的单菌落形态、大小基本一致；再挑取上述平板上的单菌落，密集划线于固体LB培养基上，经过12h培养，挑取一定量的菌体，溶于等体积LBS和30％的甘油中，振荡混匀后，在-80℃保存，备用。
⑵菌株的鉴定
①菌落个体形态特征：菌落生长初期呈白色、不透明、光滑湿润菌落、微隆起、圆形齐整；随着时间的延长，菌落变干、单菌落中部出现一个白色突起小圈。
②革兰氏染色镜检：菌株呈革兰氏阳性、杆短小、有芽孢，芽孢中生、不膨胀，属于典型的芽孢杆菌属形态特征。
③16SrDNA基因序列测定和分析：测序得到16SrDNA序列长度为1373bp，将该基因序列登陆Genbank，通过BlAST程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，BLAST结果表明其与芽孢杆菌属的多个沙福芽孢杆菌具有达到99％以上的同源性。经BLAST同源序列比较后，随机抽取其中的若干个序列构建系统进化树，结果见图4。
⑶菌株的保藏
通过以上分离、筛选与菌株鉴定结果，确认该菌株为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)，将该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.13129。
应用实施例2
菌株在水解虎杖苷生成白藜芦醇中的应用
⑴制备种子液：挑取单菌落，接种于50mL/250mL添加有1g/L的纤维二糖的LB液体培养基中，33～37℃，180～220r/min培养，10～12h后停止培养，制得种子液。
⑵制备发酵液：按照1～3％的接种量，将种子液接种到发酵培养基中，33～37℃，180～220r/min培养16h，培养结束后，制得发酵液。
⑶在4℃条件下，12000r/min离心8min，弃去上清液，向沉淀中加入20mL甲醇，在4℃条件下，12000r/min离心8min，取上清液，过有机膜，制备高效液相样品，利用HPLC进行检测。
所述发酵培养基为：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，纯度为50％的虎杖苷1g/L，pH自然。
⑷通过HPLC检测上述步骤⑶中所述样品，通过比对白藜芦醇浓度与峰面积的标准曲线，得出其转化率最高可达90％。
应用实施例3
菌株在水解虎杖苷生成白藜芦醇中的应用
⑴制备种子液：挑取单菌落，接种于50mL/250mL添加有1g/L的纤维二糖的LB液体培养基中，33～37℃，180～220r/min培养，10～12h后停止培养，制得种子液。
⑵制备发酵液：按照3～5％的接种量，将种子液接种到发酵培养基中，33～37℃，180～220r/min培养18h，培养结束后，制得发酵液。
⑶在4℃条件下，12000r/min离心8min，弃去上清液，向沉淀中加入20mL甲醇，再次在4℃条件下，12000r/min离心8min，取上清液，过有机膜，制备高效液相样品，利用高效液相仪进行检测。
所述发酵培养基为：麸皮10g/L，蛋白胨2.5g/L，KH2PO4 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO47H2O 0.4g/L，纯度为50％的虎杖苷1g/L，pH 7.0。
⑷通过高效液相仪检测上述步骤⑶中所述样品，通过比对白藜芦醇浓度与峰面积的标准曲线，得出其转化率最高可达91％。

Claims (3)

1.一株白藜芦醇发酵菌，其特征在于：菌株名称为TCCC111022，菌株的分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13129，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年10月21日。
2.权利要求1所述的白藜芦醇发酵菌在发酵白藜芦醇中的应用。
3.权利要求2所述的白藜芦醇发酵菌在发酵白藜芦醇中的应用，其特征在于：在37℃条件下发酵36h能够有效水解虎杖苷，30～70％纯度的虎杖苷添加量为1～3g/L时，生成白藜芦醇，转化率可达80～95％。
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