CN103468606B - 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产酸克雷伯氏菌新菌种（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCCNo.7662及其在蒜糖醇生产中的应用，即将筛选的产酸克雷伯氏菌G4A4菌株制备成静息细胞，并用于蒜糖醇生产，从而弥补现有技术的不足。本发明的产酸克雷伯氏菌G4A4菌株具有核糖醇脱氢酶，该酶具有较宽的底物谱，在厌氧条件下可以将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇。本发明的产酸克雷伯氏菌G4A4菌株可应用于以D-阿洛酮糖为底物的蒜糖醇生产，可以利用简单培养基进行快速生长，能进行大规模的扩大培养，开发产酸克雷伯氏菌G4A4菌株的蒜糖醇生产功能具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域中的一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用。
背景技术
稀少糖（Rare Sugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物（2002年国际稀少糖学会ISRS定义），其味道类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜味协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，对改善特殊人群的饮食起到重要作用。另外，大量研究结果还表明稀少糖在抗癌、清除自由基、神经保护等诸多方面发挥着重要的生理活性作用，还可和蛋白及多肽等活性物质发生美拉德反应从而优化其功能活性（Zeng Y,Zhang X,Guan Y,Sun Y.Characteristics and antioxidant activity of Maillard reaction products from psicose-lysine and fructose-lysine model systems.J Food Sci.2011,76(3):C398-403；Sun Y,Hayakawa S,Ogawa M,Fukada K,Izumori K.Influence of a rare sugar,d-Psicose,on the physicochemical and functional properties of an aerated food system containing egg albumen.J Agric Food Chem.2008,56(12):4789-4796.）。功能性稀少糖具有独特的生物学活性，市场开发潜力较大。
蒜糖醇（allitol）是一种六碳稀少糖醇，具有一定的降血糖功能，而且降糖过程缓慢平稳，即使大量服用也不会发生低血糖危险，服用安全，可用于制备治疗糖尿病药物；另外，蒜糖醇具有对称性，可以作为D-型和L-型六碳稀少糖相互转化的连接中心。因此，蒜糖醇不仅可用于甜味剂、保健品、降糖药物，还可以用来生产其它稀少己糖。
目前，蒜糖醇的生产方式主要是提取法和化学转化法，生产效率低，成本高。日本的研究学者何森健（Izumori Ken）教授建立的Izumoring策略为稀少糖的生物转化提供了一条新的途径（Izumori K.Izumoring:a strategy for bioproduction of all hexoses.J Biotechnol.2006,124(4):717-722）。研究发现，某些微生物可以实现D-阿洛酮糖和蒜糖醇之间的相互转化，如集聚肠杆菌Enterobacter agglomerans221e（Muniruzzaman S,Tokunaga H,Izumori K.Conversion of D-psicose to allitol by Enterobacter agglomerans strain221e.J Ferment BioengVolume.1995,79(4):323-327），该文献报道了以D-阿洛酮糖为底物转化生 产蒜糖醇，但该菌底物特异性较差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物进行转化可能生成其它副产物；又如产气肠杆菌Enterobacter aerogenes IK7（Gullapalli P,Takata G,Poonperm W,Rao D,Morimoto K,Akimitsu K,Tajima S,Izumori K.Bioproduction of D-psicose from allitol with Enterobacter aerogenes IK7:a new frontier in rare ketose production.Biosci Biotechnol Biochem.2007,71(12):3048-3054），该文献只报道了以蒜糖醇为底物转化生产D-阿洛酮糖，国内尚未有相关报道。国外的主要专利文献有：[1]Ikumori Takeshi,Tsuzaki keiji.Ribitol dehydrogenase and its production and use.Japan,JP19940218155,1994-08-20。该专利文献公开了利用产气肠杆菌Enterobacter aerogenes IK7生产1-脱氧-L-阿洛酮糖和1-脱氧-L-果糖等脱氧稀少糖的方法，但是没有涉及生产蒜糖醇的方法。[2]Izumori Ken,Morimoto Kenji,Takata Goro,Tokuda Masaaki,Tsujisaka Yoshio,Takeshita Kei,Tsusaki Keiji,Okuma Kazuhiro.Microorganism with ability to produce deoxy polyol dehydrogenase and use thereof.Japan,JP20060313672,2006-11-20。该专利文献公开了利用集聚肠杆菌Enterobacter agglomerans221e的氧化和还原作用分别生产多种稀少糖和糖醇的方法，但该菌底物特异性较差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物进行转化可能生成其它副产物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株可用于生产蒜糖醇的产酸克雷伯氏菌。
本发明所提供的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），命名为G4A4，该菌株已于2013年05月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7662。
产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的16s rRNA基因序列如序列表中序列1所示。
产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的形态特征：直杆状，其菌体长约为0.6-2.5μm，菌体宽度为0.4-0.8μm；革兰氏染色结果为革兰氏阴性菌，不产芽孢，生荚膜，不运动。
产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的培养条件：在普通LB培养基上即可生长，为兼性厌氧生长，具有呼吸和发酵两种代谢类型。当在细菌完全培养基上37℃培养24小时后，菌落呈光滑型，表面光泽，乳白色不透明，边缘整齐，直径1-2mm。最适生长温度为37℃，最适pH值为7.0。
产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的生化特性如表1所示，由表1可见，产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662不能以D-山梨糖作为唯一碳源进行生长，与已报道（Boye K,Hansen DS.Sequencing of 16S rDNA of Klebsiella:taxonomic relations within the genus and to other Enterobacteriaceae.Int J Med Microbiol.2003,292(7-8):495-503）产酸克雷伯氏菌有显著差异，是一株新型的产酸克雷伯氏菌。
产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的生化特性如下：
注：+表示能够利用，-表示不能利用。
本发明的第二个目的是提供一种发酵培养产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的方法，是将产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662接种于LB改良培养基（每1L培养基含：蛋白胨0.2-0.5g，酵母粉0.2-0.5g，氯化钠0.2-0.5g。）等低糖高氮培养基中，在37℃、pH7.0、150-250rpm（优选为200rpm）条件下进行发酵培养，至OD600值为3.0-4.0，菌株进入生长的稳定期。
本发明的第三个目的是提供一种驯化产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的方法，是将产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662接种于含有1％（质量／体积百分浓度，g／100ml）木糖醇的无机盐培养基（配方为：0.25％(NH4)2S04，0.25％KH2P04，0.5％K2HPO4，0.01％MgSO4·7H2O，0.05％酵母粉，质量／体积百分浓度，g／100ml，余量为水，pH7.0）中，在37℃、150-250rpm（优选为200rpm）条件下培养直到菌体细胞生长达到稳定期
（OD600=1.0-1.5），然后在相同条件下亚培养3-4次，使得产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶组成型表达（核糖醇脱氢酶组成型表达的检测方法为：细菌培养过程中不需加入诱导物，驯化细胞可以将核糖醇转化为核酮糖。），表明性状稳定，从而完成菌株的驯化。
本发明的第四个目的是提供一种产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662静息细胞的制备方法，是将驯化好的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662接种于LB改良培养基中并在37℃、150-250rpm（优选为200rpm）条件下培养20-30h（优选为24h）后，离心收集菌体细胞，用pH7.5-8.5（优选为8.0）的Tris-HCl缓冲液（配方：50mM Tris水溶液，用盐酸调制pH为7.5-8.5，优选8.0）或磷酸盐缓冲液（配方：50mM磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的水溶液，pH为7.5-8.5，优选8.0）洗涤菌体2-3次，加入pH7.5-8.5（优选为8.0）的Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液重悬细胞，再放置4-6小时，得到的细胞悬浮液即为产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662静息细胞。
本发明的第五个目的是提供一种用产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662生产蒜糖醇的方法，是将产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662静息细胞接种至Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中，使细胞浓度达到OD600=20-40（优选为40），然后使用底物D-阿洛酮糖纯品或D-果糖异构化后纯化得到的D-阿洛酮糖纯品或D-果糖与D-阿洛酮糖的混合物（D-果糖异构化后不经纯化得到），底物浓度为0.5-5％（优选为0.5％，以D-阿洛酮糖含量计，质量／体积百分浓度，g／100ml），并补加终浓度为0.1-0.5％（优选为0.2％，质量／体积百分浓度，g／100ml）的NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在30-45℃（优选为37℃）、pH7.0-9.0（优选为7.0）、厌氧条件下，产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662静息细胞可将底物转化为蒜糖醇。
在上述蒜糖醇的生产方法中，产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662静息细胞可将底物转化为蒜糖醇的原理是该菌中的核糖醇脱氢酶（RDH）使D-阿洛酮糖的2位羰基加氢，发生了还原化学反应，化学反应式如下：
本发明提供了一株产酸克雷伯氏菌新菌种及其在蒜糖醇生产中的应用，即将筛选 的产酸克雷伯氏菌G4A4菌株制备成静息细胞，并用于蒜糖醇生产，从而弥补现有技术的不足。本发明的产酸克雷伯氏菌G4A4菌株具有核糖醇脱氢酶，该酶具有较宽的底物谱，在厌氧条件下可以将D-阿洛酮糖还原为蒜糖醇。核糖醇脱氢酶广泛存在于各种微生物中，但一般具有较强的底物特异性，不能识别并还原D-阿洛酮糖，因此，本发明的产酸克雷伯氏菌G4A4菌株具有独特的优势，可应用于以D-阿洛酮糖为底物的蒜糖醇生产。本发明的产酸克雷伯氏菌G4A4菌株可以利用简单培养基进行快速生长，因此，可以进行大规模的扩大培养，应用于蒜糖醇的生产领域。另外，蒜糖醇可以作为一种制备治疗糖尿病药物的原料或中间体，还可以应用于制备医药品（如糖尿病治疗药物等）、保健品、其它稀少糖的原料等诸多领域中，因此，开发产酸克雷伯氏菌G4A4菌株的蒜糖醇生产功能具有广阔的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度（单位：g／100ml）或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662的筛选及保藏
一、筛选产酸克雷伯氏菌G4A4菌株
从广西南宁的土壤样本中分离到一株可以利用D-阿洛酮糖的革兰氏阴性杆菌，方法为：将土壤样品经灭菌水稀释后涂布于添加了0.5％（质量/体积百分比浓度）D-阿洛酮糖的无机盐培养基（配方：0.25％(NH4)2S04，0.25％KH2P04，0.5％K2HP04，0.01％MgS04·7H20，0.05％酵母粉，按质量/体积百分比浓度g／100ml，余量为水，pH7.0）上，在37℃下经培养获得了一株菌，其16s rRNA基因序列如序列表中序列 1所示，经分析鉴定为产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），将其命名为G4A4。
二、产酸克雷伯氏菌G4A4菌株的形态特征、培养条件及生化特性
1、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4的形态特征
直杆状，其菌体长约为0.6-2.5μm，菌体宽度为0.4-0.8μm；革兰氏染色结果为革兰氏阴性菌，不产芽孢，生荚膜，不运动。
2、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4的培养条件
在普通LB培养基上即可生长，为兼性厌氧生长，具有呼吸和发酵两种代谢类型。当在细菌完全培养基上37℃培养24小时后，菌落呈光滑型，表面光泽，乳白色不透明，边缘整齐，直径1-2mm。最适生长温度为37℃，最适pH值为7.0。
3、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4的生化特性
如表1所示，产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4不能以D-山梨糖作为唯一碳源进行生长，与已报道（Boye K,Hansen DS.Sequencing of16S rDNA of Klebsiella:taxonomic relations within the genus and to other Enterobacteriaceae.Int J Med Microbiol.2003,292(7-8):495-503）产酸克雷伯氏菌有显著差异，是一株新型的产酸克雷伯氏菌。
表1产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4的生化特性
注：+表示能够利用，-表示不能利用。
产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4菌株已于2013年05月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号），保藏编号为CGMCC No.7662。
产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662菌株在蒜糖醇生产中的应用（实施例2-5）：
实施例2、利用产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662菌株生产蒜糖醇（小规模生产）
1、产酸克雷伯氏菌G4A4的培养
将产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662接种于LB改良培养基（每1L培养基含：蛋白胨0.2-0.5g，酵母粉0.2-0.5g，氯化钠0.2-0.5g。）等低糖高氮培养基中，在37℃、pH7.0、150-250rpm（优选为200rpm）条件下对菌株进行发酵培养，至OD600值为3.0-4.0，菌株进入生长的稳定期。
2、产酸克雷伯氏菌G4A4的驯化
将产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662按1％的接种量接种于含有1％（质量／体积百分浓度，g／100ml）木糖醇的无机盐培养基（配方为：按质量／体积百分浓度，g／100ml，0.25％(NH4)2S04，0.25％KH2P04，0.5％K2HP04，0.01％MgS04·7H20，0.05％酵母粉，余量为水，pH7.0）中，在37℃、150-250rpm（优选为200rpm）条件下培养直到菌体生长达到稳定期（OD600=1.0-1.5），然后在相同条件下亚培养3-4次，使得产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶组成型表达（核糖醇脱氢酶组成型表达的检测方法为：细菌培养过程中不需加入诱导物，驯化细胞可以将核糖醇转化为核酮糖。），表明性状稳定，从而完成菌株的驯化。
3、产酸克雷伯氏菌G4A4静息细胞的制备
将驯化好的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662按0.5-1％的接种量接种于LB改良培养基中并在37℃、200rpm条件下培养24h后，离心收集菌体细胞，用pH7.5-8.5（优选为8.0）的Tris-HCl缓冲液（配方：50mM Tris水溶液，用盐酸调制pH为7.5-8.5，优选8.0）或磷酸盐缓冲液（配方：50mM磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的水溶液，pH为7.5-8.5，优选8.0）洗涤菌体2-3次，加入pH7.5-8.5（优选为8.0）的Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液重悬细胞，再放置4-6小时，得到的细胞悬浮液即为产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662静息细胞。
4、蒜糖醇的转化生产
将产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662静息细胞接种至Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中，使细胞浓度达到OD600=20，然后使用底物D-阿洛 酮糖（D-阿洛酮糖纯品或D-果糖异构化后纯化得到的D-阿洛酮糖纯品或D-果糖与D-阿洛酮糖的混合物（D-果糖异构化后不经纯化得到）均可），底物浓度为0.5％（0.5-5％均可，以D-阿洛酮糖含量计，质量／体积百分浓度，g／100ml），并补加终浓度为0.2％（g／100ml）的NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在30℃（30-45℃均可）、pH7.0（7.0-9.0均可）、厌氧条件下，产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662静息细胞可将底物转化为蒜糖醇，经过36小时后反应达到平衡，得到蒜糖醇反应液。经检测，本例蒜糖醇转化率为63.5％。在此条件下，转化率较低，是因为底物浓度较低时，G4A4菌株会代谢消耗D-阿洛酮糖，从而只有一部分的底物被转化为蒜糖醇。
实施例3、利用产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662菌株生产蒜糖醇（小规模生产）
方法与实施例2相同，不同之处是将静息细胞转化反应的温度和pH分别提高到45℃和9.0，菌体浓度提高到OD600=40。在此条件下，经过36小时后反应达到平衡，得到蒜糖醇反应液。本例蒜糖醇转化率为76.8％。提高菌体浓度后，转化率同实施例2相比有了显著提升。
实施例4、利用产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662菌株生产蒜糖醇（小规模生产）
方法与实施例2相同，不同之处是将静息细胞转化反应的温度和pH分别提高到最适生长的37℃和7.0。在此条件下，经过36小时后反应达到平衡，得到蒜糖醇反应液。本例蒜糖醇转化率为84.5％。此时的转化率最高，是因为转化的条件最适宜产酸克雷伯氏菌的产酶，也是转化反应的最佳条件，从而蒜糖醇的产量最高。
实施例5、利用产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662菌株生产蒜糖醇（中规模生产）
方法与实施例2相同，不同之处是将静息细胞转化反应的温度和pH分别提高到最适生长的37℃和7.0，此外，转化生产在发酵罐或密封反应釜中进行，反应体积为6L，反应结束后，使用高效液相色谱法测定蒜糖醇转化率，结果显示，在反应36小时后，反应液蒜糖醇转化率为74.2％，而在48小时后，反应液蒜糖醇转化率为82.3％，已经基本达到平衡。
表2不同转化生产参数对蒜糖醇转化率的影响
实施例2-5及表2说明使用本发明的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）G4A4CGMCC No.7662菌株可以实现蒜糖醇的生物转化法生产，菌体生长迅速，转化率较高（最高80％以上），转化工艺简单，污染小。由该方法得到的蒜糖醇反应液后续可以通过常规的提纯方法得到蒜糖醇产品，应用于制备医药品（如糖尿病治疗药物等）、保健品、其它稀少糖的原料等诸多领域中。
Claims (6)
1.产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4，其特征在于：其保藏编号为CGMCCNo.7662，该产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4的16s rRNA基因序列如序列表中序列1所示。
2.根据权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4，其形态特征：直杆状，其菌体长约为0.6-2.5μm，菌体宽度为0.4-0.8μm；革兰氏染色结果为革兰氏阴性菌，不产芽孢，生荚膜，不运动；
其培养条件：普通LB培养基上即可生长，为兼性厌氧生长，具有呼吸和发酵两种代谢类型；当在细菌完全培养基上37℃培养24小时后，菌落呈光滑型，表面光泽，乳白色不透明，边缘整齐，直径1-2mm；最适生长温度为37℃，最适pH值为7.0；
其生化特性如下表所示：
注：+表示能够利用，-表示不能利用。
3.一种发酵培养产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4的方法，是将权利要求1或2所述产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4接种于LB改良培养基中，在37℃、pH 7.0、150-250rpm条件下进行发酵培养，至OD600值为3.0-4.0，菌株进入生长的稳定期时选取菌株，其中，每1L LB改良培养基含：蛋白胨0.2-0.5g，酵母粉0.2-0.5g，氯化钠0.2-0.5g。
4.一种驯化产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4的方法，是将权利要求1或2所述产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4接种于含有质量/体积百分浓度g/100ml为1％的木糖醇的无机盐培养基中，在37℃、150-250rpm条件下培养直到菌体细胞生长达到稳定期，即OD600＝1.0-1.5，然后在相同条件下亚培养3-4次，使得产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶组成型表达性状稳定，完成菌株的驯化，其中，无机盐培养基的配方为：按质量/体积百分浓度g/100ml，含0.25％(NH4)2S04，0.25％KH2P04，0.5％K2HP04，0.01％MgS04·7H20，0.05％酵母粉，余量为水，pH 7.0。
5.一种产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4静息细胞的制备方法，是将权利要求4中驯化好的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4接种于LB改良培养基中并在37℃、150-250rpm条件下培养20-30h后，离心收集菌体细胞，用pH7.5-8.5的Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液洗涤菌体2-3次，加入pH 7.5-8.5的Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液重悬细胞，再放置4-6小时，得到的细胞悬浮液即为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4静息细胞，其中，每1L LB改良培养基含：蛋白胨0.2-0.5g，酵母粉0.2-0.5g，氯化钠0.2-0.5g。
6.一种用产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4生产蒜糖醇的方法，是将权利要求5所述产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4静息细胞接种至Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中，使细胞浓度达到OD600＝20-40，然后使用底物D-阿洛酮糖纯品或D-果糖异构化后纯化得到的D-阿洛酮糖纯品或D-果糖与D-阿洛酮糖的混合物，以D-阿洛酮糖含量计，底物浓度的质量/体积百分浓度g/100ml为0.5-5％，并补加终浓度按质量/体积百分浓度g/100ml计为0.1-0.5％的NADH，在30-45℃、pH 7.0-9.0、厌氧条件下，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4静息细胞将底物转化为蒜糖醇。
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Non-Patent Citations (3)
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| Direct production of allitol from D-fructose by a coupling reaction using D-tagatose 3-epimerase, ribitol debydrogenase and formate dehydrogenase;Takeshita K. et al;《Journal of Bioscience and Bioengineering》;20001231;第90卷(第5期);545-548 * |
| Efficient conversion of allitol to D-psicose by Bacillus pallidus Y25;Poonperm W. et al;《Journal of Bioscience and Bioengineering》;20070331;第103卷(第3期);282-285 * |
| 以D-果糖为原料利用新型异构酶转化生产D-阿洛糖;柏纬 等;《生物工程学报》;20120425;第28卷(第4期);457-465 * |
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