CN110079488A - 一种生产阿洛酮糖的工程菌株，其构建方法及应用 - Google Patents

一种生产阿洛酮糖的工程菌株，其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产阿洛酮糖重组菌株的构建方法及应用。所述构建方法通过调控葡萄糖胞内代谢，降低谷氨酸棒杆菌中果糖6‑磷酸激酶和葡萄糖6‑磷酸脱氢酶的酶活性，增强葡萄糖激酶和葡萄糖6‑磷酸异构酶酶活性从而提高胞内果糖6‑磷酸的含量，构建由6‑磷酸阿洛酮糖3‑差向异构酶和6‑磷酸阿洛酮糖磷酸化酶组成的阿洛酮糖合成途径，由果糖透过酶和果糖激酶组成的果糖代谢途径，以及由甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶组成的甘油代谢途径；获得了一株谷氨酸棒杆菌重组菌株，该菌株可以代谢甘油、葡萄糖、果糖或者蔗糖合成阿洛酮糖，与目前报道的生物转化果糖合成阿洛酮糖方法相比，具有转化率高、生产成本低等优点，适合规模化生产阿洛酮糖。

Description

一种生产阿洛酮糖的工程菌株，其构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产阿洛酮糖工程菌，该工程菌的制备方法以及将其用于发酵生产阿洛酮糖中的应用。
背景技术
稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物(2002年国际稀少糖学会ISRS定义)。近年来，D-阿洛酮糖作为果糖的差向异构体在膳食、保健、医药等领域引起了广泛关注，阿洛酮糖其甜度为蔗糖的70％，然而能量值仅为0.007kcal/g，且能量吸收效率仅为蔗糖的0.3％，是一种非常理想的低卡路里甜味剂，可作为蔗糖替代品应用于食品领域；D-阿洛酮糖被证明具有降血糖的作用，还可以抑制肝脏脂肪合成酶肠道α-糖苷酶的活性，从而减少腹部脂肪的累积，在治疗神经退行性和动脉粥样硬化疾病方面也有很高的医疗价值。美国食品及药品管理局(FDA)于2011年正式批准D-阿洛酮糖为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中，因此，D-阿洛酮糖具有良好的应用前景和开发价值。
目前生产阿洛酮糖主要通过化学合成和生物转化两种方法，化学合成需要多步保护和脱保护步骤，生产成本高且收率低。生物转化法以果糖为原料，经D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化合成D-阿洛酮糖，该方法催化合成效率较高，是目前合成阿洛酮糖的主要方式，然而该方法转化率低，目前最高只能达到32％的转化率，需要添加模拟流动床设备实现果糖循环利用，造成产物不易分离，阿洛酮糖生产成本升高，亟待开发一种低成本，低污染，高产率的阿洛酮糖合成新方法。当细胞代谢葡萄糖、果糖等多种碳源时，可以胞内合成果糖6-磷酸，后者可以经阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶催化为阿洛酮糖6-磷酸，再经去磷酸化酶合成阿洛酮糖，该合成路线具有转化率高的优点，因此本发明提出采用基因工程技术和微生物学方法构建微生物工程菌株，再以廉价的葡萄糖、果糖为底物发酵生产阿洛酮糖的新思路。
发明内容
本发明的目的一是提供一种生产阿洛酮糖工程菌株的构建方法。所述构建方法包括以下步骤：
(1)增强葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性，其特征为通过引入强启动子或者采用质粒表达形式提高葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因的表达强度，或者采用染色体整合方式整合其他物种来源的酶活性更高的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因。
(2)降低果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶的酶活性，其特征为采用基因敲除或者引入弱启动子方式，降低细胞果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因的表达水平。
(3)增强6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶的酶活性，其特征为采用染色体整合或者质粒表达形式，向胞内引入6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因。
(4)增强果糖透过酶和果糖激酶的酶活性，其特征为采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，增强果糖透过酶和果糖激酶基因的表达水平。
(5)增强甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的酶活性，其特征为采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，提高甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶基因的表达水平。
所述增强葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性和降低果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶的酶活性的目的在于，提高胞内果糖6-磷酸的含量；所述增强6-磷酸阿洛酮糖异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶的酶活性的目的在于将胞内果糖6-磷酸转化为阿洛酮糖6-磷酸；所述增强果糖透过酶和果糖激酶的目的在于提高工程菌株利用果糖转化为果糖6-磷酸的能力；所述增强甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的目的在于提高重组菌株代谢甘油进行细胞生长的能力。
所述阿洛酮糖工程菌株的构建方法适用于以谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酿酒酵母等菌株为宿主菌进行遗传改造，所获得工程菌株用于发酵法合成阿洛酮糖。
本发明的目的二是提供重组菌株All的构建方法，包括以下步骤：
(1)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE和来源于古生球菌属Archaeoglobus fulgidus的6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶P6PP基因，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-P6PP，将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP转化野生型谷氨酸棒杆菌13032，得到重组菌株All1。
(2)以谷氨酸棒杆菌13032为出发菌株，通过采用替换启动子方法降低果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因表达水平，得到重组菌株All2。
(3)将携带6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP构建至重组菌株All2中，获得重组菌株All3。
(4)扩增来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因，将其构建在表达载体pXMJ19中，得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI转化至重组菌株All3中，得到重组菌株All4。
(4)扩增来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶基因和大肠杆菌Escherichia coli的果糖激酶基因，并将其构建至表达载体pEC-P6PE-P6PP中得到重组载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF，将重组载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF构建至重组菌株All2中，获得重组菌株All5。
(5)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的甘油透过酶、来源于肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的甘油脱氢酶、来源于弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii的二羟丙酮激酶基因，并将其构建至表达载体pXMJ19-GlK-PGI中得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-glpF-DhaD-DhaK，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-glpF-DhaD-DhaK和pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF同时转化至重组菌株All2中得到重组菌株All6。
本发明的目的三是提供所述谷氨酸棒杆菌工程菌株All1、All3、All4、All5和All6在阿洛酮糖生产中的应用。其特征为，采用重组菌株All1和重组菌株All3发酵葡萄糖合成阿洛酮糖，重组菌株All4和重组菌株All5可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖或者以上三者的混合液如糖蜜生产阿洛酮糖，其中重组菌株All5发酵果糖和蔗糖时，阿洛酮糖合成能力显著高于重组菌株All4；采用重组菌株All6除了可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖或者以上三者的混合液如糖蜜生产阿洛酮糖酵外，还可以发酵甘油或者葡萄糖与甘油的混合培养基生产阿洛酮糖。
用该方法制备阿洛酮糖，具有原料成本低、产率高等优点，适合规模化生产阿洛酮糖。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 谷氨酸棒杆菌重组菌株All1的构建
1.构建重组表达载体pEC-P6PE-P6PP
根据KEGG数据库中来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和来源于古生球菌属Archaeoglobus fulgidus的6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因序列，设计引物，并通过PCR扩增获得相应序列，采用酶切连接方式构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-P6PP。
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株All1
将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP电转化至野生型谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株All1。
实施例2 谷氨酸棒杆菌重组菌株All3的构建
1.构建整合载体pK18mobsacB-pfk'
根据KEGG数据库中果糖6-磷酸激酶的上下游序列，设计引物扩增上游序列和下游序列，并构建至载体pK18mobsacB中，获得重组质粒pK18mobsacB-pfk'。
2.获得果糖6-磷酸激酶基因敲除的重组菌株All2
2.1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞(100ul)，将基因敲除载体pK18tpi(10ug)电转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞中，46℃热激6min，随后放入30℃摇床中复苏45min，将菌液涂布于含有卡那抗生素(25ug/mL)的固体培养基BHIS(脑心浸粉：51g/L，山梨醇：91g/L)中，放置于30℃培养箱中培养36h。
2.2挑取在卡那抗性平板上生长的阳性菌落，用引物7和引物8进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得387bp DNA片段(此DNA片段为载体pK18mobsacB-pfk'中载体中的部分片段)的为阳性克隆。
2.3挑取阳性克隆，划线于含有10％蔗糖的LB平板上，放置30℃培养箱中培养24h，此步骤的目的是在于通过蔗糖致死性，筛选卡那缺失克隆。
2.4从LB蔗糖平板上挑取若干菌落，用引物5和引物6再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1653DNA片段的为阳性克隆。
2.5保存经PCR验证正确的菌株，即无果糖6-磷酸激酶基因活性的重组谷氨酸棒杆菌，命名为All2。
3.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株All3
将携带6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP电转化至重组菌株All2中，获得重组菌株All3。
实施例3 谷氨酸棒杆菌重组菌株All4的构建
1.构建重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI
根据KEGG数据库中来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的基因序列，设计引物，并以谷氨酸棒杆菌基因组为模板扩增葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的基因，通过酶切连接方式构建至表达载体pXMJ19中，获得重组表达质粒pXMJ19-GlK-PGI。
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株All4
将重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI电转化至菌株All3中，获得重组菌株All4。
实施例4 谷氨酸棒杆菌重组菌株All5的构建
1.构建重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF
根据KEGG数据库中来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶基因和大肠杆菌Escherichia coli的果糖激酶的基因序列，设计引物，并通过酶切连接方式构建至重组表达质粒pEC-P6PE-P6PP中，得到重组表达质粒pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF。
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株All5
将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF电转化至果糖6-磷酸激酶基因敲除的重组菌株All2中，获得重组菌株All5。
实施例5 谷氨酸棒杆菌重组菌株All6的构建
1.构建重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI-glpF-DhaD-DhaK
根据KEGG数据库中来来源于大肠杆菌的甘油透过酶、来源于肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的甘油脱氢酶、来源于弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii的二羟丙酮激酶的基因序列，设计引物，并通过酶切连接方式将其构建至表达载体pXMJ19-GlK-PGI中得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-glpF-DhaD-DhaK。
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株All6
将重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI-glpF-DhaD-DhaK和pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF同时电转化至重组菌株All2中得到重组菌株All6。
实施例6 谷氨酸棒杆菌重组菌株All1和All3在阿洛酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株All1发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
选用100mL BHI培养基(脑心浸粉37g/L,卡那霉素25ng/mL)，加入终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，在30、℃200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株All1进行培养12-24h，发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80，℃检测器：示差折光检测器,上样量为10μl。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株All3发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
重组菌株All3的培养方法同1相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
实施例7 谷氨酸棒杆菌重组菌株All4在阿洛酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株All4发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
重组菌株All4的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株All4发酵果糖合成阿洛酮糖
重组菌株All4的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的果糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株All4发酵蔗糖合成阿洛酮糖
重组菌株All4的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的蔗糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
实施例8 谷氨酸棒杆菌重组菌株All5在阿洛酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株All5发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
重组菌株All5的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株All5发酵果糖合成阿洛酮糖
重组菌株All5的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的果糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株All5发酵蔗糖合成阿洛酮糖
重组菌株All5的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的蔗糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
实施例9 谷氨酸棒杆菌重组菌株All6在阿洛酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株All6发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
重组菌株All6的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株All6发酵果糖合成阿洛酮糖
重组菌株All6的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的果糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株All6发酵蔗糖合成阿洛酮糖
重组菌株All6的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的蔗糖，培养12-24h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
4、谷氨酸棒杆菌重组菌株All6发酵甘油合成阿洛酮糖
重组菌株All6的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的甘油，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
5、谷氨酸棒杆菌重组菌株All6发酵葡萄糖和甘油合成阿洛酮糖
重组菌株All6的培养方法同实施例6中重组菌株All1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖和甘油，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。

Claims (7)

1.一种生产阿洛酮糖工程菌株的构建方法，所述构建方法为：降低果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶的酶活性，增强6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶、6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶的酶活性，或者在此基础上增强葡萄糖激酶、葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性，或者进一步增强果糖透过酶和果糖激酶的酶活性，或者更进一步增强甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，适用于以谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等菌株为宿主菌进行遗传改造，所获得工程菌株用于发酵法合成阿洛酮糖。
3.一种谷氨酸棒杆菌工程菌株All的构建方法，包括以下步骤：
(1)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和来源于古生球菌属Archaeoglobus fulgidus的6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-P6PP，将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP构建至野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，获得重组菌株All1。
(2)在谷氨酸棒杆菌13032中，通过分子遗传操作降低谷氨酸棒杆菌中的果糖6-磷酸激酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因表达水平，得到重组菌株All2。
(3)将携带6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP构建至重组菌株All2中，获得重组菌株All3。
(4)扩增来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因，将其构建在表达载体pXMJ19中，得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI转化至重组菌株All3中得到重组菌株All4。
(5)扩增来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶基因和大肠杆菌Escherichia coli的果糖激酶基因，并将其构建至表达载体pEC-P6PE-P6PP中得到重组载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF，将重组载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF构建至重组菌株All2中，获得重组菌株All5。
(6)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的甘油透过酶、来源于肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的甘油脱氢酶、来源于弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii的二羟丙酮激酶基因，并将其构建至表达载体pXMJ19-GlK-PGI中得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-glpF-DhaD-DhaK，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-glpF-DhaD-DhaK和pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF同时转化至重组菌株All2中得到重组菌株All6。
4.权利要求3中所述重组菌株All1和All3在阿洛酮糖合成中的应用，其特征为，重组菌株All1和All3可以发酵葡萄糖合成阿洛酮糖。
5.权利要求3中所述重组菌株All4在阿洛酮糖合成中的应用，其特征为，重组菌株All4可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛酮糖。
6.权利要求3中所述重组菌株All5在阿洛酮糖合成中的应用，其特征为，重组菌株All5可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛酮糖。
7.权利要求3中所述重组菌株All6在阿洛酮糖合成中的应用，其特征为，重组菌株All6可以以甘油为唯一碳源进行细胞生长，该菌株不仅仅可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛酮糖，也可以发酵甘油与葡萄糖合成阿洛酮糖。
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