CN114717276A - 联合磷酸糖酶与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种联合磷酸糖酶与ATP再生系统提高以D‑葡萄糖为底物合成D‑阿洛酮糖平衡转化率的方法。以D‑葡萄糖为原料，依次经重组大肠杆菌构建、湿菌体制备、全细胞催化反应制取D‑阿洛酮糖。所述的重组大肠杆菌同时表达葡萄糖激酶、6‑磷酸葡萄糖异构酶、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸‑3差向异构酶、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸‑磷酸酯酶和腺苷激酶。其中重组大肠杆菌的构建过程中包括引入ATP再生系统。通过本方法联合磷酸糖酶和ATP再生系统提高了D‑葡萄糖合成D‑阿洛酮糖的转化率，减少了外源ATP添加。本发明具有制备过程简单、产品转化率高、绿色经济的特点，可用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于合成生物技术领域，具体涉及一种联合磷酸糖酶与ATP再生系统合成D-阿洛酮糖的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体，在自然界中含量稀少，甜度为蔗糖的70％，能量仅占0.3％。同时，D-阿洛酮糖被美国食品药品监督管理局评为“GRAS”安全级，允许将其添加在食品、膳食补充剂以及医药制剂中。D-阿洛酮糖具有许多有益人体健康的特殊功能，例如摄入适量的D-阿洛酮糖可以降低血糖血脂水平、减少脂肪堆积、清除活性氧的活性等，因此受到越来越多的关注，而开发一种高效生产D-阿洛酮糖的方法成为了满足市场增长的必要条件。
近年来大多数研究者用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)催化D-果糖合成D-阿洛酮糖。不同来源的DPEase在大肠杆菌中异源表达时，D-果糖至D-阿洛酮糖的平衡转化率可以达到20-30％。最近也有研究者将底物D-果糖替换为易得、低价的D-葡萄糖，由葡萄糖异构酶与D-阿洛酮糖-3-差向异构酶共表达合成D-阿洛酮糖。双酶体系表达中，D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的平衡转化率在12％-16％之间，但底物和中间底物积累严重。现有一种两步法是利用L-鼠李树胶糖激酶，将D-阿洛酮糖磷酸化为D-阿洛酮糖-1-磷酸，提高催化体系平衡反应转化率，再使用去磷酸化策略将磷酸基团脱去，转变为D-阿洛酮糖。该法尽管提高了转化效率，但由于它需要两步进行在实际生产中操作更加繁琐，耗费较长的时间，从而导致影响生产效率。我们现在开发出一种一步生产阿洛酮糖的方法，在操作上更加便捷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种联合糖酵解与ATP再生系统的全细胞合成D-阿洛酮糖的方法，利用该方法可以提高D-阿洛酮糖的产率。
为解决上述技术发明，本发明的技术方案是：
一种利用磷酸糖酶联动合成D-阿洛酮糖的方法，以D-葡萄糖为底物，加入重组大肠杆菌湿菌体后及辅因子后进行全细胞催化反应制得；所述的重组大肠杆菌至少同时表达葡萄糖激酶glk、6-磷酸葡萄糖异构酶pgi、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶a6pe、D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶a6pp。
所述的重组大肠杆菌同时表达葡萄糖激酶glk、6-磷酸葡萄糖异构酶pgi、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶a6pe、D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶a6pp和腺苷激酶adk。
所述的重组大肠杆菌按以下方法进行构建：将葡萄糖激酶基因glk插入在质粒pCDFDuet-1上，得到重组质粒pRSFDuet-glk；将6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi连接在pRSFDuet-glk上，得到重组质粒pRSFDuet-glk-pgi；将D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶基因a6pe与D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶基因a6pp连接到载体pETDuet-1上，得到重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp；将腺苷酸酶基因adk连接到质粒pACYCDuet-1上，酶切位点是BamHI,HindIII，得到重组质粒pACYCDuet-adk；再将重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp、重组质粒pRSFDuet-glk-pgi和重组质粒pACYCDuet-adk转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。
所述的葡萄糖激酶基因glk来源于Bacillus sp.，所述的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613，所述的腺苷酸酶基因adk来源于大肠杆菌BL21。
所述全细胞催化反应条件是：pH7-10，反应温度为30-50℃，反应时间12-18h，反应时添加辅因子；所述辅因子为金属离子和腺苷三磷酸，所述的金属离子至少为Mg2+、Mn2+、Co2 +、Ca2+之一。
所述的Mg2+添加量为5～20mM，腺苷三磷酸的添加量为16～40mM，以D-葡萄糖为底物，底物浓度为20～100g/L。
所述全细胞催化反应以D-葡萄糖为底物，底物浓度为20g/L，Mg2+的添加量为：5mM，腺苷三磷酸的添加量为5mM，反应温度37℃，pH为7.5。
所述湿菌体制备按以下操作进行：将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养，采用IPTG在20℃条件下诱导20-24h,收集得到湿菌体。
所述的LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠。
所述的将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养的接种量为：1％。
本发明的有益效果如下：
本发明在重组大肠杆菌构建时以糖酵解新途径为基础构建磷酸糖酶体系合成D-阿洛酮糖，D-葡萄糖产率最高可达到51％。
本发明联合磷酸糖酶和过表达腺苷激酶提升胞内ATP含量及实现催化反应时ATP循环再生，减少了外源ATP供给，外源ATP消耗减少为对照组的60％。
本发明以D-葡萄糖为底物进行转化，D-葡萄糖作为自然界中一种成本低廉、易获得的单糖，相对于常规合成D-阿洛酮糖所用的果糖，能有效降低制备成本。
本发明而相对比纯酶反应，不需要繁琐的蛋白纯化过程，操作简单方便，并且全细胞更能适应外界环境变化，胞内的辅酶因子也能对多酶级联反应起到积极作用，更能适应工业化生产，并且产物也相对容易分离。
本发明一步法合成D-阿洛酮糖,相较于前人两步法合成D-阿洛酮糖来说，该法在操作上更加便捷，在工业应用中所费时间和人力更加少，可以有效提高了转化效率。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明的反应流程图；
图中GLK:葡萄糖激酶；PGI:6-磷酸葡萄糖异构酶；A6PE:D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶，A6PP:D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶；ADK：腺苷激酶。
具体实施方式
下面结合具体实例来进一步说明。若为特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1-12是利用磷酸糖酶构建合成D-阿洛酮糖的新途径，而实施例13-22是在磷酸糖酶新途径合成D-阿洛酮糖的基础上将其与ATP再生系统联合进一步提高以D-葡萄糖为底物合成D-阿洛酮糖的平衡转化率，将实施例1-12与实施例13-22进行对比，观测期所用外源ATP使用量的变化。
本发明实施例中所用到的原料和试剂均为常规化学试剂，均能通过商业渠道购买得到。LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠。
实施例1
本实施例是利用磷酸糖酶联动合成D-阿洛酮糖方法的一个实施例，作为与过表达腺苷激酶提升胞内ATP含量的对比实施例，具体步骤如下：
(1)重组大肠杆菌构建：
重组质粒pRSFDuet-glk的构建：以来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的glk基因片段为模板，以glk-F:tcatcaccacagccaggatccgatgacaaagtatgcattagtcggt(BamHI)为上游引物，以glk-R:tgcggccgcaagcttgtcgacagaatgtgacctaaggtctgg(NotI)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BamHI和NotI分别对质粒pRSFDuet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒pRSFDuet-1进行重组连接，得到重组质粒pRSFDuet-glk。
重组质粒pRSFDuet-glk-pgi构建：以来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的pgi基因片段为模板,以pgi-F:agatatacatatggcagatctcatgaaaaacatcaatccaacgcag(BglII)为上游引物，pgi-R:ggtttctttaccagactcgagttaaccgcgccacgctttata(XhoI)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BglII和XhoI分别对质粒pRSFDuet-glk在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒pRSFDuet-glk进行重组连接，得到重组质粒pRSFDuet-glk-pgi。
重组质粒pETDuet-a6pe构建：以大肠杆菌a6pe基因组为模板，以a6pe-F:tcatcaccacagccaggatccgatgatgaaaatctccccctcgttaatg(BamHI)为上游引物，以a6pe-R:gcattatgcggccgcaagcttttatgctgtttttgcatgaggct(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对质粒pETDuet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒进行同源重组连接，得到重组质粒pETDuet-a6pe；
重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp构建：以大肠杆菌BL21基因组为模板，以a6pp-F:agatatacatatggcagatctcatgaaatacaccgtttacctgttcg(BglII)为上游引物，以a6pp-R:agcggtttctttaccagacgttacagcgggcaaccgc(XhoI)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BglII和XhoI分别对质粒pETDuet-a6pe在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒进行同源重组连接，得到重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp；
重组质粒pRSFDuet-glk-pgi和重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp转化：将重组质粒pRSFDuet-glk-pgi和重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp共同转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；
(2)湿菌体制备：将重组大肠杆菌在LB培养基中37℃培养，至OD600为0.6-1.0时，加入终浓度为1mM IPTG,16-25℃诱导16-24h,8000r/min离心发酵液后经PBS缓冲液重悬再离心后得到湿菌体；
(3)全细胞催化反应：以D-葡萄糖为底物，D-葡萄糖浓度为20g/L，温度控制为：30℃，以磷酸缓冲液为反应液，pH为6.5，加入辅因子ATP和金属离子，ATP加入量为40mM、金属离子为20mM的Mg2+，以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体，湿菌体的浓度为25g/L，经过12-18h催化反应，其中反应体系为1mL。
(4)通过高效液相色谱(HPLC)检测底物D-葡萄糖的消耗和D-阿洛酮糖的产生，并计算转化率。
HPLC检测条件如下：色谱分析柱Carbomix-Pb-NP10:8％(7.8×300mm),流动相为超纯水，流速为0.5mL/min,柱温78℃，示差(RI)检测器,其中D-葡萄糖标准品保留时间为14.28min，D-果糖标准品保留时间为20.12min，D-阿洛酮糖标准品保留时间为34.83min。
实施例2
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为35℃，pH为7.0，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例3
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，pH为7.5，加入ATP，加入量30mM，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例4
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为40℃，pH为8.0，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例5
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，pH为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例6
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，pH为7.5，金属离子为20mM Co2+其余操作均与实施例1操作相同。
实施例7
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，pH为7.5，金属离子为20mM Ca2+，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例8
全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为37℃，pH为7.5，金属离子为20mM Mn2+，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例9
全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为底物浓度为30g/L，37℃，pH为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例10
全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为底物浓度为50g/L，37℃，pH为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例11
全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为底物浓度为60g/L，37℃，pH为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例12
全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为底物浓度为100g/L，37℃，pH为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。
实施例13
本实施例是联合磷酸糖酶与ATP循环系统生产D-阿洛酮糖的方法的另一个实施例，具体步骤如下：
(1)重组大肠杆菌构建：
重组质粒pRSFDuet-glk-pgi和重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp构建：参照实施例1；
重组质粒pACYCDuet-adk的构建：以大肠杆菌BL21基因组为模板，以adk-F:tcatcaccacagccaggatccgatgcgtatcattctgcttggc(BamHI)为上游引物，以adk-R:gcattatgcggccgcaagcttttagccgaggattttttccagatca(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对质粒pACYCDuet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒进行同源重组连接，得到重组质粒pACYCDuet-adk；
重组质粒pRSFDuet-glk-pgi、重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp和重组质粒pACYCDuet-adk转化：将重组质粒pRSFDuet-glk-pgi、重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp和重组质粒pACYCDuet-adk共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌；
(2)湿菌体制备：参照实施例1；
(3)全细胞催化反应：以D-葡萄糖为底物，D-葡萄糖浓度为20g/L，加入ATP，加入量为25mM,金属离子为Mg2+，加入量为5mM及重组大肠杆菌经诱导后的湿菌体，湿菌体的浓度为25g/L，调节pH至8.0，控制反应温度为35℃，经过12-18h的催化反应；
实施例14
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，pH为7.0其余操作均与实施例13操作相同。
实施例15
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，调节pH至7.5，其余操作均与实施例13操作相同。
实施例16
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，pH为8.0，其余操作均与实施例13操作相同。
实施例17
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为35℃，pH为7.5，其余操作均与实施例13操作相同。
实施例18
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为40℃，pH为7.5，其余操作均与实施例13操作相同。
实施例19
全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，pH为7.5,加入ATP，加入量16mM，其余操作均与实施例13操作相同。
实施例20
全细胞催化反应时整个反应体系的底物浓度为30g/L，温度为37℃，pH为7.5,加入ATP，加入量16mM，其余操作均与实施例13操作相同。
实施例21
全细胞催化反应时整个反应体系的底物浓度为50g/L，温度为37℃，pH为7.5,其余操作均与实施例13操作相同。
实施例22
全细胞催化反应时整个反应体系的底物浓度为100g/L，温度为37℃，pH为7.5,其余操作均与实施例13操作相同。
本发明实施例1-12中的D-阿洛酮糖的转化率分别见表1，本发明实施例13-22中的D-阿洛酮糖的转化率分别见下表2。
表1
| 实施例 | 底物浓度 | 温度 | pH | 金属离子 | ATP浓度 | 湿菌体浓度 | 转化率 |
| 实施例1 | 20g/L | 30℃ | 6.5 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 39％ |
| 实施例2 | 20g/L | 35℃ | 7.0 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 33％ |
| 实施例3 | 20g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 30mM | 25g/L | 38％ |
| 实施例4 | 20g/L | 40℃ | 8.0 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 36％ |
| 实施例5 | 20g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 50％ |
| 实施例6 | 20g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMCo<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 37％ |
| 实施例7 | 20g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMCa<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 35％ |
| 实施例8 | 20g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMMn<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 40％ |
| 实施例9 | 30g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 45％ |
| 实施例10 | 50g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 43％ |
| 实施例11 | 60g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 42％ |
| 实施例12 | 100g/L | 37℃ | 7.5 | 20mMMg<sup>2+</sup> | 40mM | 25g/L | 41％ |
表2
通过表1和表2数据可以发现，本发明以D-葡萄糖为底物，经重组大肠杆菌构建、湿菌体制备、全细胞催化反应制取D-阿洛酮糖。该工艺技术与现有技术可以大大提高D-阿洛酮糖的转化率，此外将表1中的实施例1-12与表2中的实施例13-22对比可以发现，实施例5与实施例15、实施例10与实施例21以及实施例12与实施例22中选择重组大肠杆菌(可同时表达葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶和D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶和腺苷激酶)经过诱导后的湿菌体，在转化率相似的情况下，外源ATP消耗减少为原来的60％，在辅因子方面节约了成本。
以上所述仅为本发明的较佳实例而已，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明的原理如下：
葡萄糖激酶是一种己糖激酶，在ATP的存在下，催化葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖。葡萄糖-6-磷酸异构酶是糖酵解和糖异生的重要的酶类,可以实现催化D-葡萄糖-6-磷酸盐和D-果糖-6-磷酸盐之间的互换，这样可以将合成D-阿洛酮糖的底物由果糖换成更为低价的葡糖糖。接着再由D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶将果糖催化成阿洛酮糖。通过联合磷酸糖酶和ATP再生系统高效合成D-阿洛酮糖，将葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶在大肠杆菌中表达，同时，过表达腺苷激酶(adk)，有效提高大肠杆菌胞内ATP含量，促进多酶催化反应进行。
序列表
<110> 广西大学
<120> 联合磷酸糖酶与ATP再生系统合成D-阿洛酮糖的方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcatcaccac agccaggatc cgatgacaaa gtatgcatta gtcggt 46
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcggccgca agcttgtcga cagaatgtga cctaaggtct gg 42
<210> 3
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttctcaattg ccgaaatgaa aaagaatctc ggttttagcc atctggaaat tattaacgat 60
tttaccgctg tatcgatggc gatcccgatg ctgaaaaaag agcatctgat tcagtttggt 120
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> DNA
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aacatcttca ccttcgacca gtggggcgtg gaactgggta aacagctggc gaaccgtatt 1560
ctgccagagc tgaaagatga taaagaaatc agcagccacg atagctcgac caatggtctg 1620
attaaccgct ataaagcgtg gcgcggttaa 1650
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcatcaccac agccaggatc cgatgatgaa aatctccccc tcgttaatg 49
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcattatgcg gccgcaagct tttatgctgt ttttgcatga ggct 44
<210> 9
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaaaatct ccccctcgtt aatgtgtatg gatctgctga aatttaaaga acagatcgaa 60
tttatcgaca gccatgccga ttacttccac atcgatatca tggacggtca ctttgtcccc 120
aatctgacac tctcaccgtt cttcgtaagt caggttaaaa aactggcaac taaaccgctc 180
gactgtcatc tgatggtgac gcggccgcag gattacattg ctcaactggc gcgtgcggga 240
gcagatttca tcactctgca tccggaaacc atcaacggcc aggcgttccg cctgattgat 300
gaaatccgcc gtcatgacat gaaagtgggg ctgatcctta acccggagac gccagttgag 360
gccatgaaat actatatcca taaggccgat aaaattacgg ccatgactgt cgatcccggc 420
tttgccggac aaccgttcat tcctgaaatg ctggataaac ttgccgaact gaaggcatgg 480
cgtgaacgag aaggtctgga gtacgaaatt gaggtggacg gttcctgcaa ccaggcaact 540
tacgaaaaac tgatggcggc aggggcggat gtctttatcg tcggcacttc cggcctgttt 600
aatcatgcgg aaaatatcga cgaagcatgg agaattatga ccgcgcagat tctggctgca 660
aaaagcgagg tacagcctca tgcaaaaaca gcataa 696
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agatatacat atggcagatc tcatgaaata caccgtttac ctgttcg 47
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcggtttct ttaccagacg ttacagcggg caaccgc 37
<210> 12
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgaaataca ccgtttacct gttcgatttc gattataccc tggcagattc tagccgtggt 60
atcgttacct gcttccgttc tgttctggaa cgtcacggtt acaccggtat caccgatgat 120
atgatcaaac gtaccatcgg taaaaccctg gaagaatcct tctctatcct gaccggtatc 180
accgatgctg atcagctgga atcctttcgt caggaatatt ctaaagaagc agatatctat 240
atgaacgcta acaccattct gtttccggat actctgccga ccctgaccca tctgaaaaaa 300
cagggtatcc gtatcggcat tatctctacc aaataccgtt tccgtattct gtcttttctg 360
cgtaaccaca tgccggatga ttggttcgat atcatcatcg gtggtgaaga tgtgacccac 420
cacaaaccag atccggaagg tctgctgctg gcgatcgatc gtctgaaagc gtgcccggaa 480
gaagttctgt atattggcga tagcaccgtt gatgctggca ccgcggcggc ggcgggtgtt 540
tctttcaccg gcgttaccag cggtatgacc accgcgcagg aattccaggc gtacccgtac 600
gatcgtatca tctctaccct gggtcagctg atctctgttc cggaagataa aagcggttgc 660
ccgctgtaa 669
<210> 13
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgcgtatca ttctgcttgg cgctccgggc gcggggaaag ggactcaggc tcagttcatc 60
atggagaaat atggtattcc gcaaatctcc actggcgata tgctgcgtgc tgcggtcaaa 120
tctggctccg agctgggtaa acaagcaaaa gacattatgg atgctggcaa actggtcacc 180
gacgaactgg tgatcgcgct ggttaaagag cgcattgctc aggaagactg ccgtaatggt 240
ttcctgttgg acggcttccc gcgtaccatt ccgcaggcag acgcgatgaa agaagcgggc 300
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ccggttgctg aagttcgcgc tgatctggaa aaaatcctcg gctaa 645
Claims (10)
1.一种利用磷酸糖酶联动合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，以D-葡萄糖为底物，加入重组大肠杆菌湿菌体后及辅因子后进行全细胞催化反应制得；所述的重组大肠杆菌至少同时表达葡萄糖激酶glk、6-磷酸葡萄糖异构酶pgi、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶a6pe、D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶a6pp。
2.根据权利要求1所述合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌同时表达葡萄糖激酶glk、6-磷酸葡萄糖异构酶pgi、D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶a6pe、D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶a6pp和腺苷激酶adk。
3.根据权利要求2所述合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌按以下方法进行构建：将葡萄糖激酶基因glk插入在质粒pCDFDuet-1上，得到重组质粒pRSFDuet-glk；将6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi连接在pRSFDuet-glk上，得到重组质粒pRSFDuet-glk-pgi；将D-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶基因a6pe与D-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶基因a6pp连接到载体pETDuet-1上，得到重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp；将腺苷酸酶基因adk连接到质粒pACYCDuet-1上，酶切位点是BamHI,HindIII，得到重组质粒pACYCDuet-adk；再将重组质粒pETDuet-a6pe-a6pp、重组质粒pRSFDuet-glk-pgi和重组质粒pACYCDuet-adk转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。
4.根据权利要求2所述合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的葡萄糖激酶基因glk来源于Bacillus sp.，所述的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi来源于Clostridiumbolteae ATCCBAA-613，所述的腺苷酸酶基因adk来源于大肠杆菌BL21。
5.根据权利要求1所述的合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应条件是：pH7-10，反应温度为30-50℃，反应时间12-18h，反应时添加辅因子；所述辅因子为金属离子和腺苷三磷酸，所述的金属离子至少为Mg2+、Mn2+、Co2+、Ca2+之一。
6.根据权利要求1所述的合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的Mg2+添加量为5～20mM，腺苷三磷酸的添加量为16～40mM，以D-葡萄糖为底物，底物浓度为20～100g/L。
7.根据权利要求4所述的合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应以D-葡萄糖为底物，底物浓度为20g/L，Mg2+的添加量为：5mM，腺苷三磷酸的添加量为5mM，反应温度37℃，pH为7.5。
8.根据权利要求1所述的合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述湿菌体制备按以下操作进行：将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养，采用IPTG在20℃条件下诱导20-24h,收集得到湿菌体。
9.根据权利要求1所述的合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠。
10.根据权利要求2所述的合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述的将重组大肠杆菌接种到LB培养基中培养的接种量为：1％。
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2022
- 2022-05-13 CN CN202210522158.XA patent/CN114717276A/zh active Pending
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