WO2014098453A1 - 휴면 세포 전환법을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법 - Google Patents

휴면 세포 전환법을 이용한 ｄ-카이로 이노시톨의 생산 방법 Download PDF

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WO2014098453A1
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inosi
cells
chiro
medium
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명현군
윤상활
이현서
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솔젠트(주)
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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01018—Inositol 2-dehydrogenase (1.1.1.18)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing D-chiroanosyl using dormant cells of recombinant cells. More specifically Maio-Ino when the (myo inositol ⁇ ) from coming Cairo-Ino when the (D- chiro-inositol) MY using a dormant cells of a recombinant cell engineered to express the enzymes that convert to the o-Ino
  • the present invention relates to a method for producing D-chiroinosino from poems.
  • the present inventors have tried to develop a technique for producing a high yield of myo-inosi from myo-inosi using recombinant cells.
  • a recombinant cell expressing a myo-inositol transporter, an inosine dehydrogenase, and an inosose isomerase was prepared.
  • the production of D-Cyro-Inosyl from Myo-Inosio using resting cells of the cells proves that the manufacturing cost of D-Cyro-Inosy can be reduced and the purification efficiency can be increased.
  • the present invention was completed.
  • the myo-inosity transporters used in the present invention may be those derived from mammalian cells, yeast cells or bacteria. According to one embodiment of the present invention, the myo-inoseattle transporter of the present invention uses a bacterial origin. According to another embodiment of the invention, the myo-inosy transporters of the invention are Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium or Agrobacterium tumefaciens. Use separated from. According to another embodiment of the present invention, the myo-inositol transporter of the present invention uses a transporter derived from Salmonella typhimurium.
  • the inosus isomerase of the present invention uses a bacterial origin.
  • the inosos isomerase of the present invention is Agrobacterium tumefaciens, Bacil lus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glutamicum ), Or from Pantoea ananatis.
  • the inosus isomerase of the present invention uses any one selected from the group consisting of proteins having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 9.
  • the recombinant cell of the present invention encodes a DNA sequence encoding a myo-inosi transporter, a DNA sequence encoding an inosio dehydrogenase, and an inosus isomerase.
  • DNA sequence Cells transformed with the recombinant vector comprising in an expressible form.
  • the recombinant vector of the present invention comprises: (i) a first recombinant vector comprising a myo-inosi transporter coding DNA sequence operably linked to a promoter; And (ii) an inos operably linked to a promoter comprising two recombinant vectors comprising a dehydrogenase coding DNA sequence and an inososomerase coding DNA sequence.
  • a DNA sequence encoding a myo-inosity transporter, an inosi dehydrogenase, and an inososomerase is operably linked to a promoter in a recombinant vector.
  • RNA sequence that can regulate the expression of RNA.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed as a vector for cloning or expression, and can be constructed with prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter for example, a ⁇ promoter, a trp promoter, a lac promoter, a T7 promoter, a tac promoter, etc.
  • E. coli When E. coli is used as a host cell, the promoter and operator sites of the E. coli tryptophan biosynthesis pathway (Yanofsky, C, J.
  • the vector of the present invention is an optional marker and may include antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin And resistance genes for tetracycline, but is not limited thereto.
  • the antibiotic resistance gene is operably linked with a promoter for its expression.
  • the vector of the present invention is a vector for prokaryotic cells and comprises a nucleic acid sequence that allows replication in prokaryotic host cells, in particular E. coli.
  • the vector of the present invention may include the origin of replication of a bacteriophage such as the origin of replication of a bacterium of colA, colEl or pl5A or fl origin.
  • the host cell capable of continuously cloning and expressing the recombinant vector of the present invention in a stable manner may use any host cell known in the art.
  • mammalian cells eukaryotic cells, eukaryotic cells such as yeast or prokaryotic cells, but prokaryotic cells are preferably used.
  • prokaryotic cells for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E.
  • Bacillus subtilis Bacillus chew Strains of the genus Bacillus, such as lingensis, and enterococci and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marsons, Corynebacterium glutamicum and various Pseudomonas species.
  • the recombinant cell of the present invention DNA sequence encoding myo-inosine for transporter, DNA sequence encoding inosio dehydrogenase, and DNA sequence encoding inosus isomerase are inserted into the chromosome of the cell. It is a cell.
  • the recombinant cells prepared in step (a) into a resting cell state are transferred to a stat mary phase under a complete medium including myo-inosine. Incubate.
  • a medium used for culturing recombinant cells in the present invention a conventional microbial culture medium known in the art may be used. Natural or synthetic media can be used as long as the recombinant cell contains a carbon source, a nitrogen source, or an inorganic salt that can be efficiently used.
  • the culturing is performed using a complete medium rich in a carbon source, a nitrogen source and inorganic salts.
  • Carbon sources that may be included in the medium include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, or lactose; Starch, hydrolyzate of starch; Organic acids such as acetic acid and propionic acid; Ethane includes, but is not limited to, alcohols such as propanol, glycerol, and the like.
  • the nitrogen source is ammonia; Ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate .
  • ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium phosphate; Peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean extract, soybean hydrolysate; And various fermented cells and their lysates, and the like.
  • Inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, manganese Sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like.
  • the medium is cultured by adding myo-inosine, which is a substrate of an enzyme introduced into recombinant cells.
  • the concentration in the medium of myosininosi is not particularly limited, but is l-30% (w / v). According to one embodiment of the present invention, the concentration in the medium of myo-inosine is used by selecting a suitable concentration within the range of 5-20% (w / v).
  • the method for culturing recombinant cells in the present invention can be carried out using a known cell culture method or a modified method thereof. Cultivation of the recombinant cells is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or rotational culture by a rotator.
  • the incubation temperature selects a suitable concentration in the range of 10-40 ° C.
  • Incubation time may vary depending on the size of the culture. According to one embodiment of the invention, the incubation time selects a suitable time within the range of 5 hours-7 days ⁇
  • the pH of the medium is maintained in the range of 3.0-9.0 in culture.
  • the pH of the medium can be adjusted with inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, and the like.
  • Antibiotics may be added to the medium if necessary to maintain and express the recombinant vector, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin or tetracycline. It may be, but is not limited thereto.
  • a suitable inducer can be added to the medium if necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • indoleacrylic acid may be added to the medium.
  • lactose is used as a carbon source and an expression inducing agent in the medium of the present invention.
  • the term “resting cell 1" refers to cultured cells that are no longer proliferating.
  • the term "stationary phase” herein refers to a logarithmic phase when culturing cells. exponent ial After the phase, cell division and proliferation are stopped, and there is no increase in cell population, and a balanced state of synthesis and degradation of cellular components.
  • the dormant cells of the recombinant cells of the present invention the cell growth is complete, the desired protein is expressed in the cells are made in abundance, the cells depleted in the high concentration of myo-inosi it means.
  • the stopper means a state in which the concentration of myo-inosyl and the concentration of D-chiro-inosyl reach an equilibrium concentration in the culture medium.
  • Recombinant cells of the present invention expressing a myo-inosity transporter, an inosi dehydrogenase and an inosso isomerase were subjected to a myo-inosity D in a medium comprising myo-inosity. Create by converting to Cairo Inosi.
  • the concentration of myo-inosyl substrate and D-chiro-inoshiro product is in equilibrium in the culture medium, it can be determined that the stationary phase is reached.
  • the "equilibrium state" of the concentration of inosyl in a culture medium means a state in which the concentration of inosyl is no longer changed.
  • a cell concentration in a culture medium is measured.
  • step (b) the cultured cells of the recombinant cells induced into the dormant cells are recovered and cultured in a minimal medium containing myo-inossie to generate D-chiro-inositole.
  • the dormant cells of the recombinant cells are washed and then removed to remove the components contained in the complete medium.
  • the washing may comprise centrifugation after suspending using a minimal medium comprising myo-inosine.
  • the term "minimum medium” means a medium having the minimum amount of components necessary for maintaining dormant cells of recombinant cells.
  • the minimum medium means a medium containing a carbon source and an inorganic salt.
  • Minimal medium is added with myofininosine, a substrate of enzyme introduced into recombinant cells.
  • the concentration in the minimum medium of myo-inosyl is not particularly limited. According to one embodiment of the present invention, the concentration of myo-inosi in the minimum medium is selected and used within the range of 1-30% (w / v). According to another embodiment of the present invention, the concentration in the minimum medium of myo-inosyl is 5-20% (w / v).
  • Carbon sources included in the minimum medium include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, or lactose; Starch, hydrolyzate of starch; Organic acids such as acetic acid and propionic acid; Alcohols such as ethanol, propanol, glycerol and the like. According to one embodiment of the invention, the carbon source is lactose.
  • the inorganic salt is not particularly limited, and for example, disodium phosphate ( ⁇ 0 4 ), monopotassium phosphate (KH 2 P0 4 ), sodium chloride (NaCl), ammonium chloride (NH 4 C1), calcium chloride ( CaCl 2 ), or magnesium sulfate (MgS0 4 ), but is not limited thereto.
  • Minimal medium may be added with antibiotics in addition to the carbon source and inorganic salts to maintain the recombinant vector if necessary.
  • Antibiotics may include, but are not limited to, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin or tetracycline.
  • Recombinant cells are capable of induction. In the case of recombinant cells transformed with a recombinant expression vector having a promoter, a suitable inducer can be added to the medium.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • indoleacrylic acid may be added to the medium.
  • lactose may be used as the carbon source and expression inducing agent in the medium.
  • step (d) is repeated in the range of 1 to 50 times.
  • step (d) is repeated in the range of 1-40 times.
  • step (d) is repeated in the range of 1 to 30 times.
  • step (d) is repeatedly performed in a range of 1-20 times.
  • step (d) is repeated 1 to 7 times.
  • the method of the present invention further comprises the step of culturing the dormant cells in a minimal medium, separating the D-chirozynosiosis produced in the medium from the culture solution.
  • dormant cells of the cultured recombinant cells are first removed from the culture.
  • the dormant cells are removed from the culture medium by, for example, centrifugation or microfiltration, to obtain a supernatant of the culture medium from which the dormant cells have been removed.
  • a conventionally known method for separating and purifying sugars or carbohydrates or a method thereof may be used.
  • Conventionally known methods for the separation and purification of sugars include separation methods by selective adsorption using zeolite molecular sieves (US Pat. No. 4,482, 761), separation by column chromatography using cation exchange resins (US patents). No. 5,096,594), separation method by column chromatography using anion exchange resin (US Pat. No. 5,482,631), adsorption by activated carbon and elution by organic solvent Methods (Korean Patent No.
  • the present invention provides a method for producing acairo-inosi, further comprising: (e) Generating an inosi precipitate by adding an organic solvent to the minimal medium in which the dormant cell culture is completed; (f) separating the supernatant from the resulting inositol precipitate; And (g) drying the separated supernatant to obtain Inosi powder. Step (e): adding an organic solvent to the minimal medium in which the dormant cell culture is completed to generate inosi precipitate
  • Isolation and purification of D-chirozyno inos from minimal medium with dormant cell cultures are performed using the difference in solubility between myo-inosino and D-chiro-inosino.
  • the difference in solubility between myo-inosino and D-chiro-inosino in aqueous solution using water as a solvent is shown in FIG. 6, and the solubility of auro-inosino is much higher than that of myo-inosino. It is high.
  • the precipitation rate of myo-inosino and D-chiro-inosino is increased by the addition of the organic solvent, the precipitation rate of myo-inosino is much increased compared to D-chiro-inosino (Fig. 8).
  • Organic solvents may be added to the minimal medium in which the dormant cells have been completed to increase the concentration of D-chiro-inositol in the solution by precipitating the e. .
  • the organic solvent that can be used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it has a property that can induce the precipitation rate of myo-inosine more than the precipitation rate of eucairo-inosino.
  • alcohol, acetone, ethyl acetate, butyl acetate 1,3-butylene glycol or ether is used as the organic solvent.
  • an alcohol having 2 to 6 carbon atoms is used as the organic solvent.
  • ethanol, isopropanol, acetone are used as the organic solvent.
  • the amount of the organic solvent added to the dormant cell cultured minimal medium is not particularly limited. According to one embodiment of the present invention, the organic solvent is added by selecting a suitable amount within the range of 0.1 ⁇ 9 times (v / v) relative to the minimum medium.
  • the organic solvent is added in an amount of 0.1-6 times (v / v) relative to the minimum medium. According to another embodiment of the invention, the organic solvent is added in an amount of 1-4 times (v / v) relative to the minimum medium. According to another embodiment of the invention, the organic solvent is added in an amount of 0.1-2 times (v / v) relative to the minimum medium. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is added in an amount of 0.1-1.5 times (v / v) relative to the minimum medium. Inosirol precipitates induced by the addition of organic solvents include both myo-inoshiro and okairo-inositules, but myo-inosino has a higher precipitation rate. This is included in larger amounts. Step (f): separating the supernatant from the resulting inosi from the precipitate
  • the supernatant is separated from the inositol precipitate produced through step (e).
  • the inosi precipitates are myo-inos and D-chiro-inositules, but myo-inosio exhibits a greater sedimentation rate; Is included in even greater amounts. Due to the large precipitation of myo-inosyl, the concentration of myo-inosyl is lowered in the supernatant, and the concentration (purity) of D-chiro-inosyl is relatively increased.
  • the separation of the supernatant from the inosi precipitate using filtration or centrifugation.
  • separation of the supernatant from the precipitate with Inosi is performed using a filtration method. Step (g): drying the separated supernatant to obtain an inositol powder
  • the invention is D- Cairo, comprising the steps of "more after the step (g) - to provide a method for producing a Ino when: (h) step (g) Dissolving inosin powder in water to prepare an aqueous solution; (i) adding an organic solvent to the aqueous solution to produce inosi precipitate; (j) separating the supernatant from the resulting inosi from the precipitate; And (k) drying the separated supernatant to obtain Inosi powder.
  • Step (h) dissolving the powder of Inosi obtained in the step (g) in water to prepare an aqueous solution
  • Inositol powder obtained in step (g) was dissolved in water to prepare an aqueous solution in which Inositol was dissolved.
  • the water is distilled water.
  • the inosi is dissolved in water at a concentration of 2093 ⁇ 4 (w / v) or less.
  • the inosin is dissolved in water at a concentration of 0.1% (w / v) or more and 20% (w / v) or less.
  • Inosi is dissolved in water at a concentration of 0.1% (w / v) or more and 18% (w / v) or less.
  • Inosi is dissolved in water at a concentration of at least 0.1% (w / v) and at most 15% (w / v).
  • organic solvent is added to the aqueous solution in which the inositol obtained in step (h) is dissolved to form a precipitate of inosi.
  • the organic solvent is the same as described in step (e) above. If the organic solvent has a property that can induce the precipitation of myoininosi more than the precipitation of D-Cyro-inositol It is not particularly limited. According to one embodiment of the present invention, alcohol, acetone, ethyl acetate, butyl acetate, 1,3-butylene glycol or ether is used as the organic solvent. According to another embodiment of the present invention, an alcohol having 2 to 6 carbon atoms is used as the organic solvent.
  • ethanol, isopropane and acetone are used as the organic solvent.
  • the amount of the organic solvent added to the aqueous solution is added by selecting a suitable amount within the range of 0.1 to 10 times (v / v) relative to the aqueous solution.
  • the organic solvent is added in an amount of 1.5-9 times (v / v) relative to the aqueous solution.
  • the organic solvent is added in an amount of 9 times (v / v) relative to the aqueous solution.
  • the supernatant is separated from the inositol precipitate produced through step (i). Separation of the supernatant from the inosi precipitates uses filtration or centrifugation. According to one embodiment of the present invention, the separation of the supernatant from the precipitate of Inosi is performed using a filtration method. Inosi sediments contain much higher amounts of Myo-Inosi than Cairo-Inos, so the supernatant increases the purity of Ekairosino.
  • Step 00 The supernatant separated in step (j), wherein the separated supernatant is dried to obtain Inosi powder, is dried to obtain Inosi powder. Drying of the supernatant may be performed while heating the supernatant, or may be performed in a vacuum.
  • the present invention is the above step
  • step (g) thereafter provides a process for producing D-chiro-inos, further comprising the following steps: (h) ' inosino obtained in step (g) is dissolved in powderol water to prepare an aqueous solution Bran to produce inosi; (i) 'separating the supernatant from the precipitate created in the Inno when the aqueous solution; And (j) ' drying the supernatant to obtain Inosi powder.
  • Step (h) ' dissolving the inosi obtained in step (g) in water to prepare an aqueous solution and inosi to produce a precipitate
  • the powder of Inosi obtained in step (e) was dissolved in water to prepare an aqueous solution in which Inosi was dissolved.
  • the water is distilled water.
  • Inosi is dissolved in water at a high concentration of more than 20% (w / v).
  • Inosi is dissolved in water at a concentration of greater than 20% (w / v) and up to 80% (w / v).
  • Inosi is dissolved in water at a concentration of 30% (w / v) or more and 70% (w / v) or less.
  • the solubility of myo-inosyl in water is up to about 15% and the solubility of D-chiro-inosyl is up to about 55%.
  • the powder is dissolved in water at a high concentration of 70%, myo-inosity will be dissolved at a maximum concentration of 15%, and the remaining undissolved myo-inosity is formed as a silver precipitate.
  • Ecuiro-Inositol has a solubility of up to 55%, almost all D-Chai-Inosi in the powder is dissolved in this water.
  • Step (i) ' separating the supernatant from the precipitate of the inos produced in the aqueous solution
  • the supernatant is separated from the precipitate of the inositol produced in step (h) ' . Separation of the supernatant from the inosi precipitates uses filtration or centrifugation. According to one embodiment of the invention, the separation of the supernatant from the inositol precipitate is carried out using a filtration method. Inosi precipitates will most likely contain myo-inos, and inos will The dissolved supernatant has an increased purity of D-Cyro-inosyl.
  • Step (j) ' drying the supernatant to obtain Inosi powder. The supernatant separated in Step (i) ' is dried to obtain Inos.
  • Drying of the supernatant may be performed while heating the supernatant, or may be performed in a vacuum. Inosi obtained by drying the supernatant was mixed with Myo-inositol and D-Cairo-Inosi, but the purity of D-Cairo-Inosi was increased. According to the following specific examples, the purity of D-Cyro—Inosyl in the dried powder when the inositol powder was dissolved in water at a high concentration of about 70% (w / v) in step (h) ' It is about 78.5%.
  • the present invention relates to D-chirotransfection from myo-inosio using dormant cells of recombinant cells expressing the myo-inosity transporter, inositol dehydrogenase, and inososomerase.
  • the present invention relates to a method of manufacturing inosi.
  • the present invention provides a method for the collection of dormant cells of recombinant cells from Myo-Inosio by E. coli -Inosio by one culture or at least two passages in a minimal medium containing myo-inosomy. Can be converted to yield.
  • the method of the present invention for culturing dormant cells in minimal medium can yield D-Cyro-inossie in a yield equivalent to that of culture in complete medium.
  • the present invention can reduce the manufacturing cost of D-Cyro-Inositol because the use of the minimal medium, not the complete medium, and the dormant cells can be used repeatedly, and the growth of cells generated by the method using the complete medium. You can save the time you need.
  • the method of the present invention provides a method for the preparation of the microorganisms from Myo-inosino and D-chiro-inosio through a simple and low-cost process such as the addition of organic solvents, supernatant separation and drying. Poems can be separated into high purity.
  • the myo-inositol separated from the D-chiro-inositus is reusable as a substrate.
  • the present invention is a myo-inosi transporter, Inosi.
  • the present invention relates to a method for producing D-chirozynosi from myo-inosine using recombinant cells and dormant cells expressing dehydrogenase and inosos isomerase. According to the method of the present invention, the use of minimal medium, repeated use of dormant cells is possible, and the conversion yield of myo-inos to D-chiro-inos is also equal compared to the case of using a complete medium. In the case of mass production of D-Cairo-Inosino, manufacturing costs can be greatly reduced.
  • the purification efficiency of D-Cyro-inositol can also be improved compared to the use of complete media.
  • high purity purity of Myo-inosino and D-Cairo-inosino from Ekairo-inosino is obtained through simple and low cost process such as addition of organic solvent, supernatant separation and drying. Can be separated. Myo-inos separated from D-chiro-inos is reusable as a substrate.
  • 1 is a chemical structure of the stereoisomers myo-inosyl and D-chiro-inosyl.
  • FIG. 2 shows HPLC chromatograms for myo-inosyl and D-chiro-inosi and their stereoisomers or derivatives.
  • Figure 3 shows the results of converting D-chiro-inosity from myo-inoshi by the dormant cell conversion method of the present invention.
  • the recombinant strain used in the experiment is as follows.
  • ⁇ pCOLAD-Cgi ep-Pa ioll / pACYCD-St iolTl-St iolT2 (F2) / BL21 (DE3) strain
  • O pCOLAD-Bs io 1 G-Bs ioll / pACYCD-St i olTl-St iolT2 (F2) / BL21 (DE3) strain
  • A pC0LAD-AGRL628-AGRL627 / pACYCD-St io 1 Tl-St iolT2 (F2) / BL2KDE3) strain
  • ⁇ pCOLAD-Pa i olG-Pa ioll / pACYCD-St io 1 Tl- St iolT2 (F2) / BL2KDE3) strain.
  • Figure 4 is a conversion according to the type of medium in the dormant cell conversion method of the present invention Show results.
  • strain pCOLAD-Cgiep-PaiolI / pACYCD-StiolTl-StiolT2 (F2) / BL21 (DE3) was used, and the composition of each medium was as follows.
  • the concentration of cells of dormant cells is as follows. M 0D 1.5, O: 0D 3, A: OD 4.5, V: 0D 6, ⁇ : 0D 7.5, : 0D 12, ⁇ : 0D 15, 0D 20.
  • Figure 6 shows the solubility of myo-inositol and D-chiro-inosi in 25 ° C distilled water.
  • B solubility of myo-inosino
  • O solubility of D-chiro-inosino.
  • Panel 10 is a dry powder of the supernatant obtained by adding primary ethane (Myo- The dissolution characteristics of each inositle when the inositol and D-Cyro-combined powder of Inosi) are dissolved in water again.
  • Panel A shows the concentrations of myo-inoshiro and D-chiro-inosyl in the aqueous solution supernatant.
  • Panel B shows the solubility of myo-inoshiro and D-chiro-inosi in the supernatant of aqueous solution.
  • Panel C shows the precipitation rates of myo-inos and D-chiro-inosiro in the supernatant of aqueous solution.
  • Panel D shows the purity of Acairo-Inosyl in the supernatant of aqueous solution.
  • BD Myo-Ino City
  • O D-Cairo-Ino City.
  • FIG. 11 shows the addition of various amounts of ethane to an aqueous solution containing about 12% of a mixed powder of myo-inos and D-chiro-inos, the dry powder of the supernatant obtained by adding primary ethane. This is the result of measuring precipitation and ' refining properties in the case.
  • Panel A is the result of measuring the concentration of myo-inossie and D-chiro-inosilo in the supernatant.
  • Panel B is the result of measuring the precipitation rates of myo-inos and D-chiro-inos.
  • Panel C shows the purity of D-Cairo-inosyl in the supernatant.
  • B Myo-inos
  • O Ukairo-inos.
  • Example Example 1 Cloning of a Gene Converting Myo-Inosi into D-Cyro-Inosit and Construction of a Recombinant Vector Comprising the Same
  • myo-inosity was amplified by the StiolTl gene corresponding to the transporter main type and the StiolT2 gene corresponding to the subtype, and then introduced into pACYCDuet-1 expression vector (Novagen). Recombinant plasmid vectors were prepared.
  • Myo-inosito in which myo-inosity is introduced into cells by a transporter, is converted to D-chiro-inosirool through the continuous reactions of Schemes 1 to 3 below.
  • the reactions of reactions 1 and 3 are catalyzed by inosi by dehydrogenase and the reaction of reaction 2 is catalyzed by inosos isomerase.
  • the gene (iolG) encoding 1-keto-D—chiro-inosine + NADH + H + D-chiro-inosine + NAD + inosine dehydrogenase is Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium). cloned from glutamicum), Bacillus subtil is, Agrobacterium tiimefaciens, Pantoea ananatis.
  • inosos isomerase The gene encoding inosos isomerase is Bacillus It was cloned from Bacillus subtil is, Agrobacterium tumefaciens and Pantoea ananatis, respectively.
  • the combination of the iolG and ioll genes is as follows. First, a combination of the iolG gene of Corynebacterium glutaniicum and the ioll gene of Pantoea ananatis. Second, the iolG and ioll of Bacillus subtil is. The combination of the genes, third, iolG and ioll of Agrobacterium tumefaciens, and the combination of the iolG and ioll of the pantoea ananatis. Gene information corresponding to the cloned StiolTl and StiolT2 and iolG and ioU is shown in Table 1 below.
  • pACYCD-StiolTl-StiolT2 F2 was produced.
  • StiolTl-F2 and StiolTl-R for PCR from genome DNA of Salmonella ent erica subsp.ent erica serovar Typhi murium str.LT2 ATCC700720 (tax id: 99287; GenBank NID: NC_006511, ATCC700720) StiolTl was amplified and StiolT2 was amplified using PCR primers StiolT2-F and StiolT2-R. The amplified StiolTl was digested with Ncol and BamHI and inserted into the Ncol and BamHI sites of pACYCDuet-1 vector (Novagen).
  • PACYCD-StiolTl (F2) was prepared, and then the amplified StiolT2 was digested with Ndel and Sail and inserted into the Ndel and Xhol sites of the prepared vector pACYCD-StiolTKF2). was produced.
  • Inosi from various bacteria was cloned into genes encoding dehydrogenase (iolG) and inosus isomerase (ioll).
  • iolG genes were isolated from Corynebacterium glutamicum. Cloning was performed, and a synthetic vector was prepared by cloning the ioll glycolysis gene from Pantoea ananatis.
  • the iolG gene Cgiep (NCg 12957 or GI: 19554252) was cloned from the genome DNA of Corynebacterium glutamicum and the ioll gene from the genome DNA of P. ananatis. Paioll was cloned.
  • amplification of Cgiep from the genome DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (taxid: 196627; GenBank NID: NC_003450, ATCC13032) using PCR primers Cgiep-F and Cgiep-R was performed with restriction enzymes BspHI and Notl. cutting and: by inserting it to the Ncol and Notl sites of pCOLADuet-l (Novagen) to prepare a pCOLAD-Cgiep.
  • BsiolG corresponding to iolG was amplified using BsiolG-F and BsiolG-R primers from genomic DNA of 168, and then digested with restriction enzymes Pcil and Notl and inserted into Ncol and Notl sites of pCOLADuet-1 to prepare pCOLAD-BsiolG. It was.
  • Bsioll-F and Bsioll-R primers were used to amplify Bsioll corresponding to ioll, and then treated with restriction enzymes Ndel and Pacl to insert into the same restriction enzyme site of the previously constructed plasmid pCOLAD-BsiolG, and then pCOLAD-BsiolG-BsiolI. Was produced.
  • a recombinant vector was constructed by cloning iolG and ioll genes from Agrobacterium tumefaciens.
  • Agrobacter ium tumefaciens str. From the genome DNA of C58 (taxid: 176299; GenBank NID: IC) 03062), the AGRL628 gene corresponding to iolG was amplified using primers AGRL628—F and AGRL628-R, which were cleaved with restriction enzymes Pcil and Sacl to pCOLADuet-l.
  • PC0LAD-AGRL628 was prepared by introducing into the Nc and Sacl region of (Novagen).
  • AGRL_627 corresponding to ioll was amplified using AGRL627-F and AGRL627-R primers, and then digested with restriction enzymes Ndel and Sail and inserted into Ndel and Xhol sites of pC0LAD-AGRL628 to prepare a pCOLAD-AGRL628-AGRL627 recombinant vector. It was.
  • a recombinant vector was prepared by cloning iolG and ioll genes from Pantoea ananatis.
  • Amplify Paidh corresponding to iolG from the genome DNA of Pantoea ananat is LMG 20103 (taxid: 706191, GenBank NID: CP001875) using Paidh-F and Paidh-R primers, and then cleaved with restriction enzymes Pcil and Notl to pC0LADuet- pCOLAD-Paidh was prepared by inserting into the Nc and Notl sites of l.
  • Pa i 011 pCOLAD-Bs iolG-BsiolI, pC0LAD-AGRL628-AGRL627 and pCOLAD-Pa iolG-Paioll were introduced together with pACYCD-StiolTl-StiolT2 (F2) to the E. coli BL21 (DE3) strain to simultaneously have the recombinant plasmid vector Transformed E. coli strains were prepared. The produced E.
  • coli strains were as follows: 1 pCOLAD-Cg i ep-Pa ioll / pACYCD-St io ITl-St io 1T2 (F2) / BL21 (DE3) strain, 2 pCOLAD-Bs io 1 G-Bs ioll / pACYCD -St io 1 Tl-St io 1 T2 (F2) / BL21 (DE3) strain, 3 pC0LAD-AGRL628-AGRL627 / pACYCD-St iolTl-St iolT2 (F2) / BL21 (DE3) strain, 4 pCOLAD-Pa io 1 G—Pa ioll / pACYCD-St iolTl-St iolT2 (F2) / BL21 (DE3) strain.
  • the prepared medium was cultured using a complete medium. More specifically, 300 mL of baffled Erlenmeyer flasks were incubated in a volume of 50 mL, 15% (w / v) myo-inosine, 0.5% 0 / v) lactose, 50 mg / L Chloramphenicol, 50 mg / L TB medium containing kanamycin [Terrific Broth; 1.2% (vv / v) tryptone, 2.4% yeast extract, 0.4% glycerol, 0.17 M K3 ⁇ 4P0 4 (potassium monophosphate), 0.72 ⁇ K 2 HP0 4 (potassium diphosphate)] at 37 ° C.
  • romasil 5NH2 column (4.6 kW x 250 mm), mobile phase 75% acetonitrile, column temperature 40 ° C, RI detector was used in all of the experiments described below for myo-inos and D-chiro-inosino. Analysis was carried out using the method described above, after confirming that the concentrations of the myo-inosino and D-chiro-inosi reached equilibrium, the cultures were centrifuged, and centrifugation was performed at 3,000 rptn for 30 minutes. In order to prevent the precipitation of myo-inosity due to the temperature difference and cold shock of the cells, the cells were maintained at 37 ° C. The recovered cells remained in the nutrient-rich TB medium.
  • the cells were washed twice to completely remove the TB medium component.
  • the washing was carried out by suspending the collected cells with a complete solution (minimum medium) containing a substrate to be used for the conversion reaction.
  • the cells were recovered by centrifugation under the above centrifugation conditions, and all the cells for use in the dormant cell conversion method in all the experiments were used by washing twice using the above method.
  • the cells of dormant cells were used to convert myo-inosity into D-chiro-inosio in the state of growth stopped in the minimal medium, i.e., in the dormant cell state. More specifically, incubation at a 50 mL volume in a 300 mL baffled Erlenmeyer flask.
  • the cells were recovered by centrifugation at 37 ° C and 3,000 rpm for 30 minutes.
  • the recovered cells were resuspended in the medium of the above-mentioned composition, and conversion was performed for 24 hours by the same method. This conversion process was repeated 5 to 7 times.
  • the analysis of myo-inossie and D-chiro-inositole was performed by the method described in Example 1 above. The results of analysis of the conversion from myophyllosino to D-chiro-inoshir using dormant cells of recombinant strains having combinations of different genes are shown in FIG. 3.
  • iolG and ioll Recombinant strains which introduced the genes of iolG and ioll of B. subtil is, A. t Lime faci ens, P. ananatis
  • the production of D-Cairo-inosino decreased sharply (see panel A in FIG. 3).
  • pCOALD-Cgiep-PaiolI was generally not significantly different from the case in which the cells were introduced (Panel B of FIG. 3), and the result may be due to the sharp decrease in the activity of the enzyme.
  • Example 4 Comparison of Conversion Rate to D-Cyro-Inositol According to the Conversion Medium
  • a strain into which pCOLAD-Cgiep—Paioll and pACYCD-StiolTl-StiolT2 (F2) recombinant vector exhibited the most stable production in Example 3 was introduced.
  • the conversion pattern of D-Cairo-inosity (DCI) was confirmed by varying the composition of the conversion medium.
  • various kinds of mediums simpler than the minimum medium were prepared and dormant cell conversion reactions were performed.
  • the M9 minimum medium was used as a positive control, using only 0.85% (w / v) NaCl or water, 0.5% (w / v) lactose as a carbon source or glucose was added to the medium, Under these conditions, dormant cell conversion reaction was performed.
  • the first experimental group contained 15% (w / v) myo-inosine as a positive control, 0.5% (w / v) lactose, 50 mg / L chloramphenicol, and 50 mg / L kanamycin. M9 minimal medium, the second experimental group containing 15% (w / v) myo-inosine, 0.5% (w / v) lactose 50 mg / L chloramphenicol, 50 mg / L kanamycin and 0.85% NaCl solution. Medium, and the third experimental group contained 0.5% (w / v) glucose instead of 0.5% (w / v) lactose in the second experimental group, and the fourth experimental group was 0.5% (w / v) of the third experimental group.
  • the fermentation temperature was adjusted to 37 ° C., pH was maintained at 0 by using ammonia water, but DO was maintained above 40% with increasing RPM from below 40%.
  • the cells reached a maximum of about 0D 18 after 18 hours of incubation, and did not increase after D-chiro-inossie reached the equilibrium concentration of about 20 g / L in about 12 hours.
  • the cell cultures were recovered by centrifugation of the cell culture medium at which D-Cairo-inositol reached the equilibrium concentration and the fermentation was terminated at 37 ° C and 3,000 rpm for 30 minutes, and 15% (vv / v) to remove TB medium components.
  • Myo-inossie was washed with M9 minimal medium containing 0.5% (w / v) lactose, 50 mg / L chloramphenicol, 50 mg / L kanamycin. The recovered and washed cells were resuspended to the cell concentration in M9 minimal medium of the composition. Cell mass is 0D 1.5, 3, 4.5, 6, 7.5, 12, 15
  • myoininosi and D-chiro-inositol were dissolved in primary distilled water at room temperature (about 25 ° C.) to a concentration of 5% (w / v) to 80% (w / v), respectively. .
  • the undissolved portion of each solution was separated by centrifugation, and each concentration was analyzed by HPLC by taking a portion of the supernatant in which inosole was completely dissolved.
  • Analytical conditions were performed using HPLC (Shimadzu LClOAvp), a romasil 5NH2 column (4.6 x 250 cc), mobile phase 75% acetonitrile, column temperature 40 ° C, RI detector. The results are shown in FIG.
  • the solubility of myoininosi was about 15% (w / v) at 25 ° C, and about 55% (w / v) for D—Cairo-inosino.
  • the solubility difference between Si and D-Cairo-Inosi was confirmed to be very large.
  • Example 7 Primary Ethanol Treatment for Separation of Myo-inosies After culturing dormant cells, a minimal medium containing the product D-Cyro-Inos and the substrate Myo-Inos was used for the experiment.
  • the results shown in FIG. 7 are shown in FIG. 8 in terms of precipitation rate.
  • the precipitation rate of myo-inositol increased rapidly with the addition of ethane, and when 1-fold addition of ethane was added, the precipitation rate was 70-80% in all reaction conditions. It was confirmed that most of myo-inosi precipitated under the addition conditions.
  • the precipitation rate of D-Cyro-Inosine was less than about 15% until about 1 times of ethanol was added, and the precipitation rate was relatively increased when more than 2 times of ethane was added.
  • Example 8 Concentration drying and redissolution of the supernatant after treatment with primary ethane As in the method described in Example 7, the same amount (1: 1) of ethanol was mixed in the minimum medium in which the culture was completed, and then the precipitate was removed. The obtained supernatant was heated to 80 ° C, concentrated and dried in vacuo ⁇ 15% of dry powder (combined powder of Myo-inos and D-Cairo-inos) obtained after drying -Dissolved in distilled water at various concentrations of 70% and observed dissolution characteristics of myo-inosine and D-chiro-inosine at each concentration. The method of analyzing inosyl using HPLC is the same as described in Example 6.
  • FIG. 10 The results of analyzing the dissolution characteristics of the myo-inositole and the D-chiro-inosino are shown in FIG. 10.
  • Panel A of FIG. 10 shows the concentration of each inos in the supernatant, that is, the solubility, and the solubility of the myo-inos did not increase more than about 15% as shown in Example 6 above. there was.
  • the solubility of D-Cyro-inositol is about 55%, it was confirmed that all D-Cyro-Inosi was dissolved even when the dry powder was dissolved at a concentration of 70%.

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Abstract

본 발명은 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면, 최소배지를 이용하고, 휴면세포의 반복사용이 가능하며, 완전배지 사용과 비교하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨 전환 수율도 동등하므로, D-카이로-이노시톨의 대량 생산시 제조비용을 크게 절감할 수 있다. 또한, 최소 배지를 배양에 사용하므로, 완전 배지의 사용과 비교하여 D-카이로-이노시톨의 정제 효율도 크게 향상시킬 수 있다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
휴면 세포 전환법을 이용한 D—카이로 이노시를의 생산 방법 【기술 분야】
본 발명은 재조합 세포의 휴면세포를 이용한 D—카이로 아노시를의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 마이오-이노시를 (myo¬ inositol)로부터 으카이로-이노시를 (D— chiro-inositol)로 전환시키는 효소를 발현하도록 제조한 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오- 이노시를로부터 D-카이로 이노시를을 생산하는 방법에 관한 것이다.
【배경 기술】
D—카이로―이노시를 (D— chi ro-inosi tol )은 마이오―이노시를 (myo_ inositol)의 스테레오이소머로서 3 번 하이드록실 그룹이 에피머화된 형태이다 (도 1). D-카이로 -이노시를은 이노시를 포스포글리칸 (IPG)의 주요 구성성분으로 인슐린 신호전달의 중요한 매개체로 보고되어 있으며， 제 2 형 당뇨의 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. D-카이로 -이노시를은 주로 진핵생물에서 발견되며， 마이오ᅳ이노시를의 에피머화에 의해 생합성된다. D-카이로—이노시를은 주로 피니를 (D-pinitol)이나 카스가마이신 (kasugamycin)의 염산 가수분해에 의해 생산하고 있다
Pat No. 5827896， U.S. Pat No. 5091596, U.S. Pat No. 5463142, U.S. Pat No.5714643). 그러나， 원료인 피니를이나 카스가마이신이 고가이며， 유기합성법 (U.S. Pat No. 5406005, W0 96/25381)도 알려져 있으나， 부산물의 분리가 용이하지 않아 경제성이 낮다. Yamamoto 등은 Agrobacterium sp. AB10121 의 MI 에피머라제 (epimerase)를 발현시킨 세균을 이용하여 마이오—이노시를로부터 카이로 -이노시를로 전환하는 방법을 제시하였다 (JP2001-006878, W0 2002/055715) . Yamamoto 등에 의한 방법은 마이오-이노시를로부터 약 15% 수율로 D-카이로 -이노시를을 생산할 수 있으나， 보다 개선된 방법에 의한 D-카이로-이노시를 생산 방법의 개발이 요구된다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 재조합 세포를 이용하여 마이오-이노시를로부터 으 카이로 -이노시를을 높은 수율로 생산할 수 있는 기술을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과， 마이오—이노시롤 트랜스포터 (myo-inositol transporter) , 이노시를 디하이드로게나아제 (myo_inositol dehydrogenase) 및 이노소스 이소머라아제 (inosose isomerase)를 발현하는 재조합 세포를 제조하고， 이 재조합 세포의 휴면세포 (resting cell)를 이용하여 마이오- 이노시를로부터 D-카이로 -이노시를을 생산하면， D-카이로 -이노시를의 제조비용 감소 및 정제 효율의 증대 효과가 있음을 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시를로부터 D-카이로 -이노시를을 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구의 범휘 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 휴면세포를 이용하여 마이오—이노시롤로부터 D—카이로 -이노시를을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 마이오-이노시를 트랜스포테 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 재조합 세포를 마이오 -이노시를을 포함하는 배지에서 정지기 (stationary phase) 까지 배양하여 휴면세포 (resting cell) 상태로 유도하는 단계; 및 (c) 상기 휴면세포를 회수하고 마이오- 이노시를을 포함하는 최소 배지 (minimal medium)에서 배양하여 D-카이로ᅳ 이노시를을 생성시키는 단계. 이하에서 본 발명을 각 단계에 따라 보다 상세하게 설명한다. 단계 (a): 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포를 준비하는 단계
본 명세서에서 용어 "마이오-이노시를 트랜스포터 (myo-inositol transporter)' '는 마이오 -이노시를을 세포내로 이동시키는 수송효소를 의미한다. 대부분의 세포는 배지내의 이노시를을 세포내로 흡수하는 이노시를 수송 시스템을 갖고 있으며ᅳ 마이오―이노시를 트랜스포터는 포유동물 세포에서부터 박테리아에 이르기 까지 다양한 세포에서 확인되어 있다. 에어로박터 에어로게네스 (Aerobacter aerogenes) [Deshusses, J., and Reber , G.， 1972, Biochim. Biophys. Acta 274， Bacteriol . 126, 243- 250] , 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas put i da) [Reber , G. , Belet, M. , and Deshusses, J., 1977, J. Bacterol . 131, 872-875] , 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 [Gauchat— Feiss, D. , Frey, J., Belet , M. , and Deshusses, J., 1985， J. Bacteriol. 162, 324-32기와 같은 박테리아에서 마이오ᅳ이노시를 트랜스포터 유전자가 분리되었다고 보고되었으며, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) (Nikawa, J., Nagumo, T. , and Yamashita, S. (1982) J. Bacteriol . 150, 441-446)와 같은 효모에서도 마이오—이노시를 트랜스포터 유전자가 분리되어 보고되었다. 또한, 마이오-이노시를 트랜스포터는 주타입 (major type)과 부타입 (minor type)이 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 마이오-이노시를 트랜스포터는포유동물 세포, 효모 세포 또는 박테리아로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 본 발명의 마이오-이노시틀 트랜스포터는 박테리아 유래의 것을 사용한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 마이오—이노시를 트랜스포터는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtil is), 살모넬라 티피무리엄 (Salmonella typhimurium) 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)으로부터 분리된 것을 사용한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면， 본 발명의 마이오-이노시톨 트랜스포터는 살모넬라 티피무리엄 (S. typhimurium) 유래의 트랜스포터를 사용한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 마이오-이노시를 트랜스포터는 서열번호 1 및 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 "이노시를 디하이드로게나아제 (inositol dehydrogenase)' '는 하기 반웅식 1에 나타낸 바와 같이 마이오 -이노시를을 NAD+ 의존성 산화작용에 의해 2—케토-마이오ᅳ이노시를 (2-keto-myo- inositol)로 변환시키는 화학반웅 또는 이의 역방향 반웅을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 "이노시를 디하이드로게나아제' '와 관련하여 이를 코딩하는 유전자 명칭은 "iolG"으로 기재한다.
[반웅식 1]
마이오—이노시를 + NAD+ ^ 2-케토 -마이오-이노시를 + NADH + H+ 이노시를 디하이드로게나아제는 에어로박터 에어로게네스 (Aerobacter aerogenes) [Berman T, Magasanik Β (1966). J. Biol . Chem. 241 (4): 800- 806； LARNER J, JACKSON WT, GRAVES DJ, STAMER JR (1956). Arch. Biochem. ' Biophys. 60 (2)： 352— 363)과 효모 크립토코커스 멜리비오숨 (Cryptococcus mel ibiosum) [Vidal-Leir ia M, van Uden N (1973) . Biochim. Biophys. Acta. 293 (2)： 295-303]에서 분리되었다고 보고되어 있다.
본 발명의 일 구현예에 의하면， 본 발명의 이노시를 디하이드로게나아제는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 바실러스 서브틸리스 (Baci 1 lus subtil is), 코리네박테리움 글루타미큼 (Corynebacterium glutamicum) , 또는 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis)로 부터 분리된 것이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면， 본 발명의 이노시를 디하이드로게나아제는 서열번호 3， 서열번호 4， 서열번호 6， 및 서열번호 8에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 사용한다.
본 명세서에서 용어 "이노소스 이소머라아제 (inosose isomerase)"는 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이， 2-케토-마이오ᅳ이노시를을 1-케토 -D- 카이로-이노시틀 (1— ket으 D— chiro-inositol)로 전환하는 이성질체화 반웅 또는 이의 역방향 반웅을 촉매하는 활성을 갖는 효소이다. 본 명세서에서 "이노소스 이소머라아제 "와 관련하여 이를 코딩하는 유전자 명칭은
"ioll"로 기재한다. [반웅식 2]
2-케토ᅳ마이오―이노시를 1-케토— D-카이로-이노시를 본 발명의 일 구현예에 의하면， 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 박테리아 유래의 것을 사용한다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) , 바실러스 서브틸리스 (Bacil lus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 또는 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis)로부터 분리된 것이다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면， 본 발명의 이노소스 이소머라아제는 서열번호 5, 서열번호 7， 및 서열번호 9에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 사용한다.
상기 반웅식 2에 의해 생성된 1-케토— D-카이로 -이노시를은 하기 반웅식 3에 의해 본 발명의 최종산물인 D—카이로 -이노시를을 생성한다. 하기 반웅식 3의 반응은 앞서 설명된 효소인 "이노시를 디하이드로게나아제 " 가 촉매한다 .
[반응식 3]
1ᅳ케토 -D-카이로-이노시를 + NADH + H+ *→ D-카이로—이노시를 + NAD+ 상기 "마이오-이노시를 트랜스포터"， "이노시를 디하이드로게나아제'' 및 "이노소스 이소머라아제' '를 발현하는 재조합 세포는 상기 반웅식 1 내지 반응식 3의 연속적인 반응을 통해 배지에 포함된 마이오—이노시를을 D- 카이로 -이노시를로 전환한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 재조합 세포는 마이오- 이노시를 트랜스포터를 코딩하는 DNA 서열, 이노시를 디하이드로게나아제를 코딩하는 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열을 발현가능한 형태로 포함하는 재조합 백터로 형질전환된 세포이다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면， 마이오—이노시를 트랜스포터를 코딩하는 DNA 서열， 이노시를 디하이드로게나아제를 코딩하는 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열은 단일의 재조합 백터에 발현 가능한 형태로 포함될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면， 본 발명의 상기 DNA 서열들은 각각의 상이한 재조합 백터에 발현 가능한 형태로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면， 상기 본 발명의 재조합 백터는 (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오-이노시를 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 제 1의 재조합 백터; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시를 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA서열을 포함하는 게 2의 재조합 백터로 이루어진다. 본 발명에서 마이오-이노시를 트랜스포터, 이노시를 디하이드로게나아제, 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열은 재조합 백터내에서 프로모터에 작동적으로 결합되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된 (operatively linked)"은 DNA 서열의 발현조절 서열 (예를 들어 프로모터)과 기능적으로 결합되어 있다는 의미로서， 기능적 결합에 의해 DNA 서열의 발현이 발현조절 서열에 의해 조절된다.
본 명세서에서 용어 "프로모터"는 유전자 코딩 서열 또는 기능적
RNA의 발현올 조절할 수 있는 DNA서열을 의미한다.
본 발명에서의 백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며 , 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. , Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 재조합 백터는 클로닝 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있으며， 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백터가 발현 백터이고， 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, ρίλ프로모터， trp 프로모터, lac 프로모터， T7 프로모터， tac 프로모터 등)， 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균 (E. coli)가 이용되는 경우 대장균 (E. coli) 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C, J. Bacteriol., 158： 1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (ρίλ프로모터， Herskowitz, I. and Hagen, D. , Ann. Rev. Genet., 14 :399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 백터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신， 카베니실린， 클로람페니콜， 스트렙토마이신， 카나마이신， 게네티신， 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있으며， 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제 내성 유전자는 이의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다.
바람직하게는 본 발명의 백터는 원핵세포용 백터이며， 원핵 숙주세포, 특히 대장균 (E. coli)에서 복제가 가능하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서， 본 발명의 백터는 colA, colEl 또는 pl5A의 박테리아의 복제 원점 또는 fl origin과 같은 박테리오파아지의 복제 원점을 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다. 예를 들에 포유동물세포， 곤층세포， 효모와 같은 진핵세포 또는 원핵세포를 들 수 있으나， 바람직하게는 원핵세포를 사용한다. 원핵세포로서는 예컨대， 대장균인 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392 , E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스， 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움， 세라티아 마르세슨스， 코리네박테리움 글루타미쿰 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은， 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D. , J. Mol . Biol. , 166：557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al .， Nucleic. Acids Res., 16 :6127-6145 (1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 본 발명의 상기 재조합 세포는 마이오-이노시를 트랜스포터를 코딩하는 DNA 서열， 이노시를 디하이드로게나아제를 코딩하는 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열이 발현 가능한 형태로 세포의 염색체안으로 삽입된 형태의 세포이다.
본 발명의 일 구현예에 의하면， 마이오—이노시률 트랜스포터 , 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포는 동물세포, 곤층세포， 효모 또는 원핵세포이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면， 상기 재조합 세포는 원핵세포이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 재조합 세포는 박테리아 세포이다.
"
단계 (b): 상기 재조합 세포를 마이오 -이노시를을 포함하는 배지에서 정지기까지 배양하여 휴면세포 상태로 유도하는 단계
상기 단계 (a)에서 제조한 재조합 세포를 휴면세포 (resting cell) 상태로 유도하기 위해 상기 재조합 세포를 마이오 -이노시를을 포함하는 완전 배지 (complete medium)하에서 정지기 (stat mary phase)까지 배양한다. 본 발명에서 재조합 세포의 배양에 사용하는 배지는 당업계에 공지된 통상의 미생물 배양 배지를 사용할 수 있다. 재조합 세포가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원， 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 상기 배양은 탄소원 , 질소원 및 무기염류가 풍부하게 존재하는 완전배지 (complete medium)을 사용하여 행한다. 배지에 포함될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 또는 락토오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄을, 프로판올， 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄， 암모늄설페이트， 암모늄아세테이트. 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤， 육추출물 (meat extract), 효모추출물 (yeast extract), 옥수수 침지액， 카제인 가수분해물, 대두추출물， 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 무기염은 포타슘다이하이드로젠 포스페이트， 다이포타슘하이드로젠 포스페이트， 마그네슘 포스페이트， 마그네슴 설페이트, 소디엄 클로라이드， 망간 설페이트 , 구리 설페이트 , 칼슘 카보네이트 등을 포함하나， 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 배지에는 재조합 세포에 도입한 효소의 기질인 마이오- 이노시를을 첨가하여 배양한다 . 마이오ᅳ이노시를의 배지내의 농도는 특별히 한정되지 않으나, l-30%(w/v)이다. 본 발명의 일 구현예에 의하면 마이오 -이노시를의 배지내의 농도는 5-20% (w/v)의 범위내에서 적합한 농도를 선택하여 사용한다.
본 발명에서 재조합 세포의 배양 방법은 공지된 세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법을 이용하여 행할 수 있다. 재조합 세포의 배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전배양과 같은 호기성 조건 하에서 행한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 배양 온도는 10 - 40°C의 범위에서 적합한 농도를 선택한다. 배양시간은 배양의 규모에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 배양시간은 5 시간 - 7 일의 범위 내에서 적합한 시간을 선택한다ᅳ 배지의 pH는 배양 중에서 3.0 - 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산， 알칼리 용액， 우레아, 칼슘 카보네이트， 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배지에는 필요한 경우 재조합 백터의 유지 및 발현을 위해 항생제가 첨가될 수 있으며， 예를 들어, 암피실린， 겐타마이신, 카베니실린， 클로람페니콜， 스트렙토마이신， 카나마이신， 게네티신, 네오마이신 또는 테트라사이클린가 첨가될 수 있으나， 이에 한정되지 않는다.
유도 (induct ion) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 백터로 형질전환된 재조합 세포를 배양하는 경우에는 필요하다면 배지에 적합한 유도제 (inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어， 발현 백터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-으 thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산 (indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 배지에는 탄소원인 동시에 발현 유도제로서 락토오스 (lactose)를 사용한다.
본 명세서에서 용어 "휴면세포 (resting .cell)1' 는 더 이상 증식하지 않는 상태의 배양 세포를 의미한다ᅳ 본 명세서에서 용어 "정지기 (stationary phase)' '는 세포를 배양하는 경우 대수기 (exponent ial phase)를 지나 세포의 분열 및 증식이 정지하여 세포 개체 수의 증가가 나타나지 않으며， 세포 성분의 합성과 분해가 균형을 이룬 상태를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 본 발명의 재조합 세포의 휴면 세포는 균체 성장이 완료되고， 세포내에서 원하는 단백질의 발현이 층분히 이루어졌으며, 고농도의 마이오 -이노시를에 적웅된 세포를 의미한다. 당업자는 배양액내의 다양한 파라미터를 측정하여 재조합 세포가 정지기에 들어긴 휴면세포 상태임을 판단할 수 있다. 본 발명의 일 구현예 의하면， 상기 정지기는 배양 배지내에서 마이오 -이노시를의 농도 및 D-카이로 -이노시를의 농도가 평형 농도에 이른 상태를 의미한다. 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 본 발명의 재조합 세포는 마이오 -이노시를을 포함하는 배지에서 마이오- 이노시를을 D-카이로 이노시를로 전환하여 생성한다. 배양 배지내에서 기질인 마이오 -이노시를의 농도와 생성물인 D—카이로 -이노시롤의 농도가 평형 상태에 이른 경우 정지기에 도달한 것으로 판단할 수 있다. 본 명세서에서 배양액 중의 이노시를의 농도의 "평형상태' '는 이노시를의 농도가 더 이상 변화되지 않는 상태를 의미한다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면, 배양액내의 세포농도를 측정한 0D600값이 6-12 범위， 보다 더 바람직하게는 6-10의 범위에 있는 경우 재조합 세포가 휴면세포 상태인 것으로 결정할 수 있다. 단계 (C): 상기 휴면세포를 회수하고 마이오 -이노시를올 포함하는 최소 배지에서 배양하여 D-카이로 -이노시를을 생성시키는 단계
상기 단계 (b)에서 휴면세포로 유도된 재조합 세포의 배양균체를 회수하여 마이오 -이노시를을 포함하는 최소배지에서 배양하면서 D-카이로- 이노시틀을 생성시킨다.
본 발명의 일 구현예에 의하면， 재조합 세포의 휴면세포를 희수한 후 완전 배지에 포함된 성분을 제거하기 위해 세척하는 단계를 포함한다. 상기 세척은 마이오 -이노시를을 포함하는 최소배지를 사용하여 현탁시킨 후 원심분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "최소배지' '는 재조합 세포의 휴면세포를 유지시키는데 있어서 필요한 최소한의 성분을 갖는 배지를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 최소배지는 탄소원 및 무기염을 포함하는 배지를 의미한다. 최소 배지에는 재조합 세포에 도입한 효소의 기질인 마이오ᅳ이노시를을 첨가한다. 마이오 -이노시를의 최소 배지내의 농도는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 최소배지에서의 마이오 -이노시를의 농도는 1— 30%(w/v)의 범위 내에서 적합한 농도를 선택하여 사용한다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면， 마이오- 이노시를의 최소 배지내의 농도는 5-20%(w/v)이다. 최소배지에 포함되는 탄소원은 글루코오스， 프릭토오스， 수크로오스， 또는 락토오스와 같은 탄수화물; 녹말， 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올， 프로판올， 글리세를과 같은 알코올 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 탄소원은 락토오스이다. 무기염은 특별히 한정되지 않으나， 예를 들어, 다이소디엄포스페이트 (Ν ΗΡ04) , 모노포타슘포스페이트 (KH2P04)， 소디엄클로라이드 (NaCl), 암모늄클로라이드 (NH4C1), 칼슘클로라이드 (CaCl2) , 또는 마그네슴설페이트 (MgS04)을 들 수 있으나， 이에 한정되지 않는다. 최소배지에는 필요한 경우 재조합 백터의 유지를 위해 상기 탄소원과 무기염 이외에 항생제가 추가로 첨가될 수 있다. 항생제는 예를 들어， 암피실린, 겐타마이신， 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신， 게네티신, 네오마이신 또는 테트라사이클린가 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 재조합 세포가 유도 (induction) 가능한. 프로모터를 갖는 재조합 발현 백터로 형질전환된 재조합 세포인 경우 배지에 적합한 유도제 (inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어， 발현 백터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-^-D- thiogalactopyranoside)를 첨가하고， trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산 (indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 배지에는 탄소원인 동시에 발현 유도제로서 락토오스 (lactose)를 사용할 수 있다. 본 발명의 휴면세포로 유도된 재조합 세포를 마이오—이노시를이 포함된 최소배지에서 배양하면, 숙주 세포내에 이미 발현되어 있는 마이오ᅳ이노시를 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제에 의해 마이오 -이노시를이 D一카이로 -이노시틀로 빠른 속도로 전환된다. 이러한 전환속도는 일정 수준의 균체 농도에서의 배양법에 의한 전환속도와 비교하여도 매우 빠른 속도이다. 단계 (d): 상기 단계 (c) 이후에， 배양한 휴면세포를 회수하고， 마이오—이노시를을 포함하는 최소 배지에서 다시 배양하여 D-카이로- 이노시를을 생성시키는 단계
상기 단계 (c)를 행한 이후에, 최소배지에서 배양한 재조합 세포를 회수하고 마이오 -이노시틀을 포함하는 최소 배지를 사용하여 다시 배양하여 D-카이로 -이노시를을 생성시킨다. 상기 단계 (c)에서 으카이로- 이노시를로의 전환에 사용하였던 재조합 세포의 휴면세포 균체를 회수하여 재사용이 가능하다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 단계 (d)를 1 - 50회의 범위에서 반복하여 행한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면 단계 (d)를 1 - 40회 범위에서 반복하여 행한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면， 단계 (d)를 1 - 30회 범위에서 반복하여 행한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 단계 (d)를 1 - 20회 범위에서 반복하여 행한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 단계 (d)를 1 - 7회 반복하여 행한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면， 본 발명의 방법은 상기 휴면세포를 최소배지에서 배양한 후에， 배지에 생성된 D-카이로ᅳ이노시를을 배양액으로부터 분리하여 정제하는 단계를 더 포함한다. D-카이로- 이노시를의 분리 정제를 위해, 먼저 배양액으로부터 배양된 재조합 세포의 휴면세포를 제거한다. 휴면세포는 예를 들어 원심분리 또는 마이크로여과 (microfiltration) 방법에 의해 배양액으로부터 제거하고， 휴면세포가 제거된 배양액의 상층액을 얻는다. 배양 상층액으로부터 D- 카이로 -이노시를을 얻는 방법은 종래의 공지된 당 (sugar) 또는 탄수화물의 분리 정제 방법 또는 이를 변형한 방법을 이용할 수 있다. 종래 공지된 당의 분리 정제방법으로는， 제을라이트 분자체를 이용한 선택적 흡착 방법에 의한 분리방법 (미국특허 제 4 ,482， 761호)， 양이온교환수지를 이용한 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법 (미국특허 제 5, 096, 594호), 음이온 교환수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의한 분리방법 (미국특허 제 5，482，631호)， 활성탄에 의한 흡착 및 유기용매에 의한 용출 방법 (대한민국특허 제 10-0753982호)， 동결건조 및 재결정화 방법 등이 있으며， 이러한 방법을 이용하거나 이 방법의 변형된 방법 및 이 방법들을 조합하여 이용할 수 있으나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면， 본 발명은 상기 설명된 단계 (c) 또는 (d) 이후에， 다음의 단계를 더 포함하는 으카이로 -이노시를을 생산하는 방법을 제공한다: (e) 상기 휴면세포 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가하여 이노시를 침전물을 생성시키는 단계; (f) 상기 생성된 이노시틀 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (g) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는 단계. 、 단계 (e): 상기 휴면세포 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가하여 이노시를 침전물을 생성시키는 단계
휴면세포 배양이 완료된 최소배지에서 D-카이로ᅳ이노시를의 분리 및 정제는 마이오 -이노시를과 D—카이로—이노시를의 용해도 차이를 이용하여 행한다. 물을 용매로 사용한 수용액증에서 마이오 -이노시를과 D-카이로- 이노시를의 용해도 차이는 도 6에 나타나 있으며, 으카이로 -이노시를의 용해도가 마이오 -이노시를에 비해 훨씬 높다는 것을 알 수 있다. 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가한다ᅳ 이러한 유기용매의 첨가에 의해 마이오 -이노시를과 D—카이로ᅳ이노시를의 침전이 유도된다. 유기용매 첨가에 의해 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를의 침전율이 모두 증가되지만， D-카이로 -이노시를에 비해 마이오ᅳ이노시를의 침전율이 훨씬 크게 증가한다 (도 8 참조). 휴면세포 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가하여 으카이로-이노시를 보다 마이오 -이노시를을 더 많은 양으로 침전시켜 용액중의 D-카이로 -이노시틀의 농도를 증대시킬 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 유기용매는 으카이로—이노시를의 침전율 보다 마이오 -이노시를의 침전율을 더욱 크게 유도할 수 있는 특성을 갖는 것이면 특별하게 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 유기용매로서 알코올， 아세톤， 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 1,3- 부틸렌글리콜 또는 에테르를 사용한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면， 유기용매로서 탄소수 2ᅳ 6개의 알코올을 사용한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면， 유기용매로서 에탄올 , 이소프로판올 , 아세톤을 사용한다 . 휴면세포 배양 완료된 최소배지에 첨가하는 유기용매의 양은 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 ᅳ 9배 (v/v)의 범위 내에서 적합한 양을 선택하여 첨가한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 - 6배 (v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 최소 배지 대비 으 1 - 4배 (v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 - 2배 (v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면， 유기용매는 최소 배지 대비 0.1 - 1.5배 (v/v)양으로 첨가한다. 유기용매의 첨가에 의해 유도되는 이노시롤 침전물에는 마이오—이노시를과 으카이로 -이노시틀이 모두 포함되어 있으나， 마이오 -이노시를의 침전율이 더 높으므로， 마이오- 이노시를이 더 많은 양으로 포함되어 있다. 단계 (f): 상기 생성된 이노시를 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계
상기 단계 (e)를 통해 생성된 이노시틀 침전물로부터 상층액을 분리한다. 상기 이노시를 침전물은 마이오-이노시를 및 D—카이로- 이노시틀의 침전물이지만 마이오 -이노시를이 더 큰 침전율을 나타내므로， D-카이로—이노시를 보다는 마이오 -이노시를이 더욱 많은 양으로 포함되어 있다. 마이오 -이노시를의 다량 침전으로 인해 상층액 중에는 마이오- 이노시를의 농도가 낮아지게 되며， D-카이로—이노시를의 농도 (순도)는 상대적으로 증가하게 된다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 이노시를 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 이노시를 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 방법을 사용하여 행한다. 단계 (g): 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시틀 분말을 얻는 단계
상기 단계 (f)에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며， 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시를 분말에는 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를이 흔합되어 있으나, 상기 단계 (c) 또는 단계 (d)에서 배양이 완료된 최소배지와 비교하여 D-카이로- 이노시를의 순도가 증가되어 있다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면， 본 발명은 상기 단계 (g) 이후에 다음의 단계를' 더 포함하는 D-카이로 -이노시를을 생산하는 방법을 제공한다: (h) 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시를 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계; (i) 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시를 침전물을 생성시키는 단계; (j) 상기 생성된 이노시를 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (k) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는 단계 . 단계 (h): 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시를 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계
상기 단계 (g)에서 얻은 이노시틀의 분말을 물에 용해시켜 이노시를이 용해된 수용액을 제조한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 상기 물은 증류수이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면， 상기 이노시를 분말을 물에 209¾(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 이노시를 분말을 물에 0.1% (w/v) 이상 20%(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 이노시를 분말을 물에 0.1%(w/v)이상 18%(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면， 이노시를 분말을 물에 0.1% (w/v) 이상 15%(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 단계 (i): 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시를 침전물을 생성시키는 단계
상기 단계 (h)에서 얻은 이노시틀이 용해된 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시를의 침전물을 생성시킨다. 유기용매는 상기 단계 (e)에서 설명된 내용과 동일하다. 유기용매는 D-카이로 -이노시틀의 침전 보다 마이오ᅳ이노시를의 침전을 더욱 크게 유도할 수 있는 특성을 갖는 것이면 특별하게 한정되지 않는다 . 본 발명의 일 구현예에 의하면 , 유기용매로서 알코올， 아세톤， 에틸아세테이트, 부틸아세테이트， 1，3-부틸렌글리콜 또는 에테르를 사용한다. 본 발명의 다른, 구현예에 의하면， 유기용매로서 탄소수 2— 6개의 알코올을 사용한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매로서 에탄올， 이소프로판을 아세톤을 사용한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면， 수용액에 첨가되는 유기용매의 양은 수용액 대비 0.1 - 10배 (v/v)의 범위 내에서 적합한 양을 선택하여 첨가한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 수용액 대비 1.5 - 9배 (v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 수용액 대비 9배 (v/v)의 양으로 첨가한다 . 상기 이노시를 침전물은 마이오ᅳ이노시를 및 으 카이로 -이노시를의 침전물이지만， 마이오—이노시를이 더 큰 침전율을 나타내므로, D-카이로-이노시를 보다는 마이오 -이노시틀이 더욱 많은 양으로 포함되어 있다. 단계 (j): 상기 생성된 이노시를 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계
상기 단계 (i)를 통해 생성된 이노시틀 침전물로부터 상층액을 분리한다. 이노시를 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용한다. 본 발명.의 일 구현예에 의하면， 이노시를의 침전물로부터 상층액의 분리는 여과방법을 사용하여 행한다. 이노시를 침전물에는 으 카이로—이노시를 보다 마이오 -이노시를이 더욱 다량 포함되어 있으므로 상층액에는 으카이로ᅳ이노시를의 순도가 증가된다. ― 단계 00: 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는 상기 단계 (j)에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다ᅳ 상층액을 건조시켜 얻은 이노시를 분말에는 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를이 흔합되어 있으나， D-카이로- 이노시롤의 순도가 증가되어 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면， 본 발명은 상기 단계
(g) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 D-카이로 -이노시를을 생산하는 방법올 제공한다: (h)' 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시를 분말올 물에 용해시켜 수용액올 제조하고 이노시를 침전물올 생성시키는 단겨); (i)' 상기 수용액에서 생성된 이노시를 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (j)' 상기 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는 단계. 단계 (h)' ： 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시를 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시를 침전물을 생성시키는 단계
상기 단계 (e)에서 얻은 이노시를의 분말을 물에 용해시켜 이노시를이 용해된 수용액을 제조한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 물은 증류수이다. 본 발명의 다른 일 구현예에 의하면， 이노시를 분말을 물에 20%(w/v) 초과의 고농도로 용해시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 이노시를 분말을 물에 20%(w/v) 초과 80%(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다론 구현예에 의하면， 이노시를 분말을 물에 30%(w/v) 이상 70%(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 하기 구체적인 실시예에 의하면， 물에 대한 마이오 -이노시를의 용해도는 최대 약 15%이며 D-카이로 -이노시를의 용해도는 최대 약 55%이므로, 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시를 분말올 물에 70%의 고농도로 용해시키는 경우 마이오- 이노시를은 최대 15% 농도로 용해될 것이며， 나머지 용해되지 않은 마이오 -이노시를은 침전물로 생성된다. 으카이로 -이노시틀은 최대 55%의 용해도이므로 이노시를 분말 중의 거의 모든 D-카이로—이노시를이 물에 용해된다. 단계 (i)' ： 상기 수용액에서 생성된 이노시를 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계
상기 단계 (h)' 에서 생성된 이노시틀의 침전물로부터 상층액을 분리한다. 이노시를 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 이노시틀 침전물로부터 상층액의 분리는 여과방법을 사용하여 행한다. 이노시를 침전물에는 대부분이 마이오 -이노시를이 포함되어 있을 것이며， 이노시를 흔합물이 용해된 상층액에는 D-카이로 -이노시를의 순도가 증가되어 있다. 단계 (j)' ： 상기 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는 단계 상기 단계 (i)' 에서 분리한 상층액올 건조시켜 이노시를 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며， 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시를 분말에는 마이오 -이노시틀과 D-카이로 -이노시를이 흔합되어 있으나, D-카이로- 이노시를의 순도가 증가되어 있다. 하기 구체적인 실시예에 의하면, 상기 단계 (h)' 에서 이노시틀 분말을 물에 약 70%(w/v)의 고농도로 용해시킨 경우 건조된 분말에서의 D-카이로—이노시를의 순도는 약 78.5%가 된다. 본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(i) 본 발명은 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시틀 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포의 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시를로부터 D-카이로ᅳ이노시를을 제조하는 방법에 관한 것이다.
(ii) 본 발명은 재조합 세포의 휴면세포를 마이오 -이노시틀을 포함하는 최소 배지에서 1회 배양 또는 2회 이상의 계대 배양에 의해 마이오-이노시를로부터 으카이로 -이노시를을 고수율로 전환시킬 수 있다.
(iii) 휴면세포를 최소 배지에서 배양하는 본 발명의 방법은 완전 배지에서의 배양과 동등한 수율로 D-카이로 -이노시를을 얻을 수 있다.
(iv) 본 발명은 완전 배지가 아닌 최소 배지를 사용하고, 휴면세포를 반복하여 사용할 수 있으므로 D-카이로 -이노시틀의 제조비용을 낮출 수 있으며, 완전배지를 이용한 방법에서 발생하는 균체 성장에 필요한 시간을 절약할 수 있다.
( V ) 본 발명은 영양 성분이 최소로 포함된 최소 배지를 이용하므로 완전 배지에 비해 배양 완료 배양액으로부터 D-카이로 -이노시를의 정제 효율을 향상시킬 수 있다.
(vi) 본 발명의 방법은 유기용매의 첨가, 상층액 분리 및 건조와 같은 간단하고 저비용 공정을 통해 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를이 흔합된 최소배지로부터 으카이로 -이노시를을 고순도로 분리할 수 있다. (vii) 본 발명의 방법은 D-카이로-이노시틀로부터 분리된 마이오- 이노시틀은 기질로서 재사용이 가능하다.
【유리한 효과】
본 발명은 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시를. 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 ί· 발현하는 재조합 세포와 휴면세포를 이용하여 마이오-이노시를로부터 D-카이로ᅳ이노시를을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면， 최소배지를 이용하고, 휴면세포의 반복사용이 가능하며， 완전배지를 사용하는 경우와 비교하여 마이오-이노시를로부터 D-카이로-이노시를 전환 수율도 동등하므로, D- 카이로 -이노시를의 대량 생산시 제조비용을 크게 절감할 수 있다. 또한， 최소 배지를 사용하므로, 완전 배지의 사용과 비교하여 D-카이로- 이노시틀의 정제 효율도 향상시킬 수 있다. 본 발명에 의하면 유기용매의 첨가, 상층액 분리 및 건조와 같은 간단하고 저비용의 공정올 통해 마이오- 이노시를과 D-카이로 -이노시를이 흔합된 배지부터 으카이로 -이노시를을 고순도로 분리할 수 있다. D-카이로-이노시를로부터 분리된 마이오- 이노시를은 기질로서 재사용이 가능하다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 입체이성질체인 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를의 화학 구조이다.
도 2는 마이오 -이노시를과 D-카이로-이노시를 및 이들의 입체이성질체 또는 유도체들에 관한 HPLC크로마토그램을 보여준다.
도 3은 본 발명의 휴면세포 전환방법에 의해 마이오-이노시를로부터 D-카이로 -이노시를을 전환한 결과를 보여준다. 실험에 사용한 재조합 균주는 다음과 같다.
Μ： pCOLAD-Cgi ep-Pa ioll /pACYCD-St iolTl-St iolT2(F2) /BL21 ( DE3 )균주, O： pCOLAD-Bs i o 1 G-Bs ioll /pACYCD-St i olTl-St iolT2(F2) /BL21 (DE3 )균주， A： pC0LAD-AGRL628-AGRL627/pACYCD-St i o 1 Tl-St iolT2(F2) /BL2KDE3 )균주， ▽： pCOLAD-Pa i olG-Pa ioll /pACYCD-St i o 1 Tl-St iolT2(F2) /BL2KDE3 )균주.
도 4는 본 발명의 휴면세포 전환방법에서 배지의 종류에 따른 전환 결과를 보여준다. 재조합 균주는 pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYCD-StiolTl- StiolT2(F2)/BL21(DE3)균주을 사용하였으며， 각 배지의 조성은 다음과 같다.
Q: 0.5% 락토오스가 첨가된 M9 최소배지, O: 0.85% NaCl 및 0.5% 락토오스만 포함된 배지, A: 0.85% NaCl 및 0.5% 글루코오스만 포함된 배지, ▽: 0.85% NaCl 및 1.0% 글루코오스만 포함된 배지,
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0.5% 글루코오스만 포함된 증류수.
도 5는 재조합 균주 pCOLAD-Cgiepᅳ PaiolI/pACYCD-Stiom- Stion^F^/BLSKDES)을 사용하여 균체의 농도에 따른 휴면세포 전환속도를 비교한 결과이다. 휴면세포의 균체의 농도는 다음과 같다. M 0D 1.5, O: 0D 3， A: OD 4.5， V： 0D 6, 令: 0D 7.5， ： 0D 12, ►： 0D 15, 0D 20.
도 6은 25 °C 증류수에서 마이오 -이노시틀과 D-카이로 -이노시를의 용해도를 보여준다. B: 마이오 -이노시를의 용해도, O: D-카이로- 이노시를의 용해도.
도 7은 휴면세포 배양을 완료한 마이오-이노시를 및 D—카이로- 이노시를이 포함된 M9 최소배지에 에탄을을 첨가하여 얻은 결과이다. 에탄올 첨가에 의해 이노시를을 침전시키고, 이노시를 침전물을 제거하여 얻은 상층액에서 마이오-이노시를 및 D-카이로 -이노시를의 농도를 측정하였다. H: 마이오 -이노시를의 농도, O: D-카이로 -이노시를의 농도. 도 8은 휴면세포 배양을 완료하여 마이오-이노시를 및 D-카이로- 이노시를이 포함된 M9 최소배지에 에탄올을 첨가하여 얻은 결과이다. 에탄올 첨가에 의해 이노시를을 침전시킨 경우, 마이오 -이노시를과 D- 카이로 -이노시를의 침전율을 측정하였다. gS: 마이오 -이노시를의 침전율， O: D-카이로 -이노시를의 침전율.
도 9는 휴면세포 배양을 완료한 M9 최소배지에 에탄을을 첨가하여 D- 카이로 -이노시를을 분리 정제한 결과이다. 휴면세포 배양을 완료한 마이오- 이노시를 및 D-카이로 -이노시를이 포함된 M9 최소배지에 에탄올을 첨가하여 이노시를을 침전시켰다. 침전물을 제거하고 얻은 배양 상층액을 건조하여 이노시를 분말을 얻었다. 이노시를 분말에서의 D-카이로 -이노시를의 순도를 측정한 결과를 그래프로 도시하였다.
도 10은 1차 에탄을을 첨가하여 얻은 상충액의 건조 분말 (마이오- 이노시틀과 D-카이로—이노시를의 흔합 분말)을 물에 다시 용해한 경우의 각 이노시틀의 용해 특성을 보여준다. 패널 A는 수용액 상층액중의 마이오- 이노시롤 및 D-카이로 -이노시를의 농도를 보여준다. 패널 B는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시롤 및 D-카이로 -이노시를의 용해도를 보여준다. 패널 C는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시를 및 D-카이로 -이노시롤의 침전율을 보여준다. 패널 D는 수용액의 상층액 중의 으카이로 -이노시를의 순도를 보여준다. BD: 마이오 -이노시를， O: D-카이로 -이노시를.
도 11은 1차 에탄을을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말인 마이오- 이노시를과 D-카이로 -이노시를의 흔합 분말을 약 12% 함유하는 수용액에 다양한 양의 에탄을을 첨가한 경우의 침전 및'정제 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 상층액 중의 마이오-이노시를 및 D—카이로 -이노시를의 농도를 측정한 결과이다. 패널 B는 마이오-이노시를 및 D-카이로 -이노시를의 침전율을 측정한 결과이다. 패널 C는 상층액내의 D-카이로 -이노시를의 순도를 나타낸 결과이다. B: 마이오 -이노시를, O: 으카이로 -이노시를. 도 12는 마이오 -이노시를 및 D-카이로 -이노시를이 약 13 :2의 중량비율로 용해된 M9 최소배지에 다양한 유기용매를 첨가한 경우에 마이오-이노시를 및 D-카이로 -이노시를의 침전 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 에탄올, 이소프로판올 및 아세톤을 첨가한 경우의 침전특성이다. 여기에서 흰색 막대는 마이오 -이노시를의 농도를， 진회색 막대는 D-카이로- 이노시를의 농도를 나타낸다. 패널 B는 에탄을에 대한 이소프로판을 및 아세톤의 상대적인 침전 특성을 보여준다. 여기에서 연회색 막대는 D- 카이로-이노시를이고， 진회색 막대는 마이오—이노시를을 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 실시예 1: 마이오 -이노시를을 D-카이로 -이노시틀로 전환하는 유전자의 클로닝 및 이를 포함하는 재조합 백터의 제작
마이오-이노시를로부터 D-카이로 -이노시를로 전환에 관여하는 효소인 마이오-이노시틀 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제, 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 분자를 클로닝하고, 이를 발현 가능한 형태로 포함하는 재조합 플라스미드 백터를 제조하였다. 마이오—이노시를 트랜스포터를 코딩하는 유전자 (iolT)는 살모넬라 티피무리엄 (Salmonella typhimurium) 균주로부터 클로닝하였다. 살모넬라 티피무리엄 균주의 지놈 DNA로부터 마이오-이노시를 트랜스포터의 주타입에 해당하는 StiolTl 유전자와 부타입에 해당하는 StiolT2 유전자를 증폭한 후에, 이를 pACYCDuet-1 발현백터 (Novagen)에 도입하여 재조합 플라스미드 백터를 제조하였다. 마이오-이노시를 트랜스포터에 의해 세포 내로 도입된 마이오 -이노시틀은 하기 반응식 1 내지 반웅식 3의 연속적 반웅을 통해 D- 카이로 -이노시롤이 전환된다. 반웅식 1 및 반응식 3의 반웅은 이노시를 디하이드로게나아제에 의해 촉매되고, 반웅식 2의 반응은 이노소스 이소머라아제에 의해 촉매된다.
[반웅식 11
마이오-이노시를 + NAD+→ 2—케토 -마이오ᅳ이노시를 + NADH + H+ [반응식 2]
2-케토 -마이오-이노시틀 *→ 1-케토 -D-카이로-이노시틀
[반응식 3]
1-케토 -D—카이로-이노시를 + NADH + H+ D-카이로-이노시를 + NAD+ 이노시를 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 (iolG)는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtil is), 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tiimefaciens) , 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis)으로부터 클로닝하였다.
이노소스 이소머라아제를 코딩하는 유전자 (ioll)는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtil is), 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) , 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis)로부터 각각 클로닝하였다.
상기 균주들의 지놈 DNA로부터 iolG 유전자 및 ioll에 해당하는 유전자를 증폭한 후에， iolG 및 ioll 유전자의 조합을 pCOLADuet-1 발현백터 (Novagen)에 삽입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다.
iolG 및 ioll 유전자들의 조합은 다음과 같다. 첫째， 코리네박테리움 글투타미쿰 (Corynebacterium glutaniicum)의 iolG 해당 유전자와 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis)의 ioll 해당 유전자의 조합, 둘째， 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtil is)의 iolG와 ioll 해당 유전자의 조합， 셋째, 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 iolG와 ioll 해당 유전자의 조합， 넷째， 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis)의 iolG와 ioll 해당 유전자의 조합이다. 상기 클로닝한 StiolTl과 StiolT2 및 iolG와 ioU에 해당하는 유전자 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
【표 1】
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1-1. 마이오-이노시틀 트랜스포터 코딩 DNA분자를 포함하는 재조합 백터의 제조
마이오-이노시를 트랜스포터의 클로닝을 위해서 살모넬라 티피무리움 (S. Typhimurkun)의 지놈 DNA로부터 주 타입 트랜스포터 (iolTl) 및 부 타입 트랜스포터 (iolT2)를 증폭한 후에， 이를 pACYCDuet-1 발현 백터에 도입하여ᅳ, pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)를 제작하였다. 보다 상세히 설명하면, 살모넬라 티피무리엄 (Salmonella ent erica subsp. ent erica serovar Typhi murium str. LT2 ATCC700720 (tax id :99287; GenBank NID: NC_006511, ATCC700720)의 지놈 DNA로부터 PCR용 프라이머 StiolTl-F2 및 StiolTl-R을 이용하여 StiolTl을 증폭하고, PCR용 프라이머 StiolT2-F와 StiolT2-R을 이용하여 StiolT2를 증폭하였다. 상기 증폭된 StiolTl를 Ncol과 BamHI으로 절단하여 pACYCDuet-1백터 (Novagen)의 Ncol과 BamHI 부위에 삽입하여 pACYCD-StiolTl(F2)를 제작하였다. 이어서, 상기 증폭된 StiolT2를 Ndel과 Sail으로 절단하여 상기 제작한 백터 pACYCD- StiolTKF2)의 Ndel과 Xhol 부위로 삽입하여 pACYCD-StiolTl-Sl:iolT2(F2)를 제작하였다.
1-2. 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA분자를 포함하는 재조합 백터의 제조
다양한 박테리아로부터 이노시를 디하이드로게나아제 (iolG) 및 이노소스 이소머라아제 (ioll)를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다ᅳ 첫 번째로, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)으로부터 iolG 해당 유전자를 클로닝하였고, 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis)으로부터 ioll 해당 유전자를 클로닝하여 제조합 백터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum)의 지놈 DNA로부터 iolG 유전자인 Cgiep (NCg 12957 또는 GI： 19554252)를 클로닝 하였고， 판토에아 아나나티스 (P. ananatis)의 지놈 DNA로부터 ioll 유전자인 Paioll를 클로닝하였다. 보다 상세히 설명하면， Corynebacterium glutamicum ATCC 13032(taxid: 196627； GenBank NID:NC_003450, ATCC13032)의 지놈 DNA로부터 PCR용 프라이머 Cgiep-F와 Cgiep-R을 이용하여 Cgiep를 증폭한 후 제한효소 BspHI과 Notl으로 처리하여 절단하고: 이를 pCOLADuet-l(Novagen)의 Ncol과 Notl 부위로 삽입하여 pCOLAD-Cgiep를 제작하였다. 또한, Pantoea ananatis LMG 20103 (taxid: 706191, GenBank NID: NC_013956, KCCM40419)의 지놈 DNA로부터 PCR용 프라이머 Paioll— F 및 Paioll-R을 이용하여 Paioll를 증폭하고, Ndel과 Pacl으로 처리하여 절단한 후, 상기 제작한 백터 pCOLAD-Cgiep의 Ndel과 Pacl 부위로 삽입하여 최종적으로 pCOLAD— Cgiep-Paioll 백터를 제작하였다. 두 번째로， 바실러스 서브틸리스 (B. subtil is)으로부터 iolG 및 ioll 해당 유전자를 클로닝하여 재조합 백터를 제작하였다. 먼저, Bacillus subtil is subsp. subtil is str. 168의 지놈 DNA로부터 BsiolG-F 및 BsiolG- R 프라이머를 이용하여 iolG에 해당하는 BsiolG를 증폭한 후, 제한효소 Pcil과 Notl으로 절단하여 pCOLADuet-1의 Ncol과 Notl 부위로 삽입하여 pCOLAD-BsiolG를 제작하였다. 또한， Bsioll-F와 Bsioll— R 프라이머를 이용하여 ioll에 해당하는 Bsioll를 증폭하고 이를 제한효소 Ndel과 Pacl으로 처리하여 앞서 구축한 플라스미드 pCOLAD-BsiolG의 동일 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-BsiolG-BsiolI를 제작하였다.
세 번째로 아그로박테리움 튜메파시엔스 (A. tumefaciens)으로부터 iolG 및 ioll 해당 유전자를 클로닝하여 재조합 백터를 제작하였다. 먼저, Agrobacter ium tumefaciens str . C58(taxid: 176299； GenBank NID: IC )03062)의 지놈 DNA로부터 프라이머 AGRL628— F와 AGRL628-R을 이용하여 iolG에 해당하는 AGRL628 유전자를 증폭하였고, 이것을 제한효소 Pcil과 Sacl으로 절단하여 pCOLADuet-l(Novagen)의 Nc이과 Sacl 부위에 도입하여 PC0LAD-AGRL628을 제작하였다. 또한, AGRL627-F와 AGRL627-R 프라이머를 이용하여 ioll에 해당하는 AGRL_627을 증폭하고 이를 제한효소 Ndel과 Sail으로 절단하여 pC0LAD-AGRL628의 Ndel과 Xhol 부위에 삽입하여 pCOLAD- AGRL628-AGRL627 재조합 백터를 제작하였다.
네 번째로， 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananat is)으로부터 iolG 및 ioll 해당 유전자를 클로닝하여 재조합 백터를 제작하였다. Pantoea ananat is LMG 20103 (taxid: 706191， GenBank NID:CP001875)의 지놈 DNA로부터 Paidh-F와 Paidh-R 프라이머를 이용하여 iolG에 해당하는 Paidh를 증폭한 후， 제한효소 Pcil과 Notl으로 절단하여 pC0LADuet-l의 Nc이과 Notl 부위로 삽입하여 pCOLAD-Paidh를 제작하였다. 또한， Paioll- F와 Paioll-R 프라이머를 이용하여 ioll에 해당하는 PaioII를 증폭하고 이를 Ndel과 Pacl으로 처리한 후, 상기 제작한 백터 pCOLAD-Paidh의 동일한 제한효소 부위로 삽입하여 pCOLAD-Paidh-PaiolI를 제작하였다. 클로닝에 사용된 프라이머 정보는 하기 표 2에 나타내었다. 【표 2】
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실시예 2: 재조합 균주의 휴면 세포의 제조
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 플라스미드 백터인 pCOLAD— Cgiep-
Pa i 011 pCOLAD-Bs iolG-BsiolI, pC0LAD-AGRL628-AGRL627 , pCOLAD-Pa iolG- Paioll를 각각 pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2)와 함께 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하여 상기 재조합 플라스미드 백터를 동시에 갖는 형질전환 대장균 균주들올 제작하였다. 제작한 대장균 균주들은 다음과 같다: ① pCOLAD-Cg i ep-Pa ioll /pACYCD-St i o ITl-St i o 1T2 (F2 ) /BL21 (DE3 ) 균주 , ② pCOLAD-Bs i o 1 G-Bs ioll /pACYCD-St i o 1 Tl-St i o 1 T2 (F2 ) /BL21 (DE3 ) 균주 , ③ pC0LAD-AGRL628-AGRL627/pACYCD-St iolTl-St iolT2(F2)/BL21(DE3) 균주， ④ pCOLAD-Pa i o 1 G— Pa ioll /pACYCD-St iolTl-St iolT2(F2)/BL21(DE3) 균주.
상기 제작한 형질전환 대장균의 휴면세포를 제조하기 위해 완전배지를 사용하여 배양하였다. 보다 상세히 설명하면, 300 mL의 홈이 파인 (baffled) 삼각 플라스크에서 50 mL 부피로 배양하였으며， 15%(w/v) 마이오 -이노시를， 0.5%0/v) 락토오스， 50 mg/L 클로람페니콜， 50 mg/L 카나마이신을 함유한 TB 배지 [Terrific Broth; 1.2%(vv/v) 트립톤， 2.4% 효모추출물, 0.4% 글리세를， 0.17 M K¾P04(제 1인산칼륨)， 0.72Μ K2HP04(제 2인산칼륨)]를 이용하여 37°C, 180 rpi의 조건에서 약 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양 상충액에서 D-카이로ᅳ이노시를과 마이오- 이노시를이 평형 농도에 도달했음을 확인한 후 균체를 희수하였다. 배양액 중의 마이오—이노시를 및 D—카이로 -이노시를의 분석은 다음과 같이 행하였다. 우선， 배양액을 원심분리한 후 배양 상층액 1 mL을 취하고 10분간 끓인 후 다시 원심분리하여 상층액 50(hiL를 취하였다. 전처리한 배양 상층액을 HPLC(Shimadzu LClOAvp)로 분석하였으며， 분석조건은 romasil 5NH2 칼럼 (4.6 讓 x 250 mm), 이동상 75% 아세토니트릴.， 칼럼 온도 40°C, RI 검출기를 이용하였다. 후술하는 모든 실험에서 마이오- 이노시를 및 D-카이로 -이노시를의 분석은 상기의 방법을 이용하여 행하였다. 마이오 -이노시를과 D-카이로-이노시를 농도가 평형에 도달함을 확인한 후 배양액을 원심분리하였다. 원심분리는 3,000 rptn에서 30분 동안 수행하였으며, 온도 차이에 의한 마이오 -이노시를의 침전과 균체의 저온 층격 (cold shock)을 방지하기 위하여 37°C를 유지하도록 하였다. 회수한 균체에 영양성분이 많은 TB 배지의 잔여 성분이 남아있을 경우， 실제 휴면 균체에 의한 전환효과를 기대하기 어려우므로， 균체를 2회 세척하여 TB 배지 성분을 완전히 제거하였다. 세척은 수집한 균체를 전환반응에 사용할 기질이 포함된 완층액 (최소배지)로 현탁한 후 상기한 원심분리 조건하에서 원심분리하여 다시 균체를 회수하는 방법으로 하였다. 이하 모든 실험에서 휴면세포 전환방법에 사용하기 위한 균체는 모두 상기 방법을 이용하여 2회 세척하여 사용하였다. 실시예 3: 휴면세포 전환법에 의한 D-카이로 -이노시를의 생산
휴면세포의 균체를 사용하여 최소 배지에서 생장이 정지된 상태 즉, 휴면세포 상태로 마이오 -이노시를을 D-카이로 -이노시를로 전환시켰다. 보다 상세히 설명하면, 300 mL의 홈이 파인 (baffled) 삼각플라스크에서 50 mL 용량으로 배양하였다. 기질인 15%(w/v) 마이오—이노시를， 탄소원 및 발현 유도제인 0.5%(w/v) 락토오스, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신을 함유한 M9 최소 배지 [6.4%(w/v) Na2HP04-7H20, 1.5 (w/v) KH2P04 , 0.25% (w/v) NaCl, 0.5% (w/v) NH4C1, 2 mM MgS04, 0.1 mM CaCl2]에 실시예 2에서 수득한 휴면세포 균체를 접종하여 37°C, 180 rpm에서 약 24시간 동안 진탕 배양하였다. 전환이 종료된 후， 37°C, 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 상기한 조성의 배지에 다시 현탁하여 동일한 방법으로 24 시간 동안 전환을 실시하였다. 이러한 전환 과정올 5회 내지 7회 반복하였다. 마이오-이노시를 및 D- 카이로 -이노시틀의 분석은 상기 실시예 1에서와 설명된 방법으로 행하였다. 각각의 다른 유전자의 조합을 갖는 재조합 균주의 휴면세포를 사용하여 마이오ᅳ이노시를로부터 D-카이로 -이노시를로 전환을 분석한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과에 의하면， iolG 및 ioll 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum)의 Cgiep와 판토에아 아나나티스 (P. ananatis)의 Paioll으로 구성한 조합인 pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYCD-StiolTl- StiolT2(F2)/BL21(DE3) 재조합 균주의 휴면세포에서 가장 안정적인 전환율이 확인되었다. 이 경우， 배양액내 D-카이로 -이노시를의 생산량은 24 시간 (1일) 부터 192 시간 (8일)까지 약 10-15% 정도를 유지하였으나， 계대수가 증가함에 따라 약간 감소하는 양상을 보였다 (도 3의 패널 A 참조). 균체 농도 역시 점차 감소하는 양상을 나타내었다 (도 3의 패널 B 참조). 그러나, 균체 농도에 대비한 전환율은 대체로 유지되는 양상을 보였으므로 (도 3의 패널 C 참조), 으카이로 -이노시를의 생산성 감소는 휴면세포 균체 농도의 감소에 따른 영향으로 추정된다. 휴면세포 균체를 계대하는 과정에서 원심분리 단계를 거치게 된다. 원심분리 공정은 균체 자체에 물리적인 충격을 가할 수 있다. 균체에 층격을 주지 않기 위해 원심분리는 최대한 약하게 행하였으며, 이로 인해 원심분리 후 상등액을 제거하는 과정에서 균체의 손실이 나타났다. 이러한 균체 손실에 의한 균체량 감소가 D-카이로 -이노시를의 전환속도에 영향을 미친 것으로 생각된다. 또한， pCOLAD-Cgiep-PaiolI/pACYC으 StiolTl-
StiolT2(F2)/BL21(DE3) 균주의 경우 적어도 7회 계대 (192시간 배양)에 의한 전환까지는 균체 자체와 균체내에서 발현된 효소가 안정되게 기능을 수행한 것으로 확인하였다.
한편， 도 3의 결과에서 나타난 바와 같이, iolG 및 ioll의 유전자로서 바실러스 서브틸리스 (B. subtil is), 아그로박테리움 튜메파시엔스 (A. t Lime faci ens), 판토에아 아나나티스 (P. ananatis)의 iolG와 ioll의 유전자가 도입된 재조합 균주의 경우에는 48 시간， 또는 72 시간부터 D-카이로 -이노시를의 생산량이 급격히 감소하였다 (도 3의 패널 A 참조). 균체 농도의 경우 대체로 pCOALD—Cgiep-PaiolI가 도입된 경우와 크게 차이가 나지 않았으므로 (도 3의 패널 B), 상기 결과는 해당 효소의 활성이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 사료된다. 이로서 휴면세포 전환법에서 가장 우수한 활성을 가지는 i0lG 및 ioll 유전자는 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum)의 Cgiep와 판토에아 아나나티스 (P. ananatis)의 Paioll인 것으로 확인되었다. 실시예 4: 전환 배지에 따른 D-카이로-이노시틀로의 전환 속도 비교 실시예 3에서 가장 안정적인 생산을 보인 pCOLAD-Cgiep— Paioll 및 pACYCD-StiolTl-StiolT2(F2) 재조합 백터가 도입된 균주를 이용하여 전환배지의 조성을 다르게 하여 D-카이로-이노시를 (DCI)의 전환 양상을 확인하였다. 균체 성장과 재조합 단백질을 포함하여 세포내 단백질들의 발현이 충분히 이루어진 휴면 세포는 배양 시에 삼투압 조절과 최소의 탄소원 공급만이 요구될 수 있다. 전환 배지에 필요한 성분들을 확인하기 위해， 최소배지보다 단순한 다양한 종류의 배지를 조성하여 휴면세포 전환반웅을 실시하였다. 전환배지 실험에서 M9 최소배지를 양성 대조구로 하여， 0.85%(w/v) NaCl이나 물만을 사용하고, 탄소원으로는 0.5%(w/v) 락토오스를 첨가하거나 포도당을 첨가하여 배지를 제조하였으며, 이러한 조건에서 휴면세포 전환반웅을 실시하였다. 보다 상세히 설명하면， 제 1 실험군은 양성 대조군으로서 15%(w/v) 마이오 -이노시를, 0.5%(w/v) 락토오스， 50 mg/L 클로람페니콜, 및 50 mg/L 카나마이신을 함유한 M9 최소 배지이며, 제 2 실험군은 15%(w/v) 마이오 -이노시를， 0.5%(w/v) 락토오스 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신 및 0.85% NaCl 용액을 함유한 배지이며, 제 3 실험군은 제 2 실험군에서의 0.5%(w/v) 락토오스 대신 0.5%(w/v) 포도당을 함유한 배지이며, 제 4 실험군은 제 3 실험군의 0.5%(w/v) 포도당 대신 1.0% (w/v) 포도당을 함유한 배지이며 , 제 5 실험군은 제 3 실험군의 0.85% NaCl 용액 대신 물을 사용한 배지이다. 상기 각 실험군의 배지를 사용하여 실시예 2에서와 같이 2회 세척하여 초기 TB 배지 성분을 제거한 후 각 실험군의 배지를 이용하여 실시예 3에서와 같이 24시간 간격으로 5 내지 7회 휴면세포 전환반웅을 실시하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 결과에서 나타난 바와 같이， 세포 성장에 필요한 최소한의 배지 성분이 휴면세포의 전환에도 필요한 것으로 보인다. 즉， M9 최소배지를 제외한 나머지 ᅳ그룹에서는 2 내지 3회의 전환 후 급격히 전환 효을이 감소하는 것으로 나타났다 (도 4의 패널 A). 또한， 탄소원으로서 락토오스의 경우가 포도당의 경우보다 전환율이 약간 높은 것으로 보이는데 포도당의 경우 세포의 성장에 영향을 주어 균체 농도를 증가시킨 반면, 락토오스의 경우 균체 농도에는 상대적으로 영향을 덜 주면서 효소의 발현에 영향을 준 것으로 생각된다. 실시예 5: 균체 농도에 따른 D-카이로-이노시를로의 전환 속도 측정 균체량에 따른 마이오-이노시틀에서 D-카이로ᅳ이노시를로의 전환 속도를 비교하였다. 고농도의 균체를 얻기 위하여 소용량 발효를 수행하였다. 발효는 MARADO-PDA [ (주)씨엔에스， 대전， 한국] 3 리터 발효조에 1 리터 용량으로 실시하였다. 종배양 (seed culture)은 2YT 배지 [1.6%(w/v) 트립톤， l%(w/v) 효모추출물， 0.5%(w/v) 염화나트륨]를 이용하였으며, 발효배지는 15% 마이오 -이노시를， 0.5% 락토오스를 첨가한 TB 배지를 사용하였다. OD (Optical Density) 3 까지 배양한 종배양액 50 mL을 온도， pH, DO를 안정화시킨 발효조에 접종한 후 약 20 시간 동안 배양하였다. 발효온도는 37°C로 조절하였고, pH는 암모니아수를 이용하여 그 0으로 유지하였으몌 DO는 40%이하로 감소한 후부터 RPM을 증가시키면서 40% 이상으로 유지하였다. 균체는, 18 시간 배양한 후 최대 약 0D 18에 도달하였으며, D-카이로 -이노시를은 약 12 시간에 평형농도인 약 20 g/L에 도달한 후 이후로는 증가하지 않았다. D-카이로 -이노시틀이 평형농도에 도달하고 발효가 종료된 균체 배양액을 37°C, 3,000rpm에서 30 분간 원심분리하여 균체를 회수하였으며, TB 배지 성분을 제거하기 위하여 15%(vv/v) 마이오 -이노시를, 0.5%(w/v) 락토오스, 50 mg/L 클로람페니콜, 50 mg/L 카나마이신을 함유한 M9 최소 배지를 사용하여 균체를 세척하였다. 회수 및 세척한 균체는 상기 조성의 M9 최소 배지에 균체 농도에 맞게 재현탁하였다. 균체량은 0D 1.5, 3, 4.5， 6, 7.5, 12， 15로 맞추어 직경
25 誦， 높이 150 醒의 유리 시험관에서 7 tnL 부피로 37°C， 250 rpm 조건에서 약 7 시간 동안 배양하여 초기 전환속도를 측정하였다. 배양한 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5의 결과에 나타난 바와 같이， 균체량의 증가에 따라 D—카이로ᅳ이노시를 (DCI)의 전환속도가 증가하는 양상을 보여주었다. 0D값이 1.5일 경우 7 시간에서의 최종 전환속도는 DCI 농도 2% 로서, DCI 최종 평형 농도인 14%과 비교하여 1/7 수준으로서 매우 낮았다ᅳ 전환속도는 균체의 0D가 증가함에 따라 증가하여 0D가 15일 경우 7 시간에서 약 12%의 DCI 농도의 전환속도를 보였다. 그러나， 이 역시 DCI 최대 평형 농도인 14%에 도달하지 못하였다. 균체 0D가 20일 경우, 약 6시간에 DCI 평형 농도인 14%에 도달하였으며, 그래프의 양상으로 볼 때 약 5시간 이전에 평형에 도달한 것으로 보인다. 이상의 결과로 볼 때 균체농도가 최소 0D 20 이상일 때에 평형 농도 즉, 최대의 DCI 농도에 도달하게 되며, 도달 시간은 약 5 시간인 것으로 나타났다. 실시예 6: 마이오—이노시를과 D-카이로 -이노시를의 용해도 측정 마이오-이노시를 (my으 inositol)과 으카이로 -이노시를 (D-chiro- inositol)의 용해도를 측정하였다. 먼저 마이오ᅳ이노시를과 D-카이로- 이노시틀을 상온 (약 25°C)에서 1차 증류수에 각각 5%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도가 되도록 용해시켰다. 각 용액에서 용해되지 않고 침전된 부분을 원심분리를 통하여 분리하고 이노시롤이 완전히 용해된 상층액 부분을 취하여 각각의 농도를 HPLC로 분석하였다. 분석조건은 HPLC(Shimadzu LClOAvp)를 이용하여， romasil 5NH2 칼럼 (4.6 隱 X 250瞧), 이동상 75% 아세토니트릴, 칼럼 온도 40°C, RI 검출기를 이용하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 마이오ᅳ이노시를의 용해도는 25°C에서 약 15%(w/v)로 나타났으며, D—카이로 -이노시를의 경우 약 55%(w/v) 전후로 나타나， 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를의 용해도 차이가 매우 큰 것으로 확인하였다. 실시예 7: 마이오 -이노시를의 분리를 위한 1차 에탄올 처리 휴면세포의 배양이 완료되어 생성물인 D-카이로 -이노시를과 기질인 마이오 -이노시를이 포함된 최소배지를 실험에 사용하였다. 상기 최소배지에 에탄올을 가하여， 최소배지:에탄올의 비율이 각각 10:0, 9:1(0.11배)， 8:2(0.25배)， 7:3(0.43배), 6:4(0.67배)， 5:5(1배)， 4:6(1.5배)， 3:7(2.33배)， 2:8(4배), 1:9(9배)로 되도록 하여 완전히 흔합한 후 실은 (약 25°C)에서 1시간 동안 진탕하였다. 이를 3,500 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 HPLC로 마이오 -이노시를과 D-카이로—이노시틀의 농도를 분석하였다. HPLC분석 방법은 실시예 6에서 설명된 방법과 같다. 분석한 결과는 도 7， 도 8, 및 도 9에 나타내었다. 도 7은 에탄올 첨가한 후 생성된 침전물을 제거하여 얻은 상층액내에 남아있는 마이오 -이노시틀과 D- 카이로 -이노시를의 농도를 나타낸 것이다. 마이오 -이노시를의 경우， 에탄올 첨가량에 따라 농도가 빠르게 감소하여, 약 1 배수의 에탄올을 첨가한 경우 마이오 -이노시를은 초기 126 g/L 농도로부터 약 99 g/L이 침전되어 약 27 g/L의 마이오 -이노시를이 남아 있는 것으로 나타났다. 이에 비해, D-카이로 -이노시를의 감소량은 매우 낮아서 약 1 배수의 에탄을을 첨가하면 초기 17 g/L의 농도에서 15 g/L으로 감소되어 약 2 g/L만이 침전되는 것으로 나타났다.
상기 도 7에 나타난 결과를 침전율로 환산하여 도 8에 나타내었다. 마이오 -이노시를의 침전율은 에탄을 첨가량에 따라 급격히 증가하였으며, 1 배수의 에탄을을 첨가하였을 때 모든 반웅액 조건에서 비교적 유사하게 70- 80%의 침전율을 보였고, 약 2.5 배 이상의 에탄을 첨가 조건에서는 대부분의 마이오 -이노시를이 침전되는 것을 확인하였다. 이에 반하여 D- 카이로 -이노시를의 침전율은 약 1 배의 에탄올을 첨가할 때까지는 약 15% 이하의 침전율을 보였으며， 2배 이상의 에탄을을 첨가한 경우 침전율이 비교적 크게 증가하였다ᅳ
상기 도 7 및 도 8에 나타난 실험 결과를 토대로 D-카이로- 이노시를의 순도를 계산하여 도 9에 나타내었다. D-카이로 -이노시를의 순도는 1 배수의 에탄올을 첨가하였을 경우 약 35 - 40% 정도로 나타났으며, 그 이상의 양의 에탄올을 첨가하면 순도가 증가하지만， D- 카이로 -이노시틀의 손실율이 커지는 것으로 나타났다.
이상의 결과를 종합하면, 약 1 배수의 에탄을을 첨가할 경우 약 80%의 마이오 -이노시를이 침전되고, 이때 D-카'이로 -이노시를의 침전율, 즉 손실율은 15% 이하로 나타났으며, 초기 14% 정도이었던 D-카이로- 이노시를의 순도를 약 30-40%로 증가시킬 수 있었다. 한편, 에탄을 첨가량이 1 배수를 초과할 경우 D-카이로 -이노시를의 침전율 (손실율)이 급격히 증가므로 , 약 1 배수의 에탄올을 첨가하는 경우 D-카이로- 이노시를의 손실율을 최소로 하면서 마이오 -이노시를을 침전시켜 분리 및 제거할 수 있는 것으로 확인되었다. 실시예 8: 1차 에탄을 처리 후 상층액의 농축 건조 및 재용해 상기 실시예 7에서 설명된 방법과 같이, 배양이 완료된 최소배지에 동량 (1:1)의 에탄올을 흔합한 후 침전물을 제거하여 얻은 상층액을 80°C로 가열하고 진공 상태에서 농축 및 건조하였다ᅳ 건조 후 얻은 이노시를의 건조 분말 (마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를의 흔합 분말)을 15% - 70%의 다양한 농도로 증류수에 용해시켜 각 농도에서의 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를의 용해 특성올 관찰하였다. HPLC를 이용한 이노시를의 분석 방법은 실시예 6에서 설명된 내용과 동일하다. 마이오 -이노시틀과 D- 카이로 -이노시를의 용해특성을 분석한 결과는 도 10에 나타내었다. 도 10의 패널 A는 상층액에서 각 이노시를의 농도, 즉 용해도를 나타낸 것으로 마이오-이노시를 용해도는 상기 실시예 6에서 나타난 바와 같이 약 15% 이상으로는 더 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 한편, D-카이로- 이노시톨의 경우 용해도가 약 55% 이므로 건조분말을 70% 농도로 용해시킨 경우에서도 모든 D-카이로 -이노시를이 용해된 것을 확인할 수 있었다. 마이오 -이노시틀과 D-카이로 -이노시를의 용해특성을 용해도와 침전율로 표시한 결과는 각각 도 10의 패널 B와 패널 C에 나타내었다. 마이오 -이노시를은 약 20% 용액부터 용해도가 감소하기 시작하여 용액의 농도가 증가할수록 계속적으로 감소하였고， 침전율은 용액의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. D-카이로 -이노시롤의 경우 용해도는 용액의 농도가 70%인 경우에 이르기까지 100%을 유지하였으며， 이에 따라 침전율도 0%로서 전혀 침전되지 않는 것으로 나타났다. 결론적으로 최대 70% 용액을 제조하는 경우 마이오 -이노시를은 15%만이 용해되었고， D- 카이로 -이노시를은 모두 용해되었으므로, D-카이로 -이노시틀의 경우 순도는 약 73% 정도인 것으로 나타났다 (도 10의 패널 D) 실시예 9: 저농도의 마이오ᅳ이노시를과 D-카이로 -이노시를의 혼합 건조물 용액에 2차 에탄올을 처리한 경우의 정제 특성
상기 실시예 10에서 설명된 방법과 같이 배양이 완료된 M9 최소배지에 동량 (1:1)의 에탄을을 첨가한 후 침전물올 제거하여 얻은 상층액을 80°C로 가열하고 진공 상태에서 농축 및 건조하였다. 마이오- 이노시를 및 D-카이로 -이노시를의 흔합 건조물을 저농도인 15% 이하 농도의 용액으로 제조하여 여기에 에탄을을 첨가하는 실험을 수행하였다. 1차 에탄을 처리 후 상층액의 건조분말이 완전히 녹는 양의 물을 첨가하여 용해시켰으며， 이때 총 이노시를 함량으로 약 11.5%가 되었고, 각각의 농도는 마이오-이노시를 75 g/L 및 D-카이로-이노시를 40 g/L 이었다. 이 흔합용액에 에탄을을 최대 19배 까지 첨가하면서 침전 및 분리 양상을 확인하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다. 도 11의 패널 A는 에탄올 첨가 후 상층액의 농도를 나타낸 것이며， 마이오 -이노시를의 경우 약 1 배수의 에탄올을 첨가할 때까지 큰 변화가 없었으나, 1.5 배의 에탄올이 첨가되면 절반 이상의 마이오 -이노시를이 침전되는 것으로 나타났다. 이에 반하여 D-카이로 -이노시를은 1.5 배수의 에탄을에서 약간 침전되는 것으로 나타났으며, 이후에도 침전량이 크게 증가되지는 않았다. 도 11의 패널 B는 침전율을 나타낸 것이며, 마이오 -이노시를의 경우 약 9 배의 에탄올을 첨가할 경우 90% 이상 침전되었으며 , 이때 D-카이로 -이노시틀의 침전율은 약 20%인 것으로 나타났다. 따라서 약 9배 양의 에탄올을 첨가하면 대부분의 마이오ᅳ이노시를을 제거하면서 D-카이로-이노시틀 손실율을 20% 이하로 줄일 수 있고 D-카이로 -이노시를의 순도를 90% 이상으로 정제 가능하였다 (도 11 패널 C 참조). 실시예 10: 에탄을 이외의 유기용매에 의한 마이오 -이노시톨과 D- 카이로 -이노시를의 선택적 침전
상기 실시예 6 내지 실시예 9의 실험결과로부터 배양이 완료된 최소배지에 함유된 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를은 이들의 큰 용해도 차이에 의해 에탄올 첨가에 의한 분리가 가능함을 확인하였다. 2개의 탄소를 갖는 에탄을 이외의 다른 유기용매에 의해서도 이러한 분리가 가능한지 확인하기 위해 탄소수 3개의 알코을인 이소프로판올과 케톤인 아세톤을 이용하여 분리를 시도하였다. 마이오 -이노시를과 D-카이로 -이노시를와 흔합용액 제조 시, 마이오-이노시틀 및 D—카이로ᅳ이노시를의 비율은 일반적인 반웅 평형 도달 농도인 약 13:2로 하였으며， M9 최소배지 조건으로 전체 농도가 약 15%가 되도록 제조하였다. 제조한 이노시를의 흔합용액에 동일부피의 에탄올, 이소프로판올, 아세톤을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 진탕한 후 원심분리하고， 그 상층액을. HPLC로 분석하였다. 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12의 패널 A는 실제 상층액에 존재하는 이노시를의 농도를 나타낸 것이다. 마이오 -이노시를의 경우 에탄올과 이소프로판을은 그 농도가 크게 차이나지 않았으나， 아세톤에서는 약간 낮게 나타났다. D-카이로- 이노사를의 경우 이소프로판올에서 에탄올에 비해 농도가 낮았던 반면， 아세톤의 경우에는 유기용매를 처리하지 않았던 농도와 같게 나타나 전혀 침전되지 않은 것으로 나타났다. 즉， 이소프로판을은 에탄올과 비교할 때 마이오-이노시를 침전율은 비슷하고, D-카이로 -이노시를의 침전율 (손실율)이 더 높았던 반면， 아세톤은 마이오—이노시를에 대한 침전율이 더 높고, D- 카이로 -이노시를의 손실율이 적은 것으로 보인다. 이는 에탄올의 침전율에 대한 상대값을 나타낸 도 12의 패널 B에서 쉽게 볼 수 있다. 이소프로판을은 에탄올에 대하여 마이오 -이노시를의 침전율은 동일하고， 으카이로 -이노시롤의 침전율은 약 0.7 수준으로 높다. 반면 아세톤의 경우는 마이오 -이노시를의 침전율이 약 0.1배 높으며， D-카이로—이노시를에 대해서는 약 1배 수준이 낮은 것으로 나타났다. 따라서 에탄올 이외의 유기용매가 에탄올과 같이 마이오—이노시를과 D-카이로 -이노시를의 분리에 사용할 수 있는 것을 확인하였으며， 아세톤의 경우 에탄을에 비해 그 분리 특성이 유리할 수도 있다는사실을 확인하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 휴면세포를 이용하여 마이오—이노시틀로부터 D-카이로-이노시를을 생산하는 방법:
(a) 마이오-이노시를 트랜스포터， 이노시를 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제를 발현하는 재조합 세포를 준비하는 단계 ;
(b) 상기 재조합 세포를 마이오 -이노시를을 포함하는 배지에서 정지기 (stat ionary phase)까지 배양하여 휴면세포 (rest ing eel 1 ) 상태로 유도하는 단계； 및
(c) 상기 휴면세포를 회수하고 마이오 -이노시를을 포함하는 최소 배지 (minimal medium)에서 배양하여 D-카이로 -이노시를을 생성시키는 단계.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c) 이후에， 배양한 휴면세포를 회수하고, 마이오 -이노시를을 포함하는 최소 배지에서 다시 배양하여 D- 카이로 -이노시를을 생성시키는 단계 (d)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법ᅳ
【청구항 3】
제 2 항에 있어서, 상기 단계 (d)를 1 - 50 회 범위에서 반복하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c) 또는 (d) 이후에 휴면세포를 배양한 최소 배지의 배양액으로부터 D-카이로- 이노시를을 정제하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (b)에서의 정지기는 재조합 세포를 배양한 배지에서 마이오 -이노시를의 농도와 D-카이로 -이노시를의 농도가 평형에 이른 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c)에서의 최소 배지는 탄소원 및 무기염을 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 7】
제 6 항에 있어서, 상기 최소 배지는 항생제 및 발현 유도제 (inducer)를 더욱 포함한 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8】
제 6 항에 있어서， 상기 무기염은 Na2HP04, KH2P04) NaCl , NH4C1,
CaCl2, 및 MgS04 로 이루어지는 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 흔합물인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 9】
제 6 항에 있어서， 상기 탄소원은 글루코오스， 프럭토오스， 수크로오스， 락토오스， 녹말, 녹말의 가수분해물, 아세트산, 프로피온산, 에탄올， 프로판올， 및 글리세를로 이루어지는 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의ᅳ흔합물인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 10】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (a)에서의 재조합 세포는 마이오- 이노시를 트랜스포터를 코딩하는 DNA 서열， 이노시를 디하이드로게나아제를 코딩하는 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제를 코딩하는 DNA 서열을 발현 가능한 형태로 포함하는 재조합 백터로 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 11】
게 10 항에 있어서， 상기 재조합 백터는 (i) 프로모터에 작동적으로 결합된 마이오—이노시를 트랜스포터 코딩 DNA 서열을 포함하는 제 1 의 재조합 백터; 및 (ii) 프로모터에 작동적으로 결합된 이노시를 디하이드로게나아제 코딩 DNA 서열 및 이노소스 이소머라아제 코딩 DNA 서열을 포함하는 제 2 의 재조합 백터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법ᅳ
【청구항 12]
제 1 항에 있어서， 상기 재조합 세포는 동물세포, 곤층세포, 효모 또는 원핵세포인 것으로 특징으로 하는 방법 .
【청구항 13]
제 1 항에 있어서， 상기 마이오—이노시를 트랜스포터는 서열번호 1 및 서열번호 2 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 14】
제 1 항에 있어서， 상기 이노시를 디하이드로게나아제는 서열번호 3 서열번호 4 서열번호 6， 및 서열번호 8 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질들로 이루어지는 .군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15]
제 1 항에 있어서， 상기 이노소스 이소머라아제는 서열번호 5, 서열번호 7， 및 서열번호 9 에 개시된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 16]
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (c) 또는 (d) 이후에, 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(e) 상기 휴면세포 배양이 완료된 최소배지에 유기용매를 첨가하여 이노시를 침전물을 생성시키는 단계;
(f) 상기 생성된 이노시를 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (g) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시를 분말올 얻는 단계.
【청구항 17】
제 16 항에 있어서， 상기 단계 (g) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 :
(h) 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시를 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계 ;
(i) 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시를 침전물을 생성시키는 단계;
(j) 상기 생성된 이노시를 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (k) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는 단계.
【청구항 18】
제 17 항에 있어서， 상기 단계 (h)에서 이노시를 분말을 20%(w/v) 이하의 농도로 물에 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 19】
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서 , 상기 유기용매는 알코을， 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트， 1，3-부틸렌글리콜 또는 에테르인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 20】
제 16 항에 있어서， 상기 단계 (e)에서 유기용매의 첨가량은 배양이 완료된 최소 배지 대비 0.1 - 9배 (v/v)인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 21]
제 17 항에 있어서， 상기 단계 (i)에서 유기용매의 첨가량은 수용액 대비 1 - 10배 (v/v)인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 22】
제 16 항에 있어서， 상기 단계 (g) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 : (h) ' 상기 단계 (g)에서 얻은 이노시를 분말을 물에 /용해시켜 수용액을 제조하고 이노시를 침전물을 생성시키는 단계;
(i) ' 상기 수용액에서 생성된 이노시를 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계 ; 및
(])' 상기 상층액을 건조시켜 이노시를 분말을 얻는 단계.
【청구항 23】
제 23 항에 있어서， 상기 단계 (h)' 에서， 이노시를 분말을 20%(w/v) 초과 - 70%(w/v) 이하의 농도로 물에 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법 .
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