CN113755415B

CN113755415B - 一种新的具有nmn合成路径的重组微生物及生产方法

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Publication number: CN113755415B
Application number: CN202010499125.9A
Authority: CN
Inventors: 江君君; 万丽花; 陆红霞; 胡志浩
Original assignee: Suzhou Biosynthetica Co ltd
Current assignee: Suzhou Biosynthetica Co ltd
Priority date: 2020-06-04
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN113755415A

Abstract

本发明提供了一种新的具有烟酰胺单核苷酸（NMN）合成路径的重组微生物及生产方法。其中所述新的合成路径由1)过表达烟酸磷酸核糖转移酶转化烟酸合成烟酸单核苷酸，2）过表达外源的烟酸单核苷酸酰胺化酶，催化烟酸单核苷酸合成烟酰胺单核苷酸。

Description

一种新的具有NMN合成路径的重组微生物及生产方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及利用基因工程等方法改造微生物，改造后的微生物在外源添加烟酸(NA)的情况下，菌种能够将烟酸转化成目标产物NMN并输出到细胞外。

背景技术

NMN，即β-nicotinamide mononucleotide，化学名称β-烟酰胺单核苷酸，分子式C₁₁H₁₅N₂O₈P，分子量334.22，是一种自然存在的生物活性核苷酸，有2种不规则存在形式α和β，β异构体是NMN的活性形式。

NMN属于维生素B族衍生物范畴，在人体细胞能量生成中扮演重要角色，它参与细胞内NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的合成。在人体内，NMN通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。还有研究表明，通过调节生物体内NMN的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN通过参与和调节机体的内分泌，起到防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。因此，NMN在医药治疗以及功能食品方面有着广泛的应用前景。

在日常食物，如蔬菜、水果和肉制品中，都含有丰富的NMN。目前NMN的体外制备方法以化学合成为主，如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。但是这些化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题，因此需要开发低成本环保的NMN生产方法。

目前制备NMN的最环保最好的方法是生物合成方法，即采用烟酰胺磷酸合成转移酶Nampt催化烟酰胺NAM生成NMN，但是现有的天然Nampt普遍存在酶活性较低的问题，因此有耗时长、成本高、收率低的缺点，难以实现工厂化大规模生产等问题，限制了NMN的大规模应用。

发明内容

基于背景技术介绍的NMN生产现状存在的问题，本发明提供一种新的NMN合成代谢路径的重组微生物以及利用该重组微生物发酵生产NMN的新方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种新的具有NMN合成路径的重组微生物，具有NMN合成代谢路径：在细胞中过表达烟酸磷酸核糖转移酶，将外源添加的底物烟酸催化成烟酸单核苷酸，然后过表达烟酸单核苷酸酰胺化酶催化烟酸单核苷酸生成NMN。

具体的，本发明的目的之一，在于提供一种新的NMN合成代谢路径的重组微生物，所述重组微生物过表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸酰胺化酶，以烟酸(NA)为底物发酵合成NMN。

具体所述酶为如下蛋白：

(a)烟酸磷酸核糖转移酶为大肠杆菌pncB基因编码的蛋白；

(b)烟酸单核苷酸酰胺化酶分别为FtnadE*、FnnadE*和MnnadE*基因编码的蛋白；

(c)FnnadE*编码的蛋白的核苷酸序列如Seq ID No1所示；

(d)MnnadE*编码的蛋白的核苷酸序列如Seq ID No2所示。

作为优选的技术方案，是将烟酸磷酸核糖转移酶和FnnadE*编码的烟酸单核苷酸酰胺化酶进行共表达，实现外源底物NA到NMN的催化生成。

本发明的目的之二，在于提供一种不表达利用和降解NMN的酶的编码基因的重组微生物，使细胞能够积累NMN。

作为优选的技术方案，所述宿主是大肠杆菌。作为进一步优选的技术方案，首先将野生型大肠杆菌W3110中NMN脱酰胺酶(催化NMN转变成NaMN)编码基因pncC、烟酰胺核苷酸腺苷酸基转移酶编码基因nadR(催化NMN到NAD)进行敲除，得到的宿主在添加NMN发酵的情况下会有极少量NR检测到。优选的，进一步将可能催化NMN的去磷酸化酶(去磷酸化酶主要催化单核苷酸到对应的核苷产物)，如CDP-二酰甘油双磷酸酶编码基因cdh、5'-核苷酸酶编码基因ushA酸性磷酸酶编码基因aphA以及碱性磷酸酶编码基因phoA、进行敲除，结果显示NMN降解程度变低。

本发明的目的之三，在于提供一种NMN的生产方案。

作为优选的技术方案，具体的包括：1)构建烟酸磷酸核糖转移酶基因和烟酸单核苷酸酰胺化酶基因的共表达质粒；2)构建不能降解和利用NMN的基因工程菌；3)将1)的重组质粒转化2)的基因工程菌中；4)培养如3)的重组菌株，通过添加异丙基硫代半乳糖IPTG诱导重组质粒上基因的表达；5)IPTG诱导同时添加底物NA进行发酵。

本发明提供了一种利用新的NMN合成代谢路径的重组微生物生产NMN的方案，是利用NAD从头合成途径有中间产物NaMN和外源添加底物NA转化成NaMN，进一步催化生成NMN，NA有3种商品规格，即食品级、饲料级和医药级，目前生产工艺成熟，价格低廉；本发明利用大肠杆菌基因工程菌发酵来实现，与以前利用酵母比较，流程相对简单，各种投入和成本大大降低。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明制备NMN发酵工艺简单、耗时短、成本低，底物烟酸价格低廉，相对收益率较高。

附图说明：

图1为大肠杆菌NMN相关的代谢路径；

其中：NA：烟酸；NR，烟酰胺核糖；Asp:天冬氨酸；QA，喹啉酸；NaMN，烟酸单核苷酸；NaAD，烟酸腺嘌呤二核苷酸；NAD，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAM，烟酰胺；NMN，烟酰胺单核苷酸；NadC：喹啉酸磷酸核糖基转移酶；NadD：烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶；NadE：NAD合成酶；NadR，烟酰胺核苷酸腺苷酸基转移酶；PncA：烟酰胺酶；PncB：烟酸磷酸核糖基转移酶；PncC：NMN脱酰胺酶；DeoD：嘌呤核苷磷酸化酶I；XapA：嘌呤核苷磷酸化酶II；UshA：5'-核苷酸酶；Cdh：CDP-二酰甘油双磷酸酶、AphA：酸性磷酸酶；

图2HPLC检测图谱；

图3重组菌株摇瓶发酵生产NMN。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

实施例1烟酸单核苷酸酰胺化酶编码基因人工合成

NAD生物合成的最后一步是由NAD合成酶(NadE，EC 6.3.1.5)利用氨或谷氨酰胺作为氮供体，水解一分子ATP，催化NaAD生成NAD。NadE同样可以催化NaMN到NMN，但是底物偏好性很强，大肠杆菌自身NadE对NaMN基本无催化。Sorci等人发现土拉热杆菌(Francisellatularensis)中存在一种烟酸单核苷酸酰胺化酶nadE*，可以催化NaMN直接生成NMN，也可以催化NaAD生成NAD，但是对NaMN的底物偏好性更强。因此本发明合成不同微生物来源的nadE*，希望在大肠杆菌中实现NaMN到NMN的生产。大肠杆菌中NaMN是NAD从头合成途径的中间产物，同时可以由外源添加底物NA转化成NaMN作为NMN生产前体。

将Francisella tularensis来源的FtnadE*、Mannheimia succinoproducensMBEL55E来源的MnnadE*和Francisella cf.novicida 3523来源的FnnadE*等基因按照大肠杆菌表达系统进行密码子优化，并且在苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成，FnnadE*和MnnadE*基因合成序列如Seq ID No1和Seq ID No2所示。

实施例2过表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸酰胺化酶质粒构建

为了能够将外源添加的底物NA快速转化成NMN合成前体NaMN，需要将大肠杆菌自身的pncB基因进行过表达。

首先构建表达质粒pHD28：以W3110基因组为模板，利用引物对pHD28-F/pHD28-R扩增pncB基因片段，得到的片段回收后与NcoI-XhoI酶切的载体pEZ07(载体pEZ07同中国专利申请号：201510093004.3中)进行无缝克隆(GBclonart无缝克隆试剂盒，苏州神洲基因有限公司)，转化宿主TG1，通过菌液PCR和酶切验证构建成功表达质粒pEZ07-pncB，编号pHD28。

然后，分别以合成的FnnadE*、FtnadE*和MnnadE*基因序列为模板，分别用引物对pNM26-F/pNM26-R、pNM27-F/pNM27-R和pNM28-F/pNM28-R分别扩增得到FnnadE*、FtnadE*和MnnadE*片段，得到的片段回收后与XhoI-BglII酶切的pHD28进行进行无缝克隆，通过菌液PCR和酶切验证构建成功表达质粒pEZ07-pncB-FnnadE*、pEZ07-pncB-FtnadE*和pEZ07-pncB-MnnadE*，编号分别为pNM26、pNM27和pNM28。

表1 pncB、FnnadE*、FtnadE*和MnnadE*片段扩增引物

实施例3在大肠杆菌中基因敲除的方法

本发明采用Datsenko的方法在大肠杆菌中进行基因敲除(Datsenko 2000.ProcNatl Acad Sci USA,97(12):6640-6645)，相应的基因敲除引物见Baba 2006.Mol SystBiol,2(1)0008。

实施例4摇瓶发酵验证重组菌株的方法

验证重组菌株在摇瓶发酵中生产NMN的发酵培养基，具体为每升培养基中YC溶液100ml，5倍的盐溶液200ml，TM2溶液1ml，柠檬酸铁10mg，无水硫酸镁120mg，氯化钙111mg，硫胺素1ug，以去离子水定容，其中YC溶液为甘油2g，蛋白胨0.6g，酵母粉0.2g，去离子水100ml；5倍的盐溶液含有磷酸氢二钠30g，磷酸二氢钾15g，氯化钠2.5g，氯化铵5.0g，以去离子水定容至1L；TM2溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100ml，以离子水定容至1L。上面溶液灭菌为115℃，20-30分钟。

摇瓶发酵过程如下：首先接种重组菌株至含有抗生素的LB培养基中，置34℃摇床中，250rpm培养过夜；取过夜种子200μl转移到至2ml含有抗生素的LB，于37℃摇床中，250rpm培养4小时至OD₆₀₀值为1左右；随后将2ml二级种子全部转入装有18ml发酵培养基M11的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养3小时，添加IPTG至终浓度0.1mM后，同时添加底物NA，继续培养20小时左右，取样检测。

实施例5HPLC测定发酵液中的NMN和相关副产物

取800ul发酵液加入800ul乙腈，震荡5min，离心(8000rmp，1分钟)过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测。HPLC的参数如下：采用Agilent SB Aq 4.6*150mm 5μm，流动相为甲醇和乙酸铵pH5.0，流动相0.01-4.40分钟甲醇比例为1％，流速0.8ml/min；4.40-5.40分钟甲醇比例由1％上升到7％；5.40-6.50分钟甲醇比例由7％上升到18％，流速1.2ml/min；6.50-6.60分钟甲醇比例降低到为2％，6.60到12分钟，甲醇比例维持2％。利用紫外检测器检，测波长260nm；初始流动相的流速为0.8mL/min，发酵液的上样量为5μL，柱温30℃。底物NA和产物NMN出峰见图2。

实施例6不降解或不利用NMN重组微生物的构建

本发明首先在野生型大肠杆菌W3110菌株中添加NMN，使其终浓度200mg/L，发现NMN残留80mg/L，NAD的出峰位置有很小的出峰。因此，将大肠杆菌W3110作为出发菌株，按照实施例1首先敲除烟酰胺核苷酸腺苷酸基转移酶编码基因nadR和NMN脱酰胺酶编码基因pncC，得到的重组菌株再进行NMN添加降解实验，结果显示NMN残留变多，NAD出峰比野生型菌少，但是敲除菌有极少量的NR检测到。推测如下原因：NadR是催化NMN生成NAD，PncC是催化NMN到NaMN进入NAD从头合成路径，因此野生型菌株NMN会快速被降解和利用，敲除后NMN到NaMN被阻断，到NAD减弱，那么进入细胞的NMN可能通过大肠杆菌自身的去磷酸化酶降解成NR。

随后在W3110(△nadR△pncC)菌株基础上将大肠杆菌的一些去磷酸化酶，如酸性磷酸酶编码基因aphA，碱性磷酸酶编码基因phoA，CDP-二酰甘油双磷酸酶编码基因cdh以及5'-核苷酸酶编码基因ushA等进行敲除，最终构建得到重组菌株(W3110△nadR△pncC△pncA△ushA△cdh△aphA△phoA::kanFRT)，命名JN10K。得到的重组菌株再进行NMN添加降解实验，结果显示NMN残留160mg/L，NAD和NR出峰位置只有极小的出峰，和敲除前菌株比较NMN降解变的极慢。说明此菌株胞内可以积累NMN。

重组宿主JN10K，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli.)，该菌株已于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCCNo.19572。

实施例7外源添加NA进行NMN发酵生产

将上述构建的质粒pHD28、pNM26、pNM27、pNM28分别转化宿主JN10K，得到重组菌株JN10K/pHD28、JN10K/pNM26、JN10K/pNM27、JN10K/pNM28。

将上述重组菌株按照实施例4进行摇瓶发酵，在IPTG诱导同时添加底物NA，使其终浓度为100mg/L，虽然细胞自身也有NaMN，但是需要进入到NAD从头合成途径合成细胞代谢需要的NAD，因此外源添加NA可以有效提高NMN前体NaMN的含量，有利于NMN积累。

摇瓶发酵24h结果显示：JN10K/pHD28重组菌株只有PncB过表达的，添加NA，无NMN检测到；JN10K/pNM26、JN10K/pNM27、JN10K/pNM28重组菌过表达PncB和NadE*，均有NMN检测到，产量分别为3mg/L，25mg/L和13mg/L。这些结果说明这条NMN合成路径可行，虽然大肠杆菌自身不存在此条路径，但是通过过表达其他微生物来源的NaMN到NMN催化酶，也可以在大肠杆菌中实现NMN生产。当然由于NMN在细胞中的代谢比较复杂，可能还有其他降解基因的存在，因此此种方案下的NMN生产还有改造的空间，但是和现有技术相比，本发明所述的生产NMN的重组微生物只需要外源添加价格低廉的底物烟酸(NA)即可实现NMN的生产，而且比目前报道的利用自身Nampt催化生产NMN产量高，而且大肠杆菌发酵周期短，只要24小时即可，与酵母发酵制备至少72小时比较，周期大大缩短，节约原材料和人工成本。

以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州华赛生物工程技术有限公司

<120> 一种新的具有NMN合成路径的重组微生物及生产方法

<130> 2020052201

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> pHD28-F

<400> 1

taaataagga ggaataaacc atgacacaat tcgcttctcc tg 42

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> pHD28-R

<400> 2

cttcgaattc ccatatggta ccttaactgg cttttttaat atgcggaagg 50

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> pNM26-F

<400> 3

gttaatatca tcagggagct cgagcttcta aggaaataat aggagattga aaatgaaaat 60

agttaaaga 69

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> pNM26-R

<400> 4

catatggtac cagctgcaga tctttaacat tcggcatcat ctg 43

<210> 5

<211> 73

<212> DNA

<213> pNM27-F

<400> 5

gttaatatca tcagggagct cgagcttcta aggaaataat aggagattga aaatgaagat 60

cgtgaaggat ttc 73

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> pNM27-R

<400> 6

catatggtac cagctgcaga tctttaaaag tttggggtca gcg 43

<210> 7

<211> 70

<212> DNA

<213> pNM28-F

<400> 7

gttaatatca tcagggagct cgagcttcta aggaaataat aggagattga aaatgaaaac 60

cgcggcgtac 70

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> pNM28-R

<400> 8

catatggtac cagctgcaga tctttaacat tccgcctcat ccg 43

<210> 9

<211> 753

<212> DNA

<213> Seq No 1

<400> 9

atgaaaaccg cggcgtacgc cgattatctg atccagtggc tggaaaacca gcgcacggaa 60

ctgtatggca tggacggcta tacgctgggc gttagcggcg gcattgatag cgccgtttgt 120

gcccatctgg ccgcccgtac cggtgcgcca gttcaagcgc tgattctgcc ggccgaagtg 180

accagtccga gcgatgttgc cgatgcgcaa gcgacgctgg agagtgcggg tatcgacggt 240

cagattatca gcattgcccc gtggtacgat ctgatcatgc agcaactgag cccggtgctg 300

aatagtgaac cggagcgcgt gaacgttctg aagggcaatc tgatggcgcg tctgcgcatg 360

atcgcgctgt ttaccacggc gcagagccat cgcagtatcg ttctgggcac ggataatgcc 420

gcggaatggc tgaccggcta cttcaccaaa ttcggcgatg gtgccgccga tgttctccca 480

ctggcgggtc tgcgcaaaga acaagttttc gaactgggcc gctatctggg cgtgccacag 540

agcgtgctgg acaaaaaacc aagcgccggt ctgtgggcgg gtcaaacgga tgaagccgaa 600

atgggcgtga cgtatgccga aatcgatgcg tatctgcgcg gcgaaaccgt tagcccacaa 660

gcgctgcagc agatccgctt ctggcataat cgcagccacc acaaacgcat gctgccgccg 720

aaaccgaaaa gcccggatga ggcggaatgt taa 753

<210> 10

<211> 750

<212> DNA

<213> Seq No 2

<400> 10

atgaagatcg tgaaggattt cagcccgaag gagtacagcc agaatctggt gaactggctg 60

agcgacacgt gcatcaacta cccggccgaa ggctttgtga tcggcatcag tggcggcatt 120

gatagcgccg ttgccgcgag tctggcggtt aaaaccggcc tcccaacgac cgcgctgatt 180

ctcccgagca aaaacaacca gcaccaagat atccaagatg cgctggaact ggtggagaaa 240

ctgaacatcg agcaccacat cgtgaccatc cagccggcgt acgagaattt tctggcgagc 300

acgcaagaat tcatcaacac cgacaacaac cgccagctcg ttatcaaagg caacgcccaa 360

gcccgtctgc gcatgatgta cctctacgcg tacgcccagc agtacaaccg catcgtgatt 420

ggcaccgata acgcgtgcga gtggtacatg ggctacttca ccaagtttgg tgacggcgcc 480

gcggacatct tcccgctgat caatctgaag aagagccaag ttttcgagct cggcaagtat 540

ctggacgtgc cgaagaacat catcgacaaa gcgccaagtg ccggtctgtg gcaaggccag 600

accgatgaag atgaaatggg cgtgacctac caagaaatcg acgactttct ggacggcaaa 660

cagatcagcg cgaaagcgct ggaacgcatc aacttttggc acaaccgcag ccaccacaaa 720

cgcaaactgg cgctgacccc aaacttttaa 750

Claims

1.一种新的具有β-烟酰胺单核苷酸合成路径的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物采用了以下步骤构建得到：

1）以重组菌株JN10K为出发菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏编号为CGMCC No.19572；

2）构建表达质粒pEZ07-pncB-MnnadE*，其中pncB基因为大肠杆菌自身的基因，MnnadE*基因的核苷酸序列如Seq ID No2所示；

3）将步骤2）构建的表达质粒转入重组菌株JN10K获得所需的重组微生物。

2.一种新的β-烟酰胺单核苷酸的生产方法，其特征在于：在发酵的培养基中添加烟酸，利用如权利要求1所述的重组微生物发酵合成β-烟酰胺单核苷酸。