CN105385646A

CN105385646A - 5-羟色氨酸的前体定向生物合成

Info

Publication number: CN105385646A
Application number: CN201510549142.8A
Authority: CN
Inventors: 闫亚军; 孙新晓
Original assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2016-03-09
Also published as: US9663768B2; US20160060638A1

Abstract

本发明提供了有用于在微生物细胞中生产5-羟色氨酸(5-HTP)的化合物、组合物、非天然存在的生物、以及方法。一种包含至少一种微生物细胞的微生物系统被基因工程化以表达非天然存在的生物合成途径的全部或一部份，该至少一种微生物细胞是例如细菌细胞或者酵母细胞，该生物合成途径催化简单碳源例如葡萄糖转化为5-HTP。本发明可导致5-HTP的效价改善并且允许低成本、大规模生产。制造和使用这些基因工程化细胞的方法也被包含在本发明中。

Description

5-羟色氨酸的前体定向生物合成

本申请要求2014年9月2日提交的美国临时申请序列号62/044,667的权益，该申请通过引用以其全文结合在此。

背景技术

5-羟色氨酸(5-HTP)是一种天然的非蛋白原氨基酸，其充当神经递质血清素的直接生物合成前体。中枢神经系统(CNS)中血清素不足被认为是抑郁症的一个重要的生理因素。5-HTP已被证明对于治疗各种病况是有效的，包括抑郁症、失眠症、慢性头痛以及与肥胖症有关的暴食。同时,它的副作用相对较少。5-HTP的治疗效果应归于其提高血清素在大脑中合成的能力。5-HTP通过口服剂量很好地被吸收并且可以很容易地穿越血脑屏障(索尔，1998，《替代医学评论》，3，271-280)。在大部分欧洲国家，5-HTP是一种用于多种治疗目的的常用处方药，而在北美市场，它被作为一种“非处方”膳食补充剂出售。

目前，5-HTP通过从加纳籽中提取而获得，其是一种生长在非洲的木本的攀缘灌木。该原材料的供应依赖于季节和地区，一直很大地限制其有成本效益的生产和广泛的临床应用。此外，来自加纳籽的5-HTP被一种称为顶峰X的化合物污染，导致美国农业部暂时地令该补充剂在美国下架。目前，5-HTP的大宗批发价格在400到1000美元/kg之间变动。然而，尽管当前的生产成本高而且供应有限，5-HTP的全球市场仍然约50,000kg(整批价值2-5千万美元)。

发明概述

本发明提供了新型的代谢改造微生物细胞，以及使用所述细胞用于从简单碳源(例如，葡萄糖)进行微生物生产5-羟色氨酸(5-HTP)的方法。更特别地，本发明提供了新型的微生物系统，其包括一种或多种基因工程化以表达全部或一部份用于5-HTP生产的新型代谢途径的微生物细胞。该新型代谢途径使用一种或多种具有宽松底物选择性的酶，其被有利地利用于该新型代谢途径中以催化涉及一种或多种非天然底物的反应。整个生物合成途径可以被整合到单个微生物细胞；然而，已经发现当使用两种微生物细胞时5-HTP的生产提高了，其中第一细胞整合该途径的上游部份，生产5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)中间体，而第二细胞整合该途径的下游部份，生产5-HTP终产物。制造和使用该基因工程化细胞的方法也被包含在本发明中，包括但并不仅限于制造5-HTP或其任一前体(例如，5-HAA)的方法。这类方法可以包含在一定的条件下培养一种或多种在此描述的基因工程化细胞并持续足以生产5-HTP或其任一前体的时间，并且可任选地分离产物。

该方法可以进一步包含将5-HTP纳入一种食物产品中。该食物产品可以适合人类食用和/或可以是动物饲料或饮料。该方法可以包含包装5-HTP或供出售的食物产品并且可任选地向作为食品添加剂、食品补充剂或营养食品的5-HTP或食物产品提供使用说明书。在一个实施例中，该食品添加剂、食品补充剂或营养食品被包装作为动物饲料或饮料使用。

词语“优选的”和“优选地”指可以在某些环境下提供某些益处的本发明实施例。然而，在相同或其他环境下，其他实施例也可以是优选的。另外，对一个或多个优选实施例的描述不暗示其他实施例是无用的，并且不意图从本发明的范围中排除其他实施例。

术语“包含”及其变体，在这些术语在本说明书和权利要求书中出现的情况下，不具有限制性含义。

除非另外说明，“一个(a)”、“一种(an)”、“该(the)”、和“至少一个(atleastone)”可互换地使用并且意指一个或多于一个。

另外在本文中，借助端点对数值范围进行的描述包括隶属该范围的全部数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

对于本文中披露的、包括分离步骤的任何方法，这些步骤可以按任何可行顺序实施。并且，如果适宜，两个或更多个步骤的任何组合可以同时实施。

本发明的以上概述不意在描述本发明的每个所披露的实施例或每一个实施方式。以下本说明书更加具体地示例了示意性实施例。贯穿本申请，在几个地方中，通过一系列实例提供指导，这些实例能以多种组合形式使用。在每种情况下，所述系列仅作为代表性群组发挥作用并且不应当解释为排他性系列。

缩略语：

AA邻氨基苯甲酸

5-HAA5-羟基邻氨基苯甲酸

5-HI5-羟基吲哚

TP或Trp色氨酸

5-HTP5-羟色氨酸

SA水杨酸

GA龙胆酸

附图简述

图1A示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的实例。TrpE^fbrG：邻氨基苯甲酸合酶(抗反馈突变体)；SalABCD：水杨酸5-羟化酶；TrpDCA和TrpB：大肠杆菌原生色氨酸生物合成酶。虚线示出了经由色氨酸生物合成酶的作用朝向色氨酸可能的碳分流。大肠杆菌BW1是整合完整生物合成途径的示例性菌株。

图1B示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的另一实例，其分为上游和下游部份。TrpE^fbrG：邻氨基苯甲酸合酶(抗反馈突变体)；SalABCD：水杨酸5-羟化酶；TrpDCA和TrpB：大肠杆菌原生色氨酸生物合成酶。在一个双细胞系统中，大肠杆菌BW3是整合生物合成途径上游部份的示例性菌株，其出产5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)；大肠杆菌BW2是整合生物合成途径下游部份的示例性菌株。

图1A和1B中所示的步骤1，2和3代表用于如实例1所描述的逆向工程化5-HTP的微生物合成的步骤，其中步骤1代表最下游的步骤而步骤3代表最上游的步骤。

图1C示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的另外的实例，其分为上游和下游部份，其中该途径使用显示宽松底物选择性的水杨酸5-羟化酶和色氨酸生物合成活性。

图2A示出了在TrpDCBA(上图)催化下邻氨基苯甲酸(AA)转化为色氨酸(TP)以及同样在TrpDCBA(下图)催化下类似的5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)转化为5-羟色氨酸(5-HTP)。

图2B示出了TrpDCBA对于天然底物AA(黑色)以及非天然底物5-HAA(灰色)的体内测定。含有质粒pCS-trpDCBA的菌株BW2被用于体内测定。每一反应的产物显示在各柱状图的顶部。Trp：色氨酸。

图3A示出了使用含有低拷贝数质粒pSA-trpDCBA的菌株BW2将5-HAA生物转化为5-HTP。在0h和10h将5-HAA(600mg/L)加入培养物。每四小时提取样本并通过HPLC进行分析。

图3B示出了使用含有中拷贝数质粒pCS-trpDCBA的菌株BW2将5-HAA生物转化为5-HTP。在0h和10h将5-HAA(600mg/L)加入培养物。每四小时提取样本并通过HPLC进行分析。

图4A示出了在SalABCD(上图)催化下水杨酸向龙胆酸(GA)的原生细菌转化；在SalABCD催化下AA转化为5-HAA，因为水杨酸(2-羟基苯甲酸)和AA(2-氨基苯甲酸)具有相似的分子结构(中图)；以及在邻氨基苯甲酰-辅酶A合成酶(PqsA)和水杨酰-辅酶A5-羟化酶(SdgC)连续作用(下图)催化下AA转化为5-HAA。

图4B示出了邻氨基苯甲酸5-羟化酶的体内测定。菌株BW3被用作宿主。所使用的质粒显示在各柱状图的下面。每一反应的产物显示在各柱状图的顶部。

图5示出了AA生物转化为5-HAA。含有质粒pZE-salABCD的菌株BW3被用于生物转化。在0h和5h将5-HAA(300mg/L)加入培养物。每三小时提取样本并通过HPLC进行分析。

图6示出了来自葡萄糖的5-HAA生产的模块优化。菌株BW3被用作宿主。所使用的质粒显示在各柱状图的下面。

图7A示出了使用含有质粒pZE-salABCD以及pSA-trpE^fbrG的菌株BW3从葡萄糖生产5-HAA，用于5-HTP生产的两步法的第一部分(上游部份)。

图7B示出了使用含有质粒pCA-trpDCBA以及pSA-trpDCBA的菌株BW2从5-HAA生产5-HTP，用于5-HTP生产的两步法的第二部分(下游部份)。

展示性实施方式的详细说明

本发明提供了新型的生物合成途径，使得从葡萄糖经由5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)前体生产5-羟色氨酸(5-HTP)。直至现在，唯一报道的5-HTP生物合成途径是经由色氨酸，并且该反应是被色氨酸5-羟化酶(T5H)所催化的。然而，当在微生物中表达并且需要应该通过附加酶反应再生的特殊的辅助因子5,6,7,8-四氢生物蝶呤(BH4)时，T5H是不稳定的(哈马丹和里贝罗，1999，《生物与化学杂志》，274：21746-21754；林等人，2014，ACS合成生物学，3(7)：497-505)。这些问题妨碍该途径向5-HTP的经济生产应用。为了避免与5-HTP生产相关的问题，我们通过识别和使用挑选的显示底物耐受的途径酶逆向工程化用于5-HTP生产的新型生物合成途径，由此实施前体定向生物合成的概念(图1)。通过利用这些酶的宽松底物选择性，我们避免了对于不稳定的色氨酸5-羟化酶依赖的需要。

逆向工程化该新型生物合成途径的第一步，对应于代谢途径的下游部分，是找到5-HTP的一种简单前体。5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)被鉴定为一种合适的前体。在大肠杆菌色氨酸生物合成途径中，经由酶促反应在TrpDCBA(图2A，上图)催化下前体邻氨基苯甲酸(AA)转化为色氨酸(TP)。通过使用体内测定，我们惊奇地发现5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)同样可以经由酶促反应在TrpDCBA(图2B，下图)催化下被转化为5-HTP。因此，5-HAA被鉴定为一种简单的5-HTP前体。

在该新型生物合成途径的上游部份，新型的水杨酸5-羟化酶(S5H)被用于将非天然底物邻氨基苯甲酸(AA)转化为前体5-HAA。来自葡萄糖的5-HAA生产可任选进一步通过使用参与上游中间体分支酸和邻氨基苯甲酸以及5-HAA(图1)生产的分子的模块优化而提高，如下所详述。

在该新型生物合成途径的下游部份，在大肠杆菌TrpDCBA的催化下5-HTP产生自5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)前体。

在本发明细胞中表达的酶类可以相对于该宿主细胞是异源的，或者它们可以是在宿主细胞生物体中天然发现的。例如，当大肠杆菌是宿主生物时，该生物合成途径中所使用的一种或多种酶可以是原生大肠杆菌酶，而表达的酶的一种或多种可以来自其它(非大肠杆菌)生物体(例如，异源性的)。当一种对于宿主生物体是原生的酶从质粒或其它载体中表达时，该酶相对于在没有质粒的宿主生物体中在该宿主生物体中过量表达。天然存在的酶的过量表达，以及来自其它宿主的酶的表达，经由多种质粒或载体，允许组成基因工程化的总生物合成途径的各种酶的优化和微调。

尽管整个途径可以被整合到单个细胞中，本发明优选地使用两阶段法，在此也被称作两步法，其中该生物合成途径的上游和下游部份被整合进两种不同的细胞，以最佳地达到5-HTP的从头生产。更普遍的是，该创新的策略和概念是用于生物合成其它化学制剂的适用设计和非天然途径的建立。

因此，本发明包括基因工程化以生产5-HTP或在生物合成途径中在5-HTP之前的中间体的微生物细胞，以及用于制造所述细胞的方法和从所述细胞或细胞培养物中生产和分离5-HTP的方法。本发明涉及将微生物细胞基因工程化以表达全部或一部份用于从简单碳源微生物生物合成5-HTP的新型生物合成途径。本发明提供了一种有成本效益的用于从廉价碳源有效生产5-HTP的微生物方法。预期该技术可以促进生物催化平台的构建以将廉价的原料转化为高纯度的产物5-HTP，这与常规的提取方法相比将显著降低其生产成本，极大地改善其对于未经良好治疗病人的可用性，以及进一步扩大其市场。

下面更详细地描述可以被工程化以表达该5-HTP生物合成途径的微生物细胞的实例，以及用于制造所述细胞的方法和生产与分离5-HTP的方法。

上游生物合成途径

邻氨基苯甲酸(AA)的5-羟化以出产5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)。如上面指出的，5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)被鉴定为用于5-HTP生物合成的目标前体。逆向工程化该新型生物合成途径的下一步(第一步的上游)是找到从初级代谢产物合成5-HAA的途径。邻氨基苯甲酸(AA)被鉴定为是一种初级代谢产物。AA是5-HAA的一种潜在前体，因为AA的5-羟化将引起5-HAA的形成。然而，还没有AA5-羟化酶被报道。

令人惊讶地，已发现水杨酸5-羟化酶(S5H)，其原生地催化水杨酸(SA)的羟化以出产龙胆酸(GA)，显示出宽松底物选择性并且也能够催化非天然底物AA的羟化以出产5-HAA。术语“宽松底物选择性”意指该酶可以催化非原生底物的反应，在这种情况下是5-羟化。据我们所知，这是对于能够使用AA作为底物的水杨酸5-羟化酶(S5H)的第一次报告。一种新型的具有宽松底物选择性和将AA转化为5-HAA能力的S5H的发现是有意义的，因为该S5H可以在本发明的代谢改造微生物中表达以提高5-HAA合成。

用于本发明的该新型生物合成途径的一种优选的S5H是来自富养罗尔斯通氏菌H16的S5H，其表示为SalABCD；然而，本发明不限于特定的S5H。在一些实施例中，该S5H包括SalA，SalB，SalC以及SalD中的至少一个。优选地，该S5H包括SalA，SalB，SalC以及SalD。在富养罗尔斯通氏菌H16中，SalA，SalB，SalC以及SalD分别由salA，salB，salC以及salD编码，其存在于基因簇中。因此，在该S5H包括SalA，SalB，SalC以及SalD的实施例中，它们可以通过单一的基因(salABCD)或多个基因(salAB以及salCD)表达，并且可以被称为SalABCD。

一种具有S5H活性的酶可以从任何适当的生物体中获得。适当的S5H酶的其他实例包括来自罗尔斯通菌属菌株U2和铜绿假单胞菌菌株JB2的S5H(周等人，2002，《细菌学杂志》，184：1547-1555；希基等人，2001，《应用环境微生物学》，67：4603-4609)。优选地，该S5H酶是富养罗尔斯通氏菌H16S5H酶。优选地，该富养罗尔斯通氏菌H16S5H酶由salABCD编码，并且存在于高拷贝数质粒中。

在一些实施例中，S5H活性可以包括两种或更多种酶组合使用。例如，邻氨基苯甲酰-辅酶A合成酶(由pqsA编码)以及水杨酰-辅酶A5-羟化酶(由sdgC编码)可以在相继的催化中使用以将AA转化为5-HAA。当该S5H活性包括邻氨基苯甲酰-辅酶A合成酶以及水杨酰-辅酶A5-羟化酶的序列反应时，该pqsA可以是铜绿假单胞菌的基因并且该sdgC可以是链霉菌属的基因。

因此，本发明的该新型生物合成途径包括一种或多种具有宽松水杨酸5-羟化酶活性(S5H)的酶，其能够催化AA的5-羟化。术语“水杨酸5-羟化酶”意指任何具有S5H活性的单个分子或多个分子；即，其能够催化SA转化为GA；并且适当的S5H是具有宽松选择性的从而其也能够5-羟化AA以出产5-HAA。术语S5H包括任何天然存在的S5H以及其任何片段或修饰，包括由天然存在的S5H的插入、缺失或突变编码的酶，只要S5H活性被保留。该S5H可以对该细胞是内源或对该细胞是异源性的。编码该S5H的基因可以基因水平上整合到宿主细胞，或者表达自一个或多个染色体外元件，例如质粒。

邻氨基苯甲酸(AA)的酶催化合成。用于5-HAA生产的上游途径也包括参与多步转化葡萄糖为分支酸的酶，例如一种或多种莽草酸途径中的酶，以及一种或多种催化随后转化分支酸为AA的酶，即其具有邻氨基苯甲酸合酶活性(见图1)。因此，本发明的该新型生物合成途径进一步包括一种或多种参与分支酸合成的酶，例如莽草酸途径酶，以及一种或多种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶。

该莽草酸途径涉及多种酶并构成了被细菌、真菌、藻类、寄生生物以及植物所利用用于生物合成芳族氨基酸的代谢途径。分支酸是该途径中的中间代谢物。应当理解的是，尽管本发明总体的工程化代谢途径的最上游部分一般被称为莽草酸途径(见图1)，因为莽草酸是分支酸的上游代谢物，术语莽草酸途径酶应该理解为宽泛地涵盖参与分支酸生物合成的酶。

该莽草酸途径可以包含莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶以及3-脱氧-D-阿糖庚酮醛酸7-磷酸(DAHP)合酶。参与在大肠杆菌中生产初级代谢产物邻氨基苯甲酸(AA)的酶描述于孙等人(2013，《应用环境微生物学》，79：4024-4030)。

编码参与分支酸生物合成的酶(例如，莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶和/或DAHP合酶)的基因可以是宿主细胞内源的，或者它们可以从任何适当的生物体中获得。这些酶可以以原生的量存在，或者可以通过表达在一个或多个引入宿主细胞的载体(例如，质粒)上的一个或多个内源基因的额外拷贝来增强它们表达。在其他实施例中，一种或多种编码莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶和/或DAHP合酶的基因可以从不同生物体中获得，并且或者基因水平上整合到宿主细胞，或者表达自一个或多个染色体外元件，例如质粒。应当理解的是，在具有用于分支酸合成的内源性途径以使得该细胞能够产生代谢物分支酸的宿主生物中，可操作地编码一种或多种莽草酸途径酶(例如，如下以及实例I所述的“APTA”模块)的染色体外元件(例如，质粒)包括进来，无论对该细胞是内源或对该细胞是异源性的，都是任选的。

在一些实施例中，莽草酸激酶由aroL编码，磷酸烯醇丙酮酸合酶由ppsA编码，转羟乙醛酶由tktA编码，而DAHP合酶由aroG编码。一种或多种莽草酸途径中的酶可以是反馈抑制突变体。“反馈抑制突变体”不对意在限制酶活性的细胞控制机理应答，并甚至将在产物已经积累到生理学有用的水平之后继续催化反应。例如，aroG^fbr编码反馈抑制突变体DAHP合酶。该莽草酸途径可以从任何适当的生物体中获得。例如，莽草酸途径可以是大肠杆菌莽草酸途径。在一个优选实施例中，新型生物合成途径包括大肠杆菌莽草酸途径，其包括APTA模块，包括莽草酸激酶(aroL)，磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)，转羟乙醛酶(tktA)，以及DAHP合酶(aroG)，其是反馈抑制突变体(由aroG^fbr编码)。该模块与增强的分支酸可用性相关。该APTA模块表达一种或多种增加向分支酸碳流的酶。例如，第一模块的示例性组分描述于林等，2013，《自然通讯》，4：2603。

在一个实施例中，具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶包括来自色氨酸生物合成途径的TrpE或TrpG中的至少一个。在一个优选实施例中，邻氨基苯甲酸合酶活性可以通过TrpE和TrpG的组合供给。在大肠杆菌中，TrpE和TrpG分别由trpE和trpG编码，其存在于基因簇中。因此，在邻氨基苯甲酸合酶活性是由在宿主细胞中表达TrpE和TrpG两者所提供的实施例中，它们可以通过单个的基因(trpEG)表达，并且可以被称为TrpEG。邻氨基苯甲酸合酶也可以包括反馈抑制突变体。例如，trpE^fbrG编码反馈抑制突变体邻氨基苯甲酸合酶。优选地，当宿主细胞仅表达该生物合成途径的上游部份时，该宿主细胞被修饰成删除原生存在的trpD。

具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶可以是宿主细胞内源的，或者它可以从任何适当的生物体中获得。大肠杆菌邻氨基苯甲酸合酶是具有邻氨基苯甲酸合酶活性的示例性酶。在一个实施例中，新型生物合成途径包括大肠杆菌TrpEG，其是反馈抑制突变体(由trpE^fbrG编码)。优选地，该大肠杆菌邻氨基苯甲酸合酶trpE^fbrG存在于低拷贝数质粒中。

具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶可以以原生的量存在，或者可以通过表达在一个引入宿主细胞的载体(例如，质粒)上的该一种或多种内源基因的额外拷贝来增强它的表达。在其他实施例中，一种或多种编码邻氨基苯甲酸合酶活性的基因可以从不同生物体中获得，并且或者基因水平上整合到宿主细胞，或者表达自一个或多个染色体外元件，例如质粒。

具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶不限于任何特定的邻氨基苯甲酸合酶。术语“邻氨基苯甲酸合酶”意指任何具有邻氨基苯甲酸合酶活性的单个分子或多个分子；即，其能够催化分支酸的转化以出产AA。术语邻氨基苯甲酸合酶包括任何天然存在的邻氨基苯甲酸合酶以及其任何片段或任何修饰，包括由天然存在的邻氨基苯甲酸合酶的插入、缺失或突变编码的酶，只要邻氨基苯甲酸合酶活性被保留。该邻氨基苯甲酸合酶可以对该细胞是内源或对该细胞是异源性的。

途径优化。本发明的上游途径(出产5-HAA)可以任选地通过分为三个模块而优化，然后针对对三个模块的每一个中的酶进行编码的质粒而评估不同拷贝数(即表达水平)的作用。大肠杆菌宿主细胞的示例性优化描述于实例I，而该实例可以很容易地推广到其它宿主细胞。模块按逐步朝向最上游部分移动而编号。模块1由salABCD组成，表达S5H，其催化由AA形成5-HAA；模块2是trpE^fbrG模块，表达具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶，其催化转化分支酸为AA；而模块3是APTAG模块，其在莽草酸途径中表达四种酶(AroL，PpsA，TktA，AroG^fbr)以增加向分支酸合成的碳流量(孙等人，2013，《应用环境微生物学》，79：4024-4030)。根据优化结果，上游途径的一个优选实施例是宿主细胞包含高拷贝数的表达S5H的质粒用于模块1，例如实施例I所描述的pZE-salABCD；而低拷贝数的表达邻氨基苯甲酸合酶的质粒用于模块2，例如实施例I所描述的pSA-trpEfbrG。在模块3中莽草酸途径酶的额外拷贝的表达是任选的，前提是宿主细胞原生地表达莽草酸途径酶从而出产分支酸代谢物，其为AA的代谢前体。应当理解的是，在一些实施例中更普遍的是，如果酶内源地存在于宿主细胞内，在模块1，2或3中没有酶是由质粒表达的；也就是说，经由任何内源酶的质粒或其它载体的过量表达是任选的。应当进一步理解，本发明不限于示例于模块1，2或3中特定的酶；相反地，具有所描述活性的任何酶或一组酶，无论是内源性的或是异源性的，可以被用于本发明的代谢途径。

下游生物合成途径

由5-HAA合成5-HTP。在大肠杆菌色氨酸生物合成途径中，通过由TrpDCBA(图2A，上图)催化的酶促反应将邻氨基苯甲酸(AA)转化为色氨酸(TP)。令人惊讶地，我们发现TrpDCBA显示出宽松底物选择性，并且非原生底物5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)也可以通过由TrpDCBA(图2B，下图)催化的酶促反应转化为5-HTP。

因此，本发明的该新型生物合成途径包括一种或多种具有色氨酸生物合成活性的酶，并且显示出宽松底物选择性以使得它们能够运用5-HAA作为底物。在这方面，术语“色氨酸生物合成活性”意指催化AA转化为色氨酸(TP)的能力，而不限于任何具体的色氨酸生物合成酶。可使用任何具有色氨酸生物合成活性以及显示出催化5-HAA转化以出产5-HTP能力的一种或多种酶。具有色氨酸生物合成活性的酶包括任何天然存在的色氨酸生物合成酶以及其任何片段或任何修饰，包括由天然存在的色氨酸生物合成酶的插入、缺失或突变编码的酶，只要色氨酸生物合成活性被保留。色氨酸生物合成活性可以对该细胞是内源或对该细胞是异源性的。

在一些实施例中，色氨酸生物合成活性由TrpA，TrpB，TrpC以及TrpD中的至少一个提供。优选地，色氨酸生物合成活性由TrpA，TrpB，TrpC以及TrpD提供。在大肠杆菌中，TrpA，TrpB，TrpC以及TrpD分别由trpA，trpB，trpC和trpD编码，其存在于基因簇中。在色氨酸生物合成活性由TrpA，TrpB，TrpC以及TrpD所提供的实施例中，它们可以通过单个的基因(trpDCBA)或多个基因(例如，trpA和trpDCB)表达，并且可以被称为TrpDCBA。例如，色氨酸生物合成活性可以是大肠杆菌的色氨酸生物合成活性。在一个实施例中，新型生物合成途径包括大肠杆菌色氨酸生物合成途径(由trpDCBA编码)。大肠杆菌trpDCBA可以存在载体上，例如质粒。在一些实施例中，该质粒是一种低拷贝数质粒。

色氨酸生物合成活性可以以原生的量存在，或者可以通过表达在一个引入宿主细胞的载体(例如，质粒)上的编码该活性的一种或多种内源基因的额外拷贝来增强它的表达。在其他实施例中，一种或多种编码色氨酸生物合成活性的基因可以从不同生物体中获得，并且或者基因水平上整合到宿主细胞，或者表达自一个或多个染色体外元件，例如质粒。

总之，该新型生物合成途径催化简单碳源(例如，葡萄糖)转化为5-HTP。该新型生物合成途径包括1)上游部份，其催化简单碳源转化为5-HAA，其中上游部份包括一种或多种莽草酸途径酶(例如，参与分支酸生产的酶)，至少一种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶，以及至少一种具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶；2)下游部份，其经由色氨酸生物合成途径催化5-HAA转化为5-HTP。上游和下游部份都是可任选地并且优选地包括具有宽松底物专一性的酶，其被募集以使用非原生底物，以获得途径中间体或最终产物的生产。途径酶可以独立地对该宿主细胞是内源性的或对该宿主细胞是异源性的。内源酶活性可以通过宿主细胞供给，无需强化，或者活性水平可以通过另外表达来自引入宿主细胞的染色体外元件的内源酶而增强。在一个示例性实施例中，该新型生物合成途径包括1)上游部份，其包括来自大肠杆菌莽草酸途径的酶，大肠杆菌trpE^fbrG邻氨基苯甲酸合酶，以及富养罗尔斯通氏菌SalABCD水杨酸5-羟化酶；以及2)下游部份，其包括大肠杆菌色氨酸生物合成途径(TrpDCBA)。

任选地，并且有利地，该新型生物合成途径的上游和下游部份可以工程化到两个分开的细胞中。更确切地说，该新型生物合成途径的上游和下游部份可以独立地分别遗传工程化到第一和第二微生物细胞中，由此形成包含第一和第二细胞的微生物系统。

宿主細胞

本发明还提供一种经由在此讨论的新型生物合成途径能够合成5-HTP的基因工程化的微生物细胞。确切地说，本发明提供基因工程化以表达可以经由邻氨基苯甲酸的5-羟化催化邻氨基苯甲酸(AA)转化为5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)以及催化5-HAA转化为5-HTP的酶的微生物细胞。任选地，AA转化为5-HAA(即上游途径)以及5-HAA转化为5-HTP(下游途径)可以由两种不同的微生物细胞进行，其中第一细胞基因工程化以表达上游途径中的一种或多种酶，而第二细胞基因工程化以表达下游途径中的一种或多种酶。当使用双细胞系统生产5-HTP时，5-HAA由第一细胞生产，并被第二细胞作为用于生产终产物5-HTP的前体摄取。

宿主细胞可任选地进一步基因工程化以进一步增加细胞产生5-HTP的量。5-HTP生产的进一步增加可以通过各种方法实现。在一个实施例中，5-HTP的过度产生或积累可以通过敲除参与色氨酸降解的一种或多种酶实现。例如，细胞产生5-HTP的量可以通过敲除色氨酸酶(tnaA)的基因增加，已报道其是一种催化色氨酸和5-HTP两者降解的蛋白。在另一个实施例中，色氨酸操纵子工程化以减少或消除反馈抑制。例如，在氨基酸位置S40的突变(例如，突变S40F)可以整合到TrpE中以减少或消除反馈抑制。在另一个实施例中，5-HTP的过度产生或积累可以通过改变色氨酸转录阻遏蛋白(TrpR)的表达来实现。可以使用任何已知用于增加5-HTP生产的方法，包括，例如，美国专利号5,756,345中描述的方法。任选地，可以组合一种或多种过度产生或积累技术。例如，可以敲除色氨酸降解途径，而宿主细胞可以过量表达整个色氨酸操纵子。

优选地，宿主细胞是细菌或酵母细胞。示例性的宿主细胞包括大肠杆菌细胞，枯草芽孢杆菌宿主细胞和青蓝链霉菌细胞。示例性的酵母细胞包括来自酵母菌属(例如，酿酒酵母)和毕赤酵母属的酵母菌。更普遍地，可以代谢工程化以整合在此描述的生物合成途径的微生物包括埃希氏菌属、沙门菌属、梭菌属、发酵单胞菌属、假单胞菌属、芽胞杆菌属、红球菌属、产碱菌属、克雷白氏杆菌属、类芽孢杆菌、乳酸杆菌、肠道球菌属、节杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属以及酵母菌属。优选的宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌、真养产碱杆菌、红平红球菌、浸麻类芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、屎肠球菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、鹑鸡肠球菌，以及粪肠球菌。其他合适的细胞可以包括昆虫细胞、原生生物、真菌，以及动物或植物细胞。

本发明进一步包括制造该基因工程化细胞的方法以及使用该基因工程化细胞的方法。在生产5-HAA和/或5-HTP的条件下培养该基因工程化细胞。培养可以是小规模或大规模的；其可以是需气的或厌气的。优选地，该基因工程生物在大规模发酵系统中培养。将5-HAA和/或5-HTP与微生物分开，及任选地分离和纯化。产生的5-HAA和/或5-HTP可以进一步被化学或酶法衍生化。可以将5-HAA和/或5-HTP或其衍生物结合到其它材料中，例如食物、补充剂、药物、聚合化合物(包括杂聚物、共聚物、以及类似物)。5-HAA可以被用作表达下游生物合成途径的本发明基因工程化细胞的原料。

当基因工程修饰或改变一个或多个特定的代谢途径从而引起新陈代谢的改变时，基因工程化细胞也被称为“代谢改造”细胞。例如，代谢工程可以提高底物向期望产物的比率或转化、改变产生的产物的量、或生产新产品。本发明提供了一种合成生化制品5-HAA和/或5-HTP的新型代谢途径。在很多不同的细胞类型(包括细菌、植物以及动物)中修饰或改变代谢途径的方法是常规的并且在本领域中是熟知的；参见例如萨姆布鲁克等人，《分子克隆：实验手册》，冷泉港实验室出版社(1989)，以及《普通和分子细菌学方法》(格哈特等人编著)，美国微生物学会，第13-14以及16-18章(1994)。

将生物合成途径引入细胞

将本发明的新型生物合成途径引入细胞涉及该新型生物合成途径包括的一种或多种酶的表达或过量表达。当酶的表达水平高于其在相当的野生型细胞中的表达水平时，该酶在基因工程化细胞中“过量表达”。出于本发明的目的，在不表达特定的内源酶的细胞中，或在不是内源酶的细胞中(即对该细胞来说该酶不是原生的)，在该细胞中该酶任意水平的表达被视为该酶的过量表达。

如本领域普通技术人员所应当理解的，酶的过量表达可以通过大量分子生物学技术实现。例如，过量表达可以通过向细胞引入一个或多个编码所希望的酶的多核苷酸拷贝来实现。编码所希望的酶的多核苷酸可以对该细胞是内源或异源性的。优选地，使用载体将多核苷酸引入细胞；然而，也可以使用裸DNA。多核苷酸可以是环形的或线性的，单链的或双链的，并且可以是DNA、RNA，或其任何修饰或组合。载体可以是任何分子，其可以用作转运遗传物质进入细胞的运载体。载体的实例包括(但不限于)质粒、病毒载体、粘粒、以及人工染色体。用于转运核苷酸序列进入微生物的分子生物学技术的实例包括(但不限于)转染、电穿孔、转导、以及转化。这些方法在本领域是众所周知的。载体插入靶细胞对于细菌细胞通常被称为转化，对于真核细胞通常被称为转染，然而，病毒载体的插入通常被称为转导。对本发明的目的而言，术语转化、转染、以及转导在此可互换地使用。通过使用载体被转移到细胞中的多核苷酸通常被称为转基因。

优选地，载体是表达载体。“表达载体”或“表达构建体”是任何用于将特定多核苷酸引入靶细胞的载体，使得一旦表达载体处于细胞内部，该多核苷酸编码的蛋白经由细胞转录和翻译机制而产生。典型地，表达载体包括与编码所希望的酶的多核苷酸可操作地连接的调节序列。调节序列对于本领域技术人员而言是公知常识，并且可以包含，例如，复制起点、启动子序列和/或增强子序列。编码所希望的酶的多核苷酸可以存在于染色体外或可以整合到宿主细胞染色体DNA中。染色体外的DNA可被包含在胞质细胞器中(例如，线粒体(在大部分真核生物中))，以及在叶绿体和质体(在植物中)中。更典型地，染色体外的DNA被维持在载体内，其在载体上被引入细胞内。在许多情况下，为了最大化酶的表达，选择高拷贝数的载体是有益的。任选地，所述载体可进一步包含选择标记。某些选择标记可以用于证实所述载体存在于靶细胞内。其它选择标记可以用于证实所述载体和/或转基因已经整合到宿主细胞染色体DNA中。选择标记的用途在本领域内是常见的，并且技术人员将理解并明白选择标记的许多用途。在使用多个载体的实施例中，优选的是各个载体包括独立的选择标记。任选地，所述载体可进一步包含报告基因。报告基因可以用于证实所述载体在靶细胞内表达，并且可以进一步用于监测来自载体的表达。报告基因的用途在本领域内是常见的，并且技术人员将理解并明白报告基因的许多用途。

质粒

作为本发明新型的代谢途径一部分的酶可以在宿主细胞中从染色体外元件(例如，载体)表达。质粒在代谢工程中通常被用作表达载体。通过引入一个或多个编码该酶的质粒，该新型生物合成途径可在微生物细胞中方便地表达或过量表达。适合的示例性质粒描述于实例I中，并且包括但并不仅限于pCS-trpDCBA、pSA-trpDCBA、pCA-trpDCBA、pCS-trpE^fbrG、pSA-trpE^fbrG、pCS-trpE^fbrG-APTA、pSA-trpE^fbrG-APTA、pZE-salABCD、pZE-salABC、以及pZE-sdgC-pqsA。本领域普通技术人员将理解也可以使用具有不同启动子、抗生素抗性、以及复制起点(ori)的另外的质粒。

此外，应该指出，如果希望的话，使用熟知的基因工程技术和方案，可操作地编码在此描述的酶的任何或所有核苷酸序列可以代之以基因水平上整合到细菌的基因组。

在原生表达生物合成途径中一种或多种酶的宿主细胞中，任选地省略表达原生酶的质粒。

质粒可以是高拷贝数、中拷贝数或低拷贝数的质粒。尽管与本领域公认的命名“高”、“中”、以及“低”拷贝数有关的边界是不同并且在实践中可能重叠，一般而言，高拷贝数的质粒的特征是一个细胞内的拷贝数，例如，大于50或60拷贝，中拷贝数的质粒的特征是一个细胞内的拷贝数，例如，10和60之间的拷贝(例如，15-20拷贝)，而低拷贝数的质粒的特征是一个细胞内的拷贝数，例如，小于10或15拷贝(例如，3-8拷贝)。质粒pSA-trpDCBA和pCS-trpDCBA分别举例说明低和中拷贝数的质粒。

在制造该基因工程微生物和得到的工程化微生物的方法的一个优选实施例中，可操作地编码选择的酶的多核苷酸(其被工程化到宿主生物中)存在于一个或多个质粒上。分开的质粒可以用于各个酶，或两种或更多种酶可以组合到同一质粒上。因此，基因工程化的宿主生物可以包括一个或多个质粒以形成用于合成5-HTP或5-HAA的生物合成途径(上游、下游或整个)。

制造5-HTP的方法

本发明的基因工程化细胞可以在包含简单碳源(例如，葡萄糖或甘油)的培养基中生长。为了优化细胞生长以及生产效率，细胞可以在包括但是不限于以下的温度下孵育：21℃、23℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、46℃。在一个实施例中，微生物细胞在30℃下孵育。在一替代实施例中，微生物细胞在37℃下孵育。优选地，葡萄糖被用作用于细胞生长和维持的碳源；任选地，可以添加另外的碳源(例如，柠檬酸)以提高效价。

5-HTP的微生物生产可以在单步法或两步法中完成。在单步法中，完整的新型生物合成途径被引入一个微生物细胞中以实现5-HTP的从头生产。例如，一个微生物细胞可以被工程化以表达trpE^fbrG、salABCD、以及trpDCBA(参见例如，如实例I所描述的含有质粒pSA-trpE^fbrG、pZE-salABCD、以及pCS-trpDCBA的大肠杆菌菌株BW1)。然而，在单步法中，底物AA能被一种或多种色氨酸生物合成酶所利用，并且由此色氨酸(TP)的生产相比于5-HTP是有利的。

为了解决这一问题，可以使用两步法生产5-HTP。该新型生物合成途径的上游部份被引入第一微生物细胞，其可以被培养来产生5-HAA。例如，该第一微生物细胞可以被工程化以表达trpE^fbrG以及salABCD(参见例如，如实例I所描述的含有pSA-trpE^fbrG以及pZE-salABCD的大肠杆菌菌株BW3)用于从葡萄糖生产5-HAA。该新型生物合成途径的下游部份被引入第二微生物细胞以促进5-HAA转化为5-HTP。例如，该第二微生物细胞可以被工程化以表达trpDCBA(参见例如，如实例I所描述的含有pSA-trpDCBA以及pCA-trpDCBA的大肠杆菌菌株BW2)用于从5-HAA生产5-HTP。有利地，该两步法中断TrpDBCA对AA的作用并且避免朝向色氨酸合成的碳分流。在一个优选实施例中，5-HTP的微生物生产通过使用两步法完成，该两步法包括第一微生物细胞，其包括该新型生物合成途径的上游部份，以及第二微生物细胞，其包括该新型生物合成途径的下游部份。

出人意料地并且有利的是，已经发现该新型生物合成途径的上游部份不仅能生产5-HAA，而且5-HAA被分泌到上清液中。第一微生物细胞可以从上清液中分离出来，而包含5-HAA的上清液可与第二微生物细胞培养物混合，由此提供合成5-HTP的原料。在替代实施例中，第一和第二微生物细胞是共培养的。因此，在一个实施例中，顺序地培养第一和第二微生物细胞，而在另一个实施例中，第一和第二微生物细胞是共培养的。

简单碳源可以是任何容易获得的碳源。合适的碳源可以包括(但不限于)5-碳糖或6-碳糖。5-碳糖的非限制性实例包含(但不限于)木糖和阿拉伯糖。6-碳糖的非限制性实例包含(但不限于)葡萄糖、甘油、甘露糖、半乳糖、以及山梨糖。在一个实施例中，该简单碳源是葡萄糖。

任选地，5-HTP从包括该代谢途径的下游部份或完整途径的细胞中分离。5-HTP可以从细胞上清液中分离(如果该化合物被排出)，或从细胞本身中分离。任选地纯化该分离的5-HTP。纯化的5-HTP可以被用作起始材料用于其它化学或酶促反应以生产其它感兴趣的生化制品。同样地，中间代谢物5-HAA可以从仅包含途径的上游部份的细胞中或从细胞上清液中(如果5-HAA被排出)分离并且任选地纯化。根据本发明，该中间代谢物可以被用作用于5-HTP生产的原料、或用于代谢工程中其他应用、或作为其它产物的酶促化学合成的前体。

任选地，分离的5-HTP作为食品添加剂、食品补充剂或营养食品被合并到食物产品中。例如，分离的5-HTP可以被合并到动物饲料中，例如家畜或农畜的饲料。补充5-HTP对于钙代谢可以具有有益作用，并且尤其适合用于怀孕与泌乳农畜，例如奶牛。因此，该制造5-HTP的方法任选地包括包装和/或推广5-HTP作为动物食品补充剂、添加剂或营养食品，以及将5-HTP合并到食物产品(例如，动物饲料或饮料)中。

本发明的基因工程化细胞可以被用作益生菌。如在此所描述，作为益生菌的细胞，其可以包含上游代谢途径、下游代谢途径、或者两者，可以以补充剂的形式进行给药或它们可以被整合到食物产品中。任选地，该食物产品是发酵或培养的食物产品。示例性的食物产品包括乳制品，例如奶、乳酪、或酸奶。乳酸杆菌属和芽胞杆菌属是用作益生菌的示例性细菌细胞。

实例

本发明通过下列实例阐明。应该理解具体实施例、原料、量和方法应根据如本文所阐述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。

实例I

使用代谢改造大肠杆菌的5-羟色氨酸的前体定向生物合成

新型生物合成途径经过设计和反向验证，使得从葡萄糖生产5-羟色氨酸(5-HTP)。该途径利用了相关酶的宽松底物选择性，无需使用不稳定的色氨酸5-羟化酶。高效价的5-HTP是通过大肠杆菌TrpDCBA的催化从5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)前体生产的。新型的水杨酸5-羟化酶被用于将非天然底物邻氨基苯甲酸(AA)转化为5-HAA，而来自葡萄糖的5-HAA生产通过使用模块优化而提高。最后，我们通过采用两步法组合了整个途径以实现5-HTP的从头生产。本研究中使用的策略和概念将有益于用于其它化学制品的生物合成的非天然途径的设计和建立。

结果

5-羟色氨酸(5-HTP)是一种天然的非蛋白原氨基酸，并且充当神经递质血清素的直接生物合成前体。5-HTP已被证明对于治疗各种病况是有效的，包括抑郁症、失眠症、慢性头痛以及与肥胖症有关的暴食。5-HTP的治疗效果应归于其提高血清素在大脑中合成的能力。5-HTP通过口服剂量很好地被吸收并且可以很容易地穿越血脑屏障¹。

目前，从非洲植物加纳籽中提取是商业生产5HTP的方法。然而，材料供应依赖于季节性和地区性，这限制的5-HTP产量。尽管5-HTP的化学合成已被报道²，然而大规模在经济方面是不可行的。生物合成提供了有希望的替代方法用于生产5-HTP。微生物具有更加简单的遗传背景和代谢网络。它们生长更快并且生物量在简单的合成培养基中可以达到高水平。已通过使用基因工程微生物成功地产生了很多重要的化学制品^3-12。

到目前为止，唯一报道的5-HTP生物合成途径是经由色氨酸，并且该反应是被色氨酸5-羟化酶(T5H)所催化的。然而，当在微生物中表达时T5H是不稳定的并且需要特殊的辅助因子5,6,7,8-四氢生物蝶呤(BH4)，该因子应该通过另外的酶反应再生¹³。这些问题妨碍了该途径向5-HTP的经济生产应用。为了避免这些问题，我们建立了用于5-HTP生物合成的新型人工途径。该途径利用了途径酶的底物耐受性并且实施了前体定向生物合成的概念(图1)。

该途径设计的第一步(图1，步骤1，最下游)是为了找到5-HTP的一种简单前体。在大肠杆菌色氨酸生物合成途径中，邻氨基苯甲酸(AA)是色氨酸的前体，并通过由TrpDCBA催化的五个酶促反应转化为色氨酸。5-HTP是色氨酸的类似物，而其对应的前体应当是5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)。据报导，被取代的AA也可以通过该途径转化为对应的被取代的色氨酸¹⁴。为了研究反应细节，构建了中拷贝数质粒pCS-trpDCBA。tnaA和rpE被敲除的、含有pCS-trpDCBA的大肠杆菌菌株BW2被用于体内测定。敲除tnaA可以防止产物色氨酸以及5-HTP降解，而敲除trpE可以阻断AA的原生合成。

结果显示AA和5-HAA都能够经受这些途径酶，分别生产色氨酸以及5-HTP。生物转化系统针对5-HAA的体内比活(57.44±0.94μM/OD/h)是针对AA(151.37±2.93μM/OD/h)的体内比活的约40％，这指示5-羟基基团在某种程度上影响酶活性(图2)。我们还将trpDCBA克隆进了低拷贝数质粒，以出产pSA-trpDCBA。有趣的是，当含有pSA-trpDCBA的菌株BW2被用于体内测定时，中间体5-羟基吲哚(5-HI)在培养物中积累，这指示由TrpB催化的反应是限速步骤(图3A)。为了测试这部分途径的能力，我们连续向含有pCS-trpDCBA的BW2培养物供给5-HAA。在12h中，生产了1102.43±24.95mg/L的5-HTP(图3B)。

5-HTP生物合成的第二步(图1中步骤2)是为了从初级代谢产物合成5-HAA。AA是5-HAA的一种潜在前体，因为AA的5-羟化将引起5-HAA的形成。然而，目前还没有AA5-羟化酶的报告。值得注意的是，两种水杨酸5-羟化酶(S5Hs)已经从罗尔斯通菌属菌株U2和铜绿假单胞菌菌株JB2中得以表征^15,16。S5H将水杨酸羟化为龙胆酸(GA)，并且参与芳香化合物的降解。由于水杨酸(2-羟基苯甲酸)和AA(2-氨基苯甲酸)具有十分相似的分子结构，我们假设S5H也可以羟化AA。为了测试这一假设，我们搜索了蛋白数据库并且发现编码推定的S5H的基因簇。该聚簇克隆自富养罗尔斯通氏菌H16并且表示为salABCD。不同于前两种S5H，该聚簇位于染色体上而不是移动的质粒上。SalABC显示出与来自罗尔斯通菌属菌株U2的那些有高的蛋白序列相似性(57％-75％)，而SalD显示出与来自罗尔斯通菌属菌株U2的那些仅有13％的相似性。

为了表征该基因簇并且测试SalD的必要性，我们构建了两种高拷贝数质粒pZE-salABCD以及pZE-salABC。用这两种质粒分别转化tnaA和trpD敲除的大肠杆菌菌株BW3。敲除trpD可以阻断原生的TrpDCBA消耗AA和5-HAA。

该体内测定显示出SalABCD可以转化水杨酸为GA，其具有268.72±7.79μM/OD/h的比活性。然后，我们进一步测试了对AA的酶活性。正如预期的那样，该酶系统也可以将AA转化为5-HAA，尽管其具有略微低的比活性(216.06±2.02μM/OD/h)。然而，SalABC对AA的比活性显著地降低至16.75±2.06μM/OD/h，这证实SalD是S5H的必要成分(图4)。在此值得一提的是，SalABCD需要NAD(P)H而不是BH4作为辅助因子，而且前者在大肠杆菌中是丰富的代谢产物。

我们还测试了另一种酶组合来羟化AA，其由邻氨基苯甲酰-辅酶A合成酶(PqsA)和水杨酰-辅酶A5-羟化酶(SdgC)组成。PqsA参与2,4-二羟基喹啉的生物合成，其是由铜绿假单胞菌产生的细胞外的代谢物¹⁷。SdgC参与链霉菌属菌株WA46进行的水杨酸降解¹⁸。该体内测定显示出AA可以通过这两种酶的相继催化而转化为5-HAA。然而，与SalABCD的比活性相比较，该组合的比活性不是所希望的(15.44±0.92μM/OD/h)(图4)。然后，我们连续向含有质粒pZE-salABCD的菌株BW3培养物供给AA。在12h中，生产了442.51±6.25mg/L的5-HAA(图5)。

构建5-HTP生物合成的最后一步(图1中步骤3，最上游)是连接非原生下游部分途径与大肠杆菌原生新陈代谢。由于我们以前的工作已报道了在大肠杆菌中生产AA¹⁹，这里我们通过组合AA的生产和转化部分途径来优化来自葡萄糖的5-HAA生产。5-HAA的生物合成途径分为三个模块(图1)。模块1由salABCD组成，其催化由AA形成5-HAA；模块2是trpE^fbrG模块，其将分支酸转化为AA；而模块3是APTAG模块，其在莽草酸途径中表达四种酶(AroL，PpsA，TktA，AroG^fbr)以增加向分支酸合成的碳流量。

模块优化结果显示，当模块1在高拷贝数质粒(pZE-salABCD)中而模块2在低拷贝数质粒(pSA-trpE^fbrG)中(图6)时获得最高的5-HAA效价(224.31±8.89mg/L)。模块3的引入没有进一步改善该效价。此外，中间体AA在所有情况中积累，这指示即使由高拷贝数质粒表达，模块1仍然是限速步骤。

达到来自葡萄糖的5-HAA生产之后，我们试图组合整个途径以实现5-HTP的从头生产。用质粒pSA-trpE^fbrG、pZE-salABCD、以及pCS-trpDCBA转化tnaA敲除的大肠杆菌菌株BW1。将阳性转化子用于摇瓶实验。令我们惊讶的是，在培养24h之后，培养物中没有5-HTP积累，而产生205.14±6.71mg/L色氨酸。对于这种现象的一个解释是TrpDCBA显示出对AA比对5HAA更高的底物亲和性和比活性并且无需羟化，AA直接被转化为色氨酸。另一可能的解释是TrpE和TrpD已经演化形成异四聚体复合物以减少底物扩散²⁰。该酶复合物的形成可以防止SalABCD到达它的底物AA。

为了解决这一问题，然后我们开发了两步法用于生产5-HTP。首先，含有pSA-trpE^fbrG以及pZE-salABCD的大肠杆菌菌株BW3用于从葡萄糖生产5-HAA。24h后，离心除去细胞，上清液与等体积的含有pSA-trpDCBA以及pCA-trpDCBA的大肠杆菌菌株BW2的培养物混合。通过用氨苄青霉素抗性基因替换质粒pCS-trpDCBA的卡那霉素耐受性基因来构建质粒pCA-trpDCBA。进一步将产生的5-HAA转化为5-HTP，而最终效价可以达到98.09±3.24mg/L(图7)。此外，还产生了23.05±0.83mg/L色氨酸作为副产物，并且未观察中间体5-HI的积累。

方法

菌株、质粒以及培养基菌株以及质粒分别总结在表1和表2中。将大肠杆菌菌株XL1-Blue用作用于标准克隆以及质粒繁殖的宿主。将大肠杆菌菌株BW1、BW2、BW3用于体内测定以及5-HAA和5-HTP的生产。将卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani，LB)培养基用于接种体制备以及细胞繁殖。将改良的M9培养基用于5-HAA以及5-HTP的微生物合成。LB培养基包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物以及10g/LNaCl。改良的M9基本培养基包含10g/L葡萄糖、6g/LNa₂HPO₄，0.5g/LNaCl，3g/LKH₂PO₄，1g/LNH₄Cl，1mMMgSO₄，0.1mMCaCl₂，2g/L酵母提取物，2g/L柠檬酸钠以及100mg/L丝氨酸。当需要时，将氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素分别以100μg/mL、50μg/mL、34μg/mL添加到该培养基。

表1.此研究中使用的菌株。

CGSC*：大肠杆菌遗传库存中心(ColiGeneticStockCenter)

质粒构建将质粒pZE12-luc、pCS27、pSA74用于基因克隆、蛋白质表达、以及途径装配(林等，2013，《自然通讯》，4：2603)。基因salAB以及salCD从富养罗尔斯通氏菌基因组DNA中扩增。基因pqsA以及sdgC分别从铜绿假单胞菌和链霉菌属菌株WA46基因组DNA中扩增。基因trpDCBA从大肠杆菌基因组DNA中扩增。通过使用KpnI、BamHI、以及XbaI将salAB以及salCD亚克隆进质粒pZE12-luc中来构建质粒pZE-salABCD。使用相同的方法来构建质粒pZE-salABC。通过使用KpnI、NdeI、以及SphI将sdgC以及pqsA的片段插入pZE12-luc来构建质粒pZE-sdgC-pqsA。质粒pCS-trpE^fbrG在我们先前的研究中构建(孙等人，2013，《应用环境微生物学》，79：4024-4030)。通过使用KpnI以及BamHI将trpE^fbrG亚克隆进质粒pSA74中来构建pSA-trpE^fbrG。通过使用KpnI以及BamHI将trpDCBA基因插入pCS27以及pSA74来构建质粒pCS-trpDCBA和pSA-trpDCBA。通过用氨苄青霉素抗性标记替换pCS-trpDCBA的卡那霉素耐受性标记来构建质粒pCA-trpDCBA。质粒pCS-APTA在我们先前的研究中构建(林等人，2013，《自然通讯》，4：2603)。使用SacI以及SpeI将表达盒P_LlacO1-APTAPCR扩增并且插入质粒pCS-trpE^fbrG以及pSA-trpE^fbrG中，分别出产质粒pCS-trpE^fbrG-APTA以及pSA-trpE^fbrG-APTA。

表2.此研究中使用的质粒。

体内酶分析。实施体内分析以评价TrpDCBA和邻氨基苯甲酸5-羟化酶对它们底物的活性。用对应的质粒转化大肠杆菌BW25113衍生菌株。将新鲜菌落接种到3mL包含适当抗生素的LB培养基中，并且在37℃下有氧生长。将过夜培养物接种到20mLLB培养基中，并且使其在37℃下生长。当OD₆₀₀达到0.4，用0.25mMIPTG在30℃下诱导该培养物3h。细胞通过离心收集，并重悬在改良的M9培养基中。用对应的底物供给细胞悬液，并在振荡的情况下在30℃下孵育。在1h之后取出样品，并且用HPLC进行产物浓度测定。比活表示为μM/OD/h。对于生物转化实验，在若干时点将底物添加到细胞悬液中。每几个小时提取样本，并用于细胞生长和产物积累的分析。

5-HAA的微生物生产。用对应的质粒转化大肠杆菌菌株BW3。将过夜培养物接种到改良的包含适当抗生素的M9培养基中，并且在振荡的情况下在30℃下培养。当OD₆₀₀达到0.4，用0.25mMIPTG诱导该培养物，并在30℃下继续生长。每几个小时提取样本。测量OD₆₀₀值，并通过HPLC分析产物5-HAA和中间体。

5-HTP的微生物生产。我们尝试了两种不同的用于从葡萄糖生产5-HTP的方法。在第一种方法中，用质粒pZE-salABCD、pSA-trpE^fbrG、以及pCS-trpDCBA转化大肠杆菌菌株BW1。将过夜培养物接种到20mL包含氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素的改良的M9培养基中，并且使其在30℃下生长。当OD₆₀₀达到0.4，用0.25mMIPTG诱导该培养物。提取样本，并通过HPLC分析产物和中间体。第二种方法是一个两阶段的过程。首先，用质粒pZE-salABCD以及pSA-trpE^fbrG转化大肠杆菌菌株BW3。将过夜培养物接种到20mL包含氨苄青霉素、氯霉素的改良的M9培养基中，并且使其在30℃下生长。当OD₆₀₀达到0.4，用0.25mMIPTG诱导该培养物。在培养24h之后，通过离心收获培养物，而上清液与等体积的含有pCA-trpDCBA以及pSA-trpDCBA的菌株BW2的培养物(其已经用0.25mMIPTG诱导了3h)混合。这些新培养物继续在振荡的情况下在30℃下培养。每4个小时提取样本，并通过HPLC测定底物消耗和产物和中间体积累。

HPLC分析。水杨酸、GA、AA、5-HAA、色氨酸、5-HTP、5-HI购自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)或者阿克罗斯有机物(AcrosOrganics)并且被用作标准品。通过装有反相ZORBAXSB-C18柱和Ultimate3000光电二极管阵列检测器的HPLC(戴安公司(Dionex)，Ultimate3000)分析和定量标准品和样品。溶剂A是含有0.2％三氟醋酸的水，而溶剂B是甲醇。柱温度设定在28℃。在1ml/min的流速下使用以下梯度：5％至50％溶剂B，持续15min；50％至5％溶剂B，持续1min；以及5％溶剂B，持续另外4min。各化合物的定量是基于在特定波长(水杨酸303nm，GA331nm，AA330nm，5-HAA297nm，色氨酸275nm，5-HTP276nm，5-HI271nm)的吸光度处的峰面积。

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已经仅出于清晰理解的目的给出前述发明详述和实例。不应从中理解为不必要的限制。本发明不局限于所显示和描述的这些精确细节，对于本领域普通技术人员而言，变体将明显地包含在由权利要求所限定的本发明之内。

除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所使用的表示组分的量、分子量等等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非另外指明是相反的，在说明书以及权利要求书中所列举的这些数值参数是近似值，可以取决于寻求由本发明所获得的所希望的特性而改变。最低限度并且不试图限制等效物原则应用到本权利要求书的范围，每一个数值参数至少应该按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入方法来解释。

虽然描述本发明的宽泛范围的数字范围和参数是近似值，但是在特定实例中列出的数值被尽可能地精确地报道。然而，全部数值内在地含有因其相应的检验度量中存在的标准偏差而必然产生的范围。

在本申请的披露内容和通过引用方式结合在此的任何文献的披露内容之间存在任何不一致性的情况下，本申请的披露内容应当占据主导。

全部标题旨在方便读者并且不应当用来限制该标题后续文本的意思，除非如此说明。

在此引用的所有专利、专利申请(包括临时专利申请)、以及出版物(包括专利出版物和非专利出版物)和电子可得材料(包括，例如，提交到例如，GenBank和RefSeq中的核苷酸序列，以及提交到例如，SwissProt，PIR，PRF，PDB中的氨基酸序列，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)的完整披露通过引用结合。

Claims

1.一种用于生产5-羟色氨酸(5-HTP)的微生物系统，该系统包括多个基因工程化细胞，这些细胞包括：

一种第一基因工程化细胞，包括(i)至少一种莽草酸途径酶，(ii)至少一种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶，以及(iii)至少一种具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶，该酶进一步具有对非天然邻氨基苯甲酸(AA)底物的活性；以及

一种第二基因工程化细胞，包括至少一种具有色氨酸生物合成活性的酶，其中该酶催化邻氨基苯甲酸(AA)转化为色氨酸并且进一步具有对非天然5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)底物的活性。

2.如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶催化AA的5-羟化以产生5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)。

3.如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有色氨酸生物合成活性的酶催化5-HAA转化为5-HTP。

4.如权利要求1所述的微生物系统，其中该至少一种莽草酸途径包含莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶以及3-脱氧-D-阿糖庚酮醛酸7-磷酸(DAHP)合酶。

5.如权利要求4所述的微生物系统，其中该第一细胞包括多种大肠杆菌莽草酸途径酶。

6.如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶包括大肠杆菌TrpEG。

7.如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶包括由存在于低拷贝数质粒中的trpE^fbrG编码的反馈抑制突变体酶。

8.如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶包括富养罗尔斯通氏菌H16水杨酸5-羟化酶。

9.如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括至少一种载体，该至少一种载体可操作地编码莽草酸途酶、具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶、以及具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶中的至少一种。

10.如权利要求9所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括多种载体，其中该多种载体各自可操作地编码莽草酸途酶、具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶、以及具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶中的至少一种。

11.如权利要求10所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括可操作地编码至少一种莽草酸途酶的第一载体，可操作地编码具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶的第二载体，以及可操作地编码具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶的第三载体。

12.如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括可操作地编码具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶的高拷贝数质粒。

13.如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括可操作地编码具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶的低拷贝数质粒。

14.如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括可操作地编码莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶以及DAHP合酶的质粒。

15.如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有色氨酸生物合成活性的酶包括大肠杆菌TrpDCBA。

16.如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一和第二细胞是细菌细胞。

17.如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一和第二细胞是大肠杆菌细胞。

18.如权利要求1所述的微生物系统，其中该至少一种酶对于该第一或第二细胞是异源性的。

19.如权利要求1所述的微生物系统，其中该至少一种酶天然存在于该第一或第二细胞中。

20.如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一细胞被基因工程化以减少或消除分支酸生物合成、邻氨基苯甲酸生物合成或者两者的反馈抑制。

21.如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一细胞被基因工程化以将碳流重新引向分支酸生物合成、邻氨基苯甲酸生物合成或者两者。

22.一种基因工程化细胞，包括

至少一种莽草酸途径酶；

可操作地编码至少一种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶的载体；以及

可操作地编码至少一种具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶的载体，该酶进一步具有对非天然邻氨基苯甲酸(AA)底物的活性。

23.一种用于制造5-羟色氨酸(5-HTP)的方法，该方法包括：

在一定的条件下培养一种第一基因工程化细胞并持续足以生产5-HAA的时间，该第一基因工程化细胞包括(i)至少一种莽草酸途径，(ii)至少一种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶，以及(iii)至少一种具有水杨酸5-羟化酶(S5H)活性的酶，该酶进一步具有对非天然邻氨基苯甲酸(AA)底物的活性；并且

在5-HAA存在下在一定的条件下培养一种第二基因工程化细胞并持续足以生产5-HTP的时间，该第二基因工程化细胞包括至少一种具有色氨酸生物合成活性的酶，其中该酶催化邻氨基苯甲酸(AA)转化为色氨酸并且进一步具有对非天然5-羟基邻氨基苯甲酸(5-HAA)底物的活性。

24.如权利要求23所述的方法，进一步包括在用该5-HAA培养该第二细胞之前，将该第一细胞与该5-HAA分开。

25.如权利要求23所述的方法，其中培养该第一细胞生产包含该5-HAA的上清液。

26.如权利要求23所述的方法，其中该第一和第二细胞以共培养方式同时培养。

27.如权利要求23所述的方法，其中该第一细胞是在葡萄糖的存在下培养的。

28.如权利要求23所述的方法，进一步包括分离该5-HTP。