CN102884179A - 用于制备l-高丙氨酸的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请第61/308,746号(2010年2月26日提交)的优先权,在此将其全部内容引用作为参考。
发明领域
本发明提供用于合成诸如L-高丙氨酸等化合物的方法和材料,该方法包括利用微生物宿主和重组分子进行的步骤。
发明背景
对于医疗保健成本的显著增加已经在世界范围内成为明显的负担,其中许多病人由于药物治疗的高价格而拒绝采用药物治疗。手性药物和药物中间体的生物合成提供了解决这样问题的环境友好型方法,例如,通过提供用于制备治疗剂以及用于制备这样的试剂的中间体和/或前体的成本有效的方法。
L-高丙氨酸是非天然氨基酸,其是用于合成一些重要药物的关键手性中间体(图1A)。例如,其可以被转变成S-2-氨基丁酰胺,S-2-氨基丁酰胺是抗癫痫药物左乙拉西坦(levetiracetam)和布瓦西坦(brivvaracetam)的直接前体。L-高丙氨酸还可以被转变为S-2-氨基丁醇,S-2-氨基丁醇是用于合成抗结核病化合物乙胺丁醇(ethambutol)的化学中间体。用于合成治疗化合物诸如左乙拉西坦和乙胺丁醇的方法必须克服多个技术难题。例如,对于治疗安全性和效率而言,这些药物的光学纯度是非常关键的。左乙拉西坦的R-对映体没有抗癫痫活性(参见,例如Shorvon等人,(2002)Journal of Neurology,Neurosurgery,and Psychiatry 72(4):426429)以及乙胺丁醇的(R,R)-型可以导致失明(参见,例如Breuer M等人(2004)Angewandte Chemie InternationalEdition 43(7):788-824)。
尽管乙胺丁醇和左乙拉西坦现在普通药物,但在许多国家仅一个月提供量所花费的成本就超过了整个一年的人均卫生支出(参见,例如Moore-Gillon J(2001)Ann N Y Acad Sci 953:233–240)。禁用药物的价格已经导致了全球性的医疗保健问题。例如,在全世界癫痫影响了超过5千万人,但大多数患者无法承受左乙拉西坦治疗,他们必须采用更便宜但是不太有效的备选药物,诸如苯巴比妥(参见,例如Scott等人,(2001)B World HealthOrgan 79:344–351)。降低药物成本以使得它们更为广泛地可获得的一种方法涉及L-高丙氨酸合成的经济划算的方法(例如,减小诸如左乙拉西坦化合物的生产成本)。
目前,大多数天然L-氨基酸利用葡萄糖通过微生物发酵来生产(参见,例如Ikeda M(2002)Adv Biochem Eng Biot 79:1–35)。尤其是,每年生产超过两百万吨的L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸(参见,例如Leuchtenberger等人(2005)Appl Microbiol Biotechnol 69(1):1–8)。与制备天然L-氨基酸的方法相比,非天然氨基酸的商业级制备通常较为复杂并且不是环境友好的。在现有技术的一种方法中,通过转氨酶或脱氢酶将化学合成的2-酮酸类不对称地转变为光学纯的非天然氨基酸(参见,例如Leuchtenberger等人(2005)ApplMicrobiol Biotechnol 69(1):1–8;Taylor等人(1998)Trends Biotechnol16(10):412–418)。使用酶诸如酰基转移酶或酰胺酶的另外的方法用于转化非天然氨基酸的外消旋混合物(参见,例如Leuchtenberger等人(2005)ApplMicrobiol Biotechnol 69(1):1–8)。
例如由于非天然氨基酸(诸如L-高丙氨酸)在制备大量有价值的治疗化合物中的作用,在本领域中需要有利于非天然氨基酸(诸如L-高丙氨酸)的经济划算且环境友好的生物合成的方法和材料。但是与天然氨基酸不同,利用简单的糖实现非天然氨基酸的完全生物合成涉及巨大的技术难题。例如,在一个环境友好型和经济划算的方法中,改变了生物的代谢途径以扩展生物的生物合成能力(参见,例如Zhang等人(2008)Proc Natl Acad Sci USA105(52):2065320658)。在这类方法中,随后改变的代谢途径促进诸如非天然氨基酸这样的目标化合物的生成或直接生成诸如非天然氨基酸这样的目标化合物(参见,例如Causey等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA100(3):825-832)。但不幸的是,设计用于改变生物的代谢途径的任何操作的结果是不可预测的,并且这样的努力通常需要大量的蛋白质进化(参见,例如Arnold FH(2001)Nature 409(6817):253257)。
发明简述
本文中描述的发明的实施方式提供用于生物合成非天然氨基酸L-高丙氨酸的方法和材料。L-高丙氨酸是大量药学有价值的化合物的手性前体,该化合物包括抗惊厥药物左乙拉西坦和布瓦西坦,以及用于治疗结核病的细菌抑制型抗分支杆菌药物乙胺丁醇。本发明的实施方式包括组合物,该组合物包括修饰的多肽和/或微生物和/或L-高丙氨酸。
如下述实施例所说明的,使用了选择的策略来产生重组的谷氨酸脱氢酶(“GDH”)多肽。这些重组的多肽显示如下性质,该性质促进使用它们来制备L-高丙氨酸的过程,例如关于2-酮丁酸的特异性常数kcat/Km比2-酮戊二酸的特异性常数高50倍。本文中公开的重组的谷氨酸脱氢酶多肽可以用于经济划算地合成商业上显著量的L-高丙氨酸的方法。在本发明的一个示例性实施方案中,在高苏氨酸生产大肠杆菌菌株中结合表达重组的谷氨酸脱氢酶和枯草芽孢杆菌苏氨酸脱水酶蛋白质(ATCC98082,ΔrhtA),其显示利用30g/L葡萄糖产生5.4g/L L-高丙氨酸(0.18g/g葡萄糖收率,理论最大值的26%)。
本文中公开的发明具有多种实施方式。示例性的实施方式包括具有2-酮丁酸的特异性常数kcat/Km大于其2-酮戊二酸的特异性常数的谷氨酸脱氢酶多肽。本发明的典型的实施方式为组合物,其包括与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的谷氨酸脱氢酶多肽,以及该谷氨酸脱氢酶多肽还包括在残基位点K92和/或T195的氨基酸取代突变(例如K92V和T195S)。在本发明的一些实施方式中,与SEQ ID NO:1的野生型谷氨酸脱氢酶多肽相比,该谷氨酸脱氢酶多肽还包括至少2~10个取代、缺失或插入突变。例如任选地,谷氨酸脱氢酶多肽包括如下氨基酸取代突变中的至少一种,该氨基酸取代突变包括K92L、K92V、T195S、T195A、V377A或S380C。本发明的相关的实施方式是分离的与SEQ ID NO:2具有至少95%同一性的谷氨酸脱氢酶多核苷酸,其编码在氨基酸位点K92、T195、V377或S380具有至少一个突变的谷氨酸脱氢酶多肽;以及进一步其对于2-酮丁酸的特异性高于对于2-酮戊二酸的特异性。
本发明的实施方式包括如下组合物,该组合物包括与生物诸如大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌结合的本文中公开的谷氨酸脱氢酶多肽。在典型的实施方式中,利用编码本文公开的谷氨酸脱氢酶多肽的表达载体转化大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌生物。在本发明的一些实施方式中,生物为大肠杆菌菌株,其生产相对高水平的苏氨酸,例如在营养培养基中通过30g/L葡萄糖产生至少2、3、4、5、6、7或8g/L苏氨酸的菌株。在本发明的一些实施方式中,选择在代谢途径中的一个或多个基因中具有突变的生物,例如在SEQ ID NO:5的rhtA多肽中包括突变的大肠杆菌菌株,该突变导致与野生型rhtA多肽相比苏氨酸输出活性降低。在本发明的一些实施方式中,生物还过表达一种或多种多肽与本文所公开的谷氨酸脱氢酶多肽。在一个示例性实施方式中,利用编码本文所公开的GDH的表达载体以及编码苏氨酸脱水酶多肽的表达载体转化生物,该苏氨酸脱水酶多肽与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95%同一性。在本发明另外的实施方式中,用于改变生物代谢途径的多个多肽的基因被编码在一个表达载体上。任选地,在营养培养基中,生物可以合成浓度至少1、2、3、4或5g/L的L-高丙氨酸。
本发明的实施方式包括用于制备L-高丙氨酸的方法。本发明的一个示例性实施方式为制备L-高丙氨酸的方法,其包括:在营养培养基中放置大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌生物,其中该生物包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性并且还包括在残基位点K92或T195的氨基酸取代突变的谷氨酸脱氢酶多肽。然后在营养培养基中,在允许生物合成L-高丙氨酸的条件下培养该生物。通常在此类方法中使用的谷氨酸脱氢酶多肽与SEQ ID NO:1的野生型谷氨酸脱氢酶多肽相比,进一步包括至少2-10个取代、缺失或插入突变。在本发明的一些实施方式中,生物是大肠杆菌,其在SEQ ID NO:5的rhtA多肽中包括突变,该突变导致与野生型SEQ ID NO:5相比苏氨酸输出活性降低。在本发明的一些实施方式中,利用表达载体转化生物,该表达载体编码与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95%同一性的苏氨酸脱水酶多肽。
在本发明典型的实施方式中,生物在下述条件中的至少一种下生长:30-40°C的温度;至少4小时~至少48小时的时间周期;6-8的pH;和/或在包括例如M9、LB、F1或TB培养基的营养培养基中。在一个示例性实施方式中,营养培养基包括M9培养基;以及生物为选择的在M9培养基中通过30g/L葡萄糖能够产生至少2、3、4、5、6、7或8g/L苏氨酸的大肠杆菌菌株。通常地,在这些方法中,在营养培养基中生物可以制备浓度至少为1、2、3、4或5g/L的L-高丙氨酸。
用于制备L-高丙氨酸的方法的一些实施方式还包括纯化和/或化学改性本文所公开的L-高丙氨酸的步骤。例如,本发明的一些实施方式包括至少一个包括分离的用于制备L-高丙氨酸的生物的细胞(例如,营养培养基中的生物)的纯化步骤。本发明的其它实施方式可以包括至少一个纯化步骤,该纯化步骤包括离心分离用于制备L-高丙氨酸的分离的生物的细胞或细胞裂解物。其它实施方式可以包括至少一个纯化步骤,该纯化步骤包括对在培养基中存在的用于制备L-高丙氨酸的一种或多种化合物(例如,L-高丙氨酸本身)进行沉淀。实施方式可以包括至少一个纯化步骤,该纯化步骤包括对存在于营养培养基中的一种或多种化合物(例如,L-高丙氨酸)进行过滤和/或浓缩。实施方式可以包括至少一个纯化步骤,该纯化步骤包括对存在于营养培养基中的一种或多种化合物(例如,L-高丙氨酸)进行色谱分离。本发明的相关的实施方式进一步包括如下方法步骤,其中根据本发明的实施方式制备的L-高丙氨酸组合物被化学改性,例如通过在L-高丙氨酸上进行诸如酰胺化或还原反应这样的化学反应,从而进一步生产其它化合物,诸如S-2-氨基丁酰胺、S-2-氨基丁醇、左乙拉西坦、布瓦西坦或乙胺丁醇。
本发明的实施方式包括生产制品(articles of manufacture)和/或设计用于促进本发明方法的试剂盒。通常,此类试剂盒包括根据本发明的方法使用其中的元件的说明书。此类试剂盒可以包括被划分的运载方式以在封闭的区域内接受一种或多种容器,该容器诸如罐、管等,每个容器包括用于本发明的分离的元件中的一种。容器中的一种可以包括罐,该罐例如含有编码本文所公开的多肽的表达载体,例如编码具有改变的底物特异性的谷氨酸脱氢酶多肽的载体。任选地,将表达载体转化至生物(诸如大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌)中以促进它们生产L-高丙氨酸。本发明的一个示例性实施方式是用于合成L-高丙氨酸的试剂盒,该试剂盒包括:编码与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性并且包括在残基位点K92或T195的氨基酸取代突变的谷氨酸脱氢酶多肽的表达载体。通常地,试剂盒包括针对表达载体的容器。任选地,试剂盒还包括编码与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95%同一性的苏氨酸脱水酶多肽的表达载体和/或活的大肠杆菌菌株(例如过表达苏氨酸的大肠杆菌菌株和/或在SEQ ID NO:5的rhtA多肽中包括突变且从而导致与野生型rhtA多肽相比苏氨酸输出活性降低的大肠杆菌菌株)。
参考下述详细的说明,对于本领域技术人员而言本发明的其它目的、特征和优点将变得明显。应当理解虽然详述了本发明以及具体的实施例,但是本发明指出的一些实施方式是以示例的形式给出的,不意在限制。在本发明的范围内可以进行多种变化和变形,只要不脱离本发明的精神,并且本发明包括此类变形。
附图说明
图1说明合成L-高丙氨酸和相关化合物的示例性途径和过程。图1A示出了由手性中间体L-高丙氨酸到抗癫痫和抗结核病药物的化学合成路径。图1B示出了L-高丙氨酸发酵的非天然代谢途径。基因操作的E.coli能够利用葡萄糖过量生产天然氨基酸苏氨酸。通过苏氨酸脱水酶将苏氨酸转变为2-酮丁酸。然后,通过氨化由2-酮丁酸合成L-高丙氨酸。图1C示出了通过葡萄糖生物合成手性代谢物R-2-羟基丁酸和S-2-氨基丁酸的示例性步骤。图1D示出了利用R-2-羟基丁酸和S-2-氨基丁酸对应选择地合成开浦兰的示例性步骤。
图2是比较生产L-高丙氨酸的不同的氨化酶的图。在添加了10g/L 2-酮丁酸的M9培养基中接种E.coli培养物,在37°C温育了24小时。横坐标如下定义:(A)野生型E.coli BW25113;过表达(B)转氨酶IlvE;(C)来自阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的缬氨酸脱氢酶;(D)来自天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)的缬氨酸脱氢酶;(F)进化的(evolved)谷氨酸脱氢酶GDH1;以及(G)进化的谷氨酸脱氢酶GDH2。误差棒表示三次独立实验的标准偏差。
图3说明了针对2-酮丁酸的氨化进化谷氨酸脱氢酶(GDH)的选择策略。图3A示出了野生型GDH直接将氨同化为谷氨酸。图3B示出了从染色体中敲除转氨酶基因avtA和ilvE使得野生型E.coli为缬氨酸营养缺陷,这可以通过在氨化2-酮异戊酸上具有活性的突变GDH来补足。图3C示出了2-酮丁酸在化学方面与缬氨酸前体、2-酮异戊酸类似。对于2-酮异戊酸具有活性的突变GDH可能对于2-酮丁酸具有活性。
图4示出了用于进化的GDH库的构建。图4A说明了共生梭菌(Clostridium symbiosum)谷氨酸脱氢酶(PDB:1BGV)与其天然底物谷氨酸结合的结合口袋。残基K89、T193、V377和S380位于谷氨酸γ-碳的半径内。图4B示出了C.symbiosum和E.coli GDH的序列比对。结合口袋是保守的,E.coli GDH相应的残基为K92、T195、V377和S380。可以对这些残基进行随机化NNK密码子的定点饱和突变。将大小为两百万成员的库转化至缬氨酸营养缺陷型E.coli并筛选在M9基本培养基中生长的突变体。图4C是示出E.coli(ΔavtA,ΔilvE)转化子在基本培养基中的生长曲线的图。-Val表示不存在缬氨酸。+Val表示存在缬氨酸。或转化有GDH1(K92L、T195A、V377A和S380C突变)或GDH2(K92V和T195S突变)突变的细胞。在不存在缬氨酸的基本培养基中细胞不生长,但GDH突变可以在不添加缬氨酸的情况下挽救细胞生长。
图5示出了说明利用E.coli菌株和苏氨酸脱水酶不同组合生产L-高丙氨酸的突变。图5A是具有如下定义的横坐标的图:(1)BW25113;(2)过表达GDH2的BW25113;(3)过表达TdcB&GDH2的ATCC98082;(4)过表达IlvAEC&GDH2的ATCC98082;(5)过表达IlvABS&GDH2的ATCC98082;以及(6)过表达IlvABS和GDH2的ATCC98082(ΔrhtA)。图5B是示出通过葡萄糖生物合成L-高丙氨酸的收率的图。误差棒表示三次独立实验的标准偏差。
图6是说明野生型和突变谷氨酸脱氢酶的动力学常数的表。
图7是说明用于质粒构建的合成寡核苷酸的表。
图8是说明在OD600(600nm处的光学密度)处的E.coli菌株生长时间进程曲线。在33°C条件下,在生产培养基中温育细胞。圆圈表示具有pZS_thrO的野生型菌株ATCC98082;方形表示具有pZS_thrO和pZElac_ilvABS_GDH的最佳生产菌株ATCC98082(ΔrhtA)。误差棒表示三次独立实验的标准偏差。
图9是说明L-高丙氨酸生产的时间进程曲线。方形表示L-高丙氨酸浓度;圆圈表示剩余的葡萄糖浓度。误差棒表示三次独立实验的标准偏差。
图10示出了理论配比矩阵A。矩阵A是理论配比矩阵且V是包括在每个反应中的通量向量(vector of flux)。矩阵A的行表示每个代谢物,矩阵A的列表示考虑的每个反应(或总反应(lumped reaction))。
图11示出了向量矩阵B。矩阵B是包括负葡萄糖输入和零的向量。矩阵B的行表示每个代谢物。
图13是总结了由葡萄糖生产高丙氨酸的理论收率的表。该表示出对于两个变量的不同组合最大理论收率的结构。假设:1)不包括TCA循环中来自琥珀酸脱氢酶来源的UQH2的能量产生。2)假设磷酸戊糖途径的非氧化分支为3R5P→2F6P+GA3P。
图14是说明在发酵罐(5L)中生产L-高丙氨酸的图。
图15是说明从发酵液纯化L-高丙氨酸方法的实施方式示意性流程图。
发明详述
在本文中描述的或参考的技术或步骤通常被本领域技术人员很好地理解并且通常可以采用常规的方法来进行。适当地是,除非另有说明,涉及使用可商购的试剂盒和试剂的步骤通常是根据制造商确定的规程和/或参数来进行的。除非另外限定,本文中所使用的领域中的所有术语、符号和其它具体术语意在具有本发明所属的领域的技术人员所理解的通常含义。在一些情况中,为了清楚和/或马上参考,在本文中对具有通常理解的含义的术语进行了限定,不需要分析本文中此类定义的内含物认为其与本领域中通常理解的含义具有实质地区别。
在本文和权利要求中,单数形式的"a"、"an"和"the"包括复数个指示物,除非在上下文中有清楚地指示。因此,例如,"多核苷酸"包括多个这样的多核苷酸,"微生物"包括一个或多个微生物,等等。
相应地,代谢方面"设计的(engineered)"或"修饰的(modified)"微生物如下制备:通过向选择的宿主或亲本微生物中导入遗传学物质从而修饰或改变微生物的细胞生理学和生物化学。通过导入遗传学物质的亲本微生物获得了新的性质,例如生产新的胞内代谢物的能力,或生产更大量的胞内代谢物的能力。在示例性的实施方式中,向亲本微生物中导入遗传学物质导致生产诸如L-高丙氨酸这样的氨基酸的新的能力或经改变的能力。导入到亲本微生物中的遗传学物质包括基因(一个或多个)或基因的部分(编码一种或多种涉及用于生成氨基酸的生物合成途径的酶(例如,本文所公开的修饰的谷氨酸脱氢酶)),以及还可以包括用于表达和/或调节这些基因表达的额外的元件,例如启动子序列。
任选地或除了向宿主或亲本微生物中导入遗传学物质之外,设计的或修饰的微生物还可以包括分裂、缺失或敲除基因或多核苷酸以改变微生物的细胞生理学和生物化学。通过基因或多核苷酸的减少、分裂或敲除,微生物获得了新的或经改善的性质(例如,生产新的胞内代谢物的能力或生产更大量的胞内代谢物的能力,改善代谢物流流向期望的途径和/或减少不期望的副产物的生成)。
修饰本文所提供的微生物以提供在亲本微生物中所无法提供的量的代谢物。"代谢物"是指通过代谢生产的任何物质或对于特定代谢过程是必须的物质或参加特定的代谢过程的物质。代谢物可以为是代谢原料的有机化合物(例如,葡萄糖)、和代谢中的中间产物(例如,2-酮丁酸)、或代谢的终产物(例如,L-高丙氨酸)。代谢物可以用于构建更为复杂的分子,或它们可以被降解称为更简单的分子。可以通过其它代谢物合成中间代谢物,并可能由于制备更为复杂的物质,或降解为更为简单的化合物,通常伴随这化学能量的释放。
本公开识别了用于本公开方法、组合物和生物中的特定基因;但应当认知的是不必须与该基因具有绝对的同一性。例如,在特定基因或多核苷酸中的改变包括能够操作并筛选到活性的编码多肽或酶的序列。通常,此类改变包括保守突变和沉默突变。可以使用本领域已知的方法针对功能酶的表达来筛选这样修饰的或突变的多核苷酸和多肽。
"编码序列"例如可以为"编码"特定的基因,诸如谷氨酸脱氢酶基因的序列。编码序列是当在合适的调节序列的控制下,在体外或体内将核酸序列转录(在DNA情况下)和翻译(在mRNA情况下)成多肽的核酸序列。通过在5'(氨基)末端的起始密码子和在3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定编码序列的边界。转录终止序列通常位于编码序列的3'侧。
DNA"控制序列"总体上指启动子序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节区、增强子等,其共同地提供宿主细胞中的编码序列的转录和翻译。在本文中使用的术语"启动子"是指含有在期望的宿主微生物中引发可操作连接的核酸序列转录的元件的核苷酸序列。至少,启动子包含RNA聚合物结合位点。其还可以含有一个或多个增强子元件(其由定义可知增强转录)、或一个或多个控制启动子状态的开/关的调节元件。当将E.coli用作宿主微生物时,代表性的E.coli启动子包括但不限于:β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(参见Chang等人,Nature 275:615-624,1978);SP6、T3、T5和T7 RNA聚合酶启动子(Studier等人,Meth.Enzymol.185:60-89,1990);以及λ启动子(Elvin等人,Gene 87:123-126,1990);trp启动子(Nichols和Yanofsky,Meth.in Enzymology 101:155-164,1983);以及Tac和Trc启动子(Russell等人,Gene 20:231-243,1982)。当使用酵母作为宿主微生物时,示例性的酵母启动子包括3-磷酸甘油酸激酶启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、半乳糖激酶(GAL1)启动子、半乳糖差向异构酶启动子和醇脱氢酶(ADH)启动子。适合用于在其它类型的微生物中驱动基因表达启动子在本领域中也是已知的。
"可操作连接"是指对元件进行的布置,其中所描述的组分被设置为可以发挥它们通常的功能。因此可操作连接连接至编码序列的控制序列能够有效地表达编码序列。不需要控制序列紧挨着编码序列,只要其可以发挥引导表达的功能即可。
由于遗传密码的固有简并性,其他编码基本上相同或功能上等价的多肽的多核苷酸也可以用于克隆或表达编码该酶的多核苷酸。如果编码某蛋白质的核酸序列具有与编码第二蛋白质的核酸序列的相似的序列,则该蛋白质与第二蛋白质具有"同源性"或是"同源的"。备选地,如果两个蛋白质具有"相似的"氨基酸序列则蛋白质与第二蛋白质具有同源性。(因此,定义术语"同源的蛋白质"是指具有相似的氨基酸序列的两个蛋白质)。
本领域的技术人员应当理解,修饰编码序列以提高其在特定宿主中的表达可以是有利的。遗传密码冗余64个可能的密码子,但是大部分生物使用这些密码子的亚群。在物种中最经常使用的密码子被称为最优密码子,那些不经常使用的密码子被分类为少或低利用的密码子。可以替换密码子以反映宿主优选使用的密码子,有时称该过程为"密码子优化"或"控制物种密码子偏好性"。
可以制备含有特定的原核或真核宿主优选的密码子的经优化的编码序列(另外参见Murray等人(1989)Nucl.Acids Res.17:477-508),例如,增加翻译率或产生具有期望性质的重组的RNA转录,例如与由未优化的序列产生的转录相比,具有更长的半衰期。还可以修饰翻译终止密码子以反映宿主的喜好。例如酿酒酵母和哺乳动物通常的终止密码子分别为UAA和UGA。单子叶类植物通常的终止密码子为UGA,而昆虫和E.coli通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin等人(1996)Nucl.Acids Res.24:216-218)。例如在美国专利第6,015,891号中提供了在植物中针对表达优化核苷酸序列的方法,在此引用作为参考。
本领域的技术人员将会认识到由于遗传密码的简并性,核苷酸序列不同的大量DNA化合物可以用于编码本公开给定的酶。本文中涉及的编码上述生物合成酶的天然DNA序列仅用来说明本公开的实施方式,以及本公开包括编码用于本公开方法的多肽和酶蛋白质的氨基酸序列的任何DNA化合物。类似地,在不损失或显著损失期望的活性的条件下,多肽在其氨基酸序列中可以允许一个或多个氨基酸取代、缺失和插入。除了在本文中描述的特定的蛋白质之外,本公开包括具有不同氨基酸序列的多肽,只要该多肽的修饰形式或变体多肽具有涉及的多肽的酶合成代谢活性或催化活性即可。另外,本文中示出的由DNA序列编码的氨基酸序列仅用于说明本公开的实施方式。
如本文所使用的,当氨基酸序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性时,两个蛋白质(或蛋白质区域)为基本上同源的。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比,针对优化比较的目的,对序列进行比对(例如,可以向第一和第二氨基酸或核酸序列中引入裂隙以优化比对,以及出于比较的目的可以忽略非同源序列)。在一个实施方式中,出于比较目的,比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30%、通常至少40%、更通常至少50%、甚至为更通常地至少60%、以及更通常地至少70%、80%、90%、100%。然后比较在相应的氨基酸位点或核酸位点的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位点被与第二序列相应位点相同的氨基酸残基或核苷酸占据时,则在该位点分子是相同的(如本文所使用的氨基酸或核酸"同一性"与氨基酸或核酸的"同源性"是等价的)。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位点的数量的函数,考虑裂隙的数量和每个裂隙的长度,需要将其引入到两个序列的优化比对中。在本文中列出的基因和多肽/酶的序列可以容易地利用World-Wide-Web(参见例如,http:(//)eecoli.kaist.ac.kr/main.html)提供的数据库来进行鉴定。此外,使用本领域通常使用的算法可以容易地比较氨基酸序列和核酸序列的同一性。
当针对蛋白质或肽使用"同源的"时,认为不相同的残基位点通常由于保守氨基酸取代而造成。"保守氨基酸取代"是其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如,电性或疏水性)的侧链(R基团)的其他氨基酸所取代的取代。通常来说,保守氨基酸取代不会显著改变蛋白质的功能性质。在两个或氨基酸序列的不同是由于保守取代导致的情况下,可以依据取代的保守性来向上调节序列同一性百分比或同源性度。进行这样的调节的手段对于本领域技术人员而言是已知的。
下述六组均为含有彼此为保守取代的氨基酸:1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
多肽的序列同源性(也称为序列同一性百分比)通常使用序列分析软件来测定。参见例如,Genetics Computer Group (GCG),University of WisconsinBiotechnology Center,910 University Avenue,Madison,Wis.53705的序列分析软件包。蛋白质分析软件利用分配给不同的取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的同源性的量度(measure)来匹配相似的序列。例如,GCG包含如下程序:诸如可以利用缺省参数的"Gap"和"Bestfit"能够确定紧密相关的多肽(诸如来自不同的生物物种的同源的多肽或野生型蛋白质和其突变体)的序列同源性或序列同一性。参见例如,GCG Version 6.1。
用于将含有大量来自不同生物的序列的数据库与分子序列进行比较的常用算法为计算机程序BLAST(参见,例如Zhang等人(1997)Genome Res.7:649-656;Morgulis等人(2008)Bioinformatics 15:1757-1764;以及Camacho等人(2008)BMC Bioinformatics 10:421 Ye等人(2006)Nucleic Acids Res.34:W6-W9;以及Johnson等人(2008)Nucleic Acids Res.36:W5-W9),尤其是blastp或tblastn(参见,例如Altschul等人,Nucleic Acids Res.1997 September1;25(17):3389-3402)。BLASTp的常用参数为:期望值:10(缺省);过滤器:seg(缺省);打开裂隙的成本:11(缺省);延伸裂隙的成本:1(缺省);最大比对:100(缺省);字符大小:11(缺省);描述的编号:100(缺省);罚款矩阵:BLOWSUM62。
当在含有大量来自不同生物的序列的数据库中搜索时,通常比较氨基酸序列。使用氨基酸序列搜索的数据库可以利用除blastp之外的本领域已知的算法来进行。例如可以使用FASTA(GCG Version 6.1中的程序)来比较多肽序列。FASTA提供了在询问和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(参见例如,Pearson等人,Methods Enzymol.1990;183:63-98,在此作为参考引入)。例如可以使用具有缺省参数的FASTA(字符大小2和PAM250得分矩阵)来确定氨基酸序列之间的序列同一性百分比,如GCGVersion 6.1所提供的,在此作为参考引入。
应当理解在可以对一系列的微生物进行修饰以包含适合用于生产L-高丙氨酸的代谢途径。还应当理解多种微生物可以用作编码目标酶的遗传学物质的"源",该目标酶适合用于本文所提供的重组的微生物。术语"微生物"包括来自古细菌、细菌和真核生物域的原核和真核微生物物种,后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高级原生生物。术语"微生物细胞"可以与术语微生物互换使用。在本发明典型的实施方式中,微生物为大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
在本文中互换使用的术语"蛋白质"或"多肽",包括一个或多个被称作氨基酸的化学基本组件(chemical building block)的链,其通过被称为肽键的化学键彼此连接。"酶"表示完全由或大部分由蛋白质构成的催化或促进(或多或少特异地)一种或多种化学或生物反应的任何物质。术语"酶"还可指催化性的多核苷酸(例如,RNA或DNA)。"天然的"或"野生型"蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞表示在自然界中存在的蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞。
应当理解上述描述的多核苷酸包括"基因",以及上述描述的核酸分子包括"载体"或"质粒"。相应地,术语"基因"(也称为"结构基因")是指编码特定的氨基酸序列的多核苷酸,该氨基酸序列包括一种或多种蛋白质或酶的全部或部分,以及还包括确定例如在条件下哪个基因被表达的调节性(非转录)DNA序列,诸如启动子序列。基因的转录区域可以包括未翻译的区域(包括内含子、5'-未翻译区域(UTR)和3'-UTR)以及编码序列。术语"核酸"或"重组的核酸"是指多核苷酸,诸如脱氧核糖核酸(DNA),以及适当地诸如核糖核酸(RNA)。涉及核酸序列的术语"表达"是指基因的转录,由此适当地将得到的mRNA转录本翻译成蛋白质。因此,根据上下文清楚的是,蛋白质的表达是开放阅读框序列的转录和翻译的结果。
术语"操纵子"是指由普通启动子被转录为单转录单元的两个或多个基因。在一些实施方式中,包括操纵子的基因是邻近基因。应当理解通过修饰普通的启动子可以改变整个操纵子的转录(即增强、减少或消除)。备选地,可以修饰操纵子中的任何基因或基因的组合以改变编码的多肽的功能或活性。该修饰可以使编码的多肽的活性增加。另外,该修饰赋予编码的多肽新的活性。示例性的新活性包括利用备选的底物的活性和/或在备选的环境条件下发挥作用的能力。
"载体"是指通过其核酸可以在生物、细胞或细胞成分之间传播和/或转移的任何物质。载体包括病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子以及人工染色体诸如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)以及PLAC(植物人工染色体)等,其是"附加体",即其自主复制或可以整合到宿主细胞的染色体中。载体还可以是纯(naked)RNA多核苷酸、纯DNA多核苷酸、由具有相同链的DNA和RNA两者构成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等,它们在自然界不是附加体,或者载体可以是包括一个或多个上述多核苷酸构建物的生物,诸如农杆菌或细菌。
“表达载体”是指为了在细胞中表达特定的多肽或多核苷酸而引入到宿主细胞中的核酸。如本领域所知的,可以在细胞中永久或短暂保持表达载体,作为细胞中的染色体或其他DNA的一部分,或在任何细胞区室内,诸如在细胞质中的复制型载体。表达载体还可以包括驱动RNA表达的启动子,该RNA通常被翻译成细胞或细胞提取物中的多肽。例如,包含在本发明的表达载体中的合适的启动子包括那些在原核或真核宿主细胞发挥作用的启动子。启动子可以包括允许相对于宿主细胞的生长调节表达的调节性序列,或者相应化学或物理刺激而引起基因的表达被打开或关闭的调节性序列。对于E.coli和特定的其他细菌宿主细胞,来源自生物合成酶、赋予抗生素抗性的酶和噬菌体蛋白质基因的启动子也可以使用,这样的启动子包括例如半乳糖、乳糖(lac)、麦芽糖、色氨酸(trp)、β-内酰胺酶(b/a)、噬菌体λPL和T5启动子。另外,还可以使用合成型启动子诸如tac启动子(美国专利第4,551,433号)。对于E.coli表达载体,包括E.coli的复制起点(诸如来自pUC、p1P、p1I和pBR)是有用的。为了有效地将RNA翻译成蛋白质,表达载体还通常包括位于待表达的基因的编码序列的起始密码子上游的核糖体结合位点序列。表达载体中还可以存在其他元件,诸如增强子、分泌信号序列、转录终止序列、以及一种或多种标志物基因(利用其可以确认和/或选择含有载体的宿主细胞)。可以使用选择标记物(即赋予抗生素抗性或敏感性的基因),并赋予经转化的细胞在适当的选择培养基中生长细胞时可选择的表型。
“转化”是指将载体导入到宿主细胞中的步骤。可以通过多种手段中的任何一种来实现转化(或转导或转染),上述手段包括电穿孔、微注射、基因枪法(或粒子轰击介导转移(particle bombardment-mediated delivery))或农杆菌(agrobacterium)介导转化。
本公开提供如上文详细描述的重组的DNA表达载体或质粒形式的核酸分子,其编码一个或多个目标酶。通常地,这样的载体可以在宿主微生物的细胞质中复制或整合到宿主微生物的染色体DNA中。在上述任何情况下,该载体可以是稳定载体(即,即使仅在选择压力下,在多次细胞分裂的过程中存在的载体)或瞬时载体(即,随着细胞分裂的次数的增加,宿主微生物逐渐丢失的载体)。本公开提供分离形式(即不纯,但以未在自然界发现的丰度和/或浓度的制剂形式存在)以及纯化形式的DNA分子(即,基本上不含污染物质或基本上不含具有的相应的DNA可以在自然界中发现的物质)。
取决于待使用的载体和待用于复制载体或驱动表达的宿主细胞(一种或多种),可以广泛地改变表达载体的多种成分。适合于基因表达以及在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母、链霉菌以及其他通常使用的细胞中保持载体的表达载体成分是广泛为人所知的,并且是可商购的。例如包括在本公开的表达载体中的合适的启动子包括那些在原核或真核宿主微生物中发挥功能的启动子。启动子可以包括允许相对于宿主细胞的生长调节表达的调节性序列,或者相应化学或物理刺激而引起基因的表达被打开或关闭的调节性序列。对于E.coli和特定的其他细菌宿主细胞,来源自生物合成酶、赋予抗生素抗性的酶和噬菌体蛋白质基因的启动子也可以使用,这样的启动子例如半乳糖、乳糖(lac)、麦芽糖、色氨酸(trp)、β-内酰胺酶(b/a)、噬菌体λPL和T5启动子。另外,还可以使用合成型启动子诸如tac启动子(美国专利第4,551,433号)。对于E.coli表达载体,包括E.coli的复制起点(诸如来自pUC、p1P、p1I和pBR)是有用的。
因此,在本发明实施方式中有用的典型的重组的表达载体含有至少一种表达系统,即例如包括GDH的至少功能性部分和/或可操作连接至启动子的生物合成基因编码序列,以及任选在可相容的宿主细胞中操作编码序列有效表达的终止序列。可以通过转化本公开重组的DNA表达载体来修饰宿主细胞以使其含有作为染色体外元件或整合至染色体的元件的表达系统序列。
本公开的多核苷酸可以如下扩增:使用cDNA、mRNA或任选的基因组DNA作为模板和根据标准PCR扩增技术的合适的寡核苷酸引物,以及按照下述实施例部分描述的那些步骤。这样扩增的核酸可以被克隆到合适的载体中,并通过DNA序列分析来确认。还可以通过标准的合成技术(例如,使用自动的DNA合成仪)来制备对应于核苷酸序列的寡核苷酸。
应当理解的是可以如下制造编码与本文所述的酶同源的多肽的分离的核酸分子:在编码特定的多肽的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失,从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入到编码的蛋白质中。可以通过标准的技术将突变引入到多核苷酸中,所述技术诸如定点突变和PCR介导突变。与适合进行非保守氨基酸取代的那些位点(参见上述)相对,在一些位点优选进行保守氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是其中利用具有相似侧链的氨基酸残基来进行氨基酸残基取代的取代。本领域中已经识别出具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸);具有酸性侧链的氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸);具有不带电极性侧链的氨基酸(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸);具有非极性侧链的氨基酸(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸);具有β分支侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
如上所述,在本文中描述分子生物学技术(包括载体、启动子的使用以及其他相关题目)的常用教材是有用的,包括Berger和Kimmel,Guide toMolecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology Volume 152,(Academic出版集团,San Diego,Calif.)("Berger");Sambrook等人,Molecular Cloning--ALaboratory Manual,2d ed.,Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989("Sambrook")和Current Protocols in MolecularBiology,F.M.Ausubel等人编写,Current Protocols,a j oint venture betweenGreene Publishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.,(1999年补充)("Ausubel")。操作规程的实例足够指导本领域技术人员通过胞外扩增方法(包括聚合物链式反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Q-复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术(例如,NASBA)),例如生产本公开的同源性核酸的方法可以在下述文献中找到:Berger,Sambrook和Ausubel,以及Mullis等人(1987)美国专利第4,683,202号;Innis等人编写(1990)PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications(Academic出版集团,San Diego,Calif.)("Innis");Arnheim & Levinson(oct.1,1990)C&EN 36-47;The Journal Of NIH Research(1991)3:81-94;Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173;Guatelli等人,(1990)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 87:1874;Lomell等人(1989)J.Clin.Chem.35:1826;Landegren等人(1988)Science 241:1077-1080;Van Brunt(1990)Biotechnology 8:291-294;Wu和Wallace(1989)Gene 4:560;Barringer等人(1990)Gene 89:117;以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology 13:563-564。在Wallace等人的美国专利第5,426,039号中描述了在体外扩增核酸克隆的改进的方法。在Cheng等人(1994)Nature 369:684-685和其中引用的文献中总结了通过PCR扩增大核酸的改进的方法,其中产生了最高达40kb的PCR扩增子。本领域技术人员将会理解基本上任何RNA可以被转化为适合限制性消化、PCR扩增的双链DNA,以及使用反转录酶和聚合酶的序列。参见例如,Ausubel,Sambrook和Berger等。
在本文中提及的所有出版物均通过参考并入本文,以全部针对描述和公开在所述出版物中描述的方法的目的,其可以与本文的描述结合使用。提供上述讨论的出版物和其全部内容仅涉及本公开提交日期之前的公开。本文中的任何引用均不能被诠释为本发明人利用在先公开的实质而无法被授予权利的承认。
发明的具体实施方式
如下文所述,在大肠杆菌中构件了独特的代谢途径以扩展该生物的代谢功能,例如允许其生产L-高丙氨酸作为代谢物(图1B)。在野生型的代谢网络中,在“糖酵解”和“天冬氨酸生物合成”之后,葡萄糖被转变为苏氨酸(参见,例如Debabov VG(2002)Adv BioChem Eng Biot 79:113-136)。在该野生型代谢中,可以通过苏氨酸脱水酶TdcB或IlvA将苏氨酸转变为2-酮丁酸,作为异亮氨酸生物合成的前体。如下述所详细讨论的,我们描述了可以用于改变涉及2-酮丁酸的代谢途径以生物合成非天然氨基酸L-高丙氨酸的方法和材料。
在典型的实施方式中,本文中公开的经代谢工程设计的微生物包括一个或多个用于优化L-高丙氨酸生产的生物化学途径。在多个方面,本文所提供的重组微生物包括与亲本微生物相比至少一种目标酶具有提高的表达。来自合适的生物源的核酸序列编码目标酶并由此表达。在其他实施方式中,本文所提供的重组微生物包括与亲本微生物相比至少一种目标酶具有降低的表达。在一些方面中,核酸序列是来源于细菌或酵母源的基因。
可以通过如下方法获得在本文中公开的一种或多种酶过表达的微生物菌株。可以基于来自GenBank的其编码序列(一个或多个),通过其天然来源(一个或多个)利用聚合酶链式反应来获得编码本文所讨论的一种或多种多肽的DNA片段(一个或多个)。然后将DNA片段(一个或多个)可操作连接至合适的启动子以产生表达盒。在一个实例中,一个表达盒包括一个可操作连接至启动子的编码序列。在另外的实例中,一个表达盒包括多个编码序列,所有编码序列均与启动子可操作连接。在这种情况下,优选在每个编码序列的5'端引入核糖体结合位点。如果需要,可以基于宿主微生物中优选使用的密码子对编码序列进行密码子优化。
然后将上述表达盒(一个或多个)导入到合适的微生物以生产本文所述的基因上经修饰的微生物。通过本领域已知的方法来选择正向转化子并确认一种或多种上述酶的过表达,例如免疫印迹或酶活性分析。然后在适合L-高丙氨酸生产的培养基中培养经修饰的微生物。优选地,培养基含有用于制造L-高丙氨酸的葡萄糖。在充分培养期后,收集培养基并分离L-高丙氨酸。
本文所描述的发明具有多种实施方式。一个实施方式是重组的多肽,其催化苏氨酸转变为2-氧代丁酸的化学反应;以及典型地还催化然后其中该2-氧代丁酸转变为L-高丙氨酸的化学反应。任选地,在可以被转化到微生物宿主中并在微生物宿主中表达的DNA分子中编码该重组的多肽(例如,由表达载体中的DNA编码的多肽)。通常在设计用于生产氨基酸(例如L-高丙氨酸)的方法中使用重组的多肽。本发明的具体示例性实施方式是重组微生物宿主,其包括编码多肽的转化的DNA分子,该多肽催化苏氨酸向2-氧代丁酸的转变;以及还催化2-氧代丁酸向L-高丙氨酸的转化;从而使得微生物宿主细胞生产L-高丙氨酸。
本发明的另外的实施方式为组合物,其包括与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性并且还包括在残基位点K92和/或T195的氨基酸取代突变(例如K92V和T195S)的谷氨酸脱氢酶多肽。在本发明一些实施方式中,与SEQ IDNO:1的野生型谷氨酸脱氢酶多肽相比,谷氨酸脱氢酶多肽还包括至少2-10个取代(例如K92L、K92V、T195S、T195A、V377A或S380C)和/或缺失或插入(例如多组氨酸标签)突变。任选地例如,谷氨酸脱氢酶多肽包括至少一个具体的氨基酸取代突变,该氨基酸取代突变包括:K92L、K92V、T195S、T195A、V377A或S380C。本发明相关的实施方式是分离的谷氨酸脱氢酶多核苷酸,其与SEQ ID NO:2具有至少95%的同一性并且编码在K92、T195、V377或S380氨基酸位点包括至少一个突变的谷氨酸脱氢酶多肽;并且其还显示2-酮丁酸的特异性常数大于其2-酮戊二酸的特异性常数(例如为2、4、8、10、20、30、40或50倍大)。在下述实施例中,针对2-酮丁酸的GDH2突变的特异性常数kcat/Km显示比针对天然底物2-酮戊二酸的特异性常数大50倍。与转氨酶IlvE和NADH-依赖性缬氨酸脱氢酶相比,在需氧条件下,进化的谷氨酸脱氢酶2-酮丁酸至L-高丙氨酸的转化收率增加超过300%。
本发明的实施方式包括组合物,该组合物包括本文所公开的谷氨酸脱氢酶多肽与诸如大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌这样的生物的结合。在典型的实施方式中,利用编码本文所公开的谷氨酸脱氢酶多肽的表达载体来转化大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌生物。在本发明的一些实施方式中,生物为生产相对较高水平的苏氨酸的大肠杆菌菌株,例如在营养培养基中通过30g/L葡萄糖能够产生至少2、3、4、5、6、7或8g/L苏氨酸的菌株。
本发明的一些实施方式利用诸如谷氨酸棒杆菌的棒状杆菌。如本领域所知的,棒状杆菌是棒形的革兰氏阳性细菌,该细菌为需氧或兼性厌氧菌,是化能有机营养菌,且为过氧化氢酶阳性、不形成孢子并无运动的细菌(YassinAF,等人"Corynebacterium glaucum sp.nov.”Int.J.Syst.Evol.Microbiol.53(Pt 3):705–9.May 2003)。与E.Coli同样,用于生长棒状杆菌属细菌的培养条件是已知的。棒状杆菌菌株能够获取生物素来生长,即使在富集的培养基中也生长缓慢。一些菌株还需要硫胺和PABA。(Collins,M.D.等人“GenusCorynebacterium Lehmann and Neumann 1896,350AL.”Bergey's Manual ofSystematic Bacteriology,vol.2,pp.1266-1276.1986)。已知该细菌在Loeffler's培养基、血琼脂以及胰酶大豆琼脂(TSA)中生长。棒状杆菌的非病原性菌株可以用于工业用途,诸如生产氨基酸、核苷酸以及其它营养素。事实上,研究最多的一种并且是生物技术上重要的细菌菌种是谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum),该名称表示其在需氧条件下生成谷氨酸的能力(Abe,S.等人"Taxonomical studies on glutamic acid-producing bacteria."J.Gen.Appl.Microbiol.13:279-301.1976)。谷氨酸棒杆菌在生产谷氨酸一钠中的作用是广泛为人们所知的,其在食品工业中得到广泛地应用。今天,已经开发C.Glutamicum用于生产多种生物源氨基酸、核苷酸和维生素,并且提供超过两百万吨主要是L-谷氨酸和L-赖氨酸的氨基酸年产量(Burkovski,Andreas.“Corynebacteria:Genomics and Molecular Biology.”Caister Academic Press,June 2008)。
在本领域中已知适合用于生产和保持重组微生物的培养条件(例如营养培养基)(参见,例如Handbook of Microbiological Media,第四版(2010),RonaldM.Atlas(Author);和Fermentation Microbiology and Biotechnology,第三版(2006)E.M.T.El-Mans(Editor),C.F.A.Bryce(Editor),Arnold L.Demain(Editor)and A.R.Allman(Editor))。本领域的专业人员将会认识到可以对这些条件进行改变以满足每种微生物的需要。用于生产L-高丙氨酸的合适的培养条件包括培养培养基pH、离子强度、营养物含量等条件;温度条件;氧/CO2/氮含量条件;湿度条件;允许通过宿主微生物(即通过微生物的代谢作用)生产化合物的其它培养条件。用作宿主细胞的微生物的合适的培养条件是为人们熟知的。
在本发明的一些实施方式中,选择在代谢途径中在一个或多个基因中具有突变的生物以促进L-高丙氨酸的生产,例如大肠杆菌菌株其在SEQ ID NO:5的rhtA多肽中包括突变,且该突变导致与野生型SEQ ID NO:5相比苏氨酸输出活性降低。在本发明的一些实施方式中,选择除了本文所公开的谷氨酸脱氢酶多肽之外过表达一种或多种多肽的生物,例如,包含编码与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7具有至少95%同一性的苏氨酸脱水酶多肽的表达载体的生物。任选地,生物在营养培养基中能够合成浓度至少为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0g/L的L-高丙氨酸。
本公开允许专业人员产生大量重组的多肽,例如包括至少在下述位点中的一个或多个具有突变的基本上纯化的GDH多肽,所述位点为K92、T195、V377或S380,并且该GDH多肽对于2-酮丁酸的特异性大于其对于2-酮戊二酸的特异性。本公开还提供了具有1-30个、1-20个、1-10个或1-5个保守氨基酸取代的基本上纯化的GDH多肽,该GDH多肽对于2-酮丁酸的特异性大于其对于2-酮戊二酸的特异性。本公开类似地提供基本上纯化的包括与SEQ ID NO:1具有至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的序列,并且其中该多肽包括选自K92、T195、V377或S380的取代的氨基酸残基位点,以及其对于2-酮丁酸的特异性大于其对于2-酮戊二酸的特异性。
本发明的实施方式包括用于制备L-高丙氨酸的方法。本发明的一种这样的实施方式是用于制备L-高丙氨酸的方法,其包括在营养培养基中放置大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌生物,其中该生物包含与SEQ ID NO:1具有至少90-95%同一性的谷氨酸脱氢酶多肽;以及该谷氨酸脱氢酶多肽在残基位点K92或T195具有氨基酸取代突变。然后在营养培养基中在允许生物合成L-高丙氨酸的条件下培养微生物。通常地,与SEQ ID NO:1的野生型谷氨酸脱氢酶多肽相比,用于此类方法的谷氨酸脱氢酶多肽还包括至少2-10个取代、缺失或插入突变。在本发明的一些实施方式中,生物是大肠杆菌,该大肠杆菌在与SEQ ID NO:5的rhtA多肽具有至少90-95%同一性的多肽中包括突变,并且该突变是导致与野生型rhtA相比苏氨酸输出活性降低的突变。任选地,利用编码与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95%同一性的苏氨酸脱水酶多肽的表达载体来转化生物。
在本发明的示例性实施方式中,在下述条件中的至少一种下生长:30-40oC的温度;至少4小时~至少48小时的时间周期;6-8的pH;和/或在包括M9、LB、F1或TB培养基的营养培养基中。在一个示例性实施方式中,营养培养基包括M9培养基;生物是选择的大肠杆菌菌株,其具有在M9培养基中通过30g/L葡萄糖制备至少2、3、4、5、6、7或8g/L苏氨酸的能力。通常地,在这些方法中,生物在营养培养基中能够制备浓度至少为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0g/L的L-高丙氨酸。
本发明的还另外的实施方式是氨化2-酮丁酸以形成L-高丙氨酸的方法,该方法包括使2-酮丁酸与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的谷氨酸脱氢酶多肽结合,其中该谷氨酸脱氢酶多肽包括在残基位点K92、T195、V777或S380的至少两个氨基酸取代突变;以及该谷氨酸脱氢酶多肽对于2-酮丁酸的特异性大于其对于2-酮戊二酸的特异性。在这些方法中,在允许形成L-高丙氨酸的条件下,将2-酮丁酸与谷氨酸脱氢酶多肽结合。
用于制备L-高丙氨酸的一些实施方式包括进一步纯化L-高丙氨酸的步骤。在描述诸如L-高丙氨酸这样的化合物时,本领域技术人员理解该术语意在包括这些化合物以及这些化合物的盐(例如,本领域中已知的药学上可接受的盐)。例如,如本领域所已知的,L-高丙氨酸可以以游离酸形式以及L-高丙氨酸钠、L-高丙氨酸钾或L-高丙氨酸铵盐、以及其它来源于碱土金属元素的盐或其它金属盐的形式出现。
本发明的一些实施方式包括至少一个纯化步骤,该纯化步骤包括对分离的用于制备L-高丙氨酸的生物的细胞(例如,L-高丙氨酸发酵液中的那些)进行裂解。实施方式可以包括至少一个纯化步骤,该纯化步骤包括对分离的用于制备L-高丙氨酸的生物的细胞或细胞裂解物进行离心分离。实施方式可以包括至少一个纯化步骤,该纯化步骤包括沉淀在用于制备L-高丙氨酸的培养基中的一种或多种化合物(例如,L-高丙氨酸本身)。实施方式可以包括至少一个纯化步骤,其包括过滤和/或浓缩存在于营养培养基中的一种或多种化合物(例如,L-高丙氨酸)。实施方式可以包括至少一个纯化步骤,其包括色谱分离存在于营养培养基中的一种或多种化合物(例如,L-高丙氨酸)。
本文中所公开的方法的一些实施方式进一步包括使用根据本发明的实施方式制备的L-高丙氨酸组合物来化学或生物合成的步骤。在示例性的方法中,L-高丙氨酸是经化学改性的,通过利用在该化合物上进行诸如酰胺化或还原反应的化学反应以进一步产生诸如S-2-氨基丁酰胺、S-2-氨基丁醇、左乙拉西坦、布瓦西坦或乙胺丁醇这样的化合物(参见,例如图1)。在本发明具体的实施方式中,在设计制备氨基酸酰胺的方法中对L-高丙氨酸进行化学操作。能够适合用于本发明实施方式的示例性化学合成方法是已知的,并且是公开的,例如在U.S.专利第4,696,943号和第7,531,673号中公开的方法,在此将其内容并入作为参考。在本发明示例性实施方式中,该方法可以包括使氨基酸或氨基酸的盐与卤化试剂反应,或与和羧酸反应形成离去基团的物质反应,以形成中间体,然后使该中间体与氨水反应。当氨基酸或酸盐对映体纯的,则酰胺将为立体异构体。利用此类方法制备的酰胺可以用于例如形成左乙拉西坦。
本发明的实施方式还包括生产制品和/或设计用于促进本发明方法的试剂盒。通常,此类试剂盒包括根据本发明的方法使用其中的元件的说明书。此类试剂盒可以包括被划分的运载方式以在封闭的区域内接受一种或多种容器,该容器诸如罐、管等,每个容器包括用于本方法的分离的元件中的一种。容器中的一种可以包括罐,该罐例如含有编码本文所公开的多肽的表达载体,例如编码具有改变的底物特异性的谷氨酸脱氢酶多肽的载体。任选地,将表达载体转化至生物(诸如大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌)中以促进它们生产L-高丙氨酸。本发明的一个示例性实施方式是用于合成L-高丙氨酸的试剂盒,该试剂盒包括:编码与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性并且包括在残基位点K92或T195的氨基酸取代突变的谷氨酸脱氢酶多肽的表达载体,以及针对该表达载体的容器。任选地,试剂盒还包括编码与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95%同一性的苏氨酸脱水酶多肽的表达载体和/或活的大肠杆菌菌株(例如过表达苏氨酸的大肠杆菌菌株和/或在SEQ ID NO:5的rhtA多肽中包括突变且从而导致与野生型rhtA多肽相比苏氨酸输出活性降低的大肠杆菌菌株)。
在本发明典型的实施方式中,提供包含用于生产L-高丙氨酸的生产制品。该生产制品包括容器和标签。合适的容器包括例如:瓶、罐、注射器以及试管。该容器可以通过利用多种材料(诸如玻璃或塑料)来形成。容器而可以承载用于生产L-高丙氨酸的组合物(例如,利用编码重组的GDH多肽的表达载体转化的生物)。容器上或与容器相关的标签显示用于制备L-高丙氨酸的组合物。生产制品还可以包括第二容器,该第二容器包括除GDH多核苷酸之外的另外的组合物或底物。该组合物或底物例如可以用于增加L-高丙氨酸的生产中特定中间体(例如苏氨酸)的产生。还可以出于商业和用户立场需要的其它物质,包括其它缓冲液、稀释剂、填料、针、注射器以及插入有使用说明书的包装。
本发明的其它生物学方面将在下述实施例中探讨。
实施例
下述实施例举例说明可用于实施本文中公开的本发明多种实施方式的方法和材料。
实施例1:通过葡萄糖直接生物合成L-高丙氨酸的示例性方法和材料
扩展生物合成L-高丙氨酸的代谢网络
在该扩展的生物代谢途径中有两个主要的挑战:面临的第一个挑战是要找到合适的氨化酶以将2-酮丁酸转变为L-高丙氨酸,现有的酶可能无效,因为在正常细胞中无法检测到L-高丙氨酸(参见,例如Epelbaum S等人(1998)J Bacteriol 180(16):40564067),即使2-酮丁酸是天然代谢物也如此;第二个挑战涉及引导代谢以驱动碳流趋向2-酮丁酸。在大多数生物中,2-酮丁酸是经由苏氨酸合成。备选的途径包括起始于缩合乙酰辅酶A和丙酮酸以形成柠苹酸的“丙酮酸途径”(参见,例如Charon等人(1974)J Bacteriol117(1):203211),经由β-甲基天冬氨酸和β-甲基草酰乙酸的“谷氨酸途径”(参见,例如Phillips等人(1972)J Bacteriol 109(2):714–719),或诸如O-磷酸-高丝氨酸和O-乙酰基-高丝氨酸这样的活性物质的“γ删除”(参见,例如DoniniS等人(2006)Biochem Biophys Res Commun 350(4):922–928)。我们选择“苏氨酸途径”,因为在发酵工业中存在的已知技术开发了能够产生高于100g/L苏氨酸的细菌菌株(参见,例如Debabov VG(2002)Adv Biochem Eng Biot79:113–136)。
各种天然酶对于2-酮丁酸氨化的限制
为了检测任何可以作用于2-酮丁酸的E.coli的内源转氨酶,我们向在M9培养基中的野生型E.coli菌株BW25113中进料10g/L 2-酮丁酸。在24小时之后,HPLC分析显示仅生产了182mg/L的L-高丙氨酸(图2A)。由于支链氨基酸的氨基转移酶IlvE(参见,例如Inoue K等人(1988)J Biochem104(5):777–784)可能是一个有功能的候选酶,我们克隆并在BW25113中过表达了IlvE,其提高L-高丙氨酸的生产至1.2g/L(图2B)。10g/L氨基供体谷氨酸的另外进料进一步提高L-高丙氨酸效价至3.2g/L。这些实验表明诸如IlvE这样的转氨酶可以将2-酮丁酸氨化为L-高丙氨酸。但是,需要高浓度的谷氨酸以推动反应平衡,因为氨基交换是可逆的反应过程。即使在这样的极端条件下,2-酮丁酸至L-高丙氨酸的氨基交换的转化率仅为32%。
利用氨水进行酮酸的直接还原氨化是一个生产氨基酸的优选方法,因为其可避免使用谷氨酸作为氨基供体(参见,例如Zhang等人(2007)ApplMicrobiol Biotechnol 77(2):355366)。与氨基交换相比,还原氨化有能力简化代谢操作和降低生产成本。之前已经显示利用来自不同链霉菌菌种的缬氨酸脱氢酶对于体外2-酮丁酸的还原氨化是具有活性的(参见,例如Priestley等人(1989)Biochem J 261(3):853–861;Turnbull等人(1997)J Biol Chem272(40):2510525111)。由此,我们克隆并在BW25113中过表达了来自阿维链霉菌、天蓝链霉菌和角蛋白降解菌(Streptomyces fradiae)的缬氨酸脱氢酶。遗憾地是,与BW25113背景(182mg/)相比,这些脱氢酶仅稍稍提高了L-高丙氨酸效价(约240~260mg/L,图2CE)。这可能的原因是缬氨酸脱氢酶是促进指向L-高丙氨酸的降解的反应而不是在需氧条件下生物合成的催化酶。
进化谷氨酸脱氢酶以氨化2-酮丁酸
谷氨酸通过用氨水对2-酮戊二酸进行还原氨化而形成。该反应是在辅因子NADPH的存在下,通过谷氨酸脱氢酶(GDH)或谷氨酸合酶来催化(图3A)。该利用氨水的过程是非常有效的,因为谷氨酸对于其它氨基酸而言是通用的氮源。指向谷氨酸生物合成的GDH催化活性比指向谷氨酸降解的催化活性高10倍(参见,例如Sharkey等人(2009)Proteins 77(2):266–278),这使得GDH是用于氨基酸生产的理想的生物合成酶。但是,因为天然的GDH仅对于2-酮戊二酸有活性,因此我们需要设计GDH以获得用于L-高丙氨酸生物合成的指向2-酮丁酸的新的底物特异性。
为了这个目的,我们开发了进化GDH的选择策略。从染色体中删除转氨酶基因avtA和ilvE使得野生型E.coli成为缬氨酸营养缺陷型(参见,例如Wang等人(1987)J Bacteriol169(9):4228-4234),其在基本培养基中的生长可以通过突变GDH来补救,该突变GDH对于氨化缬氨酸前体2-酮异戊酸是有活性的(图3B)。因为2-酮丁酸和2-酮异戊酸的化学结构是类似的,我们推测对于2-酮异戊酸有活性的GDH变体可能对于2-酮丁酸也是有活性的(图3C)。
基于共生梭菌(Clostridium symbiosum)谷氨酸脱氢酶的晶体结构(PDB:1BGV)(参见,例如Stillman等人(1993)J Mol Biol 234(4):1131–1139),残基K89、T193、V377和S380位于谷氨酸底物γ-碳的半径内(图4A)。C.symbiosum和E.coli之间的序列比对显示结合口袋是保守的,E.coli GDH相应的残基为K92、T195、V377和S380(图4B)。使用含有简并NNK(N1/4A,T,G,C;K1/4G, T)密码子的引物,通过PCR基因装配,对这些位点进行定点饱和突变。将该合成的片段连接至质粒pZE12(参见,例如Lutz等人(1997)Nucleic Acids Res 25(6):1203-1210),将得到的库转化至缬氨酸营养缺陷型E.coli(ΔavtA,ΔilvE)。该库含有两百万个独立的克隆,在M9基本培养基中进行筛选。分离出两个突变体:具有K92L、T195A、V377A和S380C突变的GDH1;具有K92V和T195S突变的GDH2。
鉴定进化的谷氨酸脱氢酶突变体
根据图4C可以看出,不具有质粒的E.coli(ΔavtA,ΔilvE)在不存在缬氨酸的基本培养基中不能生长,而GDH突变体能够支持在不添加缬氨酸条件下的细胞生长。特别是,在基本培养基中的GDH2转化子的生长速度接近于添加了缬氨酸培养基中的生长速度,这表明GDH2成功地挽救了缬氨酸营养缺陷表型。将该进化的GDH突变体转化到BW25113中并过表达。向这样的转化子中进料10g/L 2-酮丁酸,产生了1.6g/L L-高丙氨酸(GDH1)和5.1g/L L-高丙氨酸(GDH2)(图2F、G)。有趣的是,基本培养基中的生产收率与两个GDH突变体在基本培养基中的生长速度一致。这些结果表明,我们的选择策略工作良好,并且选择的GDH2对于2-酮异戊酸和2-酮丁酸的活性均高于GDH1。GDH2转化子具有50%的转化收率,产率为5.1g/L/天,远远优于添加了高浓度谷氨酸的IlvE转化子。
为了对酶进行定性,在野生型谷氨酸脱氢酶GDHwt和突变体GDH2的N-末端均添加6xHis-标签,并过表达,通过Ni-NTA柱纯化。通过检测在340nm处的NADPH消耗(图6)来确定对2-酮戊二酸(同源底物)和2-酮异戊酸或2-酮丁酸(非天然底物)的活化的动力学常数。酶活性检测显示,对于2-酮戊二酸,GDH2的特异性常数kcat/Km比GDHwt的该特异性常数小近3000倍。虽然这两种酶对于2-酮异戊酸具有相似的Km,但GDH2具有比GDHwt高5倍的kcat,并且可以在生理条件下产生缬氨酸以供细胞生长。与GDHwt相比,GDH2具有对于2-酮丁酸显著提高的催化活性,其中Km减少4倍(8.4mM与35.4mM),并且kcat增加2倍(90.2s-1与47.2s-1)。结合亲和性方面的增加是非常有帮助的,因为高浓度的2-酮丁酸会干扰细胞的代谢活性(参见,例如Daniel等人(1983)Mol Gen Genet 190(3):452-458)。基于GDH的活性位点的晶体模型,K92的氨基与2-酮戊二酸的γ-羧基形成氢键,并决定底物特异性(参见,例如Stillman等人(1993)J Mol Biol 234(4):1131–1139)。由赖氨酸向缬氨酸的突变增加了结合口袋的疏水性,这说明了GDH2的对于2-酮丁酸的特异性常数kcat/Km比对于天然底物2-酮戊二酸的特异性常数高50倍的原因。
对L-高丙氨酸的全生物合成途径进行优化
通过定点进化,我们获得了对于2-酮丁酸的氨化具有高活性的突变体谷氨酸脱氢酶GDH2。当我们在BW25113中过表达GDH2时,通过30g/L葡萄糖生产了0.1g/L L-高丙氨酸(图5A中的柱#2)。在没有过表达GDH2的情况下,没有检测到高丙氨酸(图5A中的柱#1)。现在剩下的挑战是设计代谢以使得碳流指向2-酮丁酸。
因为2-酮丁酸来源于苏氨酸,我们将生产宿主由野生型E.coli BW25113改变为过量生产苏氨酸的ATCC98082(参见,例如Debabov VG(2002)AdvBioChem Eng Biot 79:113-136)。通过30g/L葡萄糖,E.coli菌株ATCC98082可以产生8g/L苏氨酸。在ATCC98082中过表达GDH2和苏氨酸脱水酶TdcB导致产生0.18g/L L-高丙氨酸(图5A中的柱#3)和3.7g/L苏氨酸。剩余高浓度的苏氨酸说明催化酶TdcB的活性对于将苏氨酸完全转变为2-酮丁酸是不够的。另一结果是累积了4g/L谷氨酸,这是因为低浓度2-酮丁酸无法与2-酮戊二酸竞争由GDH2催化的氨化。随后,我们由E.coli(IlvAEC)和枯草芽孢杆菌克隆了生物合成的苏氨酸脱水酶(参见,例如Shulman A等人(2008)Biochemistry 47(45):11783–11792)(IlvABS)。与GDH2一起,这些脱水酶显著地提高L-高丙氨酸的生产(图5A中的柱#4和5)。IlvABS是鉴定的最佳酶,其转化子产生3.8g/L L-高丙氨酸。但是,在发酵培养基中仍然存在2.5g/L苏氨酸。已知ATCC98082具有rhtA23突变,该突变将rhtA基因的表达提高了约10倍(参见,例如Debabov VG (2002)Adv Biochem Eng Biot79:113–136),它的蛋白质产物是强的苏氨酸输出者。我们推测苏氨酸的有效输出可能是因为苏氨酸的胞外聚集。在从ATCC98082染色体中缺失rhtA后,苏氨酸不再聚集,并且L-高丙氨酸浓度提高至5.4g/L(图5A中的柱#6)。该最终菌株具有2.7g/L/天的产量和0.18g/g葡萄糖收率(图5B),其是理论最大值的26%(下文中将描述计算的细节)。有趣地是,尽管GDH利用了大量细胞还原力,通过磷酸葡萄糖异构酶(pgi)敲除提高了NADPH的可利用度(参见,例如Chemler等人(2009)Metab Eng 10.1016/j.ymben.2009.07.003)从而降低了L-高丙氨酸生产效价至3.0g/L,这表明苏氨酸生物合成是受胞外氧化还原状态所影响的。
该工作扩展了E.coli的代谢从而直接通过葡萄糖生物合成非天然氨基酸L-高丙氨酸。在此的成功显示代谢操作不仅可以允许生成天然代谢物,还能够微生物合成非天然代谢物。传统的代谢工程化通过通量过程化(fluxengineering)来处理,以实现独特化学物质的工业水平生物合成,在其过程中应当考虑三步(途径扩展、蛋白质进化和通量提高)。蛋白质的进化是关键步骤,因为需要开发出独特的酶以实现非天然的活性。在此,我们进化了谷氨酸脱氢酶使得其直接在2-酮丁酸固定氨,其避免了使用谷氨酸作为氮供体并且显著地提高了L-高丙氨酸的收率。
开发L-高丙氨酸(在摇瓶中为5.4g/L效价和0.18g/g葡萄糖收率)的发酵方法提供了该手性化合物的可再生的供给,从而使得在不需要昂贵的手性色谱的条件下合成左乙拉西坦。左乙拉西坦的更为绿色的生产方法能够有效地降低药物成本(参见,例如US专利4,696,943;US专利6,107,492),这样可以帮助全世界在发展中国家的未受到合适的治疗的五千万癫痫病患者(认为占癫痫病患者的90%)(参见,例如Scott等人(2001)B World Health Organ79:344–351)。
实施例2:制备和使用本发明各实施方式的示例性材料和方法
载体构建
所有的克隆步骤在E.coli菌株XL10-gold(Stratagene)中进行。利用KOD聚合酶(Novagen)进行PCR反应。通过操纵子生物技术合成寡核苷酸(在下文中详细描述了序列)。编码lac阻抑物LacI的基因片段(参见,例如Zhang等分(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(52):20653–20658)被插入到质粒pZE12(参见,例如Lutz例如(1997)Nucleic Acids Res 25(6):1203–1210)的SacI位点以获得质粒pZElac。使用引物IlvEaccfwd和IlvExbarev,由E.coli K12的基因组DNA扩增ilvE基因。使用引物对VDHsaaccfwd/VDHsaxbarev、VDHscaccfwd/VDHscxbarev和VDHsfaccfwd/VDHsfxbarev,由阿维链霉菌、天蓝链霉菌和角蛋白降解菌的基因组DNA扩增缬氨酸脱氢酶基因。使用引物GDHecaccfwd和GDHecxbarev,由E.coli K12的基因组DNA扩增谷氨酸脱氢酶基因gdhA。利用Acc65I和XbaI消化所有PCR产物并连接到pZElac中以获得质粒pZElac_IlvE、pZElac_VDHsa、pZElac_VDHsc、pZElac_VDHsf和pZElac_GDH。利用引物对TdcBaccfwd/TdcBsalrev和IlvAecaccfwd/IlvAecsalrev,由E.coli K12的基因组DNA扩增E.coli苏氨酸脱水酶基因tdcB和ilvA。利用引物对IlvAbsaccfwd/IlvAbssalrev,由枯草芽孢杆菌基因组DNA扩增芽孢杆菌苏氨酸脱水酶基因。利用Acc65I和SalI消化这些片段。然后将它们与利用SalI和XbaI消化的突变体GDH基因(利用引物对GDHecsalfwd/GDHecxabrev扩增)连接。将连接的片段插入到pZElac以产生质粒pZElac_tdcB_GDH、pZElac_ilvAEC_GDH和pZElac_ilvABS_GDH。
敲除染色体基因
使用转导进行基因缺失,以及用于P1转导的菌株是由Keio collection获取的(参见,例如Baba T等人(2006)Mol Syst Biol 2:1-11(2006.0008))。含有正确缺失的克隆通过质粒pCP20转化以移除卡那霉素抗性标记。从E.coli菌株BW25113染色体中缺失缬氨酸转氨酶基因avtA和ilvE以制备被称为ValK的缬氨酸营养缺陷型。通过过量生产苏氨酸的E.coli菌株ATCC98082的染色体使苏氨酸输出基因rhtA失活从而改善了L-高丙氨酸的生产。
GDH文库的构建和筛选
用下列寡核苷酸来构建文库,所述寡核苷酸编码在相应于E.coli GdhA中Lys-92、Thr-195、Val377和Ser380的位点编码简并NNK(N为A、T、G、C;K为G、T)密码子。使用pZElac_GDH作为模板以及下述引物对,进行了四个不同的PCR:GDHecaccfwd和GDH_k92lib_rev、GDH_k92lib和GDH_T195lib_rev、GDH_T195lib和GDH_VSlib_rev、GDH_VSlib和GDHecxabrev。对由这些PCR获得的DNA片段进行电泳并通过使用Zymo-spin柱(Zymo Research)来纯化。混合等量的片段并用于进行10轮的PCR。随后添加了引物GDHecaccfwd和GDHecxabrev,然后使反应混合物再进行25轮PCR。利用Acc65I和XbaI消化的得到的1.4-kb PCR产物,并连接至利用相同的酶消化的PZElac中。将连接混合转化到电感受态ElectroMAX DH10B细胞(Invitrogen)中,获得两百万个独立的转化子。从转化子池中分离质粒DNA并用于通过电穿孔转化至缬氨酸营养缺陷型ValK中,获得一千万个独立的克隆。
将汇集的转化子(500ul,~109个细胞)在含20g/L葡萄糖和50mg/L氨苄青霉素的30ml M9培养基中37°C振摇2天。将50μL培养物传代培养到新的培养基管(100倍稀释)中。在另外5轮连续传代培养富集物之后(为了确保在培养物中最佳突变占主要地位),分离了两个突变:具有K92L、T195A、V377A和S380C突变的GDH1;以及具有K92V和T195S突变的GDH2。
蛋白质纯化和酶活性检测
使用引物GDHbamfwd和GDHbamrev扩增了编码野生型谷氨酸脱氢酶和GDH2的两个基因片段。在利用BamHI消化后,将基因片段插入到表达质粒pQE9(Qiagen)中。将得到的表达质粒转化到携带pREP4的E.coli菌株BL21(DE3)(Qiagen)中。以1/100稀释率由过夜预培养物接种细胞,并在200mL 2XYT富集培养基(含有50mg/L氨苄青霉素和25mg/L卡那霉素)中生长。在0.6的OD600,通过向细胞培养物中添加0.1mM IPTG来诱导重组蛋白质的表达,然后在30°C过夜温育。然后利用Ni-氨基三乙酸柱来纯化过表达的蛋白质。利用280nm处的UV吸收来确定蛋白质浓度。
在含有0.2M NH4Cl、0.2mM NADPH和不同浓度的2-酮酸的检测缓冲液(100mM Tris缓冲液,pH 8.0)中进行酶活性检测。通过添加经纯化的酶来引发反应,在340nm检测NADPH的消耗(淬灭系数,6.22mM-1 cm-1)。使用Origin通过将初始的速度数据拟合为米氏方程来确定动力学参数(kcat和Km)。
L-高丙氨酸的生产
为了检测由2-酮丁酸至L-高丙氨酸的转化,将质粒pZElac_IlvE、pZElac_VDHsa、pZElac_VDHsc、pZElac_VDHsf、pZElac_GDH和pZElac_GDH2转化到BW25113中。将转化子接种到具有5g/L酵母提取物、10g/L氯化铵和20g/L葡萄糖的培养基中。一旦OD达到~1.0,添加10g/L 2-酮丁酸和0.1mM IPTG,37°C温育24小时。通过HPLC分析以邻苯二甲醛(OPA)来定量氨基酸。
为了检测通过葡萄糖生产L-高丙氨酸,携带质粒pZS_thrO的E.coli菌株ATCC98082利用pZElac_tdcB_GDH、pZElac_ilvAEC_GDH和pZElac_ilvABS_GDH来转化。利用下述生产培养基对这些转化子进行发酵:每升30g葡萄糖、17g(NH4)2SO4、2g KH2PO4、1g MgSO4·7H2O、2g酵母提取物、0.1g L-缬氨酸、0.01g FeSO4:7H2O和0.01g MnSO4:7H2O。相应地添加抗生素(氨苄青霉素50mg/L、大观霉素25mg/L)。在发酵培养基中将2XYT过夜培养物稀释25倍,添加0.1mM异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白质表达。在摇瓶实验中,通过添加30g/L CaCO3来缓冲培养物培养基。在33°C的摇床(250rpm)中温育该培养物40-50小时直到葡萄糖被消耗。
理论收率的计算
为了计算通过葡萄糖制备高丙氨酸的理论收率,使用了MATLAB软件中的线性规划优化。我们首先建立了以输入和输出通量的形式的描述全部相关胞内代谢产物的质量平衡方程。将输入葡萄糖通量设定为1,从而异丁醇的收率的等于等于异丁醇通量(viBOH)除1。为了计算最大理论收率,我们进行了下述极小化:
min(-viBOH)从而AV=B
在此,A为理论配比矩阵(图10),V是在每个方程中包括的通量向量,以及B是由负葡萄糖输入和零构成的向量(图11)。A和B两排对应于每个代谢物,A栏表示考虑的每个反应(或总反应)(如图12所定义的)。
为了进行该线性优化,我们使用了MATLAB的模块“linprog”,其使用
下述形式
以拟合图12定义的该形式的f向量。
极小化之后,V10是异丁醇的最大理论收率,并且V(或x)向量的其它部分是整个代谢网络的通量分布。
在该计算中,由两个自由度:1)通过转氢酶是否可以将NADH转变为NADPH,以及2)P/O比率(通过氧化NAD(P)H获得的ATP数)。图13示出了对于这两个变量的不同组合的最大理论收率的结果。假设:1)不包括TCA循环中来自琥珀酸脱氢酶来源的UQH2的能量产生。2)假设磷酸戊糖途径的非氧化分支为3R5P→2F6P+GA3P。
实施例3:用于制备和纯化L-高丙氨酸的示例性方法
L-高丙氨酸发酵
将表达载体pZElac_ilvABS_GDH2转化到rhtA敲除的E.coliATCC98082中。将得到的菌株用于在5L发酵罐中的生产测试。针对在5L发酵罐中的L-高丙氨酸生产测试,将一环新鲜的转化子细胞接种到含有100μg/L氨苄青霉素的100ml LB(在500ml烧瓶中)中。在34°C,250rpm的Innova4000培养箱(New Brunswick Scientific,Edison,NJ)中温育该种子培养物。在过夜生长之后,使用该种子培养物作为接种物用于主发酵。准备了含有每升生产培养基具有葡萄糖(40g)、(NH4)2SO4(15g)、KH2PO4(2g)、MgSO47H2O(1g)、酵母提取物(2g)、L-缬氨酸(0.1g)、FeSO47H2O(0.01g)和MnSO47H2O(0.01g)的发酵罐(Bioflo 310,New Brunswick Scientific,Edison,NJ)。利用7%NH4OH将pH调节并控制为6.8。将发酵罐控制在34°C、700rpm和空气1vvm充气。起始时添加IPTG使其终浓度为0.1mM。还添加了氨苄青霉素(100μg/L)以确保质粒稳定性。制备了在200ml中含有76g葡萄糖和1g KH2PO4的补料培养基,用于在初始葡萄糖(40g/L)被消耗后进行补料。在全部80g/L葡萄糖被消耗之后,终止发酵。
图14示出了在发酵罐(5L)中生产L-高丙氨酸的结果。通过80g/L葡萄糖的消耗,发酵液中的L-高丙氨酸的最终效价为12.2g/L。产品收率为15.25%。
L-高丙氨酸纯化
为了充分地由发酵液纯化L-高丙氨酸,我们设计了两个不同的纯化过程,即直接结晶和色谱纯化,如图15所示。为了检测L-高丙氨酸的纯化过程,使用了具有最终12g/L的L-高丙氨酸的发酵液。通过离心分离(4000rpm,10分钟)或膜过滤除去了E.coli细胞。将其用作纯化过程的母液。针对直接结晶过程,首先利用旋转蒸发仪(50°C,100rpm)将母液(400ml)浓缩至至少100g/L浓度。将得到的体积20ml(20倍浓缩)加热至70°C。为了结晶,通过泵以5ml/分钟的流速,向该浓缩的发酵液中连续地添加50ml冷甲醇(20°C)。通过离心分离(4000rpm,10分钟)收集白色晶体。利用冷甲醇清洗晶体。在炉子中于80°C干燥纯化的晶体5小时。通过这种方式,我们能够从发酵液中纯化超过80%(81%,3.88g/4.80g)的L-高丙氨酸。
对于色谱纯化,利用5N H2SO4来酸化如上所述制备的浓缩的母液,以使其pH低于2.0。在填充有Amberlite(Sigma)(形成树脂的强酸性阳离子交换钠盐)的20cm长的玻璃柱(ID 2cm)中准备了色谱柱。向柱中上样浓缩的母液之前,利用2~4床体积的酸性水(pH<4)对阳离子交换柱(50ml的床体积)进行预平衡。将经酸化的母液上样到预平衡后的柱中。向柱中添加了3N NH4OH以洗脱L-高丙氨酸。收集每床体积(50ml)以分析用于收集的最佳方案。发现在第2~第3床体积收集的洗脱物具有95%以上的所加载L-高丙氨酸。收集的液体用5N HCl进行再酸化以使pH低于2.0。如果在该阶段浓度低于100g/L,则需要更高的浓度以优化结晶效率。剩余的结晶、清洗(如果需要)和干燥步骤与上述相同。在该色谱纯化步骤中,我们从发酵液中纯化了超过70%(73%,3.50g/4.80g)的L-高丙氨酸。
表:
表1.谷氨酸脱氢酶(GDH)多肽
位置:AAA87979447aa线性BCT 10-FEB-2004
定义:谷氨酸脱氢酶[大肠杆菌]。
登录号:AAA87979CAA25495
版本:AAA87979.1 GI:146124
DBSOURCE:l°Cus ECOGDHA accession J01615.1
来源:大肠杆菌
生物:大肠杆菌
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表2.谷氨酸脱氢酶(GDH)多核苷酸
位置 ECOGDHA 1779bp DNA线性BCT 10-FEB-2004
定义 大肠杆菌谷氨酸脱氢酶(gdhA)基因,完整cds。
登录号 J01615K00565M23171 X00988
版本 J01615.1 GI:146123
来源 大肠杆菌
CCGGGTGGCAAAACTTTAGCGTCTGAGGTTATCGCATTTGGTTATGAGATTACTCTCGTTATTAATTTGCTTTCCTGGGTCATTTTTTTCTTGCTTACCGTCACATTCTTGATGGTATAGTCGAAAACTGCAAAAGCACATGACATAAACAACATAAGCACAATCGTATTAATATATAAGGGTTTTATATCTATGGATCAGACATATTCTCTGGAGTCATTCCTCAACCATGTCCAAAAGCGCGACCCGAATCAAACCGAGTTCGCGCAAGCCGTTCGTGAAGTAATGACCACACTCTGGCCTTTTCTTGAACAAAATCCAAAATATCGCCAGATGTCATTACTGGAGCGTCTGGTTGAACCGGAGCGCGTGATCCAGTTTCGCGTGGTATGGGTTGATGATCGCAACCAGATACAGGTCAACCGTGCATGGCGTGTGCAGTTCAGCTCTGCCATCGGCCCGTACAAAGGCGGTATGCGCTTCCATCCGTCAGTTAACCTTTCCATTCTCAAATTCCTCGGCTTTGAACAAACCTTCAAAAATGCCCTGACTACTCTGCCGATGGGCGGTGGTAAAGGCGGCAGCGATTTCGATCCGAAAGGAAAAAGCGAAGGTGAAGTGATGCGTTTTTGCCAGGCGCTGATGACTGAACTGTATCGCCACCTGGGCGCGGATACCGACGTTCCGGCAGGTGATATCGGGGTTGGTGGTCGTGAAGTCGGCTTTATGGCGGGGATGATGAAAAAGCTCTCCAACAATACCGCCTGCGTCTTCACCGGTAAGGGCCTTTCATTTGGCGGCAGTCTTATTCGCCCGGAAGCTACCGGCTACGGTCTGGTTTATTTCACAGAAGCAATGCTAAAACGCCACGGTATGGGTTTTGAAGGGATGCGCGTTTCCGTTTCTGGCTCCGGCAACGTCGCCCAGTACGCTATCGAAAAAGCGATGGAATTTGGTGCTCGTGTGATCACTGCGTCAGACTCCAGCGGCACTGTAGTTGATGAAAGCGGATTCACGAAAGAGAAACTGGCACGTCTTATCGAAATCAAAGCCAGCCGCGATGGTCGAGTGGCAGATTACGCCAAAGAATTTGGTCTGGTCTATCTCGAAGGCCAACAGCCGTGGTCTCTACCGGTTGATATCGCCCTGCCTTGCGCCACCCAGAATGAACTGGATGTTGACGCCGCGCATCAGCTTATCGCTAATGGCGTTAAAGCCGTCGCCGAAGGGGCAAATATGCCGACCACCATCGAAGCGACTGAACTGTTCCAGCAGGCAGGCGTACTATTTGCACCGGGTAAAGCGGCTAATGCTGGTGGCGTCGCTACATCGGGCCTGGAAATGGCACAAAACGCTGCGCGCCTGGGCTGGAAAGCCGAGAAAGTTGACGCACGTTTGCATCACATCATGCTGGATATCCACCATGCCTGTGTTGAGCATGGTGGTGAAGGTGAGCAAACCAACTACGTGCAGGGCGCGAACATTGCCGGTTTTGTGAAGGTTGCCGATGCGATGCTGGCGCAGGGTGTGATTTAAGTTGTAAATGCCTGATGGCGCTACGCTTATCAGGCCTACAAATGGGCACAATTCATTGCAGTTACGCTCTAATGTAGGCCGGGCAAGCGCAGCGCCCCCGGCAAAATTTCAGGCGTTTATGAGTATTTAACGGATGATGCTCCCCACGGAACATTTCTTATGGGCCAACGGCATTTCTTACTGTAGTGCTCCCAAAACTGCTTGTCGTAACGATAACACGCTTCAAGTTCAGCATCCGTTAAC (SEQ ID NO:2)
表3.突变体谷氨酸脱氢酶-1(GDH1)
MDQTYSLESFLNHVQKRDPNQTEFAQAVREVMTTLWPFLEQNPKYRQMSLLERLVEPERVIQFRVVWVDDRNQIQVNRAWRVQFSSAIGPYLGGMRFHPSVNLSILKFLGFEQTFKNALTTLPMGGGKGGSDFDPKGKSEGEVMRFCQALMTELYRHLGADTDVPAGDIGVGGREVGFMAGMMKKLSNNTACVFAGKGLSFGGSLIRPEATGYGLVYFTEAMLKRHGMGFEGMRVSVSGSGNVAQYAIEKAMEFGARVITASDSSGTVVDESGFTKEKLARLIEIKASRDGRVADYAKEFGLVYLEGQQPWSLPVDIALPCATQNELDVDAAHQLIANGVKAVAEGANMPTTIEATELFQQAGVLFAPGKAANAGGAATCGLEMAQNAARLGWKAEKVDARLHHIMLDIHHACVEHGGEGEQTNYVQGANIAGFVKVADAMLAQGVI (SEQ ID NO:3)
表4.突变体谷氨酸脱氢酶-2(GDH2)
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表5.内膜转运rhtA多肽
位置:YP_003498628295aa线性BCT 19-MAR-2010
定义:内膜转运rhtA[大肠杆菌O55:H7str.CB9615]。
登录号:YP_003498628
版本:YP_003498628.1GI:291281810
DBLINK Project:46655
DBSOURCE REFSEQ:accession NC_013941.1
来源:大肠杆菌O55:H7str.CB9615
生物:大肠杆菌O55:H7str.CB9615
MPGSLRKMPVWLPIVILLVAMASIQGGASLAKSLFPLVGAPGVTALRLALGTLILIAFFKPWRLRFAKEQRLPLLFYGVSLGGMNYLFYLSIQTVPLGIAVALEFTGPLAVALFSSRRPVDFVWVVLAVLGLWFLLPLGQDVSHVDLTGCALALGAGACWAIYILSGQRAGAEHGPATVAIGSLIAALIFVPIGALQAGEALWHWSVIPLGLAVAILSTALPYSLEMIALTRLPTRTFGTLMSMEPALAAVSGMIFLGETLTPIQLLALGAIIAASMGSTLTVRKESKIKELDIN (SEQ IDNO:5)
表6.苏氨酸脱水酶多肽[大肠杆菌]
位置:ACI77715329aa线性BCT 08-JUN-2009
定义:苏氨酸脱水酶[大肠杆菌].
登录号:ACI77715
版本:ACI77715.1GI:209758806
DBSOURCE:accession EU895154.1
来源:大肠杆菌
生物:大肠杆菌
MHITYDLPVAIDDIIEAKQRLAGRIYKTGMPRSNYF SERCKGEIFLKFENMQRTGSFKIRGAFNKLSSLTDAEKRKGVVACSAGNHAQGVSLSCAMLGIDGKVVMPKGAPKSKVAATCDYSAEVVLHGDNFNDTIAKVSEIVEMEGRIFIPPYDDPKVIAGQGTIGLEIMEDLYDVDNVIVPIGGGGLIAGIAVAIKSINPTIRVIGVQSENVHGMAASFHSGEITTHRTTGTLADGCDVSRPGNLTYEIVRELVDDIVLVSEDEIRNSMIALIQRNKVVTEGAGALACAALLSGKLDQYIQNRKTVSIISGGNIDLSRVSQITGFVDA (SEQ ID NO:6)
表7.苏氨酸脱水酶多肽[枯草芽孢杆菌]
位置:AAA96639422aa线性BCT 14-DEC-2001
定义:苏氨酸脱水酶[枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168]。
登录号:AAA96639
版本:AAA96639.1 GI:1256645
DBSOURCE:l°Cus BACYACA accession L77246.1
来源:枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168
生物:枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168
MKPLLKENSLIQVKDILKAHQNVKDVVIHTPLQRNDRLSERYECNIYLKREDLQVVRSFKLRGAYHKMKQLSSEQTENGVVCASAGNHAQGVAFSCKHLGIHGKIFMPSTTPRQKVSQVELFGKGFIDIILTGDTFDDAYKSAAECCEAESRTFIHPFDDPDVMAGQGTLAVEILNDIDTEPHFLFASVGGGGLLSGVGTYLKNVSPDTKVIAVEPAGAASYFESNKAGHVVTLDKIDKFVDGAAVKKIGEETFRTLETVVDDILLVPEGKVCTSILELYNECAVVAEPAGALSVAALDLYKDQIKGKNVVCVVSGGNNDIGRMQEMKERSLIFEGLQHYFIVNFPQRAGALREFLDEVLGPNDDITRFEYTKKNNKSNGPALVGIELQNKADYGPLIERMNKKPFHYVEVNKDEDLFHLLI (SEQ ID NO:7)
Claims (20)
1.组合物,其包括与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性并且还包括在残基位点K92或T195的氨基酸取代突变的谷氨酸脱氢酶多肽。
2.根据权利要求1的组合物,其中与SEQ ID NO:1的野生型谷氨酸脱氢酶多肽相比,所述谷氨酸脱氢酶多肽还包括至少2~10个取代、缺失或插入突变。
3.根据权利要求2的组合物,其中所述多肽包含包括K92L、K92V、T195A、V377A或S380C的氨基酸取代突变。
4.根据权利要求1的组合物,其还包括大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
5.根据权利要求4的组合物,其中所述大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌包括编码权利要求1的谷氨酸脱氢酶多肽的表达载体。
6.根据权利要求5的组合物,其中,在营养培养基中所述大肠杆菌能够从30g/L葡萄糖产生至少2、3、4、5、6、7或8g/L苏氨酸。
7.根据权利要求5的组合物,其中,所述大肠杆菌进一步在SEQ ID NO:5的rhtA多肽中包括突变,该突变导致与野生型SEQ ID NO:5相比苏氨酸输出活性降低。
8.根据权利要求5的组合物,其还包括编码与SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7具有至少95%同一性的苏氨酸脱水酶多肽的表达载体。
9.根据权利要求4的组合物,其中所述大肠杆菌在营养培养基中能够合成浓度至少为0.5g/L的L-高丙氨酸。
10.谷氨酸脱氢酶多核苷酸,与SEQ ID NO:2具有至少95%同一性,其编码谷氨酸脱氢酶多肽,该谷氨酸脱氢酶多肽包括:
在氨基酸位点K92、T195、V377或S380的至少一个突变;以及
该谷氨酸脱氢酶多肽对于2-酮丁酸的特异性高于其对于2-酮戊二酸的特异性。
11.制备L-高丙氨酸的方法,包括:
在营养培养基中放置大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌生物,其中所述生物包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的谷氨酸脱氢酶多肽;以及
该谷氨酸脱氢酶多肽包括在残基位点K92或T195的氨基酸取代突变;以及
在营养培养基中培养微生物从而制造L-高丙氨酸。
12.根据权利要求11的方法,其中所述谷氨酸脱氢酶多肽与SEQ ID NO:1的野生型谷氨酸脱氢酶多肽相比,还包括至少2-10个取代、缺失或插入突变。
13.根据权利要求11的方法,其中所述生物是大肠杆菌,其在SEQ IDNO:5的rhtA多肽中包括突变,该突变导致与野生型SEQ ID NO:5相比苏氨酸输出活性降低。
14.根据权利要求11的方法,其中利用表达载体转化所述生物,该表达载体编码与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少95%同一性的苏氨酸脱水酶多肽。
15.根据权利要求11的方法,其中所述生物在下述至少一种条件下生长:
(a)30-40°C的温度;
(b)至少4小时~至少48小时的时间周期;
(c)pH6-8;或者
(d)在包括M9、LB、F1或TB培养基的营养培养基中。
16.根据权利要求15的方法,其中:
所述营养培养基包括M9培养基;以及
所述生物为大肠杆菌,其在M9培养基中从30g/L葡萄糖能够产生至少2、3、4、5、6、7或8g/L苏氨酸。
17.根据权利要求11的方法,其中所述生物在营养培养基中能够制备浓度至少为0.5g/L的L-高丙氨酸。
18.根据权利要求11的方法,进一步包括通过由至少一个纯化步骤进行的方法来纯化所制备的L-高丙氨酸,所述纯化步骤包括:
(a)裂解所述生物的细胞;
(b)离心分离;
(c)过滤;
(d)浓缩;
(e)结晶;或
(d)色谱。
19.合成L-高丙氨酸的试剂盒,该试剂盒包括:
a)表达载体,其编码与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的谷氨酸脱氢酶多肽,所述谷氨酸脱氢酶多肽包括在残基位点K92或T195的氨基酸取代突变;以及
b)容纳(a)的容器。
20.根据权利要求19的试剂盒,进一步包括编码苏氨酸脱水酶多肽的表达载体和/或大肠杆菌,所述苏氨酸脱水酶多肽具有与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7相比至少95%的同一性,所述大肠杆菌在SEQ ID NO:5的rhtA多肽中包括突变,该突变导致与野生型SEQ ID NO:5相比苏氨酸输出活性降低。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105671098A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-06-15 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种发酵法生产l-2-氨基丁酸的方法 |
CN106148259A (zh) * | 2015-04-28 | 2016-11-23 | 中国科学院微生物研究所 | 生产l-2-氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用 |
CN109266630A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-25 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种脂肪酶及其在制备布瓦西坦中间体中的应用 |
CN110343676A (zh) * | 2018-04-03 | 2019-10-18 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
CN111321178A (zh) * | 2020-03-02 | 2020-06-23 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 一种l-2-氨基丁酰胺的制备方法 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI519816B (zh) * | 2011-06-13 | 2016-02-01 | 尼康股份有限公司 | 照明光學系統、曝光裝置以及元件製造方法 |
CN103215291B (zh) * | 2012-01-18 | 2015-11-18 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 用于生产l-2-氨基丁酸的载体、工程菌株及方法 |
WO2014092496A1 (ko) * | 2012-12-13 | 2014-06-19 | 연세대학교 산학협력단 | 탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아민 화합물의 제조방법 |
KR101493311B1 (ko) * | 2012-12-13 | 2015-02-16 | 연세대학교 산학협력단 | 광학 활성 아민 및 호모알라닌의 제조방법 |
WO2016050959A2 (en) * | 2014-10-03 | 2016-04-07 | Metabolic Explorer | Mutant glutamate dehydrogenase for the conversion of homoserine into 4-hydroxy-2-ketobutyrate |
CN108588045B (zh) * | 2018-03-09 | 2019-12-10 | 浙江大学 | 谷氨酸脱氢酶突变体及其在制备l-草铵膦中的应用 |
WO2020070699A1 (en) | 2018-10-04 | 2020-04-09 | Anna University | Production of l-2-aminobutyrate from citramalate,citraconate or 2-oxobutanoate |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070009995A1 (en) * | 2003-09-25 | 2007-01-11 | Monsanto Technology Llc | Prevention of incorporation of non-standard amino acids into protein |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4551433A (en) | 1981-05-18 | 1985-11-05 | Genentech, Inc. | Microbial hybrid promoters |
GB8412357D0 (en) | 1984-05-15 | 1984-06-20 | Ucb Sa | Pharmaceutical composition |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US6015891A (en) | 1988-09-09 | 2000-01-18 | Mycogen Plant Science, Inc. | Synthetic insecticidal crystal protein gene having a modified frequency of codon usage |
WO1990004636A1 (en) * | 1988-10-25 | 1990-05-03 | Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Genetiki I Selektsii Promyshlennykh Mikroorganizmov (Vniigenetika) | Strain of bacteria escherichia coli, producer of l-threonine |
US5426039A (en) | 1993-09-08 | 1995-06-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol |
JP3510331B2 (ja) * | 1994-06-30 | 2004-03-29 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるl−アミノ酸の製造法 |
US6107492A (en) | 1998-05-08 | 2000-08-22 | Ucb, S.A. | Process for the preparation of levetiracetam |
US6451564B1 (en) * | 1999-07-02 | 2002-09-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for producing L-isoleucine |
US20060014259A9 (en) * | 1999-07-09 | 2006-01-19 | Kevin Burke | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
DE60219968T2 (de) * | 2001-02-13 | 2008-01-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia |
US7531673B2 (en) | 2004-02-18 | 2009-05-12 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Preparation of amino acid amides |
-
2011
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-
2015
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070009995A1 (en) * | 2003-09-25 | 2007-01-11 | Monsanto Technology Llc | Prevention of incorporation of non-standard amino acids into protein |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
IAN G. FOTHERINGHAM ET AL: "Engineering of a novel biochemical pathway for the biosynthesis of l-2-aminobutyric acid in Escherichia coli K12", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 * |
KECHUN ZHANG ET AL: "Expanding metabolism for total biosynthesis of the nonnatural amino acid L-homoalanine", 《PNAS》 * |
KHAN ET AL: "Molecular Properties and Enhancement of Thermostability by Random Mutagenesis of Glutamate Dehydrogenase from Bacillus subtilis", 《BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM》 * |
WOLFGANG LEUCHTENBERGER ET AL: "Biotechnological production of amino acids and derivatives current status and prospects", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 * |
XING-GUO WANG ET AL: "Conversion of a glutamate dehydrogenase into methionine norleucine dehydrogenase by site-directed mutagenesis", 《EUR. J. BIOCHEM》 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106148259A (zh) * | 2015-04-28 | 2016-11-23 | 中国科学院微生物研究所 | 生产l-2-氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用 |
CN106148259B (zh) * | 2015-04-28 | 2019-09-10 | 中国科学院微生物研究所 | 生产l-2-氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用 |
CN105671098A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-06-15 | 河南巨龙生物工程股份有限公司 | 一种发酵法生产l-2-氨基丁酸的方法 |
CN110343676A (zh) * | 2018-04-03 | 2019-10-18 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
CN109266630A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-25 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种脂肪酶及其在制备布瓦西坦中间体中的应用 |
CN109266630B (zh) * | 2018-08-31 | 2021-02-02 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种脂肪酶及其在制备布瓦西坦中间体中的应用 |
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