CN116064347A - 一种动态代谢调控大肠杆菌发酵制备α-酮异戊酸的方法 - Google Patents

一种动态代谢调控大肠杆菌发酵制备α-酮异戊酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动态代谢调控大肠杆菌发酵制备α‑酮异戊酸的方法，属于生物工程领域。本发明构建的重组大肠杆菌含有基于CRISPRi技术及降解标签建立的动态调控菌体生长代谢途径和平衡辅酶循环系统；能够以廉价的葡萄糖为碳源，以无机盐为氮源，发酵生成附加值高的α‑酮异戊酸，在两阶段发酵的发酵策略下，发酵60hα‑酮异戊酸产量可达35.2g/L，具备工业化应用的前景。

Description

一种动态代谢调控大肠杆菌发酵制备α-酮异戊酸的方法
技术领域
本发明涉及一种动态代谢调控大肠杆菌发酵制备α-酮异戊酸的方法，属于生物工程领域。
背景技术
α-酮异戊酸是α-酮酸的一种，被广泛应用于医药、化学合成、饲料领域。在医药方面，作为复方α-酮酸片的主要成分之一，可用于治疗尿毒症。另外，α-酮异戊酸是合成维生素B5的重要原料；在生物体内，α-酮异戊酸是缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的合成前体，对氨基酸的合成有重要作用。
目前，α-酮异戊酸合成最常用的方法是化学合成法。化学合成法无论从工业经济发展还是环境保护的角度，均有很大的局限性：原料复杂、工艺繁杂、反应条件严苛、催化剂高昂且存在毒性。发酵法操作简单、底物成本低且环境友好，更适用于工业化生产。
现阶段，主要以谷氨酸棒杆菌为宿主菌株发酵合成α-酮异戊酸(Applied andEnvironmental Microbiology,2010,76(24):8053-8061)，以E.coli为底盘菌株的报道较少。E.coli发酵周期短、遗传信息清晰且发酵成本低，可被用于改造为细胞工厂高效发酵合成目标产物。本研究前期构建了合成α-酮异戊酸的重组大肠杆菌(一种代谢工程改造大肠杆菌发酵制备α-酮异戊酸的方法,2022,2022100699947)，由于敲除分解α-酮异戊酸合成缬氨酸的代谢途径，导致菌株成为营养缺陷型，发酵培养过程中需要添加大量的有机氮源来维持菌体生长能力，增加了培养基成本，不利于大规模工业应用。因此，本研究通过动态调控α-酮异戊酸的竞争代谢途径，利用无机氮源高效发酵合成α-酮异戊酸，以降低生产成本。另外，由于合成1分子α-酮异戊酸，积累2分子NADH同时需要额外消耗1分子NADPH，还原力不平衡将导致代谢停滞，抑制产量和生产强度的提升。因此，本研究进一步协调还原力平衡，以提高α-酮异戊酸的产量及生产强度。
发明内容
本发明的目的是提供一种动态调控大肠杆菌代谢途径来高效制备α-酮异戊酸的方法，能够以廉价无机盐培养基发酵生产α-酮异戊酸。
本发明提供了一株重组大肠杆菌，对出发菌株进行了如下至少一种改造：
(1)抑制ilvE基因的表达；
(2)抑制pdh基因表达；
(3)表达含有A71S、R76D、S78D和Q110V突变的酮酸还原异构酶(IlvC酶)；
(4)过量表达pntA和pntAB基因。
在一种实施方式中，所述出发菌株E.coli B0016-050公开于论文《Efficient L-Alanine Production by a Thermo-Regulated Switch in Escherichia coli》，申请人承诺自申请日起二十年内在合法途径下向公众发放该菌株。
在一种实施方式中，所述抑制ilvE基因的表达包括在质粒水平表达dCas9蛋白或在基因组水平表达dCas9蛋白。
在一种实施方式中，在基因组水平表达dCas9蛋白具体是：用T7启动子表达整合在基因组DNA上的dCas9蛋白。
在一种实施方式中，用Ptrc启动子表达用于抑制ilvE基因的sgRNA，具体为：将位于pACYC-ara-dcas9-444质粒的阿拉伯糖诱导型启动子替换为Ptrc启动子。
在一种实施方式中，应用核苷酸序列为ACATCACCGACGAAGATCAGCGG或GGATGGTGTTTGGTGCTGCGCGG的sgRNA序列抑制ilvE基因的表达。
在一种实施方式中，所述在质粒水平表达dCas9蛋白是以质粒pACYCDuet-1为表达载体。
在一种实施方式中，所述抑制ilvE基因的表达还包括在ilvE基因的C端添加DAS+4降解标签。
在一种实施方式中，应用核苷酸序列为TCAGTGGAGTCCCAGATACGCGG的sgRNA序列抑制pdh基因的表达。
在一种实施方式中，所述抑制pdh基因的表达还包括在pdh基因的C端添加DAS+4降解标签。
在一种实施方式中，以pCTSDT为表达载体，表达含有A71S、R76D、S78D和Q110V突变的酮酸还原异构酶。
在一种实施方式中，所述pntA基因的Gene ID为946628；所述pntA基因的GeneID946144。
本发明提供了一种生产α-酮异戊酸的方法，利用所述重组大肠杆菌为发酵菌株生产α-酮异戊酸。
在一种实施方式中，所述方法以葡萄糖为碳源。
在一种实施方式中，所述方法以无机盐为氮源。
在一种实施方式中，所述方法在微好氧条件下进行发酵。
在一种实施方式中，用于发酵的培养基为含葡萄糖的M9培养基。
在一种实施方式中，所述M9培养基含有按g/L计的如下成分：KH2PO4 3.0、Na2HPO46.0、NaCl 0.3、NH4Cl 1.0、MgSO4·7H2O 0.49、微量元素0.1％(v/v)；所述微量元素液含有：MnSO4·4H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10.0g/L，CaCl2 2.0g/L，(NH4)Mo7O24 0.1g/L，CuSO4·5H2O3.0g/L，Na2B4O7·10H2O 0.23g/L，ZnSO4·7H2O 5.25g/L。
在一种实施方式中，所述方法采用两阶段发酵：
第一阶段：菌体生长阶段，控制温度为37℃，调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度≥30％。
第二阶段：当OD600值达到30时进入α-酮异戊酸合成阶段，加入终浓度为0.8mMIPTG诱导，并降温至30℃，控制溶氧浓度≤10％。
在一种实施方式中，所述方法还对培养至OD600为2.5的菌液使用IPTG进行诱导。
在一种实施方式中，在发酵罐中好氧培养菌株，至OD600值达到30，添加IPTG诱导。
本发明还保护所述重组大肠杆菌，或生产α-酮异戊酸的方法在医药、食品、化妆品等领域的应用。
有益效果：本发明构建了一种利用无机盐培养基高效合成α-酮异戊酸的重组大肠杆菌菌株，并对该宿主菌株进行改造优化，获得能够发酵法生产α-酮异戊酸的重组菌及发酵方法。本发明构建的重组大肠杆菌含有基于CRISPRi技术及降解标签建立的动态调控菌体生长代谢途径(图1a)和平衡辅酶循环系统(图1b)；所述动态调控菌体生长代谢途径能够在菌体生长阶段，通过缬氨酸合成代谢途径和TCA循环的运行，使菌体可以正常生长；在产物合成阶段，缬氨酸合成代谢途径和TCA循环的转录被抑制，且其残留酶被降解标签降解，两个代谢途径被关闭，以实现α-酮异戊酸产物高效积累；所述平衡辅酶循环系统含有NADH辅酶依赖途径和NADPH辅酶依赖途径，可实现α-酮异戊酸合成过程辅酶循环平衡。
本发明构建的重组菌株能够以廉价的葡萄糖为碳源，以无机盐为氮源，发酵生成附加值更高的α-酮异戊酸，发酵60h，α-酮异戊酸产量可达35.2g/L，整个发酵过程α-酮异戊酸转化率达到0.73mol/mol葡萄糖，第二阶段转换率提高到0.99mol/mol葡萄糖，接近1mol/mol的理论葡萄糖，体积生产强度为0.67g/L h。副产物异丁醇的积累量显著降低到1.2g/L，得率仅为0.04mol/mol葡萄糖。
附图说明
图1为α-酮异戊酸合成策略；a：动态代谢调控策略；b：平衡辅酶循环系统。
图2为T7 RNAP整合并发酵合成α-酮异戊酸；a：T7 RNAP整合染色体PCR验证；b：α-酮异戊酸发酵结果；M：Marker；1：原始菌株PCR验证条带；2：整合T7 RNAP-kan后菌株PCR验证条带；3：摘掉kan片段后菌株PCR验证条带。
图3为抑制ilvE基因表达的sgRNA序列筛选；a：菌体生长情况；b：缬氨酸积累量。
图4为染色体水平表达dCas9对ilvE的抑制效果；a：缬氨酸积累量；b：α-酮异戊酸产量。
图5为质粒水平表达dCas9对ilvE的抑制效果；a：缬氨酸积累量；b：α-酮异戊酸产量。
图6为结合CRISPRi技术与降解标签调控α-酮异戊酸合成的效果。
图7为dCas9启动子优化对α-酮异戊酸合成的作用。
图8为不同sgRNA序列对pdh基因表达的抑制作用。
图9为CRISPRi技术抑制ilvE与pdh基因对α-酮异戊酸合成的作用。
图10为CRISPRi结合降解标签调控的效果。
图11为NADH依赖途径合成α-酮异戊酸的效果。
图12为NADPH依赖途径合成α-酮异戊酸的效果；a：050Y4菌株PCR验证结果；b：发酵结果比较。M:Marker；1：原始菌株条带；2：整合T7-kan片段后条带；3：摘除kan片段后条带。
图13为组合策略发酵合成α-酮异戊酸的作用。
图14为菌株050Y4/pCTSDTQ487S-RBS55+pACYC-trc-dcas9-444-478 5L发酵罐合成α-酮异戊酸。
具体实施方式
培养基：
LB液体培养基：先用电子天平称取10g胰蛋白胨(Tryptone)、5g酵母粉(Yeastextract)、10g氯化钠(NaCl)于烧杯中，然后再加去离子水于烧杯中定容至1L，最后再于高压蒸汽灭菌锅中121℃湿热灭菌20min。
LB固体培养基：称取20g琼脂粉加到1L的LB液体培养基中，然后放于高压蒸汽灭菌锅中121℃湿热灭菌20min。
M9培养基(g·L-1)：KH2PO4 3.0、Na2HPO4 6.0、NaCl 0.3、NH4Cl 1.0、MgSO4·7H2O0.49、微量元素0.1％(v/v)。
微量元素液：MnSO4·4H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10.0g/L，CaCl2 2.0g/L，(NH4)Mo7O24 0.1g/L，CuSO4·5H2O 3.0g/L，Na2B4O7·10H2O 0.23g/L，ZnSO4·7H2O 5.25g/L，用0.1mol/L HCl配制。
培养基中根据需要添加相应的抗生素，抗生素添加量为：卡那霉素终浓度为50μg/mL，氨苄青霉素终浓度为120μg/mL，氯霉素终浓度为35μg/mL。
α-酮异戊酸摇瓶发酵方法:
(1)菌株的预培养
将重组菌株划线于LB平板培养基，37℃培养24h。平板单菌落接种于LB液体培养基，于37℃、200r/min培养10h，获得预培养菌液。
(2)发酵培养
向50mL含有36g/L葡萄糖的M9培养基中接种2mL步骤(1)制备的菌液，于37℃、200r/min摇床震荡培养。菌体OD600值达到1、2、2.5或者3时，加入的IPTG诱导剂至终浓度为0.4mmol/L，根据需要添加40mmol·L-1的阿拉伯糖，将摇瓶放在30℃，100、150或者200r/min摇床震荡诱导培养至60h。期间，每4h用pH试纸测量pH值，并用氨水调节发酵液pH至中性。
α-酮异戊酸的测定方法:
利用高效液相色谱(HPLC)检测α-酮异戊酸。检测条件为：色谱柱Prevail OrganicAcid(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为pH 2.5、浓度为25mmol/L的KH2PO4溶液，流速1mL/min，柱温40℃，紫外检测器波长210nm，进样量10μL。
利用Red重组方法对染色体基因进行改造：步骤参见K.A.Datsenko et al.,One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,6640–6645.
缬氨酸高效液相色谱检测方法：
(1)样品处理：取1mL发酵液1200r·min-1离心2min。将上清液用蒸馏水稀释一定倍数后，用过苯基异硫酸酯(PITC)衍生：取500μL稀释液，加入250μL 1mol·L-1的三乙胺-乙腈溶液及250μL 0.1mol·L-1的PITC-乙腈溶液，避光静置45min；反应后加入700μL的正己烷，此时出现分层现象，将下层溶液用1mL注射器吸取，即为缬氨酸含量待测样。
(2)HPLC测定条件：色谱柱为Diamonsil C18(4.6mm×250mm,5μm)，流动相分为A、B，A为80％的乙腈溶液，B为3％的乙腈和97％的0.1mol·L-1乙酸钠混合液。流速设为0.6mL·min-1，柱温设为40℃，紫外检测波长设为254nm，进样量设为10μL。采用梯度洗脱，洗脱条件设为：0-35min，流动相B从95％降至65％；35-40min，流动相B从65％升至95％；40-45min，B流动相为95％保持不变。
葡萄糖检测方法：
先用葡萄糖1g·L-1标样对生物传感仪定标，定标成功后，将待测发酵液稀释适当的倍数至浓度范围为0-2g·L-1，读数再乘以稀释倍数即为葡萄糖浓度。
实施例1：原养型菌株的获得
由于菌株050TY(公开于公开号为CN114480235A的专利申请中)被敲除了缬氨酸、亮氨酸合成途径，导致其为营养缺陷型菌株，为了减少有机氮源的利用，实现菌体利用基本培养基能够正常生长及合成产物。本实施例以已敲除甲酸、乙酸、乙醇、乳酸、琥珀酸有机酸副产物合成代谢途径(pflB、ackA-pta、adhE、ldhA、frdA基因编码)的E.coli B0016-050(公开于论文《Efficient L-Alanine Production by a Thermo-Regulated Switch inEscherichia coli》)为出发菌株。由于α-酮异戊酸合成代谢途径由T7启动子转录，菌株B0016-050中并没用T7RNA聚合酶，需要将该编码基因T7 RNAP插入菌株B0016-050基因组上。
poxB为催化丙酮酸合成乙酸代谢途径的编码基因，本实施例将T7 RNAP整合到poxB的位置，可以表达T7 RNA聚合酶的同时进一步减少副产物乙酸的积累量。具体步骤为：分别用P63/P64引物以质粒pMD-T7 RNAP-kan(公开于2020年学位论文《代谢工程改造大肠杆菌生产α-酮异戊酸》)为模板克隆打靶基因片段，利用Red重组系统将打靶基因整合于050菌株染色体上poxB基因处，重组菌株用P65/P66引物菌落PCR验证，构建菌株050Y。
如图2a为染色体整合结果，菌株B0016-050的原始条带为2030bp，整合T7 RNAP-kan后约为5000bp，去除kan基因后约为3600bp，获得菌株050Y。
表1菌株050Y构建所用引物
Figure BDA0003814964140000061
将pCTSDT重组质粒(公开于2020年学位论文《代谢工程改造大肠杆菌生产α-酮异戊酸》)通过电击转化方式转化入菌株050Y，获得菌株050Y/pCTSDT。该菌株利用M9无机盐培养基摇瓶发酵，当菌体OD600值生长达到2.5时，加入的IPTG诱导剂至终浓度为0.4mmol/L，将摇瓶放在30℃，200r/min摇床震荡诱导培养至60h。发酵结果如图2b所示，α-酮异戊酸的产量为10g·L-1，由于该菌株没有敲除分解α-酮异戊酸生成缬氨酸的代谢途径，所以缬氨酸的积累量高达4.1g·L-1。
实施例2：动态调控缬氨酸合成代谢途径
缬氨酸作为菌体生长的必需氨基酸，对菌体生长起重要作用。同时，缬氨酸合成途径又是产物α-酮异戊酸的分解代谢途径，为了协调菌体生长和产物积累。本研究通过CRISPRi技术及DAS+4降解标签分别在转录水平和酶活水平对缬氨酸合成代谢途径进行动态调控，实现菌体生长与产物合成阶段的高效分离。
(1)抑制ilvE基因的sgRNA筛选
利用CHOPCHOP网站设计抑制ilvE基因的sgRNA序列。sgRNA结合的位置会影响对目的基因的抑制效果，分别在ilvE基因片段的前、中、后位置设计结合位点，筛选出了6条sgRNA序列，如表2所示，构建含有这6种sgRNA序列的重组质粒。
表2 ilvE-sgRNA序列设计
Figure BDA0003814964140000071
质粒构建方法：以pKD-dcas9-sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，使用表3中P17/P18、P19/P20、P21/P22、P23/P24、P25/P26、P27/P28为上下游引物全质粒PCR，片段消化后纯化，转化并测序，构建pKD-ilvE121sgRNA、pKD-ilvE291sgRNA、pKD-ilvE444sgRNA、pKD-ilvE531sgRNA、pKD-ilvE729sgRNA、pKD-ilvE828sgRNA重组质粒。
表3结合ilvE基因的sgRNA筛选质粒构建所用引物
Figure BDA0003814964140000072
上述重组质粒分别电击转化050Y重组菌株，再将含有各CRISPRi质粒的重组菌株分别接种至M9发酵培养基，培养至OD600为0.6时添加终浓度为40mmol·L-1的阿拉伯糖诱导dCas9表达，进而抑制ilvE表达。检测菌体生长量及缬氨酸积累量，37℃、200r/min培养至60h的结果如图3所示，6种不同强度的sgRNA对ilvE的抑制有明显差异。其中，结合起始位点为ilvE基因片段上游起始密码子之后第291和444bp处的sgRNA可明显抑制菌体生长量，并能够使缬氨酸的积累量也降至0.03、0.08mmol·L-1。
(2)dCas9表达水平优化在重组菌050Y的基础上，将dCas9整合到染色体上，取代lldD基因，并且用不同强度的启动子T7、TM2(强度为T7启动子的37％)、TM3(强度为T7启动子的16％)(核苷酸序列如表4所示)表达dCas9，分别获得重组菌株050Y1、050Y1-1、050Y1-2。
表4不同强度的T7启动子序列
Figure BDA0003814964140000081
050Y1、050Y1-1、050Y1-2菌株构建方法：以步骤(1)构建的pKD-ilvE291sgRNA质粒为模板，用G7-cas9-F/G7-CAS9-R引物，扩增dcas9基因片段；分别以pACYC-kan-T7100-pntAB、pACYC-kan-T737-pntAB、pACYC-kan-T716-pntAB(实验室保藏质粒，质粒的DNA序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)为模板，用G7-T7-F/G7-T7-R引物扩增质粒骨架；质粒骨架分别与dcas9基因片段用In-Fusion组装试剂盒组装，构建pACYC-kan-T7100-cas9、pACYC-kan-T737-cas9、pACYC-kan-T716-cas9重组质粒；重组质粒用Ycas9-R/YT7-F引物PCR验证，正确条带大小为2200bp，错误则没有条带。分别以pACYC-kan-T7100-cas9、pACYC-kan-T737-cas9、pACYC-kan-T716-cas9质粒为模板，用引物P67/P68PCR扩增打靶片段，整合于菌株050Y染色体lldD基因处，并分别用P69/P70引物菌落PCR验证，获得菌株050Y1、050Y1-1、050Y1-2。
表5 050Y1、050Y1-1、050Y1-2菌株构建所用引物
Figure BDA0003814964140000082
以pCTSDT为模板，以表6中引物P35/P36为上下游引物扩增质粒骨架；分别以步骤(1)构建的pKD-ilvE291sgRNA、pKD-ilvE444sgRNA为模板，以P37/P38为上下游引物扩增获得质粒片段，用In-Fusion组装试剂盒组装，获得pCTSDT-291sgRNA、pCTSDT-444sgRNA重组质粒。
表6 pCTSDT-291sgRNA、pCTSDT-444sgRNA质粒构建所用引物
Figure BDA0003814964140000091
将重组质粒pCTSDT-291sgRNA和pCTSDT-444sgRNA分别转化到菌株050Y1、050Y1-1、050Y1-2中，获得重组菌050Y1/pCTSDT-291sgRNA、050Y1/pCTSDT-444sgRNA、050Y1-1/pCTSDT-291sgRNA、050Y1-1/pCTSDT-444sgRNA 050Y1-2/pCTSDT-291sgRNA、050Y1-2/pCTSDT-444sgRNA。分别将上述菌株进行摇瓶发酵，测定缬氨酸的积累量和α-酮异戊酸的产量。CRISPRi对ilvE起到抑制效果如图4所示，出发菌株缬氨酸的积累量为4.1g·L-1，291sgRNA和444sgRNA的调控下，积累量均下降。同时，α-酮异戊酸的产量有一定地提高，444sgRNA抑制水平整体优于291sgRNA。另外，染色体水平表达dCas9蛋白随着启动子强度的提高，抑制效果最好。其中，T7启动子表达dCas9结合444sgRNA，缬氨酸的积累量最低为3.20g·L-1，α-酮异戊酸的产量最高为10.45g·L-1。
(3)质粒水平表达dCas9抑制ilvE
虽然在染色体水平表达dCas9对ilvE有抑制效果，但是仍有3.20g·L-1缬氨酸积累；同时，α-酮异戊酸产量只有小幅度的提升。为了加强CRISPRi方法的调控效果，在质粒上表达dCas9。
以pACYCDuet-1质粒为模板，以表7中引物P39/P40为上下游引物扩增质粒骨架；以pKD-dcas9-sgRNA为模板，以P41/P42为上下游引物扩增质粒片段。用In-Fusion组装，获得pACYC-ara-dcas9重组质粒。以pACYC-ara-dcas9为模板，以引物P43/P44为上下游引物扩增质粒骨架；以步骤(1)构建的pKD-ilvE291sgRNA或者pKD-ilvE444sgRNA为模板，以P45/P46为上下游引物扩增sgRNA质粒片段。用In-Fusion组装，获得pACYC-ara-dcas9-291或者pACYC-ara-dcas9-444重组质粒。
表7 pACYC-ara-dcas9、pACYC-ara-dcas9-291和pACYC-ara-dcas9-444质粒构建所用引物
Figure BDA0003814964140000092
Figure BDA0003814964140000101
将pACYC-ara-dcas9-291、pACYC-ara-dcas9-444重组质粒分别转化入实施例1构建的菌株050Y/pCTSDT中，分别获得重组菌株050Y/pCTSDT+pACYC-ara-dcas9-291及050Y/pCTSDT+pACYC-ara-dcas9-444。以在菌株050Y/pCTSDT中转入pACYCDuet-1获得的重组菌为对照，将上述重组菌株摇瓶发酵，结果如图5所示。质粒水平表达dCas9后，CRISPRi方法调控效果进一步加强。与对照菌株050Y/pCTSDT+pACYCDuet-1相比，菌株050Y/pCTSDT+pACYC-ara-dcas9-291及050Y/pCTSDT+pACYC-ara-dcas9-444的缬氨酸积累量均受到明显抑制，其中444sgRNA可使缬氨酸积累量减少至1.8g·L-1，并使α-酮异戊酸的产量提高至11.0g·L-1，说明质粒水平表达dCas9优于染色体水平表达。
(4)组合CRISPRi技术与降解标签抑制ilvE
在CRISPRi方法的调控下，缬氨酸可在菌体生长期合成，为菌体生长提供营养物质，利用无机氮源生长菌体；进入α-酮异戊酸合成阶段，ilvE转录被关闭，但是，由于之前已表达的IlvE蛋白存留在细胞中，导致缬氨酸继续合成，最终缬氨酸积累量达到1.8g·L-1。本研究进一步采用DAS+4降解标签，降解残留的IlvE蛋白，以减少缬氨酸的积累量，提高α-酮异戊酸产量。
扩增核苷酸序列如GCAGCTAATGATGAAAATTACAGCGAAAATTACGCAGATGCCAGCTAA所示的DAS+4降解标签，利用Red重组系统整合于菌株050Y染色体ilvE基因下游，使位于菌株050Y染色体上ilvE的C端融合表达DAS+4降解标签，用P73/P74引物进行菌落PCR验证，获得的重组菌株命名为050Y2。
表8验证菌株050Y2所用引物
Figure BDA0003814964140000102
将质粒pCTSDT和实施例2构建的质粒pACYC-ara-dcas9-444转化入菌株050Y2中，菌株050Y2/pCTSDT+pACYC-ara-dcas9-444在50mL含有36g/L葡萄糖的M9培养基中接种种子液，于37℃、200r/min摇床震荡培养至OD600分别为1、1.5、2、2.5、3时，添加40mmol·L-1的阿拉伯糖诱导表达dCas9，并在OD600达到2.5时添加0.4mmol·L-1的IPTG，测定发酵60h副产物缬氨酸的积累量及α-酮异戊酸的产量(图6)。
结果显示，CRISPRi技术与降解标签方法组合后，缬氨酸的积累量均明显减少，α-酮异戊酸的产量也有一定增加，说明添加降解标签可以更有效地实现动态调控。在菌体生长阶段诱导dCas9表达，α-酮异戊酸的产量不会提高反而会降低；当菌体生长达到一定浓度后诱导，α-酮异戊酸产量有所提高；在OD600为2.5时诱导，产量可达11.9g·L-1，缬氨酸的积累量也减少至0.2g·L-1。
(5)dCas9启动子优化α-酮异戊酸分解代谢途径ilvE的动态调控条件为：OD600值达到2.5时，添加终浓度为40mmol·L-1的阿拉伯糖诱导dCas9表达。同时，α-酮异戊酸的合成途径中关键基因的过表达条件为：OD600达到2.5时，添加0.4mmol·L-1的IPTG诱导。因此，动态调控合成α-酮异戊酸的过程中，诱导的时机都为OD600值2.5，需要同时添加阿拉伯糖和IPTG两种诱导剂。为了简化发酵工艺、减少诱导剂的添加成本，本实施例将阿拉伯糖诱导型启动子替换为IPTG诱导型，仅用IPTG一种诱导剂实现同步开启α-酮异戊酸的合成途径和关闭其分解途径。用不同强度的启动子trc、CP9a、CP7、CP26(启动子序列如表9所示)以及lacO操纵基因替换阿拉伯糖启动子。以实施例2构建的pACYC-ara-dcas9-444为模板，分别以表10中P51/P52、P53/P54、P55/P56、P57/P58为上下游引物，全质粒PCR扩增，获得重组质粒pACYC-trc-dcas9-444、pACYC-cp9a-dcas9-444、pACYC-cp7-dcas9-444、pACYC-cp26-dcas9-444。
表9 dCas9表达启动子序列
Figure BDA0003814964140000111
表10 pACYC-trc-dcas9-444、pACYC-cp9a-dcas9-444、pACYC-cp7-dcas9-444、pACYC-cp26-dcas9-444质粒构建所用引物
Figure BDA0003814964140000112
Figure BDA0003814964140000121
分别将上述质粒转化入菌株050Y2/pCTSDT中。重组菌株发酵条件为：向50mL含有36g/L葡萄糖的M9培养基中接种2mL种子液，于37℃、200r/min摇床震荡培养。菌体OD600值达到2.5时，加入的IPTG诱导剂至终浓度为0.4mmol/L，将摇瓶放在30℃，200r/min摇床震荡诱导培养至60h。发酵期间用氨水调节发酵液pH至中性。重组菌株发酵结果如图7所示。用Ptrc启动子可进一步提高α-酮异戊酸的产量至12.4g·L-1，缬氨酸的积累量减少至0.05g·L-1。菌株改造后实现了只需添加IPTG一种诱导剂进行α-酮异戊酸发酵合成，简化了发酵工艺，降低了诱导剂的添加成本。
实施例3：利用CRISPRi技术与DAS+4降解标签动态调控三羧酸循环竞争代谢途径
(1)抑制pdh基因表达的sgRNA序列筛选
利用CHOPCHOP软件设计抑制pdh基因表达的sgRNA序列，分别在pdh基因片段的前、中、后位置设计结合位点，筛选出了3条sgRNA，如表11所示。进一步构建了3种不同强度的sgRNA筛选重组质粒。质粒构建方法：以pKD-dcas9-sgRNA为模板，使用表12中P29/P30、P31/P32、P33/P34为上下游引物全质粒PCR，片段消化后纯化，转化并测序，分别构建pKD-pdh45sgRNA、pKD-pdh342sgRNA、pKD-pdh478sgRNA重组质粒。
将上述重组质粒分别转化至大肠杆菌050Y感受态细胞，将获得的重组菌株分别在接种时、OD600为0.6时添加终浓度40mmo/L阿拉伯糖诱导dCas9表达，以抑制pdh表达，将摇瓶放在37℃，200r/min摇床震荡诱导培养至60h。通过测定菌体的生长情况，验证CRISPRi方法对pdh的抑制效果。如图8所示，3种不同强度的sgRNA对丙酮酸脱氢酶PDH的抑制有明显差异。其中，抑制效果最好的是结合位点为自aceF基因起始密码子之后第478bp处的sgRNA序列，诱导dCas9表达后，菌体OD600值从4.1降低至1.9，说明478sgRNA对PDH的抑制效果最好。
表11 pdh-sgRNA序列设计
Figure BDA0003814964140000122
Figure BDA0003814964140000131
表12 sgRNA筛选质粒构建所用引物
Figure BDA0003814964140000132
(2)以实施例2构建的pACYC-trc-dcas9-444为模板，以P47/P48为上下游引物扩增质粒骨架；以实施例2pKD-pdh478sgRNA为模板，以P49/P50为上下游引物扩增片段；两者通过In-Fusion试剂盒组装，获得重组质粒pACYC-trc-dcas9-444-478。将重组质粒pACYC-trc-dcas9-444-478转化至菌株050Y2/pCTSDT中，获得菌株050Y2/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444-478。
表13 pACYC-trc-dcas9-444-478质粒构建所用引物
Figure BDA0003814964140000133
将重组菌株050Y2/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444、050Y2/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444-478分别发酵培养合成α-酮异戊酸。发酵条件为：向50mL含有36g/L葡萄糖的M9培养基中接种2mL种子液，于37℃、200r/min摇床震荡培养，菌体OD600值达到2.5时，加入的IPTG诱导剂至终浓度为0.4mmol/L，将摇瓶放在30℃，100、150或者200r/min摇床震荡诱导培养至60h。如图9所示，在ilvE基础上叠加抑制pdh后，菌株在100、150、200r·min-1下发酵，α-酮异戊酸的产量分别为14.0、13.2、11.8g·L-1。结果表明，100r·min更适合抑制pdh表达的菌株发酵合成α-酮异戊酸，同时抑制pdh表达后产量进一步提高。
(3)CRISPRi技术与降解标签组合抑制ilvE与pdh基因
按照与实施例2第(4)部分相同的策略，用P75/P76引物PCR构建打靶片段，在菌株050Y2染色体pdh基因的C端添加DAS+4降解标签，并分别用P77/P78引物菌落PCR验证，获得菌株050Y3。
表14 050Y3菌株构建所用引物
Figure BDA0003814964140000134
Figure BDA0003814964140000141
将重组质粒pCTSDT、pACYC-trc-dcas9-444、pACYC-trc-dcas9-444-478转化050Y3菌株，将重组菌株050Y2/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444-478、050Y3/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444、050Y3/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444-478分别以2％(v/v)的接种量含有36g/L葡萄糖的M9培养基中，在菌体浓度生长至OD为2.5时，添加终浓度为0.4mM的IPTG诱导，分别于100、150、200r·min-1下摇瓶发酵，比较pdh添加降解标签前后对α-酮异戊酸合成的影响，发酵结果如图10所示。
单独添加降解标签情况下，在100r·min-1下产量最高为14.4g·L-1，比单独利用CRISPRi技术调控pdh的产量高一些。当降解标签与CRISPRi结合后，α-酮异戊酸产量在100r·min-1下提高至15.8g·L-1，说明添加降解标签降低了PDH酶活，同时，在微好氧条件下残留的丙酮酸脱氢酶酶活低，减弱了TCA循环，丙酮酸代谢流更多流向α-酮异戊酸合成。在动态调控IlvE代谢途径的基础上，动态调控竞争代谢途径关键酶PDH，进一步将α-酮异戊酸产量提高了27.4％。
实施例4：构建NADH依赖途径并强化NADPH依赖途径平衡辅酶循环
(1)构建NADH依赖途径：用全质粒PCR的方法，对Gene ID 948286所示的IlvC进行A71S、R76D、S78D、Q110V点突变(突变IlvC序列如序列5所示)，以pCTSDT质粒为模板，使用表15中P13/P14引物，全质粒PCR方法，构建pCTSDT*质粒(ilvC基因具备A71S、R76D、S78D突变)。再以pCTSDT*为模板，用P15/P16为上下游引物，全质粒PCR，得到携带如SEQ ID NO.1所示ilvC突变体的重组质粒pCTSDT-ilvC(mut)ilvC(具备A71S、R76D、S78D、Q110V突变)。
表15 IlvC酶改造所涉及引物
Figure BDA0003814964140000142
将pCTSDT-ilvC(mut)和pACYC-trc-dcas9-444-478重组质粒转化至050Y3菌株中，获得重组菌株050Y3/pCTSDT-ilvC(mut)+pACYC-trc-dcas9-444-478，将该菌株及对照菌株050Y2/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444-478分别在100、200r·min-1下摇瓶发酵。发酵条件为：向50mL含有36g/L葡萄糖的M9培养基中接种2mL种子液，于37℃、200r/min摇床震荡培养，菌体OD600值达到2.5时，加入的IPTG诱导剂至终浓度为0.4mmol/L，将摇瓶放在30℃，100或者200r/min摇床震荡诱导培养至60h。测定α-酮异戊酸产量，结果如图11所示。
在100r·min-1下摇瓶发酵60h，α-酮异戊酸产量降低至14.5g·L-1。另外，在100、200r·min-1下均有大量的丙酮酸积累，说明丙酮酸代谢流流向产物合成的代谢途径并不畅通，可能是IlvC突变酶的酶活降低导致的。
(2)强化NADPH依赖途径
本研究进一步过量表达pntAB基因(Gene ID分别为946628、946144)，将EMP途径中生成的2分子NADH转换成NADPH，构建NADPH依赖途径，以促进辅酶循环的平衡。在实施例3构建的E.coli 050Y3的染色体上pntAB基因前添加T7启动子，得到菌株E.coli050Y4。菌株构建方法：以pACYC-kan-T7100-pntAB质粒为模板，用P79/P80引物PCR扩增打靶片段，利用Red重组系统整合于050Y3染色体上，并用P81/P82引物PCR验证，结果如图12所示，野生型菌株PCR扩增片段大小为550bp，整合T7-kan片段后大小为1870bp，去掉kan片段后大小约为600bp，表明重组菌株050Y4构建成功。将pCTSDT和实施例3构建的质粒pACYC-trc-dcas9-444-478转化入050Y4感受态细胞中，获得菌株050Y4/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444-478。
表16构建菌株050Y4所用引物
Figure BDA0003814964140000151
将菌株050Y4/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444-478摇瓶发酵合成α-酮异戊酸。发酵条件为：向50mL含有36g/L葡萄糖的M9培养基中接种2mL种子液，于37℃、200r/min摇床震荡培养，菌体OD600值达到2.5时，加入的IPTG诱导剂至终浓度为0.4mmol/L，将摇瓶放在30℃，100或者200r/min摇床震荡诱导培养至60h。结果显示，pntAB基因表达加强之后，α-酮异戊酸在100r·min-1下发酵产量17.1g·L-1，进一步提高了10％。说明pntAB过表达可以增强NADH向NADPH的转换，提高了α-酮异戊酸合成水平。
实施例5：构建组合策略菌株发酵生产α-酮异戊酸
(1)组合策略菌株摇瓶发酵
将pCTSDTQ487S-RBS55(公开于《重组大肠杆菌代谢工程合成α-酮异戊酸》，中国科技论文在线，2022-01-29，http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/202201-127))和实施例3构建的pACYC-trc-dcas9-444-478重组质粒转化入实施例4构建的菌株050Y4中，构建获得重组菌株050Y4/pCTSDTQ487S-RBS55+pACYC-trc-dcas9-444-478。将该菌株及对照菌株(实施例4构建的050Y4/pCTSDT+pACYC-trc-dcas9-444-478)在100r·min-1下发酵培养，测定α-酮异戊酸的产量及异丁醇的积累量。发酵条件为：向50mL含有36g/L葡萄糖的M9培养基中接种2mL种子液，于37℃、200r/min摇床震荡培养，菌体OD600值达到2.5时，加入的IPTG诱导剂至终浓度为0.4mmol/L，将摇瓶放在30℃，100r/min摇床震荡诱导培养至60h。
结果如图13所示，将质粒pCTSDT替换成pCTSDTQ487S-RBS55可使α-酮异戊酸的产量从17.1g·L-1降低至16.5g·L-1，下降幅度并不明显。但是，异丁醇积累从1.48g·L-1减少至0.52g·L-1，显著降低了64.9％，实现了在基本不显著影响α-酮异戊酸产量的基础上减少异丁醇的积累量的效果，这有利于避免放大培养过程中积累高浓度的异丁醇抑制菌体生长。此外，菌株050Y4/pCTSDTQ487S-RBS55以无机盐培养基发酵合成α-酮异戊酸，可有效降低发酵培养基成本。
(2)组合策略菌株在发酵罐水平发酵
在5L发酵罐对菌株050Y4/pCTSDTQ487S-RBS55+pACYC-trc-dcas9-444-478进行扩大培养。为了提高α-酮异戊酸的产量及转化率，采用两阶段发酵模式。第一阶段为好氧菌体生长阶段；当菌体生长至OD600为30时，转为第二阶段，微好氧发酵(控制溶解氧浓度≤10％)合成α-酮异戊酸。
具体步骤为：
挑取单菌落到30mL LB培养基中，37℃、200r/min培养8h，再将培养液接种于50mL种子液培养基中，37℃、200r/min培养12h。将100mL种子液接种到装有2L M9发酵培养基的5L发酵罐中，初始葡萄糖浓度为30g/L。菌体生长阶段，控制温度为37℃，调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度≥30％。当OD600值达到30时进入α-酮异戊酸合成阶段，加入终浓度为0.8mM IPTG诱导，同时降温至30℃合成α-酮异戊酸。整个发酵阶段用氨水控制pH值为7。
发酵过程中，当残糖低于10g·L-1，补加30g·L-1的葡萄糖，共补加240g葡萄糖，直至发酵培养60h即发酵终止，残糖为1.4g·L-1。
菌体浓度及α-酮异戊酸产量随时间变化的结果如图14所示，菌体生长至14h时，OD600值达到30.0，转为微好氧条件合成α-酮异戊酸。在产物合成阶段，菌浓度无显著增加，表明动态调控元件有效地控制了TCA循环和缬氨酸合成代谢途径，以促进碳源完全用于合成α-酮异戊酸。α-酮异戊酸在微好氧阶段开始积累，直至发酵60h后，产量趋于稳定，最终达到35.2g·L-1，总转化率达到了0.73mol·mol-1葡萄糖，第二阶段转化率达到0.99mol·mol-1葡萄糖，体积生产强度为0.67g·(L·h)-1(表17)。整个发酵过程中，异丁醇的积累量降低至1.2g·L-1，得率只占0.04mol·mol-1葡萄糖，异丁醇积累明显减少。进一步优化微好氧阶段的溶氧强度，表明最佳控制DO值为10％，提高或降低供氧强度，α-酮异戊酸产量均不能提高。
动态调控型菌株050Y4/pCTSDTQ487S-RBS55+pACYC-trc-dcas9-444-478整个发酵过程不需添加有机氮源，培养基消耗成本显著降低。本研究利用基本培养基发酵的结果与目前已报道的(Applied and Environmental Microbiology,2013,79(18):5566-5575)利用有机氮源产量33.7g·L-1持平，总转化率是其2倍。
表17菌株050Y4/pCTSDTQ487S-RBS55 5L发酵罐发酵数据统计
Figure BDA0003814964140000171
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株重组大肠杆菌，对出发菌株进行了如下至少一种改造：
(1)抑制ilvE基因的表达；
(2)抑制pdh基因表达；
(3)表达含有A71S、R76D、S78D和Q110V突变的酮酸还原异构酶(IlvC酶)；
(4)过量表达pntA和pntAB基因。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以E.coli B0016-050为出发菌株。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述抑制ilvE基因的表达包括在质粒水平表达dCas9蛋白或在基因组水平表达dCas9蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述在基因组水平表达dCas9蛋白包括：用T7启动子表达整合在基因组DNA上的dCas9蛋白和/或用Ptrc启动子表达用于抑制ilvE基因的sgRNA。
5.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述在质粒水平表达dCas9蛋白是以质粒pACYCDuet-1为表达载体。
6.根据权利要求3～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述抑制ilvE基因的表达还包括在ilvE基因的C端添加DAS+4降解标签。
7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述抑制pdh基因的表达还包括在pdh基因的C端添加DAS+4降解标签。
8.一种生产α-酮异戊酸的方法，其特征在于，以权利要求1～7任一所述的重组大肠杆菌为发酵菌株，发酵生产α-酮异戊酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法采用两阶段发酵：
第一阶段：控制温度为5～37℃，控制溶氧浓度≥30％；
第二阶段：当OD600值达到诱导所需OD值时，加入IPTG诱导，并降温至28～30℃，控制溶氧浓度≤10％。
10.权利要求1～7任一所述的重组大肠杆菌，或权利要求8～9任一所述的方法在医药、食品或化妆品领域生产含α-酮异戊酸的产品中的应用。
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