CN116804180A - 一种生产l-缬氨酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产L‑缬氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。本发明以E.coli W3110为出发菌株，利用系统代谢工程手段加强L‑缬氨酸合成通量、提高还原力供应、动态弱化TCA循环、弱化乙酰CoA合成，构建了一株L‑缬氨酸生产菌株。以该菌株为出发菌进行适应性进化，获得L‑缬氨酸高产菌株。于5L发酵罐进行分批补料发酵，发酵周期26h，发酵液中的L‑缬氨酸浓度达到121.7g/L，转化率达到55.6％。本发明采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。与现有技术相比，本发明获得的工程菌株及其发酵工艺发酵周期短，L‑缬氨酸产量和转化率高，为目前报道最高指标。
Description
技术领域：
本发明涉及一种生产L-缬氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
L-缬氨酸是一种支链氨基酸(branch chain amino acid，BCAAs)，在哺乳动物生长和代谢中发挥着重要作用。在工业生产上，L-缬氨酸广泛应用于化妆品，制药，食品添加剂，动物饲料等领域。尤其在动物饲料行业，L-缬氨酸被证明可以显著改善家畜和家禽的生产性能，同时作为一种必需氨基酸，L-缬氨酸也是低粗蛋白日粮中最具限制性的四种氨基酸之一。随着市场需求的不断扩增，进一步提高缬氨酸产量显得尤为重要。现阶段L-缬氨酸的生产方法主要为生物发酵法。近年来，随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，通过育种可获得高效生产L-缬氨酸、遗传背景清晰、且易于培养的重组工程菌。但总体而言，现有L-缬氨酸工程菌株产量和转化率不高，限制了其大规模应用。大肠杆菌具有代谢背景较明确清晰、生长迅速、周期短等优势，是理想的工业化底盘细胞。
发明内容：
为了克服现有L-缬氨酸生产菌株性能不稳定、产酸和转化率低等不足，本发明提供一种合成效率高的产L-缬氨酸的基因工程菌及采用该菌直接发酵生产L-缬氨酸的方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案之一是：一株L-缬氨酸高产菌株，所述菌株以Escherichia coli W3110为出发菌株，在基因组上敲除乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，在基因组上过表达解除反馈抑制的乙酰羟酸合酶编码基因ilvBNM，在基因组上表过达羟酸还原异构酶编码基因ilvC及枯草芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶的编码基因bcd；然后敲除分支链氨基酸氨基转移酶编码基因ilvE，接着过表达吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB、枯草芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因rocG；敲除乙酸激酶编码基因ackA、丙酮酸脱氢酶编码基因poxB、乳酸脱氢酶编码基因ldhA；将基因组中柠檬酸合酶编码基因gltA的启动子替换为受缬氨酸弱化的PilvB启动子，当胞内L-缬氨酸积累时，gltA的转录被弱化，使得丙酮酸更多地流向L-缬氨酸合成而非TCA循环；将基因组中丙酮酸脱氢酶编码基因aceE启动子替换为弱启动子BBA_J23114以弱化aceE的转录，利用生长依赖性启动子PfliC在基因组上表达磷酸解酮酶编码基因fxpk；在此基础上，敲除6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因edd、月桂酰基转移酶编码基因lpxL及肉豆蔻酰基转移酶编码基因lpxM。
进一步地，所述乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，NCBI中Protein ID:BAE76127.1；
进一步地，所述解除反馈抑制的乙酰羟酸合酶编码基因ilvBNM，已公开于中国发明专利ZL201910484362.5；
进一步地，所述羟酸还原异构酶编码基因ilvC来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAE77523.1；
进一步地，所述亮氨酸脱氢酶的编码基因bcd来自枯草芽孢杆菌168，NCBI中Protein ID:NP_390288.1；
进一步地，所述分支链氨基酸氨基转移酶编码基因ilvE，NCBI中Protein ID:BAE77527.1；
进一步地，所述乙酸激酶编码基因ackA来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA16135.1；
进一步地，所述丙酮酸脱氢酶编码基因poxB来自大肠杆菌W3110，NCBI中ProteinID:BAA35585.1；
进一步地，所述乳酸脱氢酶编码基因ldhA来自大肠杆菌W3110，NCBI中ProteinID:BAA14990.1；
进一步地，所述吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA15342.1-BAA15336.1；
进一步地，所述谷氨酸脱氢酶编码基因rocG来自枯草芽孢杆菌168，NCBI中Protein ID:NP_391659.2；
进一步地，所述柠檬酸合酶编码基因gltA来自大肠杆菌W3110，NCBI中ProteinID:BAA35384.2；
进一步地，所述启动子PilvB为大肠杆菌W3110的ilvB基因的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
进一步地，所述丙酮酸脱氢酶编码基因aceE来自大肠杆菌W3110，NCBI中ProteinID:BAB96684；
进一步地，所述弱启动子BBA_J23114，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
进一步地，所述磷酸解酮酶编码基因fxpk来自青春双歧杆菌ATCC 15703，NCBI中ProteinID:WP_011743105.1；
进一步地，所述启动子PfliC为大肠杆菌W3110的fliC基因的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
进一步地，所述6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因edd来自大肠杆菌W3110，NCBI中ProteinID:BAA15659；
进一步地，所述月桂酰基转移酶编码基因lpxL来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA35852；
进一步地，所述月桂酰基转移酶编码基因lpxM来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA15663。
本发明提供的技术方案之二，是技术方案一所述菌株在生产L-缬氨酸中的应用。
进一步地，采用上述菌株发酵法生产L-缬氨酸的方法如下：
以5-10％接种量将种子培养物接至发酵培养基中进行发酵培养，pH维持在6.8-7.2，培养温度35℃；维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)；12h前溶氧维持在30-50％，之后溶氧维持在5-15％。发酵周期26-30h，发酵液中的L-缬氨酸浓度达到113.5-121.7g/L。
有益效果：
(1)本发明以E.coli W3110为出发菌株，利用系统代谢工程手段加强L-缬氨酸合成通量、提高还原力供应、动态弱化TCA循环、弱化乙酰CoA合成，构建了一株L-缬氨酸生产菌株。以该菌株为出发菌进行适应性进化，获得L-缬氨酸高产菌株。于5L发酵罐进行分批补料发酵，发酵周期26h，发酵液中的L-缬氨酸浓度达到121.7g/L，转化率达到55.6％。
(2)本发明采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。与现有技术相比，本发明获得的工程菌株及其发酵工艺发酵周期短，L-缬氨酸产量和转化率高，为目前报道最高指标。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明实施例所涉及的基因序列可根据前述发明内容部分提供的NCBI中的Protein ID编号对应的序列信息进行编码合成或以对应来源的微生物基因组为模板进行扩增；
解除反馈抑制的乙酰羟酸合酶编码基因ilvBNM，已公开于中国发明专利ZL201910484362.5(具体为该专利申请文本的SEQ ID NO.2，可根据该序列合成ilvBNM)：GTGAATGTGGCAGCTTCTCAACAGCCCACTCCCGCCACGGTTGCAAGCCGTGGTCGATCCGCCGCCCCTGAGCGGATGACAGGTGCACAGGCAATTGTTCGATCGCTCGAGGAGCTTAACGCCGACATCGTGTTCGGTATTCCTGGTGGTGCGGTGCTACCGGTGTATGACCCGCTCTATTCCTCCACAAAGGTGCGCCACGTCTTGGTGCGCCACGAGCAGGGCGCAGGCCACGCAGCAACCGGCTACACGCAGGTTACTGGACGCGTTGGCGTCTGCATTGCAACCTCTGGCCCAGGAGCAACCAACTTGGTTACCCCAATCGCTGATGCAAACTTGGACTCCGTTCCCATGGTTGCCATCACCGGCCAGGTCGGAAGTAGCCTGCTGGGTACCGACGCTTTCCAGGAAGCCGATATCCGCGGCATCACCATGCCAGTGACCAAGCACAACTTCATGGTCACCAACCCTAACGACATTCCACAGGCATTGGCTGAGGCATTCCACCTCGCGATTACTGGTCGCCCTGGCCCTGTTCTGGTGGATATTCCTAAGGATGTCCAGAACGCTGAATTGGATTTCGTCTGGCCACCAAAGATCGACCTGCCAGGCTACCGCCCAGTTTCAACACCACATGCTCGCCAGATCGAGCAGGCAGTCAAGCTGATCGGTGAGTCTAGGAAGCCCGTCCTTTACGTTGGTGGTGGCGTAATCAAGGCTGACGCACACGAAGAGCTTCGTGCGTTCGCTGAGCACACCGGCATCCCAGTTGTCACCACCTTGATGGCTTTGGGTACTTTCCCAGAGTCTCACGAGCTGCACATGGGTATGCCAGGCATGCATGGCACTGTGTCCGCTGTTGGTGCACTGCAGCGCAGCGACCTGCTGATTGCTATCGGCTCCCGCTTTGATGACCGCGTCACCGGTGACGTTGACACCTTCGCGCCTGACGCCAAGATCATTCACGCCGACATTGATCCTGCCGAAATCGGCAAGATCAAGCAGGTTGAGGTTCCAATCGTGGGCGATGCCCGCGAAGTTCTTGCTCGTCTGCTGGAAACCACCAAGGCAAGCAAGGCAGAGTCTGAGGACATCTCCGAGTGGGTTGACTACCTCAAGGGCCTCAAGGCACGTTTCCCGCGTGGCTACGACGAGCAGCCAGGCGATCTGCTGGCACCACAGTTTGTCATTGAAACCCTGTCCAAGGAAGTTGGCCCCGACGCAATTTACTGCGCCGGCGTTGGCCAGCACCAAATGTGGGCAGCTCAGTTCGTTGACTTTGAAAAGCCACGCACCTGGCTCAACTCCGGTGGACTGGGCACCATGGGCTACGCAGTTCCTGCGGCCCTTGGAGCAAAGGCTGGCGCACCTGACAAGGAAGTCTGGGCTATCGACGGCGACGGCTGTTTCCAGATGACCAACCAGGAACTCACCACCGCCGCAGTTGAAGGTTTCCCCATTAAGATCGCACTAATCAACAACGGAAACCTGGGCATGGTTCGCCAATGGCAGACCCTATTCTATGAAGGACGGTACTCAAATACTAAACTTCGTAACCAGGGCGAGTACATGCCCGACTTTGTTACCCTTTCTGAGGGACTTGGCTGTGTTGCCATCCGCGTCACCAAAGCGGAGGAAGTACTGCCAGCCATCCAAAAGGCTCGAGAGATCAACGACCGCCCAGTAGTCATCGACTTCATCGTCGGTGAAGACGCACAGGTATGGCCAATGGTGTCTGCTGGATCATCCAACTCCGATATCCAGTACGCACTCGGATTGCGCCCATTCTTTGATGGTGATGAATCTGCAGCAGAAGATCCTGCCGACATTCACGAAGCCGTCAGCGACATTGATGCCGCCGTTGAATCGACCGAGGCATAAGGAGAGACCCAAGATGGCTAATTCTGACGTCACCCGCCACATCCTGTCCGTACTCGTTCAGGACGTAGACGGAATCATTTCCCGCGTATCAGGTATGTTCACCCGACGCGCATTCAACCTCGTGTCCCTCGTGTCTGCAAAGACCGAAACACTCGGCATCAACCGCATCACGGTTGTTGTCGACGCCGACGAGCTCAACATTGAGCAGATCACCAAGCAGCTCAACAAGCTGATCCCCGTGCTCAAAGTCGTGCGACTTGATGAAGAGACCACTATCGCCCGCGCAATCATGCTGGTTAAGGTCTCTGCGGACAGCACCAACCGTCCGCAGATCGTCGACGCCGCGAACATCTTCCGCGCCCGAGTCGTCGACGTGGCTCCAGACTCTGTGGTTATTGAATCCACAGGCACCCCAGGCAAGCTCCGCGCACTGCTTGACGTGATGGAACCATTCGGAATCCGCGAACTGATCCAATCCGGACAGATTGCACTCAACCGCGGTCCGAAGACCATGGCTCCGGCCAAGATCTAA
本发明所涉及的PilvB启动子序列，如SEQ ID NO.1所示：
CCAGCTGACGTACCTTTCCGCTGCCTGTTGCCAGCTGTTGTGCACGCGGTATCTCAAGG
AGAAACGTTGTGCTTGTTGACATAACACAGTGTGCTCACGCGGGGTTAAGGCGCTGAC
GGCACCACCCGTTTCAGCCAGGACTTAGTGCGCCGGGTAACGATGCGGCCCCCGCATA
ACACATTGCGTACAGTGATATTATAGAAGTTTACTGTATAAATAAACAGTAATATTTGG
ACAAAACGCAAACTGTGATCGATACTCAACTATGCACTAAATACGTCAAAATTCGTGC
CGAAATTGCGCGTTCTGCGCGGAACACGTATACTTTCAGTGTTGACATAATACAGTGTG
CTTTGCGGTTACCAGCCGCAGGCGACTGACGAAACCTCGCTCCGGCGGGGTTTTTTGTT
ATCTGCAATTCAGTACAAAACGTGATCAACCCCTCAATTTTCCCTTGCTGAAAAATTTT
CCATTGTCTCCCCTGTAAAGCTGTGCTTGTATAAATATTGTTAAACACAAAACCAACAA
GGTCCCCAATGACTACTTCCATGCTCAACGCAAAACTACTACCAACTGCGCCATCCGCC
GCAGTGGTCGTCGTGCGTGTGGTGGTGGTCGTCGGCAATGCGCCGTAGGGACTGGAAC
AACACACGATTCCAAAACCCCGCCGGCGCAAACCGGGCGGGGTTTTTCGTTTAAGCAC
CTCCCGGAAAGTCGGCCCAGAAGAAAAGGACTGGAGC
本发明所涉及的BBA_J23114启动子序列，如SEQ ID NO.2所示：
TTTATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC
本发明所涉及的PfliC启动子序列，如SEQ ID NO.3所示：
AAAAATGGCTGTTTTTGAAAAAAATTCTAAAGGTTGTTTTACGACAGACGATAACAGG
GTTGACGGCGATTGAGCCGACGGGTGGAAACCCAATACGTAATCAACGACTTGCAATA
TAGGATAACGAATC
本发明发酵过程中的物质检测方法如下：
(1)L-缬氨酸检测方法
采用高效液相色谱系统(high-performance liquid chromatography,HPLC)对L-缬氨酸定量分析。用2,4-二硝基氟苯衍生处理样品，以使其可被液相信号器所检测，具体流程如下：
样品衍生方法：取1ml发酵液经13000×g离心3min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2,4-二硝基氟苯进行衍生反应(上述上清液过0.22μm的有机膜待用，向1.5mL EP管加入200μL衍生缓冲液、10μL过膜后的上清液和300μL衍生剂摇晃均匀，置于65℃水浴锅避光水浴60min，之后取出冷却，取定容缓冲液690μL定容至1.2mL，混匀过膜)，过滤至样品池中，分别以超声过滤后的50％的乙腈和4.1g/L乙酸钠为有机相和无机相，调整柱温33℃，待基线为0，压力线水平时，开始待测样品的测定。其检测条件为：Agilent AAA(4.6mm×150mm，5-Micron)，采用乙腈/乙酸钠二元梯度洗脱，流速1mL/min，柱温33℃，检测波长360nm。
(2)菌体浓度及其它产物的检测
通过分光光度计测定菌株OD600，监测其生长。用SBA生物传感器仪(SBA-40C；山东科学院生物研究所，济南)检测发酵过程中葡萄糖的浓度。
本发明实施例所用引物序列如下表所示：
本发明实施例中菌株基因型如下表所示：
| 菌株 | 基因型 |
| E.coli W3110ΔlacI | E.coli W3110敲除lacI |
| Val-1 | E.coli W3110ΔlacI yncI::Ptrc-ilvBNM-Ttrc |
| Val-2 | Val-1yeeL::Ptrc-ilvC-Ttrc |
| Val-3 | Val-2ycgH::Ptrc-bcd-Ttrc |
| Val-4 | Val-3ΔilvE |
| Val-5 | Val-4yjgX::Ptrc-pntAB-Ttrc |
| Val-6 | Val-5yghX::Ptrc-rocG-Ttrc |
| Val-7 | Val-6ΔackAΔpoxBΔldhA |
| Val-8 | Val-7PgltA::PilvB |
| Val-9 | Val-8PaceE::PBBAJ23114 |
| Val-10 | Val-9gapC::PfliC-fxpk-Ttrc |
| Val-11 | Val-10Δedd |
| Val-12 | Val-11ΔlpxLΔlpxM |
需要特别说明的是，本发明菌株的构建过程中，基因的编辑顺序可根据实际需求进行调整，编辑顺序的先后不会对最终获得的菌株生产L-缬氨酸的效果产生影响。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1：lacI敲除菌株E.coli W3110ΔlacI的构建
(1)重叠片段UlacI-DlacI的构建
以野生型大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物lac-1/lac-2及lac-3/lac-4扩增lacI的上游同源臂和下游同源臂，然后利用重叠PCR获得lacI上、下游同源臂融合片段UlacI-DlacI。
(2)pGRB-lacI质粒的构建
根据lacI序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列pGRB-lacI-S/pGRB-lacI-A，二者退火后利用重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞医疗科技有限公司)连接至质粒pGRB，经转化E.coli DH5α、含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选、测序鉴定获得重组质粒pGRB-lacI。
(3)lacI敲除菌株E.coli W3110ΔlacI的构建
将重组质粒pGRB-lacI和融合片段UlacI-DlacI电转化至含有pREDcas9质粒的E.coliW3110感受态细胞中，复苏后涂布于含100μg/mL壮观霉素、氨苄青霉素的LB固体培养上，32℃恒温过夜培养。次日用引物lac-1/lac-4进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。活化转化子，并添加终浓度为0.2mmol/L的阿拉伯糖，32℃振荡培养过夜，使pGRB-lacI丢失；然后42℃振荡培养过夜，使pREDcas9质粒丢失，获得菌株E.coli W3110ΔlacI。
实施例2：L-缬氨酸工程菌株Val-1的构建
(1)重叠片段UyncI-Ptrc-ilvBNM-Ttrc-DyncI的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-yncI-S/U-yncI-A和D-yncI-S/D-yncI-A扩增yncI的上游同源臂和下游同源臂；以人工合成的ilvBNM片段为模板，利用引物ilvBNM-S和ilvBNM-A扩增包含Ptrc启动子、Ttrc终止子以及ilvBNM基因的片段Ptrc-ilvBNM-Ttrc(Ptrc启动子和Ttrc终止子已设计在了引物ilvBNM-S和ilvBNM-A中)。PCR产物回收后，利用引物U-yncI-S/D-yncI-A经重叠PCR获得包含yncI上、下游同源臂、Ptrc-ilvBNM-Ttrc的融合片段UyncI-Ptrc-ilvBNM-Ttrc-DyncI。
(2)pGRB-yncI质粒的构建
根据yncI序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列pGRB-yncI-S和pGRB-yncI-A，采用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-yncI。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-1的构建
将重组质粒pGRB-yncI和融合片段UyncI-Ptrc-ilvBNM-Ttrc-DyncI转化至含有pREDcas9质粒的E.coli W3110ΔlacI的感受态细胞中，用引物U-yncI-S/D-yncI-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-1。
实施例3：L-缬氨酸工程菌株Val-2的构建
(1)重叠片段UyeeL-Ptrc-ilvC-Ttrc-DyeeL的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-yeeL-S/U-yeeL-A、D-yeeL-S/D-yeeL-A和ilvC-S/ilvC-A扩增yeeL的上游同源臂、下游同源臂、以及包含Ptrc启动子、Ttrc终止子和ilvC基因的Ptrc-ilvC-Ttrc片段。PCR产物回收后，利用引物U-yeeL-S/D-yeeL-A经重叠PCR获得包含yeeL上、下游同源臂、Ptrc-ilvC-Ttrc的融合片段UyeeL-Ptrc-ilvC-Ttrc-DyeeL。
(2)pGRB-yeeL质粒的构建
根据yeeL序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列pGRB-yeeL-S和pGRB-yeeL-A，采用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-yeeL。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-2的构建
将重组质粒pGRB-yeeL和融合片段UyeeL-Ptrc-ilvC-Ttrc-DyeeL转化至含有pREDcas9质粒的Val-1的感受态细胞中，用引物U-yeeL-S/D-yeeL-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-2。
实施例4：L-缬氨酸工程菌株Val-3的构建
(1)重叠片段UycgH-Ptrc-bcd-Ttrc-DycgH的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-ycgH-S/U-ycgH-A和D-ycgH-S/D-ycgH-A扩增ycgH的上游同源臂和下游同源臂。以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168基因组为模板，利用引物bcd-S/bcd-A扩增包含Ptrc启动子、Ttrc终止子和bcd基因的Ptrc-bcd-Ttrc片段。PCR产物回收后，利用引物U-ycgH-S/D-ycgH-A经重叠PCR获得包含ycgH上、下游同源臂、Ptrc-bcd-Ttrc的融合片段UycgH-Ptrc-bcd-Ttrc-DycgH。
(2)pGRB-ycgH质粒的构建
根据ycgH序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-ycgH-S和pGRB-ycgH-A，采用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-ycgH。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-3的构建
将重组质粒pGRB-ycgH和融合片段UycgH-Ptrc-bcd-Ttrc-DycgH转化至含有pREDcas9质粒的Val-2的感受态细胞中，用引物U-ycgH-S/D-ycgH-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，Val-3。
实施例5：L-缬氨酸工程菌株Val-4的构建
(1)重叠片段UilvE-DilvE的构建
以野生型大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-ilvE-S/U-ilvE-A及D-ilvE-S/D-ilvE-A扩增ilvE的上、下游同源臂，然后利用重叠PCR获得ilvE上、下游同源臂融合片段UilvE-DilvE。
(2)pGRB-ilvE质粒的构建
根据ilvE序列设计并合成gRNA 20bp正向和反向序列pGRB-ilvE-S和pGRB-ilvE-A。采用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-ilvE。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-4的构建
将重组质粒pGRB-ilvE和融合片段UilvE-DilvE电转化至含有pREDcas9质粒的Val-3感受态细胞中，用引物U-ilvE-S/D-ilvE-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-4。
实施例6：L-缬氨酸工程菌株Val-5构建
(1)重叠片段UyjgX-Ptrc-pntAB-Ttrc-DyjgX的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-yjgX-S/U-yjgX-A和D-yjgX-S/D-yjgX-A、pntAB-S/pntAB-A扩增yjgX上游同源臂、和下游同源臂，以及包含Ptrc启动子、Ttrc终止子和pntAB基因的片段Ptrc-pntAB-Ttrc。PCR产物回收后，利用引物U-yjgX-S/D-yjgX-A经重叠PCR获得包含yjgX上、下游同源臂、Ptrc-pntAB-Ttrc的融合片段UyjgX-Ptrc-pntAB-Ttrc-DyjgX。
(2)pGRB-yjgX质粒的构建
根据yjgX序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-yjgX-S和pGRB-yjgX-A，用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-yjgX。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-5的构建
将重组质粒pGRB-yjgX和融合片段UyjgX-Ptrc-pntAB-Ttrc-DyjgX转化至含有pREDcas9质粒的Val-4的感受态细胞中，用引物U-yjgX-S/D-yjgX-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-5。
实施例7：L-缬氨酸工程菌株Val-6的构建
(1)重叠片段UyghX-Ptrc-rocG-Ttrc-DyghX的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-yghX-S/U-yghX-A、D-yghX-S/D-yghX-A扩增yghX的上游同源臂和下游同源臂。以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，利用引物rocG-A/D-rocG-S扩增包含Ptrc启动子、Ttrc终止子和rocG基因的Ptrc-rocG-Ttrc片段。PCR产物回收后，利用引物U-yghX-S/D-yghX-A经重叠PCR获得包含yghX上、下游同源臂、Ptrc-rocG-Ttrc的融合片段UyghX-Ptrc-rocG-Ttrc-DyghX。
(2)pGRB-yghX质粒的构建
根据yghX序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-yghX-S和pGRB-yghX-A，用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-yghX。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-6的构建
将重组质粒pGRB-yghX和融合片段UyghX-Ptrc-rocG-Ttrc-DyghX转化至含有pREDcas9质粒的Val-5的感受态细胞中，用引物U-yghX-S/D-yghX-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-6。
实施例8：L-缬亮氨酸工程菌株Val-7的构建
(1)重叠片段UackA-DackA、UpoxB-DpoxB及UldhA-DldhA的构建
以野生型大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-ackA-S/U-ackA-A、D-ackA-S/D-ackA-A、U-poxB-S/U-poxB-A、D-poxB-S/D-poxB-A、U-ldhA-S/U-ldhA-A及D-ldhA-S/D-ldhA-A扩增ackA、poxB、ldhA的上、下游同源臂，然后利用重叠PCR获得其上、下游同源臂融合片段UackA-DackA、UpoxB-DpoxB及UldhA-DldhA。
(2)pGRB-ackA、pGRB-poxB及pGRB-ldhA质粒的构建
根据ackA、poxB、ldhA序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-ackA-S/pGRB-ackA-A，pGRB-poxB-S/pGRB-poxB-A及pGRB-ldhA-S/pGRB-ldhA-A。用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-ackA、pGRB-poxB及pGRB-ldhA。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-7的构建
将重组质粒pGRB-ackA和融合片段UackA-DackA电转化至含有pREDcas9质粒的Val-6感受态细胞中，用引物U-ackA-S/D-ackA-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-6ΔackA。将重组质粒pGRB-poxB和融合片段UpoxB-DpoxB电转化至含有pREDcas9质粒的Val-6ΔackA感受态细胞中，用引物U-poxB-S/D-poxB-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-6ΔackAΔpoxB。将重组质粒pGRB-ldhA和融合片段UldhA-DldhA电转化至含有pREDcas9质粒的Val-6ΔackAΔpoxB感受态细胞中，用引物U-ldhA-S/D-ldhA-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-7。
实施例9：L-缬氨酸工程菌株Val-8的构建
(1)重叠片段UgltA-PilvB-DgltA的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-gltA-S/U-gltA-A、D-gltA-S/D-gltA-A及PilvB-S/PilvB-A扩增gltA启动子的上游同源臂、下游同源臂及ilvB基因启动子PilvB。PCR产物回收后，利用引物U-gltA-S/D-gltA-A经重叠PCR获得包含gltA基因启动子上、下游同源臂、PilvB的融合片段UgltA-PilvB-DgltA。
(2)pGRB-PgltA质粒的构建
根据gltA基因的启动子序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-PgltA-S和pGRB-PgltA-A，通过上述方法构建重组质粒pGRB-PgltA。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-8的构建
将重组质粒pGRB-PgltA和融合片段UgltA-PilvB-DgltA转化至含有pREDcas9质粒的Val-7的感受态细胞中，用引物U-gltA-S/D-gltA-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-8。
实施例10：L-缬氨酸工程菌株Val-9的构建
(1)重叠片段UaceE-PBBA_J23114-DaceE的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-aceE-S/U-aceE-A及D-aceE-S/D-aceE-A扩增aceE启动子的上游同源臂、下游同源臂，其中U-aceE-A及D-aceE-S序列中含启动子PBBA_J23114。PCR产物回收后，利用引物U-aceE-S/D-aceE-A经重叠PCR获得包含aceE基因启动子上、下游同源臂、PBBA_J23114的融合片段UaceE-PBBA_J23114-DaceE。
(2)pGRB-PaceE质粒的构建
根据aceE基因的启动子序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-PaceE-S和pGRB-PaceE-A，通过实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-PaceE。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-9的构建
将重组质粒pGRB-PaceE和融合片段UaceE-PBBA_J23114-DaceE转化至含有pREDcas9质粒的Val-8的感受态细胞中，用引物U-aceE-S/D-aceE-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-9。
实施例11：L-缬氨酸工程菌株Val-10的构建
(1)重叠片段UgapC-PfliC-fxpk-Ttrc-DgapC的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-gapC-S/U-gapC-A和D-gapC-S/D-gapC-A扩增gapC的上游同源臂和下游同源臂。以青春双歧杆菌Bifidobacteriumadolescentis ATCC 15703基因组为模板，利用引物fxpk-A/fxpk-S扩增包含PfliC启动子、Ttrc终止子和fxpk-基因的基因片段PfliC-fxpk-Ttrc。PCR产物回收后，利用引物U-gapC-S/D-gapC-A经重叠PCR获得包含gapC上、下游同源臂、PfliC-fxpk-Ttrc的融合片段UgapC-PfliC-fxpk-Ttrc-DgapC。(2)pGRB-gapC质粒的构建
根据gapC序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-gapC-S和pGRB-gapC-A，用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-gapC。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-10的构建
将重组质粒pGRB-gapC和融合片段UgapC-PfliC-fxpk-Ttrc-DgapC转化至含有pREDcas9质粒的leu8的感受态细胞中，用引物U-gapC-S/D-gapC-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-10。
实施例12：L-缬氨酸工程菌株Val-11的构建
(1)重叠片段Uedd-Dedd的构建
以野生型大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-edd-S/U-edd-A及D-edd-S/D-edd-A扩增edd的上、下游同源臂，然后利用重叠PCR获得其上、下游同源臂融合片段Uedd-Dedd。
(2)pGRB-edd质粒的构建
根据edd序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-edd-S/pGRB-edd-A。用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-edd。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-11的构建
将重组质粒pGRB-edd和融合片段Uedd-Dedd电转化至含有pREDcas9质粒的Val-10感受态细胞中，用引物U-edd-S/D-edd-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-11。
实施例13：L-缬氨酸工程菌株Val-12的构建
(1)重叠片段UlpxL-DlpxL及UlpxM-DlpxM的构建
以野生型大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别利用引物U-lpxL-S/U-lpxL-A、D-lpxL-S/D-lpxL-A、U-lpxM-S/U-lpxM-A及D-lpxM-S/D-lpxM-A扩增lpxL及lpxM的上、下游同源臂，然后利用重叠PCR获得其上、下游同源臂融合片段UlpxL-DlpxL及UlpxM-DlpxM。
(2)pGRB-lpxL及pGRB-lpxM质粒的构建
根据lpxL及lpxM序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列pGRB-lpxL-S/pGRB-lpxL-A及pGRB-lpxM-S/pGRB-lpxM-A。用实施例1步骤(2)同样的方法构建重组质粒pGRB-lpxL及pGRB-lpxM。
(3)L-缬氨酸工程菌株Val-12的构建
将重组质粒pGRB-lpxL和融合片段UlpxL-DlpxL电转化至含有pREDcas9质粒的Val-11感受态细胞中，用引物U-lpxL-S/D-lpxL-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-11ΔlpxL。将重组质粒pGRB-lpxM和融合片段UlpxM-DlpxM电转化至含有pREDcas9质粒的Val-11ΔlpxL感受态细胞中，用引物U-lpxM-S/D-lpxM-A鉴定阳性转化子。并按实施例1步骤(3)相同的方法丢失质粒，获得菌株Val-12。
实施例14：L-缬氨酸工程菌的摇瓶发酵
(1)种子培养
分别将L-缬氨酸基因工程菌Val-1、Val-2、Val-3、Val-4、Val-5、Val-6、Val-7、Val-8、Val-9、Val-10、Val-11和Val-12接种到LB固体培养基斜面上，37℃培养12h。然后接种至30mL种子培养基中，37℃，220rpm摇床振荡培养6h-8h。
(2)发酵培养
以1％接种量接种至发酵培养基，37℃培养。以220rpm摇床振荡培养12h后再静置培养12h。发酵过程中补充80％葡萄糖2-3次维持残糖浓度为0.1-0.5％，每次补充1mL，用氨水调节pH约为7.0。
(3)发酵液中L-缬氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2,4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-缬氨酸含量。菌株产量如下表所示。
构建的基因工程菌株Val-12的L-缬氨酸产量达到59.6g/L。
(4)培养基
种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，6g/L蛋白胨，1.2g/L KH2PO4，1g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·7H2O，1.3mg/L VB1，0.3mg/L VH，20mL/L苯酚红，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物，4g/L蛋白胨，2g/L KH2PO4，1.8g/L MgSO4·7H2O，1g/L二水柠檬酸钠，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·7H2O，0.8mg/L VB1，0.2mg/L VH，20mL/L苯酚红，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例15：L-缬氨酸工程菌的5L发酵罐发酵
(1)种子培养
用接种环将3-5支经新鲜LB斜面培养基活化的L-缬氨酸工程菌接种至装有2.5L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在20％，通风量2-4m3/h，搅拌转速200-800rpm，37℃培养6h。
(2)发酵培养
以10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃。12h前通风量2-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在30-40％；12h后通风量0.01m3/h，搅拌转速100-200rpm，溶氧维持在5-8％。发酵过程中流加80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2。
(3)发酵液中L-缬氨酸的检测
发酵26h后，将发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对发酵液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-缬氨酸含量。各菌株的L-缬氨酸发酵参数如下表所示。
表1L-缬氨酸工程菌株发酵参数(26h)
基因工程菌株Val-12经26h发酵，其L-缬氨酸产量达到121.7g/L，转化率为55.6％，生产强度达4.7g/L/h。上述L-缬氨酸产量、转化率及生产强度为目前报道最高指标，发酵周期为目前报道最短。
(4)培养基
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，2g/L蛋白胨，2g/L KH2PO4，1.5g/LMgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·7H2O，1.3mg/L VB1，0.3mg/L VH，8mL/L玉米浆，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：10g/L葡萄糖，3g/L酵母提取物，1g/L谷氨酸，3g/L KH2PO4，1.8g/LMgSO4·7H2O，2g/L二水柠檬酸钠，10mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·7H2O，2mg/LVB1，0.2mg/L VH，8mL/L玉米浆，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例16：L-缬氨酸工程菌Val-12的5L发酵罐发酵
(1)种子培养
同实施例15步骤(1)
(2)发酵培养
以5％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃。12h前通风量2-3m3/h，搅拌转速300-800rpm，溶氧维持在20-30％；12h后通风量0.01m3/h，搅拌转速100-200rpm，溶氧维持在5-8％。发酵过程中流加80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2。
(3)发酵液中L-缬氨酸的检测
同实施例15步骤(3)。L-缬氨酸工程菌Val-12经30h发酵，其L-亮氨酸产量达到113.5g/L，转化率为50.3％，生产强度达3.78g/L/h。
(4)培养基
同实施例15步骤(4)。
实施例17：L-缬氨酸工程菌Val-12的5L发酵罐发酵
(1)种子培养
同实施例15步骤(1)
(2)发酵培养
以10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃。12h前通风量3-4m3/h，搅拌转速300-900rpm，溶氧维持在40-50％；12h后通风量0.01m3/h，搅拌转速200-300rpm，溶氧维持在10-15％。发酵过程中流加80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2。(3)发酵液中L-缬氨酸的检测
同实施例15步骤(3)。L-缬氨酸工程菌Val-12经30h发酵，其L-亮氨酸产量达到117.4g/L，转化率为44.3％，生产强度达3.91g/L/h。
(4)培养基
同实施例15步骤(4)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (4)
1.一株L-缬氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株以Escherichia coli W3110为出发菌株，在基因组上敲除乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，在基因组上过表达解除反馈抑制的乙酰羟酸合酶编码基因ilvBNM，在基因组上表过达羟酸还原异构酶编码基因ilvC及枯草芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶的编码基因bcd，然后敲除分支链氨基酸氨基转移酶编码基因ilvE，接着过表达吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB、枯草芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因rocG，敲除乙酸激酶编码基因ackA、丙酮酸脱氢酶编码基因poxB、乳酸脱氢酶编码基因ldhA，将基因组中柠檬酸合酶编码基因gltA的启动子替换为受缬氨酸弱化的PilvB启动子，将基因组中丙酮酸脱氢酶编码基因aceE启动子替换为弱启动子BBA_J23114，利用生长依赖性启动子PfliC在基因组上表达磷酸解酮酶编码基因fxpk，敲除6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因edd、月桂酰基转移酶编码基因lpxL及肉豆蔻酰基转移酶编码基因lpxM。
2.如权利要求1所述的一株L-缬氨酸生产菌株，其特征在于，
所述乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，NCBI中Protein ID:BAE76127.1；
所述解除反馈抑制的乙酰羟酸合酶编码基因ilvBNM，已公开于中国发明专利ZL201910484362.5；
所述羟酸还原异构酶编码基因ilvC来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAE77523.1；
所述亮氨酸脱氢酶的编码基因bcd来自枯草芽孢杆菌168，NCBI中Protein ID:NP_390288.1；
所述分支链氨基酸氨基转移酶编码基因ilvE，NCBI中Protein ID:BAE77527.1；
所述乙酸激酶编码基因ackA来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA16135.1；
所述丙酮酸脱氢酶编码基因poxB来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA35585.1；
所述乳酸脱氢酶编码基因ldhA来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA14990.1；
所述吡啶核苷酸转氢酶的基因pntAB来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA15342.1-BAA15336.1；
所述谷氨酸脱氢酶编码基因rocG来自枯草芽孢杆菌168，NCBI中Protein ID:NP_391659.2；
所述柠檬酸合酶编码基因gltA来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA35384.2；
所述启动子PilvB为大肠杆菌W3110的ilvB基因的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；
所述丙酮酸脱氢酶编码基因aceE来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAB96684；
所述弱启动子BBA_J23114，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
所述磷酸解酮酶编码基因fxpk来自青春双歧杆菌ATCC 15703，NCBI中Protein ID:WP_011743105.1；
所述启动子PfliC为大肠杆菌W3110的fliC基因的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3所示；
所述6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因edd来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA15659；
所述月桂酰基转移酶编码基因lpxL来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA35852；
所述月桂酰基转移酶编码基因lpxM来自大肠杆菌W3110，NCBI中Protein ID:BAA15663。
3.权利要求1所述L-缬氨酸生产菌株的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵法生产L-缬氨酸的方法如下：
以5-10％接种量将种子培养物接至发酵培养基中进行发酵培养，pH维持在6.8-7.2，培养温度35℃；维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)；12h前溶氧维持在30-50％，之后溶氧维持在5-15％。发酵周期26-30h。
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|---|---|---|---|---|
| CN116333956A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-06-27 | 江南大学 | 一种谷氨酸棒状杆菌及采用谷氨酸棒状杆菌发酵生产l-缬氨酸的方法 |
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- 2022-12-28 CN CN202211694641.2A patent/CN116804180A/zh active Pending
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| CN116333956A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-06-27 | 江南大学 | 一种谷氨酸棒状杆菌及采用谷氨酸棒状杆菌发酵生产l-缬氨酸的方法 |
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