CN112481186B - 一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产4‑羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。所述菌株以TUIE03为宿主，过表达异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的同时将α‑酮戊二酸脱氢酶E1亚基编码基因sucA的表达进行弱化。该菌株经过24‑48h发酵，4‑羟基异亮氨酸产量达到32.5‑62.4g/L，整个发酵过程中未检测到L‑异亮氨酸，表明L‑异亮氨酸被完全转化。该方法采用的发酵工艺简单，无需添加前体物L‑异亮氨酸和α‑酮戊二酸，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。

Description

一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用
技术领域：
本发明涉及一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
4-羟基异亮氨酸是L-异亮氨酸的一种羟基化物。4-羟基异亮氨酸是传统降血糖药物葫芦巴种子中的主要活性物质，具有4-羟基异亮氨酸促进胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗，降血糖，降血脂的作用，在治疗糖尿病方面有良好应用前景。4-羟基异亮氨酸主要的生产方法有提取法、化学合成法，酶催化法和微生物发酵法。目前工业化生产主要采用葫芦巴种子提取法，然而每提取1.0g的4-HIL需要消耗6.7kg的葫芦巴种子，产量低且原料成本高，工艺复杂。化学合成法和酶催化法需要昂贵的底物和辅酶，反应条件苛刻，易产生有毒副产物，影响后续的医疗使用。相比之下，微生物发酵法生产效率高，成本低廉且已成功地用于多种天然产品的工业化生产,将会是现有提取法的一种理想的替代方法。
张志钧等(201811611461.7)利用表达有异亮氨酸双加氧酶的大肠杆菌静息细胞作为酶源，通过添加前体物L-异亮氨酸和α-酮戊二酸，4-羟基异亮氨酸产量28.3g/L。饶志明等(201910120166.X)采用相同的方法利用枯草芽孢杆菌工程菌，使得4-羟基异亮氨酸产量达到27.8g/L。张文丽等(Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型双加氧酶重组大肠杆菌全细胞催化合成)采用含异亮氨酸双加氧酶的大肠杆菌静息细胞作为酶源，利用底物L-异亮氨酸和α-酮戊二酸，4-羟基异亮氨酸产量达到58.8g/L。上述方法不足之处在于，需要添加L-异亮氨酸和α-酮戊二酸两种前体物，大大增加了生产成本。史锋等(201910248263.7)将异亮氨酸双加氧酶编码基因导入能够生产谷氨酸棒杆菌，在添加前体物α-酮戊二酸的条件下，可生成4-羟基异亮氨酸16.35g/L，发酵周期为144h。该方法不足之处在于，需要添加前体物α-酮戊二酸、4-羟基异亮氨酸产量低、发酵周期长。孟静等(两阶段溶氧控制及FeSO4添加对谷氨酸棒杆菌合成4-羟基异亮氨酸的影响)利用谷氨酸棒杆菌构建了需添加L-异亮氨酸和α-酮戊二酸的4-羟基异亮氨酸生产菌株，该菌能够利用葡萄糖直接发酵合成4-羟基异亮氨酸，经64h发酵，4-羟基异亮氨酸产量达到43.4g/L。然而该方法的发酵产量较低，发酵周期偏长。
发明内容：
为解决上述需要添加前体物L-异亮氨酸和(或)α-酮戊二酸、4-羟基异亮氨酸产量低、发酵周期长、生产成本高等瓶颈问题，本发明提供一种产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及采用该菌直接发酵生产4-羟基异亮氨酸的方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案之一是：提供一株4-羟基异亮氨酸高产菌株，所述菌株以TUIE03为宿主，过表达异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的同时将α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基编码基因sucA(BAA35392.1)的表达进行弱化；
进一步地，所述异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；
进一步地，通过将sucA原启动子替换为BBA_J23114弱启动子进行弱表达；
进一步地，所述BBA_J23114弱启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
所述宿主菌TUIE03已公开于中国专利ZL 2019105529156。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案之二是：提供构建上述4-羟基异亮氨酸基因工程菌的方法，包括如下步骤：
(1)重组质粒pST-ido的构建
以SEQ ID NO.1所示的ido基因片段为模板，利用引物ido-1和ido-2扩增ido基因片段，PCR产物经EcoR I和Hind III双酶切后经T4连接酶连接至经相同酶切的pSTV28质粒后获得pST-ido；
(2)sucA弱化菌株HIL02的构建
以野生型大肠杆菌W3110基因组为模板，分别利用引物sucA-1/sucA-2及sucA-3/sucA-4扩增sucA启动子的上下游同源臂，然后利用重叠PCR获得sucA启动子上游同源臂、启动子BBA_J23114和sucA启动子下游同源臂的融合片段UPsucA-BBA_J23114-DPsucA；
将RB-1/RB-2退火后连接至pGRB，获得pGRB-sucA；
将pGRB-sucA和UPsucA-BBA_J23114-DPsucA电转化至含pREDcas9的TUIE03，经筛选获得sucA弱化菌株HIL02；
(3)4-羟基异亮氨酸生产菌株HIL03的构建
将步骤(1)获得的pST-ido转化至HIL02，经筛选获得HIL03。
本发明解决上述问题所采用的技术方案之三是：菌株HIL03在生产4-羟基异亮氨酸中的应用；
进一步地，采用菌株HIL03发酵生产4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
①种子培养：将本发明所述的大肠杆菌基因工程菌经活化后接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30-40％，通风量3-5m3/h，搅拌转速200-800rpm，35℃培养6-8h。
②发酵罐发酵：以5％-10％接种量将步骤①的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度32℃-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-50％，流加浓度为80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期24-48h，产量为32.5-62.4g/L；
③发酵液中L-异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸的检测：发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对催化液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
所述种子培养基成分为：35g/L葡萄糖，0.5-12g/L(NH4)2SO4，5-10g/L酵母粉，1-6g/L胰蛋白胨，3-10g/L玉米浆干粉，2-4g/L KH2PO4，10-50mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
所述发酵培养基成分为：10-20g/L葡萄糖，1-5g/L(NH4)2SO4，2-8g/L酵母粉，0.2-1g/L胰蛋白胨，2-5g/L玉米浆干粉，2-5g/L KH4PO4，1-4g/L MgSO4·7H2O，5-15mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
有益效果：
(1)本发明以L-异亮氨酸高产菌TUIE03为出发菌株，利用代谢工程手段，通过引入4-羟基异亮氨酸合成途径并弱化α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基转录构建了生产4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌基因工程菌。于5L发酵罐进行分批补料发酵，24h时发酵强度最高，为1.83g/L/h，此时4-羟基异亮氨酸产量为43.8g/L；44h时4-羟基异亮氨酸产量最高，达到62.4g/L，此时发酵强度为1.42g/L/h。整个发酵过程中未检测到L-异亮氨酸，表明L-异亮氨酸被完全转化。
(2)该方法采用的发酵工艺简单，无需添加前体物L-异亮氨酸和α-酮戊二酸，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。与现有技术相比，本发明获得的工程菌株和工艺无需添加前体物L-异亮氨酸和α-酮戊二酸，其4-羟基异亮氨酸产量和发酵强度高于现有技术。
附图说明：
图1 4-羟基异亮氨酸基因工程菌HIL01和HIL03以及L-异亮氨酸生产菌株TUIE03摇瓶发酵结果；
图2 4-羟基异亮氨酸基因工程菌HIL03的发酵过程曲线。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：于TUIE03构建4-羟基异亮氨酸合成途径
(1)ido基因的扩增及
以SEQ ID NO.1所示的ido基因片段为模板，设计引物ido-1和ido-2扩增ido基因片段，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒进行回收。
(2)重组质粒pSTV28-ido的构建为
用限制性内切酶EcoR I和Hind III分别对质粒pSTV28与基因片段ido分别进行酶切处理。然后，使用胶回收试剂盒回收纯化线性化的pSTV28质粒与ido片段，然后利用T4连接酶连接。将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，复苏后均匀涂布在含0.05mmol/L氯霉素的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。次日挑选平板上单菌落利用引物ido-1和ido-2进行菌落PCR验证，筛选阳性转化子。将阳性转化子进行再培养，提取重组质粒，命名为pSTV28-ido。
(4)工程菌株HIL01的构建
将重组质粒pSTV28-ido电击转化至大肠杆菌TUIE03感受态细胞中，复苏后均匀涂布在含0.05mmol/L氯霉素的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。次日挑选平板上单菌落利用引物ido-1和ido-2进行菌落PCR验证，筛选阳性转化子，命名为HIL01。
实施例2：sucA弱化菌HIL02的构建
(1)重叠片段的构建
以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别利用引物sucA-1/sucA-2及sucA-3/sucA-4扩增sucA启动子的上下游同源臂，其中引物中包含弱启动子BBA_J23114序列，PCR产物回收后经重叠PCR获得包含sucA启动子上、下游同源臂、启动子BBA_J23114的融合片段UPsucA-BBA_J23114-DPsucA。
(2)pGRB-sucA质粒的构建
根据sucA启动子序列设计并合成gRNA20bp正向和反向序列RB-1和RB-2，二者退火后利用重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞医疗科技有限公司)连接至质粒pGRB，经转化E.coli DH5α、含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基筛选、测序鉴定获得重组质粒pGRB-sucA。
(3)sucA弱化菌HIL02的构建
将重组质粒pGRB-sucA和融合片段UPsucA-BBA_J23114-DPsucA电转化至含有pREDcas9质粒的TUIE03感受态细胞中，复苏后涂布于含100μg/mL壮观霉素的LB固体培养上，32℃恒温过夜培养。次日用引物sucA-5/sucA-6进行菌落PCR鉴定，筛选阳性转化子。活化转化子，并添加终浓度为0.2mmol/L的阿拉伯糖，32℃振荡培养过夜，使pGRB-sucA丢失；然后42℃震荡培养过夜，使pREDcas9质粒丢失，获得菌株HIL02。
实施例3：4-羟基异亮氨酸生产菌HIL03的构建
提取重组质粒pSTV28-ido，将其电转化至菌株HIL02中，经氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR鉴定，获得菌株HIL03。
实施例4：HIL01和HIL03摇瓶发酵
(1)种子培养
分别将HIL01和HIL03接种到含20μg/mL氯霉素和50μg/mL青霉素的LB固体培养基斜面上，以TUIE03为对照，培养12h。然后接种至50mL种子培养基中，32℃，200rpm摇床振荡培养6h-8h。
(2)发酵培养
以1％接种量接种至发酵培养基，32℃，200rpm摇床振荡培养24h。发酵过程中根据情况补充80％葡萄糖2-3次维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，每次补充1mL，用氨水调节pH约为7。
(3)发酵液中4-羟基异亮氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对催化液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HIL01的4-羟基异亮氨酸产量达到15.7g/L，但仍有4.8g/L的异亮氨酸残余。而菌株HIL03的4-羟基异亮氨酸产量达到22.4g/L，未检测到L-异亮氨酸。而对照菌TUIE03产生L-异亮氨酸13.9g/L，无4-羟基异亮氨酸合成。
其中：
种子培养基成分为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，3g/L胰蛋白胨，0.2g/LKH2PO4，0.1g/L MgSO4·7H2O，5mg/L FeSO4·7H2O，2.0％苯酚红，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，2g/L胰蛋白胨，0.5g/LKH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，15mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·H2O，2mg/L VB1，2.0％苯酚红，pH 7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例5：菌株HIL03的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HIL03全部接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至7.2，溶氧维持在20％，通风量3-5m3/h，搅拌转速200-800rpm，32℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以8％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度33℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在40％，流加浓度为80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至7.2，发酵周期36h。
(3)发酵液中4-羟基异亮氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对催化液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HIL03的4-羟基异亮氨酸产量达到46.6g/L，未检测到L-异亮氨酸。其中：
种子培养基成分为：30g/L葡萄糖，0.5g/L(NH4)2SO4，5g/L酵母粉，1g/L胰蛋白胨，3g/L玉米浆干粉，2g/L KH2PO4，10mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：12g/L葡萄糖，1g/L(NH4)2SO4，2g/L酵母粉，0.2g/L胰蛋白胨，2g/L玉米浆干粉，2g/L KH4PO4，1g/L MgSO4·7H2O，5mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例6：菌株HIL03的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HIL03全部接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至7.2，溶氧维持在30％，通风量3-5m3/h，搅拌转速200-800rpm，32℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在45％，流加浓度为80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至7.2，发酵周期42h。
(3)发酵液中4-羟基异亮氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对催化液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
菌株HIL03的4-羟基异亮氨酸产量达到50.9g/L，未检测到L-异亮氨酸。其中：
种子培养基成分为：32g/L葡萄糖，0.8g/L(NH4)2SO4，7g/L酵母粉，2g/L胰蛋白胨，4g/L玉米浆干粉，2.5g/L KH2PO4，12mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：18g/L葡萄糖，2g/L(NH4)2SO4，3g/L酵母粉，0.8g/L胰蛋白胨，3g/L玉米浆干粉，2.5g/L KH4PO4，2g/L MgSO4·7H2O，9mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
实施例7：菌株HIL03的5L发酵罐发酵
(1)种子培养：用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的菌株HIL03全部接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至7.2，溶氧维持在30％，通风量3-5m3/h，搅拌转速200-800rpm，32℃培养6h。
(2)发酵罐发酵：以10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30％，流加浓度为80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至7.2，发酵周期48h。
(3)发酵液中4-羟基异亮氨酸的检测
发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对催化液进行衍生反应，采用高效液相色谱测定4-羟基异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(150mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm。
在菌株HIL03的发酵过程中，24h时发酵强度最高，为1.83g/L/h，此时4-羟基异亮氨酸产量为43.8g/L；44h时4-羟基异亮氨酸产量最高，达到62.4g/L，此时发酵强度为1.42g/L/h。整个发酵过程中未检测到L-异亮氨酸，发酵过程曲线如图2所示。
其中：
种子培养基成分为：34g/L葡萄糖，10g/L(NH4)2SO4，9g/L酵母粉，6g/L胰蛋白胨，8g/L玉米浆干粉，4g/L KH2PO4，20mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基成分为：20g/L葡萄糖，4g/L(NH4)2SO4，8g/L酵母粉，1g/L胰蛋白胨，5g/L玉米浆干粉，3.5g/L KH4PO4，4g/L MgSO4·7H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
本发明实施例所用引物序列列表：
Figure BDA0002847358540000091
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种生产4-羟基异亮氨酸的基因工程菌及其应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌
<400> 1
atgaaaatga gcggttttag catcgaagag aaagtgcacg agtttgaaag caagggcttc 60
ctggagatca gcaacgaact ttttctgcaa gaagaagaaa accatcgcct gctgacccag 120
gcccagctgg agtactacaa cctggaggat gatgcctatg gcgagtgccg tgcccgcagc 180
tacagccgct acatcaagta cgtggacagc ccggattacg ttctggataa tagtaatgaa 240
tattttcaga cgaaagagta caattatgat gatggcggca aggtgcgcca gttccacagc 300
attaacgaca gcttcctgta taacccgctg atccagaaca tcgttcgctt cgataccgag 360
ttcgccttta aaaccaatat catcgatacc agcaaggatc tgatcatcgg cctgcaccag 420
gtgcgctata aagccaccaa agagcgtccg agcttcagca gcccgatttg gctgcataag 480
gatgacgaac cggtggtgtt cctgggactg atgaatctga gcaacaccgc cattggtggc 540
gacagtctga ttgccaacag cccgcgcgag atcaaccagt tcatcagcct gaaagagccg 600
ctggaaaccc tggttttcgg ccagaaggtg tttcacgcag ttaccccgct gggtaccgaa 660
tgcagcaccg aagcattccg cgacattctg ctggtgacct ttagctataa agaaaccaaa 720
taa 723
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttatggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagc 35

Claims (4)

1.一种4-羟基异亮氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株以TUIE03为宿主，过表达异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的同时将α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基编码基因sucA的表达进行弱化；
所述弱化是通过将sucA原启动子替换为BBA_J23114弱启动子进行弱表达；
所述异亮氨酸双加氧酶编码基因ido的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
所述BBA_J23114弱启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述菌株在生产4-羟基异亮氨酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵生产4-羟基异亮氨酸的方法如下：将种子液以5％-10％接种量接入发酵培养基进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-50％，流加葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％，发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期24-48h。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养基成分为：10-20g/L葡萄糖，1-5g/L(NH4)2SO4，2-8g/L酵母粉，0.2-1g/L胰蛋白胨，2-5g/L玉米浆干粉，2-5g/L KH4PO4，1-4g/LMgSO4·7H2O，5-15mg/L FeSO4·7H2O，pH调至7.0-7.2，115℃，高压蒸汽灭菌15min。
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