JP5210391B2 - 乳酸生産細菌及び乳酸生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、乳酸生産細菌及び乳酸生産方法に関する。

乳酸にはＬ−乳酸とＤ−乳酸があり、Ｌ−乳酸は工業生産されているポリ乳酸の原料であり、一方、Ｄ−乳酸についてもポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。但し、上記いずれの用途においても、原料たる乳酸には高い光学純度が要求されるのが事実である。

自然界には乳酸を効率良く生産する微生物が存在し、一部では、それらを用いた乳酸製造法が行われているが、副生物、例えば酢酸、エタノール、アセトイン、ピルビン酸といった化合物も生産され、最終産物である乳酸の品質低下につながることがある。また光学異性体の混入が原因で、光学純度の低下をきたす事も重大な問題となる。

そのような乳酸の純度低下を回避するために、近年発展してきた遺伝子組換え技術を利用して微生物の特定遺伝子を破壊して、狙った副生物の生産を特異的に阻害する方法が開発されている。特に、乳酸菌や糸状菌など、元来乳酸を高生産できる微生物での適用よりも、ゲノム情報が豊富で、遺伝子組換え宿主としての実績が十分にあるエシェリヒア・コリ、酵母等で、光学純度の高い乳酸生産技術の開発が試みられている。

例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２００６ Ｏｃｔ；２８（１９）：１５２７−１５３５（Ｇｒａｂａｒらの文献）によれば、大腸菌のピルビン酸からＤ−乳酸への代謝経路の遺伝子であるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）、およびメチルグリオキサールからＤ−乳酸への代謝経路の遺伝子であるｍｓｇＡ遺伝子を破壊し、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ由来Ｌ−乳酸脱水素酵素を生産する大腸菌を、１ｍＭのベタインを含むミネラルで構成された合成培地で培養することによって、光学純度の高いＬ−乳酸の生産に成功している。

本文献によれば、ｍｓｇＡ遺伝子を破壊していない大腸菌は、ベタイン存在下では、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）を破壊したとしても、大腸菌が生合成するメチルグリオキサールに由来するＤ−乳酸が生産される為、原料中にＤ−乳酸の混入が無くても９６％ｅ．ｅ．程度の光学純度しか得られないことが示されている。

また、本文献中の大腸菌にはＤ−乳酸を分解する為のＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｌｄ）が存在しているが、ｍｓｇＡ遺伝子を破壊しなければ、ベタイン存在下では光学純度は９５〜９６％程度となることが示されている。すなわち、大腸菌に内在するｄｌｄ遺伝子の発現のみでは大腸菌が合成するわずかなＤ−乳酸すら十分分解することができず、高い光学純度が得られないことが示されている。また、ベタインが存在しない培地では、原料中にＤ−乳酸が含まれていなければ９９％以上の高い光学純度の乳酸を生産することが可能であるが、所望の乳酸の生産速度が半分程度に低下してしまうことが示されている。

これらのことから、ｍｓｇＡ遺伝子の破壊とベタインの添加が無ければ高いＬ−乳酸の生産性と高い光学純度の両立は困難であることが示されている。
また、本文献は、大腸菌が生産するＤ−乳酸の生産を抑制し、Ｄ−乳酸の含まれていない培地を用いて光学純度の高いＬ−乳酸を生産するものであって、培地成分にＤ−乳酸が含まれる場合に光学純度を高める方法を記載したものではない。

特開２００４−１８７６４３号公報には、高い光学純度を得るために乳酸ラセマーゼの活性を低下させる方法が開示されている。この方法は乳酸生産菌自体がＤＬ−乳酸をつくってしまう場合には有効であるが、培地中にＤＬ−乳酸が含まれる場合には効果が望めない。
また、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，Ｖｏｌ．７３（１），ｐｐ８０−８２（２００１）には、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを使ってＤＬ−乳酸混合液をＤ−乳酸溶液にするという方法が開示されているが、報告中の実験では１ｍＬという小スケールであり、乳酸の濃度は１０ｍＭ程度と低く、一般に１０００ｍＭ以上となる乳酸生産菌を用いた工業的生産においても有効であるとは考えられない。

一方、ＷＯ２００５／０３３３２４号パンフレットによれば、ｄｌｄ遺伝子を破壊した大腸菌を用いて、コーンスティープリカーを含む培地から光学純度の高いＤ−乳酸の生産に成功している。コーンスティープリカーにはＤＬ−乳酸が含まれており、ｄｌｄ遺伝子を破壊した大腸菌は、微好気条件でのＤ−乳酸の分解を抑制し、Ｌ−乳酸を分解しながらＤ−乳酸を生産することにより、光学純度の高いＤ−乳酸の生産に成功している。本文献によれば、通気は、糖の代謝速度や光学異性体の分解速度、不純物の生産速度に影響を与え、通気を過剰にすれば糖の代謝速度が低下するため乳酸の生産速度が低下することが示されている。そのため、乳酸の生産を目的とする場合、通気量には上限があり、最適な通気量を求めることが必要であることが示されている。すなわち、好気的な代謝反応であるＬ−乳酸の分解のために供給できる酸素量はＤ−乳酸の生産速度を低下させない量までである。

ところで、工業的には乳酸の生産速度は高いことが望ましく、光学純度の低下をもたらす光学異性体も、極力、速やかに分解されることが望ましい。Ｌ−乳酸またはＤ−乳酸をピルビン酸へ分解する酵素は、ＦＭＮ（flavin mononucleotide）またはＦＡＤ（flavin adenine dinucleotide ）などの補酵素を利用するか、直接酸素を利用して乳酸をピルビン酸へ変換する。補酵素を利用する酵素は、その補酵素の再生のために呼吸、すなわち酸素を利用することが効率的である為、結局いずれの酵素も、供給可能な酸素量に酵素活性が制限を受ける。

しかしながら、酸素の供給量を増加させれば、光学純度を低下させる乳酸は速やかに分解されるが、糖の代謝速度が低下することになり、所望の乳酸の生産速度が大幅に低下する。このため、酸素量に拘わらず細胞外の原料由来の乳酸の分解速度を向上させ、より短時間に所望の乳酸の光学純度を向上させることは極めて困難であった。

従って、本発明は、光学純度が高い乳酸をより短時間に生産する乳酸生産大腸菌及び乳酸生産方法を提供することにある。

本発明は以下のとおりである。
［１］ Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか一方を分解していずれか他方を生産するように、１種類以上のＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ及び１種類以上の非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼの各酵素活性が共に強化されている乳酸生産大腸菌であって、前記ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼの活性強化が、Ｌ−乳酸生産の場合には、ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性強化であり、Ｄ−乳酸生産の場合には、ＬｄｈＡの活性強化であり、
前記非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼの活性強化が、Ｌ−乳酸生産の場合には、Lact deh membドメインを有するＤｌｄによるＤｌｄの活性強化であり、Ｄ−乳酸生産の場合には、ＬｌｄＤの活性強化、又は、ＬｌｄＤの活性強化と、ＬｌｄＲの不活化若しくは低減化、Ｌｏｘの活性強化、及びＬｃｔＯの活性強化からなる群の１つ以上との組み合わせであり、該ＬｌｄＤの活性強化が、ＬｌｄＤをコードする遺伝子のＯＲＦ中の３３位にサイレント変異を有する変異体ｌｌｄＤ遺伝子の発現によるものである当該乳酸生産大腸菌。
［２］ 前記Ｄ−乳酸生産の場合の前記非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素の活性強化が、ＬｌｄＤの活性強化と、ＬｌｄＲの不活化若しくは低減化、Ｌｏｘの活性強化、及びＬｃｔＯの活性強化からなる群のいずれか１つとの組み合わせである［１］記載の乳酸生産大腸菌。
［３］ 前記変異体ＬｌｄＤが、配列番号４１の塩基配列で表されるものである［１］又は［２］記載の乳酸生産大腸菌。
［４］ 前記Ｄ−乳酸生産の場合の前記非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素の活性強化が、ＬｌｄＲの不活化若しくは低減化と、前記変異体ＬｌｄＤによるＬｌｄＤ活性強化と、Ｌｏｘの活性強化との組み合わせ、又は、前記変異体ＬｌｄＤによるＬｌｄＤ活性強化とＬｏｘの活性強化との組み合わせ、である［２］又は［３］記載の乳酸生産大腸菌。
［５］ 前記ＬｌｄＤの遺伝子が大腸菌由来の遺伝子であり、前記Ｌｏｘの遺伝子がエンテロコッカス属菌由来の遺伝子であり、前記ＬｃｔＯの遺伝子がラクトコッカス属菌由来の遺伝子である［１］〜［４］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［６］ 前記Ｄ−乳酸生産の場合に、Ｄｌｄ活性及びＰｆｌ活性からなる群より選択された少なくとも一つが不活化または低減化している［１］〜［５］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［７］ 前記Ｌ−乳酸生産の場合の前記ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼが、ビフィドバクテリウム属菌に由来するものである［１］に記載の乳酸生産大腸菌。
［８］ 前記Ｌ−乳酸生産の場合の前記Ｄｌｄが、大腸菌、ザイモモナス属菌及びコリネバクテリウム属菌からなる群より選ばれる少なくとも１種に由来する［１］又は［７］に記載の乳酸生産大腸菌。
［９］ 前記Ｌ−乳酸生産の場合の前記Ｄｌｄが、さらにＦＡＤ−oxidase_Cドメインを有する［１］、［７］又は［８］に記載の乳酸生産大腸菌。
［１０］ 前記Ｌ−乳酸生産の場合の前記Ｄｌｄが、ザイモモナス属菌及びコリネバクテリウム属菌からなる群より選ばれる少なくとも１種に由来する［１］又は［７］〜［９］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［１１］ 前記Ｌ−乳酸生産の場合に、ＬｄｈＡ活性、ＬｌｄＤ活性及びＰｆｌ活性の少なくとも一つが不活化または低減化されている［１］又は［７］〜［１０］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［１２］ Ｍｄｈ及びＡｓｐＡの活性からなる群より選択された少なくとも一つが不活化または低減化されている［１］〜［１１］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［１３］ スクロース非ＰＴＳ遺伝子群及びＦｒｕＫからなる群より選択された少なくとも一つが強化されている［１］〜［１２］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［１４］ ＦｒｕＲ活性が不活化または低減化されている［１］〜［１３］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌。
［１５］ ［１］〜［１４］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌を用いて乳酸を生産する乳酸生産方法。
［１６］ 常圧で、０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、攪拌速度が１Ｌ容培養槽を用いた場合に１００ｒｐｍ以上３５０ｒｐｍ以下の条件で達成し得る通気条件下で乳酸生産を行う、［１５］記載の乳酸生産方法。
［１７］ 前記１Ｌ容培養槽が、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１である［１６］記載の乳酸生産方法。
［１８］ ［１］〜［６］及び［１２］〜［１４］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌を用いてＤ−乳酸を生産するＤ−乳酸生産方法。
［１９］ 常圧で０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、攪拌速度が１Ｌ容培養槽を用いた場合に１００ｒｐｍ以上３５０ｒｐｍ以下の条件で達成し得る通気条件下でＤ−乳酸生産を行う、［１８］記載のＤ−乳酸生産方法。
［２０］ 前記１Ｌ容培養槽が、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１である［１９］記載のＤ−乳酸生産方法。
［２１］ ［１］又は［７］〜［１４］のいずれかに記載の乳酸生産大腸菌を用いてＬ−乳酸を生産するＬ−乳酸生産方法。
［２２］ ０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、攪拌速度が１Ｌ容培養槽を用いた場合に１００ｒｐｍ以上３５０ｒｐｍ以下の条件で達成し得る通気条件下でＬ−乳酸生産を行う、［２１］に記載のＬ−乳酸生産方法。
［２３］ 前記１Ｌ容培養槽が、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１である［２２］記載のＬ−乳酸生産方法。

本発明の乳酸生産大腸菌は、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか一方を分解していずれか他方を生産するように、１種類以上のＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素及び１種類以上の非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素の各酵素活性が共に強化されている乳酸生産大腸菌である。

本発明の大腸菌は、乳酸代謝系における１種類以上のＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素及び１種類以上の非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素の各酵素活性が共に強化されて、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか一方を生成するためにいずれか他方を分解しうるので、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか一方の生産と共に、光学純度を低下させる光学異性体のみの速やかな分解を同時に進行させることができる。
この結果、光学純度が高い乳酸をより短時間に生産する乳酸生産大腸菌及び乳酸生産方法を提供することができる。

本発明において酵素活性の「強化」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたもの、或いは当該酵素遺伝子のリプレッサー活性を低減化又は不活化することの結果として当該酵素活性を強化させることを含む。
本発明における酵素活性の「低減化」とは、当該酵素をコードする遺伝子の遺伝子組換えにより、それらの処理を行う前の状態よりも有意に当該酵素の活性が低下している状態を指す。
本発明において酵素活性の「不活化」とは、既存のいずれの測定系によっても、測定対象の当該酵素の活性が検出限界以下である状態を指す。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明の乳酸生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
本明細書中で示された数値範囲は、記載された数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
以下に本発明を詳しく説明する。

本発明の乳酸生産大腸菌では、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか一方を生成するためにいずれか他方を分解していずれか一方の乳酸を生成するように、１種類以上のＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ及び１種類以上の非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼの各酵素活性が共に強化されていればよい。具体的には、前記ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼの活性強化が、ピルビン酸からＤ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか一方を生成するものであり、且つ、前記非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼが、前記Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか他方を基質として分解するものであることが好ましい。この結果、ピルビン酸からＤ−乳酸又はＬ−乳酸が確実に生成し、他方の分解が促進されるので、光学純度が高い乳酸が、より具体的に効率よく得られる。

このようなＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．２７または、酵素番号１．１．１．２８に分類されるＮＡＤを補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼを意味する。この酵素は、乳酸代謝系において、ＮＡＤを補酵素としてＬ−乳酸又はＤ−乳酸とピルビン酸との間の酸化還元反応を行う。基質量及びＮＡＤの量等に応じて酸化還元反応を行う機能を有するが、光学純度の高い乳酸を生産する観点から、ピルビン酸からＤ−乳酸又はＬ−乳酸を生成するＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼの活性強化であることが好ましい。

ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を宿主細菌に導入しうる遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、エシェリヒア属菌（Escherichia）、シュードモナス属菌（Pseudomonas）、アエロバクター属菌（Aerobacter）、クロストリジウム属菌（Clostridium）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に由来するもの、特にエシェリヒア属菌（Escherichia）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来の遺伝子、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

また本発明における非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素とは、ＮＡＤ以外を補酵素とする乳酸デヒドロゲナーゼ、または酸素を直接利用して乳酸を酸化する乳酸オキシダーゼを意味する。これらの酵素は、乳酸代謝系において、ＦＡＤやＦＭＮなどを補酵素として、または直接酸素を利用して、Ｌ−乳酸又はＤ−乳酸とピルビン酸との間の酸化還元反応を行う酵素である。基質量及び補酵素量などに応じて酸化還元反応を行う機能を有する酵素であり、本発明では、Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか一方を基質としてピルビン酸まで分解し得る機能を強化する酵素であることが好ましい。

非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素活性を宿主細菌に導入しうる遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、エシェリヒア属菌（Escherichia）、シュードモナス属菌（Pseudomonas）、アエロバクター属菌（Aerobacter）、クロストリジウム属菌（Clostridium）、エンテロコッカス属菌（Enterococcus）、ストレプトコッカス属菌（Streptococcus）、ペディオコッカス属菌（Pediococcus）、ラクトコッカス属菌（Lactococcus）、アエロコッカス（Aerococcus）属菌、コリネバクテリウム属菌（Corynebacterium）、ザイモモナス属菌（Zymomonas）に由来するもの、特にエシェリヒア属菌（Escherichia）、エンテロコッカス属菌（Enterococcus）、コリネバクテリウム属菌（Corynebacterium）、ザイモモナス属菌（Zymomonas）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ９６２５株、コリネバクテリウム・グルタミカム ＮＢＲＣ１２１６８株、ザイモモナス・モビルス ＡＴＣＣ３１８２１株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

このように非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ及びＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼを組み合わせて、且つそれぞれの活性強化をすることによって、一方の光学異性体を生成する一方で、光学純度を低下させる他方の光学異性体の分解を行うので、乳酸を高い光学純度で且つ迅速に生産することができる。

本発明の乳酸生産大腸菌は、上述した各酵素活性の強化に寄与するいずれの遺伝子を強化するものであってもよいが、Ｄ−乳酸又はＬ−乳酸それぞれの光学純度及び生産効率の観点から、後述する各遺伝子で強化したものであることが好ましい。
以下、Ｄ−乳酸を生産するＤ−乳酸生産菌とＬ−乳酸を生産するＬ−乳酸生産菌とに分けて説明する。

＜Ｄ−乳酸生産菌＞
本発明におけるＤ−乳酸生産菌では、ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性強化としてＬｄｈＡの活性が強化されていることが好ましい。
本発明におけるＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼとして活性が強化されるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）とは、ピルビン酸とＮＡＤＨからＤ−乳酸とＮＡＤを生成する酵素を指す。なお、一般にはＬｄｈＡはＬ−乳酸を生産するものとＤ−乳酸を生産するもののどちらも知られているが、本発明においては、混乱を避けるため、Ｄ−乳酸を生産するもののみをＬｄｈＡと表記する。

ｌｄｈＡ遺伝子としては、この酵素活性を保有する生物から得られる遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列であってもよい。
好適なｌｄｈＡ遺伝子の例としては、上述したＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼについて記述した菌に由来するものを挙げることができ、具体的にはＢｕｎｃｈら（Microbiology1, 43(Pt 1), pp.187-195 (1997)）が取得した遺伝子、またはエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡを鋳型に後述する配列番号１９および配列番号２０よりＰＣＲにより増幅されるＤＮＡフラグメントに含まれる配列をもつ遺伝子を例示できる。

本発明におけるＬｄｈＡ活性を増強する方策の一つとして、ＬｄｈＡをコードする遺伝子を、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結した状態で発現プラスミドに組込み、それを所望の細菌へ導入する方法が有効である。その場合の解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に細菌内、好ましくはエシェリヒア・コリ内で機能する強力なプロモーターで、且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターを指し、具体的にはグリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーターが例示できる。このようにして得られた大腸菌は、通気条件下でＤ−乳酸を生産させる時にｌｄｈＡの発現が増強されていないものと比較してＤ−乳酸の蓄積量が向上し、Ｄ−乳酸の光学純度を向上させることが可能となる。

また発明におけるＤ−乳酸生産菌では、非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素の活性強化が、ＬｌｄＤの活性強化、Ｌ−乳酸オキシダーゼの活性強化、ＬｌｄＲの不活若しくは低減化、又はこれらの１つ以上の組み合わせであることが好ましい。
これにより、Ｌ−乳酸を効率よくピルビン酸に分解することができ、Ｄ−乳酸を生産する際に光学純度を迅速に高めることができる。

本発明における非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素として活性が強化される非ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｌｄＤ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．２．３に分類され、Ｌ−乳酸とＦＭＮからピルビン酸とＦＭＮＨを生成する酵素を指す。このｌｌｄＤ遺伝子としては、この酵素活性を保有する生物から得られる遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列であってもよい。

好適なものとしては、エシェリヒア属菌（Escherichia）、シュードモナス属菌（Pseudomonas）、シゲラ属菌（Shigella）、シトロバクター属菌（Citrobacter）、サルモネラ属菌（Salmonella）に由来するもの、特にエシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

また、ＬｌｄＤは、Ｌ−乳酸のより迅速な分解を図る観点から、ｌｌｄＤ遺伝子のＯＲＦをコードする配列の３３番目がサイレント変異を生じる変異体ｌｌｄＤ遺伝子より発現されるＬｌｄＤであることが好ましく、３３番目の塩基がＣからＴとなる変異体ｌｌｄＤ（Ｃ３３Ｔ変異体ｌｌｄＤ）（配列番号４１）であることが更に好ましい。Ｃ３３Ｔ変異体ｌｌｄＤ遺伝子を公知の遺伝子組換え技術により大腸菌に導入することで、容易に高活性大腸菌株を得ることができる。この高活性株を用いることによって、より高速でＬ−乳酸を分解することができ、Ｄ−乳酸の光学純度を向上させることができる。

また、非ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素として活性が強化されるＬ−乳酸オキシダーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１３．１２．−−に分類され、Ｌ−乳酸と酸素存在下で、ピルビン酸と過酸化水素を生成する酵素を指す。これらの遺伝子ｌｏｘ、ｌｃｔＯとしては、この酵素活性を保有する生物から得られる遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列であってもよい。

好適なものとしては、エンテロコッカス属菌（Enterococcus）、ストレプトコッカス属菌（Streptococcus）、ペディオコッカス属菌（Pediococcus）、ラクトコッカス属菌（Lactococcus）、アエロコッカス属菌（Aerococcus）に由来するものを挙げることができ、これらの中でも、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ９６２５及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ １９４３５から単離したものであることが特に好ましい。

本発明におけるＬｌｄＤ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ活性を増強する方策の一つとして、ＬｌｄＤまたは上記Ｌ−乳酸オキシダーゼをコードする遺伝子を、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結した状態で発現プラスミドに組込み、それを所望の大腸菌へ導入する方法が有効である。その場合の解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に細菌内、好ましくはエシェリヒア・コリ内で機能する強力なプロモーターで、且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターを指し、具体的にはグリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーターが例示できる。このようにして得られた大腸菌は、通気条件下でＤ−乳酸を生産させる時にＬｌｄＤまたはＬ−乳酸オキシダーゼの発現が増強されていないものと比較してＤ−乳酸の蓄積量が向上し、Ｄ−乳酸の光学純度を向上させることが可能となる。

また、ＬｌｄＤ及びＬ−乳酸オキシダーゼは、それぞれ公知の配列をそのまま使用してもよく、また場合によっては、それぞれの酵素活性を損なわない変異体であってもよい。このような変異体としては、アミノ酸の付加、削除、転換などが挙げられる。このような活性を損なわない変異体については、当業界で公知の方法によって得ることができる。

また、非ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性強化として、不活化又は低減化されるＬｌｄＲは、上記のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｌｄＤ）の転写を抑制する制御因子である。ＬｌｄＲの活性を低減化又は不活化することにより、ＬｌｄＤ活性の抑制を阻止することができ、又はＬｌｄＤ活性を効果的に強化することができる。

更に、本発明のＤ−乳酸生産菌は、Ｄｌｄ活性及びＰｆｌ活性からなる群より選択された少なくとも一つが不活化または低減化していることが好ましい。
本発明におけるＤｌｄ（ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ）とは、Ｄ−乳酸から、補酵素である酸化型フラビンアデニンジヌクレオチドの存在下でピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を意味する。このＤｌｄの活性を不活化又は低減化することによって、生産物であるＤ−乳酸の分解を抑制することができる。

また本発明におけるＰｆｌ（ピルベートホルメートリアーゼ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．５４に分類され、ホルメートアセチルトランスフェラーゼとも呼ばれる酵素である。本酵素はピルビン酸からギ酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。このＰｆｌの活性を不活化又は低減化することによって、Ｄ−乳酸の生成原料であるピルビン酸の分解を抑制することができる。

本発明におけるＬｄｈＡ活性が強化されると共にＤｌｄ活性若しくはＰｆｌ活性又はこれら双方が不活化あるいは低減化されている微生物として、ＷＯ２００５／０３３３２４号に記載のエシェリヒア・コリＭＴ−１０９９４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００５８）株が例示できる。

また、本発明のＤ−乳酸生産菌は、上記に加えて、Ｍｄｈ及びＡｓｐＡの活性からなる群より選択された少なくとも一つが不活化または低減化されていることが、副生物の生産量を抑制する観点から、好ましい。

Ｍｄｈ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．３７に分類され、リンゴ酸から、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でオキサロ酢酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。このため、Ｍｄｈの活性を不活化又は低減化することにより、コハク酸の副生を抑えることができる。

またＡｓｐＡ（アスパラギン酸アンモニアリアーゼ）国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．３．１．１．に分類され、アスパルターゼとも呼ばれる酵素である。本酵素はＬ−アスパラギン酸からフマル酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を意味する。このため、ＡｓｐＡの活性を不活化又は低減化することにより、フマル酸の副生を抑えることができる。

本発明のＤ−乳酸生産菌は、グルコースなどの糖を原料としてＤ−乳酸を生産することができるが、他の糖を原料としてＤ−乳酸を生産可能にするためにスクロース非ＰＴＳ遺伝子群及びＦｒｕＫからなる群より選択された少なくとも一つが強化されていてもよく、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群及びＦｒｕＫの双方が強化されていることがより好ましく、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちｃｓｃＡのみとＦｒｕＫとが共に強化されていることが更に好ましい。

本発明におけるスクロース非ＰＴＳ遺伝子群とは、微生物のスクロース資化経路のうち非ＰＴＳ系に関与する遺伝子群のことをいう。詳しくは、リプレッサー蛋白質（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）、スクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）で構成される遺伝子群である。本発明においてスクロース非ＰＴＳ遺伝子群の遺伝子が選択される場合、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちの１種又は２種以上の遺伝子が選択されていてもよく、例えば、ｃｓｃＡのみ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＫの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＢの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡとｃｓｃＢとｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡとｃｓｃＫとｃｓｃＲの組み合わせなどが挙げられる。なかでも、乳酸を更に効率よく生産するという観点から、ｃｓｃＡ遺伝子のみが選択されることが好ましい。なお、本発明のある特定の態様では、「スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちの１種又は２種以上の遺伝子」のうち、リプレッサー蛋白質（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）及びスクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）の組み合わせと、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）及びスクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）の組み合わせ以外が好ましい。

本発明におけるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号３．２．１．２６に分類され、スクロースからＤ−グルコースとＤ−フルクトースを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
この酵素は、Ｋ１２株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、プロトン共輸送移送系、インベルターゼ、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非ＰＴＳ代謝経路の酵素の１つである（Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45, pp418-422参照）。本発明においてこのｃｓｃＡのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースをペリプラズムでグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースＰＴＳ及びフルクトースＰＴＳを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化を可能にすることができる。

本発明の宿主細菌に導入されるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。またＣｓｃＡには、ＣｓｃＡを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。

本発明の宿主細菌に導入されるリプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサータンパク質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明の宿主細菌に導入されるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明の宿主細菌に導入されるスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明におけるフルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）は、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．７．１．５６に分類され、ホスホフルクトキナーゼ１とも呼ばれる酵素である。細菌類、例えば大腸菌においてグルコース存在下でのフルクトース取り込みが一般に抑制されるのに対して、ＦｒｕＫの発現強化がグルコースの存在下にもかかわらず、フルクトースの取り込みを促進し、Ｄ−乳酸生産細菌においてＤ−乳酸の生産性の向上に寄与するという知見はこれまでに全くみられていない。また、上記ＣｓｃＡによってスクロースからできたフルクトースが細胞内に取り込まれてフルクトース−１−リン酸に代謝された後、一連のフルクトース代謝系におけるＦｒｕＫの発現強化のみで乳酸の生産性が向上することも予想外であった。

本発明の宿主大腸菌に導入されるフルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトース−１−リン酸キナーゼをコードする遺伝子（ｆｒｕＫ）の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、エシェリヒア属菌（Escherichia）、シュードモナス属菌（Pseudomonas）、アエロバクター属菌（Aerobacter）、クロストリジウム属菌（Clostridium）に由来するもの、特にエシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。

本発明において、より好ましくは、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）及びフルクトースリン酸キナーゼがいずれも、エシェリヒア・コリＯ１５７細菌又はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５由来の各蛋白質をコードする遺伝子の導入により得られたものとすることができる。これらの細菌由来の遺伝子とすることにより、確実に機能発現させることができる。

また本発明に係るＤ−乳酸生産菌は、更に、ＦｒｕＲ活性が不活化又は低減化されていることが、フルクトースの取り込みを促進できる観点から、好ましい。

本発明において活性が低減されるＦｒｕＲの遺伝子としては、宿主細菌が本来保有するものであればよく、宿主細菌が本来有するＦｒｕＲをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて組み込まれた合成ＤＮＡ配列としてもよい。

このようなＤ−乳酸生産菌を、後述する生産方法に用いることによって、光学純度高く且つ迅速にＤ−乳酸を生産することができる。

＜Ｌ−乳酸生産菌＞
本発明におけるＬ−乳酸生産菌では、ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性強化として、ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性が強化されていることが好ましい。
本発明におけるＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼとして活性が強化されるＬ−乳酸デヒドロゲナーゼとは、ピルビン酸とＮＡＤＨからＬ−乳酸とＮＡＤを生成する酵素を指す。ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子としては、この酵素活性を保有する生物から得られる遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列であってもよい。

好適なＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、大腸菌で発現可能でＬ−乳酸を生産できるＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であれば特に限定しないが、例えば、ビフィドバクテリウム属、エンテロバクター属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属由来のＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを挙げることができ、特に乳酸の生産性の観点からビフィドバクテリウム・ロンガムに由来するＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｄｈ２）であることが好ましい。

また、ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を増強する方策の一つとしては、Ｄ−乳酸生産大腸菌におけるｌｄｈＡについて説明したプロモーターの使用などを挙げることができ、前述した事項をそのまま適用することができる。そのようなＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性が増強された細菌は、通気条件下でＬ−乳酸を生産させる時にＬ−乳酸デヒドロゲナーゼの発現が増強されていないものと比較してＬ−乳酸の蓄積量が向上し、Ｌ−乳酸の光学純度を向上させることが可能となる。

本発明におけるＬ−乳酸生産菌では、非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素として、Ｄｌｄの活性が強化されていることが光学純度向上の観点から好ましい。
本発明におけるＤｌｄ（ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．２．４に分類され、Ｄ−乳酸から、補酵素である酸化型フラビンアデニンジヌクレオチドの存在下でピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を意味する。

Ｄｌｄの活性強化のために宿主菌に導入可能なｄｌｄ遺伝子は、如何なる微生物に由来するものであってもよく、エシェリヒア属菌（Escherichia）、コリネバクテリウム属菌（Corynebacterium）、ザイモモナス属菌（Zymomonas）に由来するものを挙げることができる。

中でも、Lact deh membドメインを共通して有する大腸菌、ザイモモナス及びコリネバクテリウムからなる群より選択された少なくとも１つのｄｌｄ遺伝子であることが光学純度向上の観点からより好ましく、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、ザイモモナス・モビリスにそれぞれ由来するｄｌｄ遺伝子であることが特に好ましい。なおザイモモナス属及びコネリバクテリウム属のｄｌｄ遺伝子は、更にＦＡＤオキシダーゼドメインも共通して有している。このLact deh membドメインとは、細胞膜に配位する乳酸デヒドロゲナーゼが共通して持つ類似性の高いアミノ酸配列である。

Lact deh membドメイン又はＦＡＤオキシダーゼドメインの配列の有無についての情報は、酵素のアミノ酸配列をPfam database（Nucleic Acids Research (2008) Database Issue 36:D281-D288）等を用いて入力、検索することによって得られる。例えば、http://pfam.sanger.ac.uk/searchにアミノ酸配列を入力し、初期状態で検索することにより所望のアミノ酸配列中にLact deh membドメイン又はＦＡＤオキシダーゼドメインの配列が存在するかどうかを知ることができる。

非ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性強化として、この酵素遺伝子の転写を抑制する制御因子がある場合には、これを低減化又は不活化してもよい。
また、Ｄｌｄ活性を増強する方策の一つとしては、Ｄ−乳酸生産大腸菌におけるｌｄｈＡについて説明したプロモーターの使用などを挙げることができ、前述した事項をそのまま適用することができる。

また、本発明に係るＬ−乳酸生産菌では、ＬｄｈＡ活性、ＬｌｄＤ活性及びＰｆｌ活性からなる群より選択された少なくとも一つが不活化または低減化されていることが、好ましい。
ここで活性が不活化または低減化の対象となるＬｄｈＡ、ＬｌｄＤ及びＰｆｌに関する事項については、前述した事項をそのまま適用することができる。
ＬｄｈＡ活性の不活化又は低減化により、Ｌ−乳酸を生成する原料となるピルビン酸の分解を抑制することができる。
ＬｌｄＤ活性の不活化又は低減化により、生産物であるＬ−乳酸の消費を抑制することができる。

また本発明におけるＬ−乳酸生産菌では、前述したＤ−乳酸生産菌と同様に、上記に加えて、Ｍｄｈ及びＡｓｐＡの活性からなる群より選択された少なくとも一つが不活化または低減化されていることが、副生物の生産量を抑制する観点から、好ましい。
更に本発明におけるＬ−乳酸生産菌では、前述したＤ−乳酸生産菌と同様に、他の糖を原料としてＬ−乳酸を生産可能にするためにＣｓｃＡ及びＦｒｕＫからなる群より選択された少なくとも一つが強化されていてもよく、ＣｓｃＡ及びＦｒｕＫの双方が強化されていることが更に好ましい。更にまた、本発明のＬ−乳酸生産菌では、ＦｒｕＲ活性が不活化又は低減化されていることが、フルクトースの取り込みを促進できる観点から、好ましい。
不活化若しくは低減化、または強化の対象となるＭｄｈ及びＡｓｐＡ並びに、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群、ＦｒｕＫ及びＦｒｕＲに関する事項については、前述したものをそのまま適用することができる。

＜乳酸生産方法＞
次に本発明の乳酸生産方法について説明する。
本発明の乳酸生産方法は、上述した乳酸生産菌を用いて乳酸を生産する方法である。
特に、上記のＤ−乳酸生産菌を用いて培養することにより、Ｄ−乳酸を高い光学純度で且つ効率よく生産することができる。同様に上記のＬ−乳酸生産菌を用いて培養することにより、Ｌ−乳酸を高い光学純度で且つ効率よく生産することができる。
本発明のこれらの乳酸生産方法は、具体的には、上述した各乳酸生産菌を培養液で培養すること、前記培養により得られた培養物から乳酸生産菌が生成した特定の乳酸を回収することを含む。

本発明の乳酸生産方法では、乳酸製造の原料として通常用いられる植物由来原料を用いることができる。植物由来原料としては、植物から得られる炭素源であればよい。具体的には、根、茎、幹、枝、葉、花又は種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。

このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物やセルロース加水分解物など、またはこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリンまたは脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
特に本発明における乳酸生産大腸菌がＣｓｃＡ活性を有するものである場合には、スクロース資化能を備えており、スクロースを含む植物原料であっても良好に資化して乳酸を生産することができる。

本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、またはこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。

植物由来原料と乳酸生産細菌との混合は、乳酸生産細菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、細菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。

また培地中の乳酸生産細菌の含有量としては、細菌の種類及び活性によって異なるが一般に、初発の菌濃度を培養液に対して０．１質量％〜３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％〜１０質量％とすることができる。

本発明の培養とは、培地を用いて本発明に係る微生物を培養することである。その際、使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び乳酸を生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた培地であれば特に制限はない。

なかでも、２種以上のアミノ酸が添加された培地で培養することが、生産速度の観点から好ましい。本発明における２種以上のアミノ酸が添加された培地とは、天然に存在する各種アミノ酸の中から少なくとも２種以上を含有する培地を意味し、酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、ホエー、廃糖蜜、コーンスティープリカーなどの天然物や天然物抽出物の加水分解物を含有する培地も含む。より好ましい結果を得るためには酵母エキス、ペプトン、ホエー、廃糖蜜及びコーンスティープリカーより選ばれる少なくとも１種類、もしくはそれらの混合物が０．５質量％から２０質量％含む培地が好ましく、２質量％から１５質量％ではさらに好ましい。特にコーンスティープリカー添加は大きな効果が得られ、このとき硫酸アンモニウムなどの塩は添加しないほうがむしろよい結果となる場合がある。培地は通常液体培地である。

培養条件としては作成された菌体、培養装置により変動するが、例えば培養温度は２０℃から４０℃、より好ましくは２５℃から３５℃で培養することが好ましく、ｐＨはＮａＯＨ、ＮＨ_３等で６．０から８．０、より好ましくは７．０から７．６で調整し、培養することが好ましい。培養時間は特に限定されないが、菌体が十分に増殖し、且つ乳酸が生成するに必要な時間である。

培養に際しては通常は温度、ｐＨ、通気条件、攪拌速度を制御し得る培養槽を用いるのが一般的であるが、本発明の培養に際しては培養槽を使用することに限定されない。培養槽を用いて培養する場合には、必要により、予め前培養として種培養を行い、これを必要量予め調製しておいた培養槽内の培地に接種してもよい。
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、培養液、及びそれらの処理物を指す。

以上のようにして得られた培養液等の培養物から乳酸を回収する方法は、例えば培養液からならば通常知られた方法が利用でき、例えば酸性化した後直接蒸留する方法、ラクチドを形成させて蒸留する方法、アルコールと触媒を加えエステル化した後蒸留する方法、有機溶媒中に抽出する方法、イオン交換カラムで分離する方法、電気透析により濃縮分離する方法などやそれらを組み合わせた方法が採用できる。また、本発明の方法により生産された菌体は、乳酸の生産に適した酵素群を生産していることから、これを利用してさらに乳酸を生産し、回収することも培養物から乳酸を回収する方法の一部とみなされる。
本発明の乳酸生産方法では、光学純度の高い乳酸を生産することができるので、培養物に含まれる乳酸を回収すれば、Ｄ−乳酸又はＬ−乳酸を純度よく得ることができる。

本発明で得られた微生物を培養して乳酸を生産させる際には、通気を全く行わなくともよいが、より好ましい結果を得るためには通気を行った方がよい。ここで言う通気条件下とは必ずしも培養液中を空気が通過する必要はなく、培養槽の形状によっては適度に培養液を撹拌しながら培養液上の空気層が換気されるような上面通気も含み、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。液中に通気する場合は内圧、撹拌羽根位置、撹拌羽根形状、撹拌速度の組み合わせにより溶存酸素濃度が変化するために乳酸の生産性および乳酸以外の有機酸量などを指標に次のように最適条件を求めることができる。

例えば、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１等の比較的小型の培養槽で培養する場合は、５００ｇの培養液を使用した際、空気を常圧で０．０１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、撹拌速度５０ｒｐｍ〜５００ｒｐｍ、より好ましくは、常圧で０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、撹拌速度１００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍで達成し得る通気条件で好ましい結果を得ることができる。この条件は通気撹拌条件が温度３０℃の水を対象とした場合常圧で酸素移動速度係数ｋＬａが１／ｈ以上４００／ｈ以下となる条件で達成し得る酸素供給を可能とする条件である。

また、最適な通気条件の別の指標としては、ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｏｘ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株が嫌気培養で生産するギ酸、酢酸、コハク酸若しくはエタノール又はこれらの組み合わせが総量で、５．０ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以下になり且つ、乳酸が生産されるような通気量、撹拌速度により達成される通気条件である。

また、最適な通気条件の別の指標としては、０．３％の光学異性体であるＬ−乳酸を含む培地でｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｏｘ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を培養した際に、１０〜１００時間以内にＬ−乳酸の濃度が０．０２質量％以下に低下するような通気量、攪拌速度である。

上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。上記のように通気を行うことで乳酸の生産性の向上、光学異性体の削減を達成することができる。

本発明の乳酸生産方法によれば、Ｌ−乳酸又はＤ−乳酸を高い光学純度で得ることができ、生産原料に光学純度を低下させる他方の光学異性体が含まれている場合でも、目的ではない光学異性体を分解することにより、目的とする光学異性体を生産することができる。

本発明の乳酸生産方法では、定法のＨＰＬＣやＦ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）を用いて光学純度を確認することができる。特に上記Ｆ−キットに従い、得られた上清中のＬ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定し、下記式に代入して求めた方法により測定して、９８％ｅ．ｅ．以上の光学純度で目的とするＬ−又はＤ−乳酸を得ることができ、好ましくは９９．５％ｅ．ｅ．以上の光学純度で目的とするＬ−又はＤ−乳酸を得ることができる。
光学純度（％e.e.）
＝１００×（Ｄ乳酸濃度−Ｌ乳酸濃度）/（Ｄ乳酸濃度＋Ｌ乳酸濃度）
上記式において乳酸濃度は、質量基準である。

また本発明の乳酸生産方法によれば、ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ及び非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼの双方を共に強化されていない大腸菌を用いてＤ−乳酸又はＬ−乳酸を製造する場合と比較して、上述したような高い光学純度の光学異性体を迅速に生産することができる。

以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」及び「部」は質量基準である。

-- Ｄ−乳酸生産菌 --
［実施例１］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ｄｌｄ遺伝子欠失株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下Ｄｌｄと略すことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ１００３８）。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡのｄｌｄ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＧ（配列番号１）、ＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣ（配列番号２）、ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧ（配列番号３）及びＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣ（配列番号４）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１と配列番号２のプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｄｌｄ−Ｌ断片と呼ぶことがある）を増幅し、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｄｌｄ−Ｒ断片と呼ぶことがある）を増幅した。得られたｄｌｄ−Ｌ断片、ｄｌｄ−Ｒ断片をそれぞれ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩ、ＰｓｔＩとＸｂａＩで消化した。このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（Hashimoto-Gotoh, T., et.al., Gene, Vol.241(1), pp185-191 (2000)）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。得られたプラスミドをｐＴＨΔｄｌｄと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。

［実施例２］
実施例１で得られたプラスミドｐＴＨΔｄｌｄをＭＧ１６５５株に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。

次に上記クローンをＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した後に、ＬＢ液体培地（３ｍｌ／試験管）に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈（１０^−２〜１０^−６程度）し、ＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、ＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｄｌｄを含む約２．０ｋｂ断片を増幅させ、ｄｌｄ遺伝子領域が欠失している株を選抜し、以上を満足するクローンをｄｌｄ欠失株とし、得られた株をＭＧ１６５５Δｄｌｄ株と命名した。

［実施例３］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｐｆｌ、ｄｌｄ遺伝子欠失株作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼ（以下Ｐｆｌと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０００１９２）。Ｐｆｌをコードする遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＧ（配列番号５）、ＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＣＧ（配列番号６）ＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＴＡＣＴＧＣＧＴＡＣＴＴＣＧ（配列番号７）ＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧ（配列番号８）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と配列番号６のプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｐｆｌＢ−Ｌ断片と呼ぶことがある）を増幅し、また、配列番号７と配列番号８のプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｐｆｌＢ−Ｒ断片と呼ぶことがある）を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｆｌＢ−Ｌ断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで、ｐｆｌＢ−Ｒ断片をＳｐｈＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ＰｆｌＢをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、ｐＴＨΔｐｆｌと命名した。

得られたプラスミドｐＴＨΔｐｆｌを、実施例２で得られたＭＧ１６５５Δｄｌｄ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
得られたクローンから、実施例２と同様の方法に従ってｐｆｌ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５Δｄｌｄ株を得、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株と命名した。

［実施例４］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｍｄｈ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０００４０３）。Ｍｄｈをコードする遺伝子（９３９ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号９）、ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＣＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＴＴＧ（配列番号１０）、ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＧＧ（配列番号１１）及びＡＡＡＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＡＣ（配列番号１２）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号９と配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２の組み合わせで、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約８００ｂｐ（以下ｍｄｈ−Ｌ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片と、約１，０００ｂｐ（以下ｍｄｈ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｍｄｈ−Ｌ断片をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで、ｍｄｈ−Ｒ断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＫｐｎＩ及びＸｂａＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ｍｄｈをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、本プラスミドをｐＴＨΔｍｄｈと命名した。

プラスミドｐＴＨΔｍｄｈを実施例３で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株に形質転換し、実施例２と同様の方法に従って、ｍｄｈ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株と命名した。

［実施例５］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのａｓｐＡ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０００４８６）。ＡｓｐＡをコードする遺伝子（１，４８２ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＴＴＴＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＣＧＴＴＧＧＴＧＧ（配列番号１３）、ＣＧＡＡＣＡＧＴＡＡＴＣＧＴＡＣＡＧＧＧ（配列番号１４）、ＴＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡＡＴＡＣＣＣＧＡＧ（配列番号１５）及びＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号１６）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３と配列番号１４、配列番号１５と配列番号１６の組み合わせで、上記プライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約９１０ｂｐ（以下ａｓｐＡ−Ｌ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片と、約１，１００ｂｐ（以下ａｓｐＡ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ａｓｐＡ−Ｌ断片とａｓｐＡ−Ｒ断片の両者ともにＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝バイオ）で末端を平滑化した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて定法にて５´末端をリン酸化した。また、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１を、ＳｍａＩ消化後、アルカリフォスファターゼにて脱リン酸化処理を行った。上記のリン酸化した２種類の断片と、脱リン酸化したプラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ＡｓｐＡをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得て、このプラスミドをｐＴＨΔａｓｐと命名した。
プラスミドｐＴＨΔａｓｐを実施例４で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株に形質転換し、最終的にａｓｐＡ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株を得、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株と命名した。本株を得る詳細な方法は、本発明の実施例２に記載された方法に準じた。

［実施例６］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株のゲノム上ｌｄｈＡプロモーターのＧＡＰＤＨプロモーターへの置換＞
エシェリヒア・コリのｌｄｈＡ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ３６９２８）。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ（配列番号１７）、及びＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号１８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするフラグメントを得た。さらにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）を取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴ（配列番号１９）、及びＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＣ（配列番号２０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．０ｋｂｐのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）フラグメントを得た。上記の２つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ｌｄｈＡを回収した。

さらにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｌｄｈＡ遺伝子５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣ（配列番号２１）とＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣ（配列番号２２）を用いて、エシェリヒア・コリゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの配列情報に基づいて作製されたＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号２３）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｌｄｈＡ遺伝子の配列情報に基づいて作製されたＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＣＣ（配列番号２４）を用いて、先に作製したプラスミドｐＧＡＰｌｄｈＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子の開始コドン近傍領域からなる約８５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。

上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化した。得られたフラグメントと、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１をＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合し、その後、ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に３０℃で形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＴＨ−ＧＡＰｌｄｈＡと命名した。

得られたプラスミドｐＴＨ−ＧＡＰｌｄｈＡを、実施例５で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをクロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、さらにクロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをクロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子を含む約８００ｂｐ断片を増幅させ、ｌｄｈＡプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株と命名した。

＜ｌｌｄＲ破壊株の作製＞
ｌｌｄＲ遺伝子を破壊するプラスミドを以下の方法で作製した。
エシェリヒア・コリのｌｌｄＲ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６ ３７７７０７７〜３７７７８５３）。
ｌｌｄＲをコードする遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＴＣＡＴＴＣＧＣＴＣＧＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＣＧＡＴＡ（配列番号２５）、ＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＧＧＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＡＡＧＡＣＡＴ（配列番号２６）を用いて、エシェリヒア・コリゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによりｌｌｄＲ上流のＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで切断した。次に、ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧ（配列番号２７）、ＧＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号２８）をプライマーとしてエシェリヒア・コリゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによりｌｌｄＲ下流のＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素ＫｐｎＩ、ＳａｌＩで切断した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ＬｌｄＤをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、本プラスミドをｐＴＨΔｌｌｄＲと命名した。

得られたプラスミドを、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体が得られるようにクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをクロラムフェニコールを含まないＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、さらにクロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。

出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをクロラムフェニコールを含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりｌｌｄＲ周辺を増幅させ、ｌｌｄＲ領域が欠損している株を選抜し、以上を満足するクローンをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株と命名した。

［実施例７］
＜エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のｆｒｕＲ遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、ｆｒｕＲ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の８８０２８〜８９０３２に記載されている。

ｆｒｕＲをコードする遺伝子（１００５ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ＴＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＡＡＣＣＧＣＴＡＴＣＴＧＧ（配列番号２９）、ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＴＧＧ（配列番号３０）、ＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＣＧＴＡＧＣＴＡＡＧＣ（配列番号３１）及びＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号３２）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９と配列番号３０、配列番号３１と配列番号３２の組み合わせで上記プライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約９５０ｂｐ（以下ｆｒｕＲ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約８８０ｂｐ（以下ｆｒｕＲ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｆｒｕＲ−Ｌ断片をＰｓｔＩ及びＸｂａＩで、ｆｒｕＲ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０１９６１０）のＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、ＦｒｕＲをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片を含むプラスミドを得、本プラスミドをｐＴＨΔｆｒｕＲと命名した。

プラスミドｐＴＨΔｆｒｕＲを実施例６で得られたエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、実施例２と同様の方法に従って、ｆｒｕＲ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株と命名した。

［実施例８］
＜エシェリヒア・コリＯ１５７由来スクロース加水分解酵素（インベルターゼ）遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリＯ１５７のインベルターゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、インベルターゼをコードする遺伝子（ｃｓｃＡ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ１５７株ゲノム配列の３２７４３８３〜３２７５８１６に記載されている。上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。

ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号３３）、及びＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号３４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。

インベルターゼ遺伝子を取得するために、エシェリヒア・コリＯ１５７のゲノムＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ：ＩＲＭＭ４４９）をテンプレートに用いて、ＧＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡＴＣＴＣＧＡＴＴＧＣＡＴＧ（配列番号３５）、及びＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号３６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩで消化することで約１．４ｋｂｐのインベルターゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｈＡＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを回収した。

このプラスミドｐＧＡＰ-ｃｓｃＡを実施例７で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株を得た。
また実施例６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株を得た

［実施例９］
＜ｌｏｘ遺伝子の単離＞
特開平１０−２４８５７４に開示されているＬ−乳酸酸化酵素の塩基配列を基に、ＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴＧ（配列番号３７）、ＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＡＴＴＣＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＴＴＡ（配列番号３８）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを２種設計し、合成した。配列番号３７のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位とｌｄｈＡのＳＤ配列を有している。配列番号３８のプライマーは５’末端にＫｐｎＩ認識部位を有している。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ９６２５（特開平１０−２４８５７４中ではＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ （ｓｕｂｓｐ． Ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＩＦＯ３４２７と記述されている）より染色体ＤＮＡを単離し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片を単離した。増幅されたＤＮＡ断片を精製し、ＸｂａＩで消化した。実施例８で得られたｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｈＡＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｌｏｘを回収した。
ＤＮＡシークエンサーにより、単離したｌｏｘ遺伝子の塩基配列を決定した。

［実施例１０］
＜ｌｌｄＤの単離＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり、エシェリヒア・コリのＦＭＮ依存型Ｌ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（ｌｌｄＤ）の塩基配列も報告されている。（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６、３７７７８５０〜３７７９０４０）。ｌｌｄＤをクローニングするため、ＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧ（配列番号３９）、ＧＡＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号４０）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを２種設計し、合成した。

エシェリヒア・コリＫ１２株のゲノムＤＮＡを通常の方法で単離し、得られたＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を精製し、ＸｂａＩで消化した。実施例８で得られたｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｈＡＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｌｌｄＤを回収した。ＤＮＡシークエンサーにより、単離したｌｌｄＤの塩基配列を決定した。

＜変異ｌｌｄＤの作製＞
変異ｌｌｄＤを作製するために上記で用いた配列番号３９、配列番号４０に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いてｐＧＡＰ−ｌｌｄＤを鋳型としてＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標） ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のプロトコールに従いｌｌｄＤの変異遺伝子をＰＣＲを用いて作製した。増幅されたＤＮＡ断片を精製し、ＸｂａＩで消化した。実施例８で得られたｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｈＡＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを１ウエル２ｍｌの容量の９６穴ディープウエルプレートに３００μＬの培地（１％グルコース，１．２％ペプトン，２％酵母エキス、（ｐＨ７．５））を添加したものに植菌し、３３度２４時間攪拌培養した。培養終了後、集菌し、上清を除いた後、２００μｌの溶菌酵素液（０．２８５ｍｇ／ｍｌＬｙｓｏｚｙｍｅ、１．５Ｕ／ｍｌＤＮａｓｅＩ、２ｍＭＭｇＣｌ２）を加えて３５回ピペッティングにより混合した。３５℃１５分インキュベートした後、さらに３５回ピペッティングにより混合、溶菌したことを目視で確認した後、１０μｌを取り、１９０μｌの反応液（２０ｍｇ／ｍｌ ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ、 ３ｍｇ／ｍｌ ３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ０．５ＭＫＰＢ（ｐＨ７．０））に添加した。次に４０μｌの１００ｍＭ Ｌ−乳酸ナトリウム（ｐＨ７．０）添加し、５７０ｎｍの吸光度の増加速度を観察した。
コントロールと比較して１．５倍以上の増加速度を示すコロニーからプラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンサーにより、単離した変異ｌｌｄＤの塩基配列を決定した。配列を配列番号４１に示す。得られたプラスミドをｐＧＡＰ−変異ｌｌｄＤとした。

＜Ｌｏｘ，ＬｌｄＤ同時強化プラスミドの構築＞
ｐＧＡＰ−変異ｌｌｄＤを鋳型としてＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧ（配列番号４２）、ＧＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号２８）をプライマーにＰＣＲによって得られたｌｌｄＤフラグメントを制限酵素ＳａｌＩで切断し、精製したフラグメントをｐＧＡＰ−ｌｏｘを制限酵素ＳａｌＩで切断したフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドｐＧＡＰ−ｌｏｘ−変異ｌｌｄＤを得た。変異ｌｌｄＤの挿入方向はシークエンスにより確認した。

［実施例１１］
＜ｌｃｔＯの単離＞
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＩＬ１４０３のＬ−乳酸酸化酵素をコードする遺伝子の塩基配列は公開されている。（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００６３５７、４８１３〜３６６２）この塩基配列情報を基に、Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ １９４３５からＬ−乳酸酸化酵素遺伝子を単離するため、ＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＴＡ（配列番号４３）、ＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＴ（配列番号４４）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを２種設計し、合成した。配列番号４３のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位とｌｄｈのＳＤ配列を有している。配列番号４４のプライマーは５’末端にＫｐｎＩ認識部位を有している。

Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ １９４３５のゲノムＤＮＡを単離し、これを鋳型として配列番号４３、４４に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、通常の条件でＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を精製し、ＸｂａＩで消化した。実施例８で得られたｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｈＡＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からｌｃｔＯを含むプラスミドを得て、ｐＧＡＰ−ｌｃｔＯと命名した。
ＤＮＡシークエンサーにより、単離したｌｃｔＯの塩基配列を決定した。

［実施例１２］
＜乳酸生産用プラスミドの構築＞
実施例８で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを制限酵素ＫｐｎＩ、ＳａｌＩで切断し、精製したフラグメントを得た。ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴＧ（配列番号４５）、ＣＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＡＴＴＣＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＴＴＡ（配列番号４６）をプライマーとして実施例９と同様にＰＣＲを行ったｌｏｘのフラグメント、ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧ（配列番号２７）、ＧＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号２８）をプライマーとして実施例１０と同様にＰＣＲを行ったｌｌｄＤのフラグメント、及びＡＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣＡＧＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＴＡ（配列番号４７）、ＡＣＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＴ（配列番号４８）をプライマーとして実施例１１と同様にＰＣＲを行ったｌｃｔＯのフラグメントをそれぞれを制限酵素ＫｐｎＩ，ＳａｌＩで切断し、それぞれのフラグメントに上記で得たｐＧＡＰ−ｃｓｃＡのフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体よりｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｏｘ， ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｌｄＤ，ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｃｔＯを得た。さらに大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧ（配列番号４２）、ＧＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号２８）をプライマーにＰＣＲによって得られたｌｌｄＤフラグメントを制限酵素ＳａｌＩで切断し、精製したフラグメントをｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｏｘを制限酵素ＳａｌＩで切断したフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミド ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｏｘ−ｌｌｄＤを得た。 挿入方向はシークエンスを行って確認した。さらに大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧ（配列番号４２）、ＧＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧ（配列番号２８）をプライマーにＰＣＲによって得られたｌｌｄＤフラグメントを制限酵素ＳａｌＩで切断し、精製したフラグメントをｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｃｔＯを制限酵素ＳａｌＩで切断したフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミド ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｃｔＯ−ｌｌｄＤを得た。これらプラスミドを、実施例７で得られたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｏｘ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株， ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株，ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｃｔＯ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株、ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｏｘ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株、ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｃｔＯ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を得た。

［実施例１３］
＜ＬｌｄＤ強化の効果＞
プラスミドｐＢＲｇａｐＰ、及びｐＧＡＰ−ｌｌｄＤを実施例６で作製したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、ｐＢＲｇａｐＰ/ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株及びｐＧＡＰ−ｌｌｄＤ/ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を作製した。
前培養として５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに１００ｍｌの５０μg/ml濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ ｃａｔ.２４４６２０）をいれ、上記Ｄ−乳酸生産菌を別々に植菌し、一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った後、１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に培地（１２％グルコース、３％コーンスティープリカー：日本食品化工製 Lot（190718C）以下、同じ）５００ｍＬを入れたものに別々に０．５％植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２で４８時間行った。得られた培養液中の乳酸の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。また得られた乳酸の光学純度についてはＦ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、得られた上清中のＬ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定し、次式に代入して求めた。
光学純度（％e.e.）
＝１００×（Ｄ乳酸濃度−Ｌ乳酸濃度）/（Ｄ乳酸濃度＋Ｌ乳酸濃度）
結果を表１に示す。表１に示されるように、ｌｌｄＤを強化することにより、得られる乳酸の光学純度が向上することが判明した。

＜変異ｌｌｄＤによるＬｌｄＤ強化の効果＞
実施例１０で得られたｐＧＡＰ−変異ｌｌｄＤを実施例６で作製したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、ｐＧＡＰ−変異ｌｌｄＤ/ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を作製した。前培養として５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに１００ｍｌの５０μg/ml濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ ｃａｔ.２４４６２０）をいれ、上記Ｄ−乳酸生産菌を別々に植菌し、一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った後、１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に培地（１２％グルコース、５％コーンスティープリカー）５００ｍＬを入れたものに別々に０．５％植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５で３０時間行った。得られた培養液中の乳酸の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。また得られた乳酸の光学純度については、Ｆ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、得られた上清中のＬ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定し、次式に代入して求めた。
光学純度（％e.e.）
＝１００×（Ｄ乳酸濃度−Ｌ乳酸濃度）/（Ｄ乳酸濃度＋Ｌ乳酸濃度）。
比較の為、上記で作製した変異導入前のｐＧＡＰ−ｌｌｄＤ/ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を同様に培養した。
結果を表２に示す。表２に示されるように、変異体ｌｌｄＤを用いることによって、変異導入前のｌｌｄＤと比較して、得られる乳酸の光学純度が向上することが判明した。

＜ｌｌｄＲ破壊の効果＞
実施例１０で得られたｐＧＡＰ−ｌｌｄＤを実施例６で得られたｌｌｄＲ破壊株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、得られたコロニーを前培養として５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに１００ｍｌの５０μg/ml濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ ｃａｔ.２４４６２０）をいれ、上記Ｄ−乳酸生産菌を植菌した。一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った後、１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に培地（１２％グルコース、５％コーンスティープリカー）５００ｍＬを入れたものに別々に０．５％植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５で３０時間行った。得られた培養液中の乳酸濃度の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。また得られた乳酸の光学純度についてはＦ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、得られた上清中のＬ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定し、次式に代入して求めた。
光学純度（％e.e.）
＝１００×（Ｄ乳酸濃度−Ｌ乳酸濃度）/（Ｄ乳酸濃度＋Ｌ乳酸濃度）。
比較の為、ｌｌｄＲを破壊していないｐＧＡＰ−ｌｌｄＤ/ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を同様に培養した。
結果を表３に示す。表３に示されるように、ｌｌｄＲの破壊は、ｌｌｄＲ破壊前と比較して、得られる乳酸の光学純度が向上することが判明した。

＜Ｌｏｘ強化の効果＞
実施例９で得られたｐＧＡＰ−ｌｏｘ及び実施例１０で得られたｐＧＡＰ−ｌｏｘ−変異ｌｌｄＤを実施例６で得られたｌｌｄＲ破壊株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、得られたコロニーを前培養として５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに１００ｍｌの５０μg/ml濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ ｃａｔ.２４４６２０）をいれ、上記Ｄ−乳酸生産菌を別々に植菌した。一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った後、１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に培地（１２％グルコース、５％コーンスティープリカー）５００ｍＬを入れたものに別々に０．５％植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．４で２４時間行った。得られた培養液中の乳酸濃度の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。また得られた乳酸の光学純度についてはＦ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、得られた上清中のＬ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定し、次式に代入して求めた。
光学純度（％e.e.）
＝１００×（Ｄ乳酸濃度−Ｌ乳酸濃度）/（Ｄ乳酸濃度＋Ｌ乳酸濃度）。
比較の為、上記で得られた変異ｌｌｄＤ強化株であるｐＧＡＰ−変異ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を同様に培養した。結果を表４に示す。表４に示されるように、Ｌｏｘの強化は変異ｌｌｄＤ遺伝子による強化以上に光学純度を向上させる効果があることが判明した。Ｌｏｘと変異ｌｌｄＤの同時強化はさらに、得られる乳酸の光学純度を向上させる効果があることが判明した。

＜糖蜜からのＤ−乳酸の生産＞
実施例１２で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株、ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｏｘ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を前培養として、表５に示す前培養培地２０ｍｌを入れた１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに、別々に植菌し、一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。１Ｌ容培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に表６に示す培地５００ｍＬを入れたものに別々に０．５％植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度３５０ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５で４８時間行った。得られた培養液中の乳酸濃度の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。また得られた乳酸の光学純度についてはＦ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、得られた上清中のＬ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定し、次式に代入して求めた。
光学純度（％e.e.）
＝１００×（Ｄ乳酸濃度−Ｌ乳酸濃度）/（Ｄ乳酸濃度＋Ｌ乳酸濃度）。

比較として実施例８で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを実施例７で得られたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に組み換えたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株についても同様の培養を行った。
結果を表７に示す。表７に示されるように、糖蜜を原料とした場合にも、ＬｌｄＤ、Ｌｏｘの強化により、得られる乳酸の光学純度が向上することが判明した。

＜ＬｃｔＯ強化の効果＞
実施例１２で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株，及びｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｌｃｔＯ−ｌｌｄＤ／ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐΔｆｒｕＲ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を前培養として、１０ｇの炭酸カルシウム（純正化学 １級）を入れ、予め殺菌した１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに、表８に示す培地２０ｍｌを入れたフラスコにそれぞれ植菌し、一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。その後、１０ｇの炭酸カルシウム（純正化学 １級）を入れ、予め殺菌した１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに、表８に示す培地２０ｍｌを入れたフラスコに前培養液１ｍｌを加え、３５℃、１００ｒｐｍで２４時間攪拌培養を行った。

培養終了時に、得られた培養液中の乳酸の測定はＨＰＬＣで定法に従って測定した。また得られた乳酸の光学純度についてはＦ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、得られた上清中のＬ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定し、次式に代入して求めた。
光学純度（％e.e.）
＝１００×（Ｄ乳酸濃度−Ｌ乳酸濃度）/（Ｄ乳酸濃度＋Ｌ乳酸濃度）
結果を表９に示す。表９に示されるように、ｌｃｔＯ強化により、得られる乳酸の光学純度が向上することが確認された。

-- Ｌ−乳酸生産菌 --
［実施例１４］
＜ビフィドバクテリウム由来ｌｄｈ２遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株の構築＞
ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｌｏｎｇｕｍ）のＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ２）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３３５８５に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の５５５〜１５１７に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。

ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号３３）、及びＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号３４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。

ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、ビフィドバクテリウム・ロンガム（ＡＴＣＣ １５７０７）をテンプレートに用いて、ＡＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣ（配列番号４９）、及びＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＧ（配列番号５０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩで消化することで約１．０ｋｂｐのＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｌｄｈ２を回収した。

このプラスミドｐＧＡＰ−ｌｄｈ２を実施例３で作成したｐＴＨΔｐｆｌを用い、実施例２と同様な手法でｐｆｌ遺伝子を欠失させたＭＧ１６５５株（ＭＧ１６５５Δｐｆｌ株と呼ぶ）のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株を得た。

［実施例１５］
＜ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株によるＬ−乳酸生産＞
実施例１３と同様に、ＭＧ１６５５Δｐｆｌ／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株のグルコースからのＬ−乳酸生産を調べた。
下記の表１０に示す培地４７５ｇ入れたものに、実施例１３と同様の方法で前培養したフラスコ内容物２５ｍｌを植菌した。

培養は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５（２４％ ＮａＯＨで調整）で１８時間行った。
１８時間培養後の培養液中のＬ−乳酸濃度は、９７．０２ｇ／Ｌだった。
この結果より、ビフィドバクテリウム由来のＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを用いて、グルコースからＬ−乳酸を生産できることを確認した。

［実施例１６］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ-ｌｄｈ２株の構築＞
実施例１４で作成したｐＧＡＰ−ｌｄｈ２プラスミドを実施例６で構築したＤ−乳酸生産株に導入した形質転換体を作成した。具体的には以下のように行った。
プラスミドｐＧＡＰ−ｌｄｈ２を実施例６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換した。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株を得た。

［実施例１７］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株によるＬ−乳酸生産＞
実施例１３と同様に、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｌｄｈ２株のグルコースからのＬ−乳酸生産を調べた。
培養は大気圧下、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５（２４％ ＮａＯＨで調整）で１８時間行った。
１８時間培養後の培養液中のＬ−乳酸濃度は、１１６．８４ｇ／Ｌだった。
この結果より、Ｄ−乳酸生産大腸菌株に、プラスミドｐＧＡＰ−ｌｄｈ２を組み込むことにより、グルコースを原料としてＬ−乳酸を生産できることを確認した。Ｌ−乳酸が生産されたことは、Ｆ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、Ｌ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定することで確認した。

［実施例１８］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株の構築＞
実施例１５で用いたＤ−乳酸生産用大腸菌株（ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株）のｌｄｈＡ遺伝子をｌｄｈ２遺伝子に置き換え、更にＬ−乳酸の分解を触媒する酵素の遺伝子ｌｌｄＤを破壊して、Ｌ−乳酸生産用大腸菌株を構築した。具体的には、以下のようにして行った。

（ｌｄｈＡ遺伝子破壊株の作成）
ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡのｌｄｈＡ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣ（配列番号２１）、ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣ（配列番号２２）、ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣ（配列番号５１）及びＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＡＡＣＣ（配列番号５２）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。これらのプライマーを用い、実施例１と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドｐＴＨΔｌｄｈＡを構築した。更に、ｐＴＨΔｌｄｈＡをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例２と同様な手法を用いてｌｄｈＡ欠失株を選択した。得られた株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株と命名した。

（ｄｌｄ遺伝子復帰株の作成）
大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡのｄｌｄ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＧ（配列番号１）、ＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣ（配列番号４）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。これらのプライマーを用い、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを実施し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで切断した。さらにプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで切断し、上記ｄｌｄ断片と混合した後、リガーゼで結合し、プラスミドｐＴＨＤＬＤを構築した。更に、ｐＴＨＤＬＤをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、実施例２と同様な手法を用いてｄｌｄ復帰株を選択した。得られた株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株と命名した。

（ｌｌｄＤ遺伝子破壊株の作成）
ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡのｌｌｄＤ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＡＴＣＴ（配列番号５３）、ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＧＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣＧＧ（配列番号５４）、ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＴＧＧ（配列番号５５）及びＣＧＴＣＴＡＧＡＡＣＧＧＧＴＡＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣＧ（配列番号５６）のオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。これらのプライマーを用い、実施例１と同様の手法で遺伝子破壊用プラスミドｐＴＨΔｌｌｄＤを構築した。更に、ｐＴＨΔｌｌｄＤをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株コンピテントセルに形質転換し、実施例２と同様な手法を用いてｌｌｄＤ欠失株を選択した。得られた株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株と命名した。

（ｌｄｈ２遺伝子ゲノム挿入株の作成）
ビフィドバクテリウム・ロンガムのＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ２）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ３３５８５に記載のビフィドバクテリウムゲノム配列の５５５〜１５１７に記載されている。
Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ２）を取得する為にビフィドバクテリウム ロンガム（ＡＴＣＣ１５７０７）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＴＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣ（配列番号５７）、ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＧ（配列番号５０）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを実施し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで切断した。

ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号５８）、ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧ（配列番号５９）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで切断した。
実施例１５で得られたｐＴＨΔｌｄｈＡをＸｂａＩで切断したプラスミド、上記で得られたビフィドバクテリウム・ロンガム由来ｌｄｈ２のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片、及び大腸菌由来ＧＡＰＤＨプロモーターのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＴＨΔｌｄｈＡ：：ＧＡＰｌｄｈ２を回収した。得られたプラスミドをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入ΔｌｄｈＡ株に形質転換し、実施例２と同様の方法を用いてｌｄｈ２ゲノム挿入株をｌｄｈ２をＰＣＲで増幅することにより選択した。
得られた株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株と命名した。

［実施例１９］
＜ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株の構築＞
実施例１６で構築したＬ−乳酸生産用大腸菌株にスクロース加水分解酵素（インベルターゼ）遺伝子発現ベクターを導入し、スクロースからＬ−乳酸を生産する大腸菌株を構築した。具体的には以下のようにして行った。
実施例８で構築したプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを実施例１６で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入/ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ株を得た。

［実施例２０］
＜大腸菌由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現大腸菌の構築＞
ＭＧ１６５５株ゲノムＤＮＡのｄｌｄ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて、ＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＴ（配列番号６１）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを実施し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩ、及びＳａｌＩで切断した。このフラグメントと実施例８で作製したｐＧＡＰ−ｃｓｃＡをＫｐｎＩ、ＳａｌＩで切断したフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＥＣ）を回収した。

［実施例２１］
＜コリネバクテリウム・グルタミカム由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現大腸菌の構築＞
コリネバクテリウム・グルタミカム由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＢＸ９２７１５０に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムゲノム配列の２６１００９〜２５９２９４に記載されている。
ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｄｌｄ）を取得する為にコリネバクテリウム・グルタミカム（ＮＢＲＣ１２１６８）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧ（配列番号６２）、ＴＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＣ（配列番号６３）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成した。コリネバクテリウム・グルタミカム（ＮＢＲＣ１２１６８）はＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより入手できる。これらのプライマーを用いてＰＣＲを実施し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩで切断した。このフラグメントと実施例８で作製したｐＧＡＰ−ｃｓｃＡをＫｐｎＩで切断したフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＣＧ）を回収した。

［実施例２２］
＜ザイモモナス・モビルス由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現大腸菌の構築＞
ザイモモナス・モビルス由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００８６９２に記載のザイモモナス・モビルスゲノム配列の２５６６５８〜２５８３８２に記載されている。
ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｄｌｄ）を取得する為にザイモモナス・モビルス（ＡＴＣＣ ３１８２１）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣ（配列番号６４）、ＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧ（配列番号６５）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成し、ＰＣＲを実施した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩで切断した。このフラグメントと実施例８で作製したｐＧＡＰ−ｃｓｃＡをＫｐｎＩで切断したフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＺＭ）を回収した。

［実施例２３］
＜キサントモナス・キャンペストリス由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現大腸菌の構築＞
キサントモナス・キャンペストリス由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０１２１６９に記載のキサントモナス・キャンペストリスゲノム配列の１０２８４〜８８９０に記載されている。
ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｄｌｄ）を取得する為にキサントモナス・キャンペストリス（ＡＴＣＣ ３３９１３）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＣＡＣＣＧＣ（配列番号６６）、ＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＧＧＡＴＴＣ（配列番号６７）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成し、ＰＣＲを実施した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩで切断した。このフラグメントと実施例８で作製したｐＧＡＰ−ｃｓｃＡをＫｐｎＩで切断し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ Ｃａｔ．６０２５）を用いて制限酵素切断個所を平滑化したフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＸＣ）を回収した。

［実施例２４］
＜キサントモナス・オリゼ由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現大腸菌の構築＞
キサントモナス・オリゼ由来ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ０１３５９８に記載のキサントモナス・オリゼゲノム配列の４０９８２３５〜４０９９６６２に記載されている。
ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｄｌｄ）を取得する為にキサントモナス・オリゼ（ＪＣＭ ２０２４１）のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＣＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＣＣＡＣＣＧＣＡＣ（配列番号６８）、ＴＴＧＧＴＡＣＣＴＡＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＣＡ（配列番号６９）のオリゴヌクレオチドプライマーを２種合成し、ＰＣＲを実施した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩで切断した。このフラグメントと実施例８で作製したｐＧＡＰ−ｃｓｃＡをＫｐｎＩで切断したフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＸＯ）を回収した。
ＪＣＭ ２０２４１はＪａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓより入手することができる。

［実施例２５］
＜Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍｅｉｎ保有/非保有ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現大腸菌により生産されるＬ−乳酸の光学純度＞
実施例１８で得られたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株に実施例７と同様の処理を行って構築したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｍｄｈΔａｓｐΔｌｌｄＤΔｆｒｕＲΔｌｄｈＡ／ＧＡＰｌｄｈ２ゲノム挿入株に、次の各プラスミドを形質転換し、由来の異なるＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現大腸菌を作成した。
（Ａ）：実施例８で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ
（Ｂ）：実施例２０で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＥＣ）
（Ｃ）：実施例２１で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＣＧ）
（Ｄ）：実施例２２で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＺＭ）
（Ｅ）：実施例２３で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＸＣ）
（Ｆ）：実施例２４で得られたｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｄｌｄ（ＸＯ）
前培養として、表１１に示す前培養培地２０ｍｌを入れた１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに、各ＦＡＤ依存型Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現株を植菌し、一晩３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。その後、１０ｇの炭酸カルシウム（純正化学 １級）を入れ、予め殺菌した１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに、表１２に示す培地２０ｍｌを入れたフラスコに前培養液１ｍｌを加え、３５℃、１００ｒｐｍで２４時間攪拌培養を行った。

培養終了後、遠心分離により上清を得た。光学純度は、Ｆ−キット Ｄ−／Ｌ−乳酸（ジェイ・ケイ・インターナショナル 製品番号１１１２８２１）に従い、得られた上清中のＬ−乳酸量、及びＤ−乳酸量を測定し、次式に代入して求めた。
光学純度（％e.e.）
＝１００×（Ｌ乳酸濃度−Ｄ乳酸濃度）/（Ｌ乳酸濃度＋Ｄ乳酸濃度）。
結果を表１３に示す。表１３に示されるように、Lact-deh-membドメインを持つ、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、ザイモモナス・モビルス由来のｄｌｄを発現する大腸菌が特に高い光学純度を短時間に達成することが判明した。

２００８年９月１６日に出願の日本国出願番号第２００８−２３７１７７号、２００９年２月１３日に出願の日本国出願番号第２００９−３２０４２号及び２００９年２月１３日に出願の日本国出願番号第２００９−３２０４３号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (23)

1. Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸のいずれか一方を分解していずれか他方を生産するように、１種類以上のＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼ及び１種類以上の非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼの各酵素活性が共に強化されている乳酸生産大腸菌であって、
   前記ＮＡＤ依存型乳酸デヒドロゲナーゼの活性強化が、
   Ｌ−乳酸生産の場合には、ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性強化であり、
   Ｄ−乳酸生産の場合には、ＬｄｈＡの活性強化であり、
   前記非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼの活性強化が、
   Ｌ−乳酸生産の場合には、Lact deh membドメインを有するＤｌｄによるＤｌｄの活性強化であり、
   Ｄ−乳酸生産の場合には、
   ＬｌｄＤの活性強化、又は、
   ＬｌｄＤの活性強化と、ＬｌｄＲの不活化若しくは低減化、Ｌｏｘの活性強化、及びＬｃｔＯの活性強化からなる群の１つ以上との組み合わせ
   であり、該ＬｌｄＤの活性強化が、ＬｌｄＤをコードする遺伝子のＯＲＦ中の３３位にサイレント変異を有する変異体ｌｌｄＤ遺伝子の発現によるものである
   当該乳酸生産大腸菌。
2. 前記Ｄ−乳酸生産の場合の前記非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素の活性強化が、
   ＬｌｄＤの活性強化と、ＬｌｄＲの不活化若しくは低減化、Ｌｏｘの活性強化、及びＬｃｔＯの活性強化からなる群の１つ以上との組み合わせ
   である請求項１記載の乳酸生産大腸菌。
3. 前記変異体ＬｌｄＤが、配列番号４１の塩基配列で表されるものである請求項１又は請求項２記載の乳酸生産大腸菌。
4. 前記Ｄ−乳酸生産の場合の前記非ＮＡＤ依存型乳酸オキシドレダクターゼ酵素の活性強化が、
   ＬｌｄＲの不活化若しくは低減化と、前記変異体ＬｌｄＤによるＬｌｄＤ活性強化と、Ｌｏｘの活性強化との組み合わせ、又は、
   前記変異体ＬｌｄＤによるＬｌｄＤ活性強化とＬｏｘの活性強化との組み合わせ、
   である請求項２又は請求項３記載の乳酸生産大腸菌。
5. 前記ＬｌｄＤの遺伝子が大腸菌由来の遺伝子であり、前記Ｌｏｘの遺伝子がエンテロコッカス属菌由来の遺伝子であり、前記ＬｃｔＯの遺伝子がラクトコッカス属菌由来の遺伝子である請求項１〜請求項４のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌。
6. 前記Ｄ−乳酸生産の場合に、Ｄｌｄ活性及びＰｆｌ活性からなる群より選択された少なくとも一つが不活化または低減化している請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌。
7. 前記Ｌ−乳酸生産の場合の前記ＮＡＤ依存型Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼが、ビフィドバクテリウム属菌に由来するものである請求項１に記載の乳酸生産大腸菌。
8. 前記Ｌ−乳酸生産の場合の前記Ｄｌｄが、大腸菌、ザイモモナス属菌及びコリネバクテリウム属菌からなる群より選ばれる少なくとも１種に由来する請求項１又は請求項７に記載の乳酸生産大腸菌。
9. 前記Ｌ−乳酸生産の場合の前記Ｄｌｄが、さらにＦＡＤ−oxidase_Cドメインを有する請求項１、請求項７又は請求項８記載の乳酸生産大腸菌。
10. 前記Ｌ−乳酸生産の場合の前記Ｄｌｄが、ザイモモナス属菌及びコリネバクテリウム属菌からなる群より選ばれる少なくとも１種に由来する請求項１又は請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の乳酸生産大腸菌。
11. 前記Ｌ−乳酸生産の場合に、ＬｄｈＡ活性、ＬｌｄＤ活性及びＰｆｌ活性の少なくとも一つが不活化または低減化されている請求項１又は請求項７〜請求項１０のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌。
12. Ｍｄｈ及びＡｓｐＡの活性からなる群より選択された少なくとも一つが不活化または低減化されている請求項１〜請求項１１のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌。
13. スクロース非ＰＴＳ遺伝子群及びＦｒｕＫからなる群より選択された少なくとも一つが強化されている請求項１〜請求項１２のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌。
14. ＦｒｕＲ活性が不活化または低減化されている請求項１〜請求項１３のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌。
15. 請求項１〜請求項１４のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌を用いて乳酸を生産する乳酸生産方法。
16. 常圧で、０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、攪拌速度が１Ｌ容培養槽を用いた場合に１００ｒｐｍ以上３５０ｒｐｍ以下の条件で達成し得る通気条件下で乳酸生産を行う、請求項１５記載の乳酸生産方法。
17. 前記１Ｌ容培養槽が、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１である請求項１６記載の乳酸生産方法。
18. 請求項１〜請求項６及び請求項１２〜請求項１４のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌を用いてＤ−乳酸を生産するＤ−乳酸生産方法。
19. 常圧で、０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、攪拌速度が１Ｌ容培養槽を用いた場合に１００ｒｐｍ以上３５０ｒｐｍ以下の条件で達成し得る通気条件下でＤ−乳酸生産を行う、請求項１８記載のＤ−乳酸生産方法。
20. 前記１Ｌ容培養槽が、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１である請求項１９記載のＤ−乳酸生産方法。
21. 請求項１又は請求項７〜請求項１４のいずれか１項記載の乳酸生産大腸菌を用いてＬ−乳酸を生産するＬ−乳酸生産方法。
22. 常圧で、０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、攪拌速度が１Ｌ容培養槽を用いた場合に１００ｒｐｍ以上３５０ｒｐｍ以下の条件で達成し得る通気条件下でＬ−乳酸生産を行う、請求項２１記載のＬ−乳酸生産方法。
23. 前記１Ｌ容培養槽が、ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１である請求項２２記載のＬ−乳酸生産方法。